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Séparation par électrochromatographie des fractions du sérum à pouvoir inhibiteur sur la trypsine
CLINICA CHIMICA ACTA
219
DES
SI?:PARATION PAR BI_E~TR~CHROMAT~GR_~PHIE Sl?RUM
R.
A POUVOIR
KIEKENS,
J.-P.
INHIBITEUR
GOVAERTS,
FRACTIONS
DU
SUR LA TRYPSINE*
P. WISSOCQ,
FR. GILLIS
ET H. GILLIS
Laboratoire de Chirurgie Expirrimentalr, H@ital Brugmann, Universite’ Libre de Bruxelles, Fondatic n Mdddicale Heine Elisabeth, Bruxelles (Belgique) (Rey
le 3 octobre,
1964)
SUMMARY
ElectrochromatograPhic
Separation
of Trypsin-Inhibiting
Serztm Fractions
In the serum of the dog, bidimensional electrochromatography separates two fractions, one inhibiting trypsin, the other binding the trypsin without inactivating the enzyme. The maximal inhibitory capacity is present in the a,-globulin fraction, a smaller inhibitory capacity being observed in the cr,-globulin fraction. The a3globulins bind trypsin without inactivating it.
L’utilisation clinique des inhibiteurs des proteases pancreatiques dans le traitement de la pancreatite a&u&, a suscite un renouveau d’intCr&t pour l’etude des inhibiteurs plasmatiques de ces enzymes. Mais Haverback et ~011.’ ont montre qu’il existe egalement, dans le serum humain, une cr,-globuline qui forme un complexe avec les enzymes proteolytiques sans les inactiver. Nous avons &pare, dans le serum de chien, d’une part, les fractions inhibitrices de la trypsine et, d’autre part, celle qui se lie a la trypsine sans l’inactiver. MJ?THODES
L’dectrophorBse horizontale (type Grassman et Hannig) est faite sur papier Whatman 3 MM, dans un tampon compose de Tris, EDTA et acide borique a PH 8.4 (Goa%), pendant 44 h avec une tension de 7.7 V/cm. Les proteines sont colorees par l’amidoschwarz IO B 3. L’dectrochromatographie est realisee a une temperature de 4’ sur un appareil de Peeters et ~011.~9 5 avec le mCme tampon de Goa mais dilue (2 vol. tampon-3 vol. eau). L’amperage est fix6 a 14 mA, ce qui donne 650 V pour un papier Whatman 3 MM de 22 cm de longueur et 30 cm de largeur.
* Travail r&list5 avec l’aide du Fonds de la Recherche Scientifique MBdicale. Clin. Chim. Acta, 12 (1965) zIg-zzz
220
I<. 1<11:1<1:ss
et al.
On applique le sorum ou la solution de trypsine a raison d(~ ; 05 i 1);” hem-e. en stirum ou en En j Ii, le debit total cst de 330 1. Xpres l’arret de l’alimcntation trypsine, l’elution rst poursuivie pendant 7 h. Cette elution n’est ccpcndant pas quantitative. Le volume total de liquide recueilli rst de :.~ 3X ml, rCpartis assc’x uniformement
dans lcs differents
l’amidoschwarz
Dans
tubes.
.A la fin de l’csperience,
lc papicr
cst color-6 par
IO H.
lcs eluats,
la trypsine
est do&e par la methode
de Lundhfi
qui utilise
comme substrat le benzoyl-L-arginin-ethylester (HAEE). Pour la mesurc du fx~uvoir inhibitew de la tryfz&e, le \rolume de chacun des dluats est amen& a 4 ml dont 0.05 ml sont mis en presence de IO ,~g de trypsine durant 30 min a zoo. La trypsine non inhibee est dosire au BAIZE.
I. L’dect~ophortke des prote’ines se’viqztes L’electrophor&e des proteines seriques montre la presence de trois ct-globulines et de deux P-globulines, tant en electrophorese horizontale qu’en electrochromatographie bidimensionnelle (Fig. I). Clin.
Chim.
Acta,
IL (1965)
rrg-zzr
BLECTROCHR~MAT~GRAPHIE
2.
Localisation
de l’inhibitew
DE
~CRUM
221
de la trypsine
11 existe une inhibition maximale dans la zone des a,-globulines. Dans les conditions de la mesure, une inhibition de 30 a 60% est notee dans les tubes 6 a 7. Dans la zone des a,-globulines (tubes 8 a g), une inactivation plus faible est observde (IO St 20%).
3. &ectrochromatographie
de la trypsine (20,000 ,ug/ml). La Trypure Novo (trypsine I fois cristallide) migre principalement vers la cathode (Fig. 2). L’etalement est important (tubes 14 a 23) mais, seuls, les tubes 19 A 22 contiennent de grandes quantites d’enzyme. - trypsine pure ---- serum+trypslne b ser”m+trypslne
20.000 pg/ml 2,000 pg/ml
tryps1ne %
trypsme
i
pg/ml
200 175 150I 125 100 75 !
No’
des tubes
Fig. 2. filectrochromatographie de trypsine et de s&urn + trypsine. RBpartition de la trypsine dans les Bluats en % de la quantit6 totale de trypsine recueillie (a) et en ,ug/ml (b).
4. i?lectrochromatographie
de s&Mm addition& de trypsine (Fig. 2) Quand on soumet a l’electrochromatographie du serum addition& de 2,000 ,ug/ml de trypsine, on observe une activite trypsinique, d’une part, dans les tubes 7 a 14 et, d’autre part, dans les tubes 18 a 21. Le maximum d’activite est observe dans les tubes II 8.13, c’est-a-dire dans la zone des a,-globulines. Du cbtC cathodique, on ne trouve que des faibles quantites de trypsine. Lorsque la quantite de trypsine ajoutee au serum est plus grande (20,000 pug /ml), on retrouve dans la zone des a,-globulines, une quantite de trypsine comparable a celle de l’experience pr&:Cdente mais le taux de trypsine du c&C cathodique est eleve.
5. I?lectrochronzatographie du st+um. Activation des &ats par la streptokinase Lorsqu’on soumet 0.2 ml de chaque Cluat a une activation prealable par 1,000 U. de streptokinase (5 min a 37’), aucune des fractions n’hydrolyse le BAEE. C&n. Chim. Acta,
IZ (1965)
zrg--222
Dans le s&urn de chien, nous avons, comme d’autres auteurs7yH, +par@, tant par 1’6lectrophor6se horizontale que par 1’4lectrochromatographie bidimensionnelle, trois a-globulines et deux /I-globulines. Comme l’avaient observP Jacobsson ct Haverback] dans le s&urn humain, nous trouvons, chez le chien, deux fractions inhibitrices de la trypsine:
l’une,
importante,
est dans la zone des a,-globulines,
faible, est dans la zone des cr,-globulines. La trypsine seule migre vers la cathode.
Lorsque
la trypsine
l’autrc,
plus
est m6lang4e
& du
s&urn, une activitt’: trypsinique est observke B la fois dans la zone des cr,-globulines et du c&6 cathodique. A\-cc les deux concentrations de trypsine utilis&s, l’activite trypsinique dans la zone des a,-globulines est comparable. Pour des concentrations de 2,000 pg/ml, seules des traces dc trypsine sont retrouv&es du c6tG cathodique alors qu’aux concentrations de 20,000 pug/ml, il persiste unc activite trypsiniqut importante du c6t@ cathodique. L’hydrolysc du substrat (RAEE)
dans la zone des cr,-globulines
bablement due i la trypsine et non j l’activation, s&urn, le plasminogkne par esemplc. En effet, aucune
hydrolyse
du RAEE
tokinase. Nous pouvons
ne SC produit
done conclure
est tl-6s pro-
par la trypsinc, de proenzymes du dans les conditions de la mesurc,
apr&s activation
du s&-urn par la strcp-
que, chez le chien, commc chez l’hommc,
Its in-
hibiteurs de la trypsine m&rent avec lcs CI~-et a,-globulines. Mais, chez le chien, les protitines qui lient la trypsinr, sans l’inactiver, m&rent avec les a:,-globulines. Chez l’hommc, Haverback ct ~011.1ont trouv6 cette propriM dans la zone des x,-globulincs. Toutcfois, dans le s&-urn humain, l’&ctrophor&sc ne &pare couramment qw deus a-globulines.
L’6lectrochromatographie permet la Gparation, dans le s&-urn de chien, dc trois a-globulines. Les inhibiteurs de la trypsine migrent avec les x1- et a,-globulines; les cr,-globulines
lient la trypsine
saw inactiver
l’enzyme.
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DES
SI?:PARATION PAR BI_E~TR~CHROMAT~GR_~PHIE Sl?RUM
R.
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KIEKENS,
J.-P.
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GOVAERTS,
FRACTIONS
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SUR LA TRYPSINE*
P. WISSOCQ,
FR. GILLIS
ET H. GILLIS
Laboratoire de Chirurgie Expirrimentalr, H@ital Brugmann, Universite’ Libre de Bruxelles, Fondatic n Mdddicale Heine Elisabeth, Bruxelles (Belgique) (Rey
le 3 octobre,
1964)
SUMMARY
ElectrochromatograPhic
Separation
of Trypsin-Inhibiting
Serztm Fractions
In the serum of the dog, bidimensional electrochromatography separates two fractions, one inhibiting trypsin, the other binding the trypsin without inactivating the enzyme. The maximal inhibitory capacity is present in the a,-globulin fraction, a smaller inhibitory capacity being observed in the cr,-globulin fraction. The a3globulins bind trypsin without inactivating it.
L’utilisation clinique des inhibiteurs des proteases pancreatiques dans le traitement de la pancreatite a&u&, a suscite un renouveau d’intCr&t pour l’etude des inhibiteurs plasmatiques de ces enzymes. Mais Haverback et ~011.’ ont montre qu’il existe egalement, dans le serum humain, une cr,-globuline qui forme un complexe avec les enzymes proteolytiques sans les inactiver. Nous avons &pare, dans le serum de chien, d’une part, les fractions inhibitrices de la trypsine et, d’autre part, celle qui se lie a la trypsine sans l’inactiver. MJ?THODES
L’dectrophorBse horizontale (type Grassman et Hannig) est faite sur papier Whatman 3 MM, dans un tampon compose de Tris, EDTA et acide borique a PH 8.4 (Goa%), pendant 44 h avec une tension de 7.7 V/cm. Les proteines sont colorees par l’amidoschwarz IO B 3. L’dectrochromatographie est realisee a une temperature de 4’ sur un appareil de Peeters et ~011.~9 5 avec le mCme tampon de Goa mais dilue (2 vol. tampon-3 vol. eau). L’amperage est fix6 a 14 mA, ce qui donne 650 V pour un papier Whatman 3 MM de 22 cm de longueur et 30 cm de largeur.
* Travail r&list5 avec l’aide du Fonds de la Recherche Scientifique MBdicale. Clin. Chim. Acta, 12 (1965) zIg-zzz
220
I<. 1<11:1<1:ss
et al.
On applique le sorum ou la solution de trypsine a raison d(~ ; 05 i 1);” hem-e. en stirum ou en En j Ii, le debit total cst de 330 1. Xpres l’arret de l’alimcntation trypsine, l’elution rst poursuivie pendant 7 h. Cette elution n’est ccpcndant pas quantitative. Le volume total de liquide recueilli rst de :.~ 3X ml, rCpartis assc’x uniformement
dans lcs differents
l’amidoschwarz
Dans
tubes.
.A la fin de l’csperience,
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cst color-6 par
IO H.
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est do&e par la methode
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qui utilise
comme substrat le benzoyl-L-arginin-ethylester (HAEE). Pour la mesurc du fx~uvoir inhibitew de la tryfz&e, le \rolume de chacun des dluats est amen& a 4 ml dont 0.05 ml sont mis en presence de IO ,~g de trypsine durant 30 min a zoo. La trypsine non inhibee est dosire au BAIZE.
I. L’dect~ophortke des prote’ines se’viqztes L’electrophor&e des proteines seriques montre la presence de trois ct-globulines et de deux P-globulines, tant en electrophorese horizontale qu’en electrochromatographie bidimensionnelle (Fig. I). Clin.
Chim.
Acta,
IL (1965)
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BLECTROCHR~MAT~GRAPHIE
2.
Localisation
de l’inhibitew
DE
~CRUM
221
de la trypsine
11 existe une inhibition maximale dans la zone des a,-globulines. Dans les conditions de la mesure, une inhibition de 30 a 60% est notee dans les tubes 6 a 7. Dans la zone des a,-globulines (tubes 8 a g), une inactivation plus faible est observde (IO St 20%).
3. &ectrochromatographie
de la trypsine (20,000 ,ug/ml). La Trypure Novo (trypsine I fois cristallide) migre principalement vers la cathode (Fig. 2). L’etalement est important (tubes 14 a 23) mais, seuls, les tubes 19 A 22 contiennent de grandes quantites d’enzyme. - trypsine pure ---- serum+trypslne b ser”m+trypslne
20.000 pg/ml 2,000 pg/ml
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Fig. 2. filectrochromatographie de trypsine et de s&urn + trypsine. RBpartition de la trypsine dans les Bluats en % de la quantit6 totale de trypsine recueillie (a) et en ,ug/ml (b).
4. i?lectrochromatographie
de s&Mm addition& de trypsine (Fig. 2) Quand on soumet a l’electrochromatographie du serum addition& de 2,000 ,ug/ml de trypsine, on observe une activite trypsinique, d’une part, dans les tubes 7 a 14 et, d’autre part, dans les tubes 18 a 21. Le maximum d’activite est observe dans les tubes II 8.13, c’est-a-dire dans la zone des a,-globulines. Du cbtC cathodique, on ne trouve que des faibles quantites de trypsine. Lorsque la quantite de trypsine ajoutee au serum est plus grande (20,000 pug /ml), on retrouve dans la zone des a,-globulines, une quantite de trypsine comparable a celle de l’experience pr&:Cdente mais le taux de trypsine du c&C cathodique est eleve.
5. I?lectrochronzatographie du st+um. Activation des &ats par la streptokinase Lorsqu’on soumet 0.2 ml de chaque Cluat a une activation prealable par 1,000 U. de streptokinase (5 min a 37’), aucune des fractions n’hydrolyse le BAEE. C&n. Chim. Acta,
IZ (1965)
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Dans le s&urn de chien, nous avons, comme d’autres auteurs7yH, +par@, tant par 1’6lectrophor6se horizontale que par 1’4lectrochromatographie bidimensionnelle, trois a-globulines et deux /I-globulines. Comme l’avaient observP Jacobsson ct Haverback] dans le s&urn humain, nous trouvons, chez le chien, deux fractions inhibitrices de la trypsine:
l’une,
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est dans la zone des a,-globulines,
faible, est dans la zone des cr,-globulines. La trypsine seule migre vers la cathode.
Lorsque
la trypsine
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plus
est m6lang4e
& du
s&urn, une activitt’: trypsinique est observke B la fois dans la zone des cr,-globulines et du c&6 cathodique. A\-cc les deux concentrations de trypsine utilis&s, l’activite trypsinique dans la zone des a,-globulines est comparable. Pour des concentrations de 2,000 pg/ml, seules des traces dc trypsine sont retrouv&es du c6tG cathodique alors qu’aux concentrations de 20,000 pug/ml, il persiste unc activite trypsiniqut importante du c6t@ cathodique. L’hydrolysc du substrat (RAEE)
dans la zone des cr,-globulines
bablement due i la trypsine et non j l’activation, s&urn, le plasminogkne par esemplc. En effet, aucune
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du RAEE
tokinase. Nous pouvons
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par la trypsinc, de proenzymes du dans les conditions de la mesurc,
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que, chez le chien, commc chez l’hommc,
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hibiteurs de la trypsine m&rent avec lcs CI~-et a,-globulines. Mais, chez le chien, les protitines qui lient la trypsinr, sans l’inactiver, m&rent avec les a:,-globulines. Chez l’hommc, Haverback ct ~011.1ont trouv6 cette propriM dans la zone des x,-globulincs. Toutcfois, dans le s&-urn humain, l’&ctrophor&sc ne &pare couramment qw deus a-globulines.
L’6lectrochromatographie permet la Gparation, dans le s&-urn de chien, dc trois a-globulines. Les inhibiteurs de la trypsine migrent avec les x1- et a,-globulines; les cr,-globulines
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