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Sur le role du calcium pendant l'activation du trypsinogéne par la trypsine
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BIOCHEMISTRY
AND
BIOPHYSICS
69, 475-485
(1957)
Sur le Role du Calcium pendant 1’Activation du Trypsinoghne par la Trypsine P. Desnuelle et C. Gabeloteau Laboratoire
de Chimie Riologique-FacultC Sciences Marseille (France)
des
Received January 8, 1957 Kunitz a montre depuis quclques annees yue les ions calcium influent de faGon tres sensible sur l’activation autocatalytique du trypsinogene. En presence de ces ions, la conversion trypsinogene-trypsine est a la fois rapide et quantitative (1). En leur absence par contre, l’activite trypsique apparait lent.ement,. Une partic du precurseur donne naissance a dcs proteines inactives et incapables de s’activer que Kunitz appelle “prot&es inertes” (2). Le probleme consiste a chcrcher comment agit le calcium et en quoi la structure des proteines inertes diffbre de celle de la trypsine active. Quelques travaux ¢s consacres au mecanisme de l’activation du trypsinogene (3-5) permettent d’ailleurs de poser cc probleme en termes plus p&is. On sait en efkt que le trypsinogene contient, vraisemblablement une chainc “ouvcrte” et que son activation va de pair avec la rupture de la sixieme liaison (liaison lysyl-isoleucine) en partant do l’cxtremite X-terminale de la chaine. Cette rupture provoque l’ablation de la sequence N-terminale, laquelle apparait dans le melange d’activation sous la forme d’un hexapeptide Val(Asp)dLys. I1 convient alors de se demander si les proteines inertcs de Kunitz ont ou non perdu l’hexapeptide en question. Dans l’afirmat,ive, on pourrait penser que la liaison lysyl-isoleucine est coupee aussi bien en l’absence qu’en presence de calcium. hlais, en l’absencc de calcium, we partie de la trypsine form& se desactiverait grace ;I la rupture de certaines liaisons supplementaires. Cctte premiere hypothbe esb conforme aux theories classiques concernant l’autolysc de la trypsine et, dc fac;on plus gemkale, au role dc protection que 1’011attribue au calcium pendant la prot,eolyse trypsique des proteines. Elle imite d’autre part 8. etudicr ulterieurement la nature 475
ct, la position des liaisons dent, la rupture provoque l’inactivation de la trypsine. L’hypothbse inverse n’interdit d’ailleurs pas de penser que la presence du calcium kite certaines ruptures defavorables a l’activation. Mais elle nous oblige en outre a admettre que l’ion favorise la rupture de la liaison lysyl-isoleucine. Une telle hypothese est done intkessante, non seulement parce qu’elle fait jouer au calcium deux roles opposes (un rOle protecteur et un Ale promoteur) au tours de la protkolyse d’une m6me proteine, mais aussi parce qu’elle permet de localiser le r61e promotcur au niveau d’une liaison peptidique bicn determinee. TECHNIQUES
Le trypsinogene commercial dont now disposions (1 fois cristallise) contenait environ 13% de trypsine et des quantites t&s notables de peptides. Considerant que la recristallisation d’un tel produit Btait une entreprise hasardeuse (6), nous I’avons simplement debarrasse de ses peptides par dialyse et de la majeure partie de son activite trypsique par un traitement prealable avec du diisopropylfluorophosphate (DFP). 2 g de trypsinogene commercial contenant 62’% de SONg2 sont dissous dans 40 ml d’eau. On ajoute B la solution 20 fois la quantite stoechiometrique de DFP (calculee & partir de la trypsine presente), puis 40 ml d’un tampon borate 0.4M pH 8,O a 0”. Apres 4 h. a 0”, on precipite les proteines dans SOdAm 0.7 S, on dialyse lcur solution aqueuse contre HCI low3 K pendant 40 h. et on lyophilise. Rendement : 640 mg de trypsinogene contenant encore 2% de trypsine active et 11% de diisopropylphosphoryltrypsine. Les 87% restants sont totalement activables par la trypsine en presence de calcium. 11s representent done du trypsinogene pm.
Activation L’activation est realisee en ajoutant la quantite voulue de trypsine a une solution’ de Ia preparation precedent,e dans du tampon borate 0.05M pH 7.8 a 0”. Pendant les activations en presence de calcium, In solution contient CaCl? S la concentration 5 X 10U2 M. La reaction est arretee au bout, d’un temps determine en abaissant le pH a 2 par addition de HCI IrT. L’activite trypsique est mesuree par titrimetrie avec le benzoylarginine ethylester comme sub&rat (3). Les pourcentages d’activation sont mesures b partir de la teneur rcelle en trypsinogene des preparations.
Chromatograpkie La plupart des conclusions d’activation du trypsinogene
du p&sent travail sont tirees en comparant le degrci et la quantite de l’hexapeptide Val(Asp)cLys lib&e
1 Cette solution contient generalement 1.33% de trypsinogene activable. n’en contient que 0.065% au tours des experiences concernant la determination extremites N-terminales des proteines inertes.
Elle ties
CALCIUM ET L'ACTIVATIOS
DU TRYPSISOGhk:
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pendant l’activation. La separation chromatographique du peptide et sa determination quantitative doivent dorm &tre faites tres soigneusement. La technique utilisee est analogue a celle de Duvic et Keurath (4). La colonnc de Dowex 50 x 2 toutefois a une longueur double (60 au lieu de 30 cm) car les mClanges de peptides form&pendant les activations saris calcium sont notablement pluscomplexesqu’en presence de calcium. Lc liquide d’elution est un tampon citrate O.l;\l a pII 4.0 addition& au moment de l’emploi de 1% de BRIJ-35 a 33%. Lc d6bit de la colonne est regh? a 4 ml/h. Chaque fraction est de 1 ml. En gCnCra1, une fraction sur quatre est traitbe par la ninhydrinc en prCsence de chlorure stanncux (8). Les ddterminations colorimetriqucs permettcnt ainsi de tracer un diagrumme approximatif et de localiser la position du pit de l’hexapeptide. La forme de ce pit est ensuite precisee en effectuant sur des fractions intermediaires nutant de dosages qu’il cst necessaire. L’equivalent-leucine de l’hexapeptide Val(Asp)&ys a et6 trouv6 Bgal h. 1.75. La purete du pit de l’hexapeptidc a et6 verifiee dans chaque cas en prblevant une fraction au sommet et deux fractions dans les branches ascendante et descendante (7). Les trois fractions ont et6 dessalees par echange de Ieurs ions avcc ceux de I’acetate d’ammonium sur uric petite colonne de Donex 50 X 2 forme NH’+ puis elles ont 6th CtudiCes sur papier avant et aprbs hydrolyse. Lc pit n’a Cte declare pur et par consequent le dosage n’a et6 consider6 comme significstif qu’a la condition que les trois fractions donnent avant hydrolyse une seule tache (ou tout au moins une tache t&s largemcnt predominante) dans le syst6mc butanolacide formique-eau (4~1:5)~ et, apr& hydrolysc acide, Its trois seules taches uttenducs de valine, d’acide aspartique et de Iysinc dans lc rapport stoechiometriquc convenable. I~ESULTATS EXPERIYESTAUX
Activation du trypsinogh
en prdsence et en l’absence de calcium
Les courbes de la fig. 1 permettent de juger I’effet du calcium sur l’activation du trypsinogene et I’autolyse de la trypsine. Elles confirmcnt. et precisent t&s notablement les rbultat,s obtenus par d’autrcs auteurs (1,2,9-11). Les commentaires suivants peuvent 6tre faits a propos de ces courbcs: a. L’effet accekateur exerce par le calcium sur I’activation du trypsinogene apparait avec une nettctk particuliere quand on compare les courbes II et III: 2.3% de trypsine aver: calcium activent plus vite le trypsinogene que 19.6 % de trypsine saris calcium. Etant don& la forme exponentielle des courbes, il est assez difficile d’exprimer cette acceldration par un chiffre precis sans proceder a un calcul de cinetiquc. Mais on * Dana ce systeme et avec le papier Whatman no 1, l’hexapeptide VaI(Asp),Lys migre comme la lysine ou un peu plus lentement. Par revelation B la ninhydrinc en solution a 0.2% dans I’acetone, il donne une coloration violette rclativement faible.
roit ai&ment que le calcium augment.e plus de 10 fois la vitesse de l’a,c~tivation. b. En outre, les courbes du diagramme infkrieur de la fig. 1 moutrent que l’activation est incompkte quand on omet, d’ajouter du calcium. Heures 0 * ‘Cli
100 - ==-o--+ +--+,,_
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30 20 Heures FIG. 1. Activation du trypsinoghe et autolyse de ILL trypsinc en prhence ou en l’absence de calcium. O-O : expdriences avec calcium. -t-t: rxphicnces saris calcium. Diq~o~t~tric~ infhieur: actioation du trypsinogkns. Concentration initiale du prkcurseur 1.33%. Temp. 0” pH 7.8. Courbes I et II: activation dans CnC12 5 X IO-” M par 19.6 et 2.3% de trypsine, rcspect’ivement, Courbes III, IV et V: activation saris calcium par 18.6, 7.3 et 2.3% de trypaine. respectivement. Courbe VI: activation dans le vcrshc 1OP M par 19.6’% dc trypsine. Diagramme supbrieur: inactivation de la trypsine par autolyse. Courbc VII: danh CaClz 5 X 10v2 M (concentration initiale de Ia trypsine: 0.450Jo) Courbes VI11 et IX: saris calcium (concentration initiale de la trppsine: 0.13 et 0.45%, respectivtlment) Courbe X: dans le vershe 1OP M (concentration initiale de 1:~ trypsinr: 0.45%). 10
CALCIUM
ET
L’ACTIVATION
DU
TRYPSINOGhNE
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Chose curieuse, les courbes relatives % ce mode d’activation (courbes III a VI) convergent toutes vers une limite commune, independante de la quantite de trypsine utilisee et correspondant & la formation d’environ 50% d’enzyme. En presence de calcium au contraire (courbes I et II), 1 mole de precurseur acquiert une activite egale a celle de 1 mole de trypsine cristallisee (activation : 100%). c. Le caractkre incomplet de l’activation sans calcium ne semble pas resulter d’une autolyse progressive de la trypsine formee. Les courbes VIII et IX de la fig. 1 nous apprennent en effet que la trypsine perd a peu pres lo-15 % de son activite en I’absence de calcium dans nos conditions exp&imentales.3 Cette perte leg&e est incapable d’expliquer a elle seule le deficit d’environ 50% precedemment constate. 11est done vraisemblable que les protkines inertes de Kunitz se forment, non pas a partir de la trypsine par un processus ulterieur de d&activation, mais bien directement a partir du trypsinogene. Une experience encore plus demonstrative va d’ailleurs le confirmer bient&. d. Le fait de ne pas ajouter de calcium aux melanges d’activation ne signifie pas que ces melanges en soient completement depourvus. Afin d’eliminer les ions preexistants, nous avons done effectue quelques experiences avec du versene a la concentration lOA M. Ce reactif, comme il est d’ailleurs bien connu (12)) accelbre de fapon tres sensible l’autolyse de la trypsine (courbe X). Mais il est sans action sur le phenomene d’activation. La courbe VI relative B l’activation du trypsinogene en presence de versene tend d’abord vers la limite habituelle de 50 %. Puis, elle s’inf&hit vers le bas a cause de l’autolyse anormalement rapide de la trypsine formBe. Contrairement a ce qu’on aurait pu penser, le versene ne favorise done pas la formation des proteines inertes aux d&pens de celle de la trypsine. Lib&ration de l’hexapeptide en prdsence et en Z’absence de calcium
3.6 pmole de trypsinogene en solution a 1.33 740 pH 7.8 et 0” sont activees par la trypsine. Au bout du temps voulu, une partie aliquote du melange est p&levee pour une mesure d’activite et le reste est immklia3 L’autolyse de la trypsine est d’autant plus rapide que Ies solutions de cet enzyme sont plus concentrhes. Pour que les exphiences d’autolyse et d’activation fournissent des rhultats comparatifs, il est done nhessaire que la concentration de la trypsine soit analogue dans les deux oas. Pendant l’activation du trypsinogene sans calcium, cette concentration passe de 0.0 h 0.6ojo. La concentration initiale de la trypsine au cows de I’autolyse est 0.2% (courbe VIII) et 0.4570 (courbe IX).
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DESNUELLE
AND
1
GABELOTEAU
n
i0 ml &at FIG. 2. Chromatographie des peptides pendant I’activation du trypsinoghne avec ou sans calcium. Colonne (60 x 0.9 cm) de Dowex 50 x 2 250-450 mailles Bluke par un tampon citrate 0.1 M & pH 4.0. Temp. 25”. DBbit de la colonne: 4 ml/h. Volume des fractions: 1 ml. Diagramme du bus: Activation du trypsinoghne par 2.3y0 de trypsine a 0” pH 7.8 dans CaClz 5 X 10-Z M. Diagramme du haut: Activation du trypsinogbne par 19.6% de trypsine & 0” pH 7.8 sans addition d’ions calcium. 0
50
100
tement amen6 A pH 2 par KC1 N et chromatographik comme indiqu6 plus haut.4 La fig. 2 reproduit deux diagrammes caractkristiques. Le diagramme du bas est relatif A une activation de Ah. par 2.3 % de trypsine dans CaC12 5 X 1OP M et le diagramme du haut, & une activation de 2h.1/2 par 19.6% de tzypsinej saris addition de calcium. En examinant la fig. 2 on voit que les deux diagrammes possPdent un 4 La partie protbique des mklanges ne &ne pas car elle est tr&s fortement adsorb6e sur le Dowex-50 X 2. Elle est Clube aprits I’oprkation au moment du lnvage de la rksine par NaOH 0.2 T’u’. 6 Quand les activations sans calcium durent trop longtemps, des rbactiona secondaires se produisent, le melange peptidique est t’r&s complexe et le pit de l’hexapeptide Val(Asp)4Lys ne peut plus Btre ohknu B l’etat pur. Anssi avons-nous ut,ilis& des quantitks de trypsine relativement fort,es afin d’acc&&-er le ph6nom8ne duns toute la mesure du possible.
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ET
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DU
TRYPSINOGhE
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pit principal sit& au m&me endroit (115-120 ml d’eluat) . Les tests d&its plus haut indiquent que ce pit est pur dans les deux CBSet qu’il correspond a l’hexapeptide Val(Asp),Lys. Pendant l’activation en presence de calcium, 1 mole de trypsinogbne pesant 25,000 g a don& 0.79 mole de trypsine et 0.89 mole d’hexapeptide. Deux experiences en l’absence de calcium ont donne 0.27-0.28 mole de trypsine et 0.33W.32 mole de peptide pour 1 mole de precurseur. Une relation stoechiometrique entre la trypsine formee et I’hexapeptide lib&e a deja Bte notee par Davie et Neurath (4) pendant l’activation du trypsinogene en presence de calcium. Elle constitue d’ailleurs le meilleur argument en faveur du role determinant joue par I’ablation du peptide pendant I’activation. Nous trouvons que cette relation existe egalement dans les circonstances particulieres de l’activation sans calcium. Un tel resultat confirme de faGon particulierement demonstrative que les proteines inertes sont engendrees directement a pa&r du trypsinogene par une reaction independante de celle de l’activation. Cette reaction n’implique pasl’ablation de l’hexapeptide et par consequent la rupture de la liaison lysyl-isoleutine. 11 est d’ailleurs interessant de constater que la rupture de la liaison lysyl-isoleucine ne se produit pas au sein des proteines inertes, m&me quand ces proteines sont ulterieurement traitees par la trypsine en presence de calcium. Du trypsinogene est active a 0” et pH 7.8 par 7.3 % de trypsine pendant 20h. sans calcium. La courbe IV de la fig. 1 nous apprend que la limite de l’activation est alors atteinte et que le melange obtenu contient a peu prb 50 % de trypsine et 50 % de proteines inertes. Ce melange est addition& Q 0’ et pH 7.9 de 20 mole de diisopropylfluorophosphate pour inactiver la trypsine formee. I1 est dialyse pendant 48h. B 4” contre HCl 10T3 M pour &miner les peptides et il est lyophilise. I1 est enfin trait6 b 0” et pH 7.8 par 3.6 Yo de trypsine pendant 4h., en presence cette fois de CaClz 5 X 10v2 M. Aucune trace d’hexapeptide ne peut &tre decelee par chromatographie. Pendant sa transformation en proteines inertes, le trypsinogene a done subi des modifications irreversibles de structure qui rendent impossible la rupture ulterieure de la liaison lysyl-isoleucine, m&me dans les conditions favorables de l’activation avec calcium. Rdsidus N-terminaux
des prot4ine.s inertes
La g&&se des prot&nes inertes est bien moins importante sur le plan general que la g&&se de la trypsine. Elle n’est cependant pas depourvue 6Exp&iences correspondant aux diagrammes de la fig. 2.
1s”
I~ESMJELLE
ASD
G.\BKLOTE.iT
d’int&?t car les r&actions qu’elle impliyue font perdre au trypsinogtinc sa caract6ristique essentielle, c’est & dire son aptitude B l’activation. Nous en avons abordi! 1’6tude par la technique habituelle de d&ermination des r6sidus X-krminaux. ;Ipr& avoir active du trypsinoghne en prksence ou en l’absence de (calcium, la part’ie prot&que des m6langes a 6th prkipitke par l’acidr trichlora&ique et le pr6cipit6 a 6th condens avec le fluorodinitroben&w (I:<). Les dinitrophknyl protkines (DIG’-protkines) ont Bt6 soigneusement lavt?es afin d’assurer une Blimination aussi compl&te que possible des DKP-peptides, puis elles ont Bt6 hydrolys6es par HCI 5.6 N. Dans le cas de I’activation avec calcium, on trouve, comme p&vu, beaucoup de DPN-isoleucine (0.9 mole) qui correspond au r&sidu K-terminal de la trypsine (3), et un peu de DKP-valine (0.1 mole) qui provient’, soit du trypsinogkne restant (3), soit d’une trace d’hexapeptide ayant 6chapph aux operations de purification. Mais, dans le cas de l’activation saw calcium, on trouve 0.5 mole de 3 DNP-amino acides &h&o-solubles: 1:i 1)X1’-isoleucine, la DNP-valine et’ la DNP-shrine. L’isoleucine N-tcrminalr appartient sans dout’e ?I la fraction de trypsine formhe en l’absencr de calcium. Les deux autres residus N-terminaux, c’est 21dire la vatline clt In s&ine, peuvent par contre &tre attribu& aux protdines inertes. Or, la valinr ne semble pas reprdsenter au sein de ccs proSines un r@sidu S-tw minal nouveau. Elle exist’e d&j& dans le trypsinogitne et on sait, clue 13 conversion trypsinogPne-protkines inertes (qui n’implique pas le d&art du pepMe Val(Asp)rLys) ne la fait pas disparaitre. Reste done la s@riw dont la prdsence en position N-terminale est saris doute une cons6quenc~ dire&e de la conversion. Les DXP-amino acides hydrosolubles et instables n’ont pas encow fait I’objet d’une &ude spkiale. Les rkltats p&&dents sont done pr6liminaires. Mais le fait de trouver, quelle que soit’ la durde de l’activatiol\ sans calrium, un seul r6sidu K-terminal nouveau dans la fraction 6th&soluble, suggke dk maintenant que la conversion kypsinogkne-prot&tw inertes est un phknomkne prot’kolytique et, que cette protkolyse cst, rc4atirement simple. D1scuss10x
La formation des proteines inertes et celle des n&ochymotrypsinog&nw (14) semblent p&enter certaines analogies et certaines diff krenccs q u ‘i I est inGressant de discuter tout d’abord bri+vement. Dans un cas conmw dans l’autre, nous voyons que le prkurseur (trypsinogtine ou cshynlotryp
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DU
TRYPSINOGhNE
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sinogbne) est active par la rupture d’une liaison d&erminee et, inversement, que la rupture d’une ou plusieurs autres liaisons ne provoque pas l’activation. Mais les neochymotrypsinogenes sont encore activables alors que les proteines inertes de Kunitz ne le sont plus. En outre, des diffkrences fondamentales apparaissent dans le mkanisme intime des deux phenomenes. Pour le chymotrypsinogene, la rupture activante et les ruptures non-activantes sont effectuees par deux enzymes (trypsine et chymotrypsine) dont la specificit n’est pas la m&me. On comprend done assezaisement que l’un des enzymes attaque le precurseur dans une region privilkgiee et favorable %l’activation et que l’attaque de l’autre seproduise ailleurs, dans une region defavorable. Pour le trypsinogene, au contraire, la trypsine est capable d’effectuer la rupture favorable et les ruptures defavorables, le seul element directeur &ant la presence ou l’absence de calcium. Le fait que l’activation du trypsinogene soit quantitative en presence de calcium signifie selon toute vraisemblance que cet ion s’unit reversiblement au precurseur (Tg) pour donner un complexe (TgCa) et que ce complexe est integralement converti en trypsine. Nous nous trouvons done avec le trypsinogene dans une situation analogue a celle de la trypsine et les m&meshypotheses peuvent Ctre formulees dans les deux cas. Ou bien (9, 10) la forme TgCa est simplement en Bquilibre avec la forme Tg, TgCa donne la trypsine (T) et Tg donne T et des proteines inertes (Pi) Tg + Ca i+ TgCa I(\ 1 T T Pi Ou bien (11) , le trypsinogbne se trouve lui-m&me sous deux formes, l’une activable (Tg,) et l’autre non-activable (Tgi) et ces deux formes se combinent reversiblement avec le calcium pour donner TgCa pleinement activable. T+-Tg,+
Ca&TgCa
+ Ca $ TgCa’ La deuxieme hypothbse 6vite de supposer que la m&meforme Tg puisse engendrer $ la fois des proteines inertes et de la trypsine. Elle a aussi
I’avantage de sugg6rer A l’esprit une situation fort nette: celle d’une prot&e non-activable Tgi qui devient pleinement activable aprb son union avec le calcium. Quoi qu’il en soit, le prohkme le plus important est que It: calcium soit capable d’exercer au sein du trypsinogkne deux effets diamkralement oppos6s: acc&ration considkable de la protColyse de la liaison lysyl-isoleucine et suppression quasi-totale des prot4olyses parasites engendrant les protkines inertes. I1 sera inGressant dans l’avenir de rhercher B savoir si l’ion agit spkifiquement sur la liaison lysyl-isoleuvine et dans son entourage immBdiat ou si le double effet pr&$demment constat rksulte d’une seule et m&me modification non-spkifique de la forme de la molkule du trypsinog&ne. R~SCM~
1. Alors que l’activation autocatalytique du trypsinogkne est quantitative en pr&ence d’ions calcium, le prkurseur engendre en leur absent S peu p&s 50% de protkines inactives et non-activables (protkines “inertes”). L’addition de verskne ne modifie pas sensiblement cette proportion. 2. Les ions calcium exercent au sein du trypsinogEtne deux effets dium&ralement oppo&: acc&ration notable de la prot,&olyse de la ski&w liaison en part>ant de l’ext’r6mit6 n’-terminale de la cshaine (liaison Iysylisoleucine) et suppression quasi-totale de certaines autres protkolyses qui, PII l’absence de calcium, sont responsables de la conversion du prkurseur (‘11proMines “inertes.” Pendant la conversion, le trypsinogkne subit des modifications irr6versibles de structure dont l’une des manifestations extdrieures est l’apparition d’un rksidu de s&ine en position K-terminale. En outre, la liaison lysyl-isoleucine ne peut plus &tre coup6e par la tr’ypsine dans les protkines “inertes,” m&me en p&ewe de calcium. BIRLIOGRAPHIE I. hkDoN.ar), M. R., ET KUNITZ, hf., J. Gen. Ph.ysiol. 26, 53 (1941). 2. KUNITZ, M., J. Gen. Physiol. 22, 293 (1939). 3. ROVERY, hf., FABRE, C., ET DESNUELLE, P., Riochim. et Riophys. Acta 12. 547 (1953). 4. DAVIE, E. W., ET NEURATH, H., J. Biol. Chem. 212, 515 (1955). 5. DESNUELLE, I’., ET FABRE, C., Biochim. et Biophys. Ada 18, 49 (19551. 6. TIETZE, F., J. Biol. Chem. 204, 1 (1953). 7. ROVERY, M., POILROUX, M., CURNIER, A., ET DESNUELLE, P., Riochitn. tit Biophys. Acta 17, 565 (1955). 8. MOORE, S., ET STEIN, W. H., J. Biol. Chem. 176, 367 (1948).
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9. 10. 11. 12. 13.
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L’ACTIVATION
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TRYPSINOGtiNE
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BIER, M., ET NORD, F. F., Arch. Biochem. and Biophys. 31,335; 33,320 (1951). GORINI, L., Biochim. et Biophys. Ada, 7, 318 (1951). GREEN, N. M., ET NEURATH, ET., .I. Biol. Chem. 204,379 (1953). GORINI, L., ET FELIX, F., Biochim. et Biophys. Acta, 11, 535 (1953). SANGER, F., Biochem. J. 39, 507 (1945). 14. ROVERY, M., POILROUX, M., YOSHIDA, A., ET DESNUELLE, P., Biochim. et Biophys. Acta 23, 608 (1952).
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Received January 8, 1957 Kunitz a montre depuis quclques annees yue les ions calcium influent de faGon tres sensible sur l’activation autocatalytique du trypsinogene. En presence de ces ions, la conversion trypsinogene-trypsine est a la fois rapide et quantitative (1). En leur absence par contre, l’activite trypsique apparait lent.ement,. Une partic du precurseur donne naissance a dcs proteines inactives et incapables de s’activer que Kunitz appelle “prot&es inertes” (2). Le probleme consiste a chcrcher comment agit le calcium et en quoi la structure des proteines inertes diffbre de celle de la trypsine active. Quelques travaux ¢s consacres au mecanisme de l’activation du trypsinogene (3-5) permettent d’ailleurs de poser cc probleme en termes plus p&is. On sait en efkt que le trypsinogene contient, vraisemblablement une chainc “ouvcrte” et que son activation va de pair avec la rupture de la sixieme liaison (liaison lysyl-isoleucine) en partant do l’cxtremite X-terminale de la chaine. Cette rupture provoque l’ablation de la sequence N-terminale, laquelle apparait dans le melange d’activation sous la forme d’un hexapeptide Val(Asp)dLys. I1 convient alors de se demander si les proteines inertcs de Kunitz ont ou non perdu l’hexapeptide en question. Dans l’afirmat,ive, on pourrait penser que la liaison lysyl-isoleucine est coupee aussi bien en l’absence qu’en presence de calcium. hlais, en l’absencc de calcium, we partie de la trypsine form& se desactiverait grace ;I la rupture de certaines liaisons supplementaires. Cctte premiere hypothbe esb conforme aux theories classiques concernant l’autolysc de la trypsine et, dc fac;on plus gemkale, au role dc protection que 1’011attribue au calcium pendant la prot,eolyse trypsique des proteines. Elle imite d’autre part 8. etudicr ulterieurement la nature 475
ct, la position des liaisons dent, la rupture provoque l’inactivation de la trypsine. L’hypothbse inverse n’interdit d’ailleurs pas de penser que la presence du calcium kite certaines ruptures defavorables a l’activation. Mais elle nous oblige en outre a admettre que l’ion favorise la rupture de la liaison lysyl-isoleucine. Une telle hypothese est done intkessante, non seulement parce qu’elle fait jouer au calcium deux roles opposes (un rOle protecteur et un Ale promoteur) au tours de la protkolyse d’une m6me proteine, mais aussi parce qu’elle permet de localiser le r61e promotcur au niveau d’une liaison peptidique bicn determinee. TECHNIQUES
Le trypsinogene commercial dont now disposions (1 fois cristallise) contenait environ 13% de trypsine et des quantites t&s notables de peptides. Considerant que la recristallisation d’un tel produit Btait une entreprise hasardeuse (6), nous I’avons simplement debarrasse de ses peptides par dialyse et de la majeure partie de son activite trypsique par un traitement prealable avec du diisopropylfluorophosphate (DFP). 2 g de trypsinogene commercial contenant 62’% de SONg2 sont dissous dans 40 ml d’eau. On ajoute B la solution 20 fois la quantite stoechiometrique de DFP (calculee & partir de la trypsine presente), puis 40 ml d’un tampon borate 0.4M pH 8,O a 0”. Apres 4 h. a 0”, on precipite les proteines dans SOdAm 0.7 S, on dialyse lcur solution aqueuse contre HCI low3 K pendant 40 h. et on lyophilise. Rendement : 640 mg de trypsinogene contenant encore 2% de trypsine active et 11% de diisopropylphosphoryltrypsine. Les 87% restants sont totalement activables par la trypsine en presence de calcium. 11s representent done du trypsinogene pm.
Activation L’activation est realisee en ajoutant la quantite voulue de trypsine a une solution’ de Ia preparation precedent,e dans du tampon borate 0.05M pH 7.8 a 0”. Pendant les activations en presence de calcium, In solution contient CaCl? S la concentration 5 X 10U2 M. La reaction est arretee au bout, d’un temps determine en abaissant le pH a 2 par addition de HCI IrT. L’activite trypsique est mesuree par titrimetrie avec le benzoylarginine ethylester comme sub&rat (3). Les pourcentages d’activation sont mesures b partir de la teneur rcelle en trypsinogene des preparations.
Chromatograpkie La plupart des conclusions d’activation du trypsinogene
du p&sent travail sont tirees en comparant le degrci et la quantite de l’hexapeptide Val(Asp)cLys lib&e
1 Cette solution contient generalement 1.33% de trypsinogene activable. n’en contient que 0.065% au tours des experiences concernant la determination extremites N-terminales des proteines inertes.
Elle ties
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DU TRYPSISOGhk:
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pendant l’activation. La separation chromatographique du peptide et sa determination quantitative doivent dorm &tre faites tres soigneusement. La technique utilisee est analogue a celle de Duvic et Keurath (4). La colonnc de Dowex 50 x 2 toutefois a une longueur double (60 au lieu de 30 cm) car les mClanges de peptides form&pendant les activations saris calcium sont notablement pluscomplexesqu’en presence de calcium. Lc liquide d’elution est un tampon citrate O.l;\l a pII 4.0 addition& au moment de l’emploi de 1% de BRIJ-35 a 33%. Lc d6bit de la colonne est regh? a 4 ml/h. Chaque fraction est de 1 ml. En gCnCra1, une fraction sur quatre est traitbe par la ninhydrinc en prCsence de chlorure stanncux (8). Les ddterminations colorimetriqucs permettcnt ainsi de tracer un diagrumme approximatif et de localiser la position du pit de l’hexapeptide. La forme de ce pit est ensuite precisee en effectuant sur des fractions intermediaires nutant de dosages qu’il cst necessaire. L’equivalent-leucine de l’hexapeptide Val(Asp)&ys a et6 trouv6 Bgal h. 1.75. La purete du pit de l’hexapeptidc a et6 verifiee dans chaque cas en prblevant une fraction au sommet et deux fractions dans les branches ascendante et descendante (7). Les trois fractions ont et6 dessalees par echange de Ieurs ions avcc ceux de I’acetate d’ammonium sur uric petite colonne de Donex 50 X 2 forme NH’+ puis elles ont 6th CtudiCes sur papier avant et aprbs hydrolyse. Lc pit n’a Cte declare pur et par consequent le dosage n’a et6 consider6 comme significstif qu’a la condition que les trois fractions donnent avant hydrolyse une seule tache (ou tout au moins une tache t&s largemcnt predominante) dans le syst6mc butanolacide formique-eau (4~1:5)~ et, apr& hydrolysc acide, Its trois seules taches uttenducs de valine, d’acide aspartique et de Iysinc dans lc rapport stoechiometriquc convenable. I~ESULTATS EXPERIYESTAUX
Activation du trypsinogh
en prdsence et en l’absence de calcium
Les courbes de la fig. 1 permettent de juger I’effet du calcium sur l’activation du trypsinogene et I’autolyse de la trypsine. Elles confirmcnt. et precisent t&s notablement les rbultat,s obtenus par d’autrcs auteurs (1,2,9-11). Les commentaires suivants peuvent 6tre faits a propos de ces courbcs: a. L’effet accekateur exerce par le calcium sur I’activation du trypsinogene apparait avec une nettctk particuliere quand on compare les courbes II et III: 2.3% de trypsine aver: calcium activent plus vite le trypsinogene que 19.6 % de trypsine saris calcium. Etant don& la forme exponentielle des courbes, il est assez difficile d’exprimer cette acceldration par un chiffre precis sans proceder a un calcul de cinetiquc. Mais on * Dana ce systeme et avec le papier Whatman no 1, l’hexapeptide VaI(Asp),Lys migre comme la lysine ou un peu plus lentement. Par revelation B la ninhydrinc en solution a 0.2% dans I’acetone, il donne une coloration violette rclativement faible.
roit ai&ment que le calcium augment.e plus de 10 fois la vitesse de l’a,c~tivation. b. En outre, les courbes du diagramme infkrieur de la fig. 1 moutrent que l’activation est incompkte quand on omet, d’ajouter du calcium. Heures 0 * ‘Cli
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30 20 Heures FIG. 1. Activation du trypsinoghe et autolyse de ILL trypsinc en prhence ou en l’absence de calcium. O-O : expdriences avec calcium. -t-t: rxphicnces saris calcium. Diq~o~t~tric~ infhieur: actioation du trypsinogkns. Concentration initiale du prkcurseur 1.33%. Temp. 0” pH 7.8. Courbes I et II: activation dans CnC12 5 X IO-” M par 19.6 et 2.3% de trypsine, rcspect’ivement, Courbes III, IV et V: activation saris calcium par 18.6, 7.3 et 2.3% de trypaine. respectivement. Courbe VI: activation dans le vcrshc 1OP M par 19.6’% dc trypsine. Diagramme supbrieur: inactivation de la trypsine par autolyse. Courbc VII: danh CaClz 5 X 10v2 M (concentration initiale de Ia trypsine: 0.450Jo) Courbes VI11 et IX: saris calcium (concentration initiale de la trppsine: 0.13 et 0.45%, respectivtlment) Courbe X: dans le vershe 1OP M (concentration initiale de 1:~ trypsinr: 0.45%). 10
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Chose curieuse, les courbes relatives % ce mode d’activation (courbes III a VI) convergent toutes vers une limite commune, independante de la quantite de trypsine utilisee et correspondant & la formation d’environ 50% d’enzyme. En presence de calcium au contraire (courbes I et II), 1 mole de precurseur acquiert une activite egale a celle de 1 mole de trypsine cristallisee (activation : 100%). c. Le caractkre incomplet de l’activation sans calcium ne semble pas resulter d’une autolyse progressive de la trypsine formee. Les courbes VIII et IX de la fig. 1 nous apprennent en effet que la trypsine perd a peu pres lo-15 % de son activite en I’absence de calcium dans nos conditions exp&imentales.3 Cette perte leg&e est incapable d’expliquer a elle seule le deficit d’environ 50% precedemment constate. 11est done vraisemblable que les protkines inertes de Kunitz se forment, non pas a partir de la trypsine par un processus ulterieur de d&activation, mais bien directement a partir du trypsinogene. Une experience encore plus demonstrative va d’ailleurs le confirmer bient&. d. Le fait de ne pas ajouter de calcium aux melanges d’activation ne signifie pas que ces melanges en soient completement depourvus. Afin d’eliminer les ions preexistants, nous avons done effectue quelques experiences avec du versene a la concentration lOA M. Ce reactif, comme il est d’ailleurs bien connu (12)) accelbre de fapon tres sensible l’autolyse de la trypsine (courbe X). Mais il est sans action sur le phenomene d’activation. La courbe VI relative B l’activation du trypsinogene en presence de versene tend d’abord vers la limite habituelle de 50 %. Puis, elle s’inf&hit vers le bas a cause de l’autolyse anormalement rapide de la trypsine formBe. Contrairement a ce qu’on aurait pu penser, le versene ne favorise done pas la formation des proteines inertes aux d&pens de celle de la trypsine. Lib&ration de l’hexapeptide en prdsence et en Z’absence de calcium
3.6 pmole de trypsinogene en solution a 1.33 740 pH 7.8 et 0” sont activees par la trypsine. Au bout du temps voulu, une partie aliquote du melange est p&levee pour une mesure d’activite et le reste est immklia3 L’autolyse de la trypsine est d’autant plus rapide que Ies solutions de cet enzyme sont plus concentrhes. Pour que les exphiences d’autolyse et d’activation fournissent des rhultats comparatifs, il est done nhessaire que la concentration de la trypsine soit analogue dans les deux oas. Pendant l’activation du trypsinogene sans calcium, cette concentration passe de 0.0 h 0.6ojo. La concentration initiale de la trypsine au cows de I’autolyse est 0.2% (courbe VIII) et 0.4570 (courbe IX).
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DESNUELLE
AND
1
GABELOTEAU
n
i0 ml &at FIG. 2. Chromatographie des peptides pendant I’activation du trypsinoghne avec ou sans calcium. Colonne (60 x 0.9 cm) de Dowex 50 x 2 250-450 mailles Bluke par un tampon citrate 0.1 M & pH 4.0. Temp. 25”. DBbit de la colonne: 4 ml/h. Volume des fractions: 1 ml. Diagramme du bus: Activation du trypsinoghne par 2.3y0 de trypsine a 0” pH 7.8 dans CaClz 5 X 10-Z M. Diagramme du haut: Activation du trypsinogbne par 19.6% de trypsine & 0” pH 7.8 sans addition d’ions calcium. 0
50
100
tement amen6 A pH 2 par KC1 N et chromatographik comme indiqu6 plus haut.4 La fig. 2 reproduit deux diagrammes caractkristiques. Le diagramme du bas est relatif A une activation de Ah. par 2.3 % de trypsine dans CaC12 5 X 1OP M et le diagramme du haut, & une activation de 2h.1/2 par 19.6% de tzypsinej saris addition de calcium. En examinant la fig. 2 on voit que les deux diagrammes possPdent un 4 La partie protbique des mklanges ne &ne pas car elle est tr&s fortement adsorb6e sur le Dowex-50 X 2. Elle est Clube aprits I’oprkation au moment du lnvage de la rksine par NaOH 0.2 T’u’. 6 Quand les activations sans calcium durent trop longtemps, des rbactiona secondaires se produisent, le melange peptidique est t’r&s complexe et le pit de l’hexapeptide Val(Asp)4Lys ne peut plus Btre ohknu B l’etat pur. Anssi avons-nous ut,ilis& des quantitks de trypsine relativement fort,es afin d’acc&&-er le ph6nom8ne duns toute la mesure du possible.
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pit principal sit& au m&me endroit (115-120 ml d’eluat) . Les tests d&its plus haut indiquent que ce pit est pur dans les deux CBSet qu’il correspond a l’hexapeptide Val(Asp),Lys. Pendant l’activation en presence de calcium, 1 mole de trypsinogbne pesant 25,000 g a don& 0.79 mole de trypsine et 0.89 mole d’hexapeptide. Deux experiences en l’absence de calcium ont donne 0.27-0.28 mole de trypsine et 0.33W.32 mole de peptide pour 1 mole de precurseur. Une relation stoechiometrique entre la trypsine formee et I’hexapeptide lib&e a deja Bte notee par Davie et Neurath (4) pendant l’activation du trypsinogene en presence de calcium. Elle constitue d’ailleurs le meilleur argument en faveur du role determinant joue par I’ablation du peptide pendant I’activation. Nous trouvons que cette relation existe egalement dans les circonstances particulieres de l’activation sans calcium. Un tel resultat confirme de faGon particulierement demonstrative que les proteines inertes sont engendrees directement a pa&r du trypsinogene par une reaction independante de celle de l’activation. Cette reaction n’implique pasl’ablation de l’hexapeptide et par consequent la rupture de la liaison lysyl-isoleutine. 11 est d’ailleurs interessant de constater que la rupture de la liaison lysyl-isoleucine ne se produit pas au sein des proteines inertes, m&me quand ces proteines sont ulterieurement traitees par la trypsine en presence de calcium. Du trypsinogene est active a 0” et pH 7.8 par 7.3 % de trypsine pendant 20h. sans calcium. La courbe IV de la fig. 1 nous apprend que la limite de l’activation est alors atteinte et que le melange obtenu contient a peu prb 50 % de trypsine et 50 % de proteines inertes. Ce melange est addition& Q 0’ et pH 7.9 de 20 mole de diisopropylfluorophosphate pour inactiver la trypsine formee. I1 est dialyse pendant 48h. B 4” contre HCl 10T3 M pour &miner les peptides et il est lyophilise. I1 est enfin trait6 b 0” et pH 7.8 par 3.6 Yo de trypsine pendant 4h., en presence cette fois de CaClz 5 X 10v2 M. Aucune trace d’hexapeptide ne peut &tre decelee par chromatographie. Pendant sa transformation en proteines inertes, le trypsinogene a done subi des modifications irreversibles de structure qui rendent impossible la rupture ulterieure de la liaison lysyl-isoleucine, m&me dans les conditions favorables de l’activation avec calcium. Rdsidus N-terminaux
des prot4ine.s inertes
La g&&se des prot&nes inertes est bien moins importante sur le plan general que la g&&se de la trypsine. Elle n’est cependant pas depourvue 6Exp&iences correspondant aux diagrammes de la fig. 2.
1s”
I~ESMJELLE
ASD
G.\BKLOTE.iT
d’int&?t car les r&actions qu’elle impliyue font perdre au trypsinogtinc sa caract6ristique essentielle, c’est & dire son aptitude B l’activation. Nous en avons abordi! 1’6tude par la technique habituelle de d&ermination des r6sidus X-krminaux. ;Ipr& avoir active du trypsinoghne en prksence ou en l’absence de (calcium, la part’ie prot&que des m6langes a 6th prkipitke par l’acidr trichlora&ique et le pr6cipit6 a 6th condens avec le fluorodinitroben&w (I:<). Les dinitrophknyl protkines (DIG’-protkines) ont Bt6 soigneusement lavt?es afin d’assurer une Blimination aussi compl&te que possible des DKP-peptides, puis elles ont Bt6 hydrolys6es par HCI 5.6 N. Dans le cas de I’activation avec calcium, on trouve, comme p&vu, beaucoup de DPN-isoleucine (0.9 mole) qui correspond au r&sidu K-terminal de la trypsine (3), et un peu de DKP-valine (0.1 mole) qui provient’, soit du trypsinogkne restant (3), soit d’une trace d’hexapeptide ayant 6chapph aux operations de purification. Mais, dans le cas de l’activation saw calcium, on trouve 0.5 mole de 3 DNP-amino acides &h&o-solubles: 1:i 1)X1’-isoleucine, la DNP-valine et’ la DNP-shrine. L’isoleucine N-tcrminalr appartient sans dout’e ?I la fraction de trypsine formhe en l’absencr de calcium. Les deux autres residus N-terminaux, c’est 21dire la vatline clt In s&ine, peuvent par contre &tre attribu& aux protdines inertes. Or, la valinr ne semble pas reprdsenter au sein de ccs proSines un r@sidu S-tw minal nouveau. Elle exist’e d&j& dans le trypsinogitne et on sait, clue 13 conversion trypsinogPne-protkines inertes (qui n’implique pas le d&art du pepMe Val(Asp)rLys) ne la fait pas disparaitre. Reste done la s@riw dont la prdsence en position N-terminale est saris doute une cons6quenc~ dire&e de la conversion. Les DXP-amino acides hydrosolubles et instables n’ont pas encow fait I’objet d’une &ude spkiale. Les rkltats p&&dents sont done pr6liminaires. Mais le fait de trouver, quelle que soit’ la durde de l’activatiol\ sans calrium, un seul r6sidu K-terminal nouveau dans la fraction 6th&soluble, suggke dk maintenant que la conversion kypsinogkne-prot&tw inertes est un phknomkne prot’kolytique et, que cette protkolyse cst, rc4atirement simple. D1scuss10x
La formation des proteines inertes et celle des n&ochymotrypsinog&nw (14) semblent p&enter certaines analogies et certaines diff krenccs q u ‘i I est inGressant de discuter tout d’abord bri+vement. Dans un cas conmw dans l’autre, nous voyons que le prkurseur (trypsinogtine ou cshynlotryp
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sinogbne) est active par la rupture d’une liaison d&erminee et, inversement, que la rupture d’une ou plusieurs autres liaisons ne provoque pas l’activation. Mais les neochymotrypsinogenes sont encore activables alors que les proteines inertes de Kunitz ne le sont plus. En outre, des diffkrences fondamentales apparaissent dans le mkanisme intime des deux phenomenes. Pour le chymotrypsinogene, la rupture activante et les ruptures non-activantes sont effectuees par deux enzymes (trypsine et chymotrypsine) dont la specificit n’est pas la m&me. On comprend done assezaisement que l’un des enzymes attaque le precurseur dans une region privilkgiee et favorable %l’activation et que l’attaque de l’autre seproduise ailleurs, dans une region defavorable. Pour le trypsinogene, au contraire, la trypsine est capable d’effectuer la rupture favorable et les ruptures defavorables, le seul element directeur &ant la presence ou l’absence de calcium. Le fait que l’activation du trypsinogene soit quantitative en presence de calcium signifie selon toute vraisemblance que cet ion s’unit reversiblement au precurseur (Tg) pour donner un complexe (TgCa) et que ce complexe est integralement converti en trypsine. Nous nous trouvons done avec le trypsinogene dans une situation analogue a celle de la trypsine et les m&meshypotheses peuvent Ctre formulees dans les deux cas. Ou bien (9, 10) la forme TgCa est simplement en Bquilibre avec la forme Tg, TgCa donne la trypsine (T) et Tg donne T et des proteines inertes (Pi) Tg + Ca i+ TgCa I(\ 1 T T Pi Ou bien (11) , le trypsinogbne se trouve lui-m&me sous deux formes, l’une activable (Tg,) et l’autre non-activable (Tgi) et ces deux formes se combinent reversiblement avec le calcium pour donner TgCa pleinement activable. T+-Tg,+
Ca&TgCa
+ Ca $ TgCa’ La deuxieme hypothbse 6vite de supposer que la m&meforme Tg puisse engendrer $ la fois des proteines inertes et de la trypsine. Elle a aussi
I’avantage de sugg6rer A l’esprit une situation fort nette: celle d’une prot&e non-activable Tgi qui devient pleinement activable aprb son union avec le calcium. Quoi qu’il en soit, le prohkme le plus important est que It: calcium soit capable d’exercer au sein du trypsinogkne deux effets diamkralement oppos6s: acc&ration considkable de la protColyse de la liaison lysyl-isoleucine et suppression quasi-totale des prot4olyses parasites engendrant les protkines inertes. I1 sera inGressant dans l’avenir de rhercher B savoir si l’ion agit spkifiquement sur la liaison lysyl-isoleuvine et dans son entourage immBdiat ou si le double effet pr&$demment constat rksulte d’une seule et m&me modification non-spkifique de la forme de la molkule du trypsinog&ne. R~SCM~
1. Alors que l’activation autocatalytique du trypsinogkne est quantitative en pr&ence d’ions calcium, le prkurseur engendre en leur absent S peu p&s 50% de protkines inactives et non-activables (protkines “inertes”). L’addition de verskne ne modifie pas sensiblement cette proportion. 2. Les ions calcium exercent au sein du trypsinogEtne deux effets dium&ralement oppo&: acc&ration notable de la prot,&olyse de la ski&w liaison en part>ant de l’ext’r6mit6 n’-terminale de la cshaine (liaison Iysylisoleucine) et suppression quasi-totale de certaines autres protkolyses qui, PII l’absence de calcium, sont responsables de la conversion du prkurseur (‘11proMines “inertes.” Pendant la conversion, le trypsinogkne subit des modifications irr6versibles de structure dont l’une des manifestations extdrieures est l’apparition d’un rksidu de s&ine en position K-terminale. En outre, la liaison lysyl-isoleucine ne peut plus &tre coup6e par la tr’ypsine dans les protkines “inertes,” m&me en p&ewe de calcium. BIRLIOGRAPHIE I. hkDoN.ar), M. R., ET KUNITZ, hf., J. Gen. Ph.ysiol. 26, 53 (1941). 2. KUNITZ, M., J. Gen. Physiol. 22, 293 (1939). 3. ROVERY, hf., FABRE, C., ET DESNUELLE, P., Riochim. et Riophys. Acta 12. 547 (1953). 4. DAVIE, E. W., ET NEURATH, H., J. Biol. Chem. 212, 515 (1955). 5. DESNUELLE, I’., ET FABRE, C., Biochim. et Biophys. Ada 18, 49 (19551. 6. TIETZE, F., J. Biol. Chem. 204, 1 (1953). 7. ROVERY, M., POILROUX, M., CURNIER, A., ET DESNUELLE, P., Riochitn. tit Biophys. Acta 17, 565 (1955). 8. MOORE, S., ET STEIN, W. H., J. Biol. Chem. 176, 367 (1948).
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TRYPSINOGtiNE
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