Sur la réaction au phénol de kunkel étude des fractions lipoprotéidiques par électrophorèse bidimensionnelle

CLINICA

I4

SUR 1.A RI;:ACTIOS fi;:Tux

CHIMICA

ACTA

AU PHkKOL

DE KUNKEL

DES FRA~I-IO~S LIP~PR~WIDIQUE:S

I;:LECTROPHOKGSE D. VINCRST,

i'm I~IDI~~E~:S~~NNEI,LE*

J. I’OLOSO\‘SKI

ET I<. \1-i\LD

I.abovaloirs de Biochimie clirriqtre, Centve hospilalier r&$mml, Mdpital de Pwpan, I‘oulouse, Lnboratoire de Biochimie rnPdicale de la Facullt de MBdecine, Paris (Frcmce)

La &action au phenol de Kunkel est considdrde comme rdpondant aux lipidcs Griques et son utilisation clinique a meme dtC primitivcmcnt indiquCc comme un moyen commode de dosage rapide de la lipiddmie I, Diverscs rechcrches ont montrc quc, sans apportcr une correspondance pr&ise avrc le taux de la lipidPmie, ellc manifestc, dans son intcnsite, un parallClisme assex net, dans de nombreux cas cliniques (athQosclCrosc) avec l’augmentation dcs /?I-lipoprotCidcs2. Toutcfois des travaux complCmcntaires ont permis de reconnaitre quc, sur lcs fractions purifiCcs par ultracentrifugation, les a-IipoprotCides, comme les /I, et les chylomicrons, donnent un trouble au rEactif de Kunkel, proportionnel & lcur teneur en lipides”. On sait par aillcurs quc cc rdactif prCcipite aussi le fibrino@ne et certains de ses di:rivCs”. Nous avons rbalisC une s&e nouvelle de recherches en utilisant l’Clectrophor&sc bidimensionnellc (appareil Elphor V) selon les donnCcs de GRASShlASX ET HAYSIG ct nous en rapportons ici les Aultats obtenus sur quelques &rums pathologiques inGressants.

Les &rums dtudiCs Ctaicnt amends, dil&s & I/* ou ?L‘id cn tampon dc barbiturate A pH = S.6 au contact du papier sgparateur par le dispositif spCcia1 permettant un tr&s faible ddbit (0.07-0.09 ml A l’heurc). Une tension de 150 B 300 V sous 5 B IO mA Ctait appliquee et l’Clectrophor?se ktait poursuivic pendant 15 5 24 h. Lcs liquidcs de s¶tion collect& a la base de l’appareil Ctaicnt analysbs de faGon g recherchcr ceux qui donnaient un trouble par le rCactif ph&wlique de Kunkel, tandis que le ddveloppemcnt du papicr scparateur soit par le blcu de bromophCno1, soit par le noir Soudan, permettait de determiner h quellcs fractions protdidiqucs ou lipoproteidiques se rapportaicnt les liquides sbpards. La r&action de Kunkel Ctait faite dans dcs tubes a hemolyse sur I ml de rbactif auqucl on ajoutait 0.1 ou 0.2 ml des liquidcs de sgparation selon les cas. D’abord ces liquides btaient ajoutds sans mt!langc et on obscrvait dans qucls tubes SC formait une zone opalescente intermbdiaire. Puis aprks mClange on notait le trouble form& ct on en apprdciait 1’intcnsitC relative. Lc reactif utilisd dtait la solution de NaCl 12% et phdnol pur I?~ dans l’eau bidistillee. Dans quelques cas ccpcndant, pour rcndre la rc’action plus sensible on a utilist un rkactif de 20:; p lus concentre pour compenscr la dilution due au mblangc dc 0.2 ml de liquidc analys& a I ml de rgactif. * Conlmunication 1Iai rgjg.

pr&sentC au $Bmc Colloquium

“l’rotides

of rhc 13iological

Fluids”,

Urugcs,

SUR LA R6ACTION AU PHkNOL DE KUNKEL

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Rl&iULTATS

Nous n’avons pas 6tudi6 de s&urns absolument normaux, la reaction de Kunkel Ctant alors trop faible pour pouvoir &tre facilement observee sur les fractions &par&es et, de ce fait meme, diluees. Nous distinguerons dans nos resultats, d’abord ceux obtenus sur un serum Kunkel positif (hypercholesterolemie) mais d’aspect electrophoretique sensiblement normal, puis sur deux serums de nephrose dont l’un se signalait par une hyperlipidemie ex-

Fig. I. Electrophor&se bidimensionnelle d’un s&urn hypercholest8rol6mique. A gauche: mise en 6vidence des protides (I 80 V; 5.5 mA) . A droite : Mise en Evidence des lipides. En bas : sont indiquees les intensitks relatives du trouble obtenu par les liquides de separation en presence du reactif phenolique de Kunkel.

traordinairement forte, enfin sur un cas de syndrome kahlerien qui presentait une tr&s forte positivite a la reaction de Kunkel. Nous avons enfin ajoute a ces recherches quelques essais sur le serum de Poulet dont on sait qu’il se signale par une t&s forte positivite de la reaction de Kunkel59 6. Etude

d’un sfh.~vn d’asfiect

Wectrophor&ique

normal

Les resultats en sont donnes dans la figure ci-contre od les intensitds relatives des turbidit& obtenues avec les liquides de separation Clectrophoretique sont confront& avec les papiers developpes pour reveler les fractions proteidiques d’une part, lipoproteidiques d’autre part. Ici on observe une bonne concordance de la reaction de Kunkel avec les deux fractions GFet /3-lipoproteiques, l’intensite du trouble &ant plus intense pour la fraction /3. Par contre, on n’observe pas de relation caracteristique avec les fractions proteidiques, la zone de positivite s’etendant depuis la serum albumine (et meme un peu au devant d’elle) jusqu’a 1’~ et au debut de la /3-globuline. l?tude de shums

de n@hzrose lipo$dique

Le I~I cas de nephrose lipo’idique CtudiCse rapportait a une forme typique extremement accentuee et Cvolutive, chez un jeune homme de 20 ans, hospitalis & I.

Clin. Chim

Acta,

5 (1960) q-c?.

16

D. VINCENT, J. POLONOVSKI, R. WALT)

l’H&el-Dieu de Toulouse, service du Prof. GADRAT. La r6action de Kunkel au phCno1 Ctait trb fortement positive: 1650 degres Meunier, soit 8~5 Vernes ou IIO unit&s Maclagan. L’hyperlipidemie Btait massive: 48 gO,lO,,cholestbolemie: IO go/,,; cl2 globuline : 48 y. des protides totaux. Le s&urn &tait fortement lactescent. Par rapport aux fractions proteidiques on observe ici une image d’apparence originale, inattendue et paradoxale. La Zone Kunkel-positive s’etend tr&sloin en avant de la fraction &rum-

Fig. z. Electronhorbse bidimensionnelle d’un s&un de nenhrose 1ipoIdique t&s fortement hvperlip&nique (I l-d V; 3.5 mA). A gauche: mise en evidence des protides. A droite: mise en &id&e des lipides. Au dessous indications des intensites relatives du trouble don& par les liquides s&par& en presence de reactif de Kunkel-phenol. En bas: Blectrophorese ordinaire du r&me &rum, mettant en evidence les bandes protidiques (en haut) et lipidiques (en bas).

albumine oh une trace peu coloree est nettement visible, et c’est dans cette par-tie pr~albuminique que la reaction rev&t son intensite max~um. La zone positive se termine au niveau des ~~-globu~nes avec une intensite nettement moindre. Mais on voit, en considerant les fractions lipoprot~idiques qu’elle leur correspond parfaitement bien. En effet la bande hpidique principale ext&mement intense se situe en avant de la s&rum albumine et elle est suivie d’une zone de moindre intensite s’etendant jusqu’a l’cr,-globuline inclusivement. Commentaires Ces constatations appellent quelques commentaires. D’abord la localisation des lipoproteides en avant de la serum albumine sur le diagramme de l’electrophorirse bidimensionnelle apparait tres extraordinaire. La comparaison avec l’electrophorese ordinaire sur papier accuse encore cette anomalie que l’on ne d&le plus de cette ma-

SUR LA R&ACTION AU PHIkOL

DE KUNKEL

r7

niere. On y wit en effet que la bande des ~-~poprot~ines est presqu’~app~ente tandis que la bande des /Hipoproteides t&s intense se situe entre les Q- et les p-globulines et qu’elle est suivie par une zone trbs color&e form&e par les chylomicrons. La perturbation observee en electrophorese bidimensionnelle s’explique a notre avis par la combinaison de deux facteurs : (a) La mobilite proportionnellement plus forte des /I-hpoproteides de la nephrose par rapport aux lipoproteides normaux, fait deja connu et signal6 par divers bioc~mistes7-ll. (b) Le ralentissement de la descente des molecules lipoproteidiques anormalement grosses sur le papier separateur. II en resuIte que le temps de descente de ces fractions qui semblaient con’espondre a la fraction /Slipoproteidique et aux chylomicrons, est augment6 et qu’elles se trouvent par consequent soumises plus longtemps au champ electrique avant d’atteindre la base du papier. Ce

Fig. 3. Comparaison de la descent0 sur le papier, en 4 h, au cows de l’dlectrophor&se, des fractions protidiques (& gauche) et lipidiques (a droite) d’un s&urn de nkphrose lipoidique t&s fortement hyperlipbmique.

processus de freinage mecanique dans le sens vertical vient alors favoriser la deviation horizontale de ces lipoproteides vers le pole +. Au contraire, dans l’electrophorese ordinaire, ce ralentissement mecanique de la migration est compense largement par une charge plus forte et au total la migration apparait relativement peu augmentee, par rapport aux lipoproteides du serum normal. Ces considerations peuvent &tre explicitees par l’experience suivante que nous avons realisee SW le m&me serum. Nous avons laisse l’electrophorese se faire pendant 4 h seulement, de telle faqon que les fractions n’atteignent pas la base du papier. Deux essais identiques ont et6 effectues dans les memes conditions de tension et d’intensite et les papiers separateurs ont alors &C developpks, l’un mettant en evidence les prot&ides, l’autre les lipides. On voit alors que les proteides descendent, en ce laps de temps, relativement bas, la serum-albumine atteignant un niveau plus has que l’ol,-globuline qui, elle-meme, va un peu plus has que la p- et la y-globuline. La limite inferieure de ces fractions forme alors un escalier caracteristique. Par contre, dans le m&me temps, les lipoprot&ides n’effectuent qu’un parcours vertical encore plus faible (environ la moitie de

IS

D. VINCEXT,

J. POLONOVSKI,

R. WALD

celui de la serum albuminc, mais la deviation dlectrophordtique est relativement forte et d&passe, vers le pole i, la limitc de deviation de la serum albumine. Cette zone est d’ailleurs visible sur lc diagramme proteidiquc h gauche et A la partie supericure de la serum albuminc, mais clle cst peu apparente a cause de la faible teneur en proteides dc cette lipoproteinc (Fig. 3). On peut voir aussi par l’intcnsitd de la tachc form& prcs du point d’arrivee du serum sur le papicr qu’unc partie des lipoproteides s’accroche au papier et ne descend qu’avcc une extreme lentcur. 2. 1-e 26mccas de nephrose Ctudid, qui se rapportait a une formc mixte, moins pure (femme de 4s ans, hospitalis& h l’H6pital de Purpan a Toulouse, dans la clinique medicale du Prof. MERIEL) Ctait un syndrome nephrotiquc avcc nephrite acccntuee: hypertension, lipiddmic a IS go/0,; cholcsterolemie a 3.8 g O/00;a, 27% dcs proteides totaux, la r6action de Kunkel-phenol Ctait d’intensite rclativement mod&&: 140 unites Yeunier (soit 70 \‘ernes ou I0 unites Maclagan). I>ans ce cas nous avons observe quc la zone de positivitd dc la reaction de Kunkel phenol ne s’etend quc tres legerement en avant de la serum albumine et jusqu’h la limitc ant6ricurc dcs /Iglobulines. Par rapport aux lipoproteides ellc correspond aux Z- et aux /3-lipoproteides avcc lc maximum d’intcnsitc’! pour cc‘s dcrnieres.

11 nous a et6 donnd d’observcr un cas de syndrome de Kahler dont Ic serum provoquait une tres forte turbidit au Kunkel-phenol, atteignant 1000 ou meme 2000 degrds Yleunier (soit joo-rooo degres Verncs ou 70 -140 unites Maclagan) ct parfois davantage selon les periodes d’evolution. 11 s’agissait d’unc femme dc 72 ans hospitalisee 21l’Hotel-Dieu de Toulouse (service du Prof. GADRAT). On observait dcs signes radiologiqucs osseux craniens, dc la plasmocytose sanguine et I’Clectrophoresc man trait unc trPs forte hypergamma globulinernie (42 :,A des proteides totaux). II n’y avait pas d’albuminurie de Bcncc Jones. 11 ne s’agissait done pas d’unc maladie dc Kahler absolumcnt typiquc. Lc syndrome biologique comportait : form01 gdlification positive, reaction a I’eau distillee nitgative, r&action dc Maclagan positive, reaction dc Kunkclzinc tres positive. Devant le trouble extremcment fort donnc’: par cc serum en presence de reactif au phdnol de Kunkel, nous avons vCrifiC qu’aucun trouble n’etait don& par la solution de NaCl a 12';;,concentration A laquclle se trouvc ce scl dans le reactif de Kunkcl-phenol. I1 s’agissait done bicn d’une reaction dc Kunkcl-phenol tres positive. J.a lipidernie pourtant rcstait sensiblement dans des limitcs normalcs: 8 g”/OO.La rdaction rcstait sensiblcment au meme degre dc positivite sur le serum d&lipid@. On doit done admettre que cctte reaction si intense Ctait due clans cc cas a l’hypergammaglobulinemic. L’clectrophori:se bidimcnsionnelle now a montre d’abord que la zone dc positivitc au Kunkel-phenol correspondait cxactcment a la bande intense dc ~-globulin-. Toutefois un cssai compl&mentaire a plus forte concentration de serum now a pcrmis de constater, en plus dc la zone de positivite avec grosse floculation, corrcspondant aux y-globulincs, dcus autres zones d’intensitd beaucoup plus faible (simple turbidite) qui corrcspondaient aux dcux bandes lipidiques tl et @ de ce serum (Fig. 4). On pcut done dire quc dans ce cas de syndrome de Kahler la trcs forte positivite dc la reaction phenoliquc dc Kunkel repondait cn t&s grandc part aux y-globulincs fait explicit6 par lcs resultats anormalcs et pour une faiblc part aux lipoprotiidcs, Clin. Chin!. Ada,

.5 (lqh)

X.1-21

SUR LA F&ACTION AU PHBNOL DE KUNKEL

=9

don&s par le s&urn delipide dont la turbidity au Kunkel ph&rol etait Egerement plus faible que celle du s&urn total. Ainsi doit-on signaler qu’en dehors des hyperlipoproteidemies la reaction phenolique de Kunkel peut &tre trb positive dans certaines hypergammaglobulinemies comme celle du syndrBme de Kahler signalee dans cette observation. Notons que

Fig. 4. Electrophor&e bidimensionn~~e d’un &rum de syndrame de Kahler hyper~amma~lobulin~mique (150 V; 5 mA). A gauche: mise en 6vidence des bandes protidiques. A droite: mise en tividence des bandes Iipidiques. Audessous: r&&tat de la reaction de Kunkel-phCno1 surles liquides de s6paration. En bas: 6lectrophorBse ordinaire du m&me s&urn avec mise en Evidence des bandes protidiques (en haut) et lipidiques (en bas). JAYLE ET BADIN~ ont observC une tres intense positivite de la reaction de Kunkelphenol dans un ~-my~lome alors qu’elle restait negative dans un y-myCbme.

Les quelques essais effectu& sur du s&urn de Poulet nous ont montre que la r4 action de Kunkel est positive dans deux zones dont l’une correspond auxlipoproteides principaux (CC),l’autre debordant targement sur les fi- et y-globulines. Toutefois la lipidernie &ant dam les s&urns analysb a 5 g Oiooenviron et la r&action de Kunkel &ant trouv6e extrCmement elevke (1400 Meunier, soit 700 Vernes ou approximativement IOO unites Maclagan) on doit admettre soit que les lipoproteides prCcipitant par le reactif phenolique sont relativement a faible teneur en lipides soit que des protcides non lies aux lipides sont entrain& dans cette precipitation. C’est cette deuxieme hypothese qui semble se vCrifier d’apres quelques essais complemenCEipt. Chint.A&, 5 (rp60)x4-21

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L). VINCEST,

J. POLONOVSKI,

R. WALL)

taires qui nous ont montrt! par des Gparations ClcctrophorCtiques plus larges que Itas zones dormant un trouble au reactif phCnolique ddbordent largttmcnt en dehors dt: la localisation dcs IipoprotCides dans la a6ne des 1/-globulincs, zones auxquelles elles nc se supctrposent que tr&s irrdguli&ment, faits que nous pr&iscrons tians de5 rechcrchei ultCricures, mais qui indiqucnt deja que clans le s&urn de Poulct la reaction dc Kunkcl d6jB signal& comme trCs fortement positive”> 6 nc r6pond pas exclusivement aux lip3 prot6idcs.

1-a r6action dr turbiditi: au phtinal de Kunkel r&pond A la prdcipitation dc toutcs lcs fractions lipoprot&diques cy ct 13du &rum. Dans la n6phrose on pcut observer h 1’Clectrophori:se bidimensionncllc unt: image 1ipoprotCidique particuli&e, ces fractions pouvant SC local&r en avant de la s&-urn albuminct, rlsultnnte d’un processus anormalement lent de descentc des grosses mol&cules 1ipoproti;idiques sur le papicr et d’une migration Clcctrophori:tiqutt rclati\.c>ment rapidc. La turbidit au rdactif pht%wliquc dc Kunkel pcut rPpondre non sculement aux lipoprot~idcs, mais aussi h de grosses mol6culcs globuliniques anormalcs comm:: on I’a co&at& clans un s&urn de syndrOmc de Kahlcr h~pcrgammaglobulin~miqu~.

Sous

cxprimons notre gratitude A Messieurs lcs Professeurs J. GADRAT ET 1’. k Ieurs collaborateurs de la l;acult@ de M&lecinc et des H Opitaux de ‘Tolllouse. qui nous ont obiigcammcnt confi4 Its s&urns CtudiCs ct nous ont apportti tous renscigncments cliniqws utiles. 17ERIEL ct

R6sultats esp&imentaux de sdparation dlectroptlor~tique continue sur papicr (apparcil Elphor V), la r&action au ph6nol dc Kunkel &ant pratiqude sur Ies liquides de separation cormspondant aux fractions prot&diques ct 1ipoprotGidiques reconnues par d6veloppcmcnt du papicr en fin d’espgrience. La turbidit au Kunkcl-ph&nol est donnCc par les fractions 1ipoprotMiqucs z aussi bien quc /S. Iln cas dc nkphrosc lipoi‘dique j trf3 forte hyperlipid6mie a permis quclques observations int&essantcs : la r&action ph
SCR

LA RkACTIOS

AU I’HkSOL

21

DE KI:SKEL

The results of a separation of the components of various samples of serum by means of paper electrophorcsis (Elphor V apparatus) are reported. Kunkel’s phenol reaction was applictl to the: liquids separated, which were identified as the protein and lipoprotein fractions by development on paper at the end of the expwimcnt. The zas well as the: fi-proteins cause turbidity with Kunkcl’s phenol reagent. A case of lipoid nephrosis accompaniccl by very severe hqperlipaemia supplied some interesting obscr\.ations: the phenol reaction is cspccially positive in one: of the leading zones on a level bvith and even in advance of the serum albumin and corresponding to a strong This is attributable to the greater mobility of the lipoprotein band poor in proteins. lipoproteins, already &scribed in ncphrosis, together with the slower mo\lcmcnt of large: lipid molcculcs along the paper in two-dimensional electrophoresis. The: cx- and $-lipoprotein fractions of Poulet’s strum, known for its positive reaction with Kunkcl’s phenol rcagcnt, give the same reaction but proteins also largely. Finally, a case of Kahler’s disease with very scvcrc hypergammaglobulinaemia is dcscribcd, which gives a \‘er): positive reaction with Kunkel’s phenol reagent. The lipoproteins cannot bc responsible for this reaction since it is still positive cvcn after removal of lipids and corresponds exactly to the y-globulin zone.

ET J. TRI;FFERT, Semaim 116p., j (rqj7j l3 163. RAYSAL.I), J. ROBERT ~‘IXsrrovcv~s ET II. I’.\sQ~;HT, Sewzaine ho^p., 30 (1954) 4065, ‘I I). Anr.I~sHI~KG, R. Boss.\K, I. SHER .4xD II. SOBOTKA, Clin. Chem., I (Igjj) 1833. D C;. IACRDE

lo R.

Clint. Chin,.

Ada, j

:x960) 11-21