Sur les derives guanidiques et le phosphagene de quelques annelides polychetes de la baie de naples et du mollusque Arca noae L.

Comp. Biochem. Physiol., 1960, Vol. 1, pp. 44 to 55. Pergamon Press Ltd., London. Printed in Great Britain

SUR LES DERIVES GUANIDIQUES ET LE PHOSPHAGENE DE QUELQUES ANNELIDES POLYCHETES DE LA BAIE DE NAPLES ET DU MOLLUSQUE ARCA NOAE L. J. R O C H E , Y. R O B I N , N . - V . T H O A I et L. A. P R A D E L L a b o r a t o i r e de Biologie M a r i n e d u Coll~ge du France, Concarneau, Finist~re, France, et Stazione Zoologica, Napoli, Italie (Received 31 March 1959)

R 6 s u m ~ - - L e phosphag~ne musculaire de Spirographis spallanzanii Viviani est constitud par l'argininephosphate. Les phosphag~nes de toutes les autres Anndlides dtudi~es pr~cddemment sont d'une nature diff~rente (phosphocr~atine, phosphoglycocyamine, phosphotaurocyamine) et il en est de m~me de ceux d'autres Vers (phospholombricine). 2. La comparaison des dt~riv~s guanidiques des tissus (muscle ou tractus digestif) d'Anndlides Polych~tes S~dentaires ou Errantes rficoltdes en Bretagne et en bale de Naples a permis de d6finir les caract~res sp6cifiques des unes et des autres en ce qui concerne leurs constituants guanidiques. Ces caract6res paraissent inddpendants de l'habitat. 3. Le phosphag~ne d'Arca noae L. est l'argininephosphate et le muscle de ce Mollusque ne renferme comme dfirivfi guanidique libre que l'arginine, associ~e h de petites quantitds d'arcai'ne et d'agmatine et de deux guanidines monosubstitufies inconnues. 4. L'origine de l'arcaine est discutde ~ partir des r~sultats obtenus sur Arca tzoae L. et sur d'autres Invertfibrfis, et l'hypoth~se de sa formation bactdrienne h partir de l'arginine est envisag~e. A b s t r a c t - - ( 1 ) The phosphagen present in muscle of Spirographis spallanzanii Viviani has been identified as argininephosphate. It is thus different from all other phosphagens previously characterized in polychaete annelids (phosphocreatin, phosphoglycocyamine, phosphotaurocyamine) and in other worms (phospholombricine). (2) The comparison of guanidine derivatives of muscle and the digestive tract of various sedentary or erratic polychaetes collected in Brittany or in the bay of Naples allows us to define specific biochemical characters of these animals. These characters are independent of their habitat. (3) The phosphagen of Arca noae L. is argininephosphate. Muscle of this mollusc contains only arginine, small amounts of agmatin and arcain and two unknown guanidine derivatives. (4) The origin of arcain is discussed from the data by the study of Arca noae L. and of other Invertebrates. The hypothesis of the bacterial formation of arcain from arginine is considered.

A u c o u r s d e t r a v a u x a n t d r i e u r s s u r la r 6 p a r t i t i o n d e s d f r i v 6 s g u a n i d i q u e s e t d e s p h o s p h a g + n e s c h e z les Invert6br6s, n o t r e a t t e n t i o n s'est p a r t i c u l i 6 r e m e n t p o r t d e 44

SUR LES DI~RIVI~SGUANIDIQUES ET LE PHOSPHAGI~NE DE QUELQUE$ ANN]~LIDES POLYCHI~TES

45

sur le groupe des Anndlides, chez lesquelles Baldwin et Yudkin avaient signal~ en 1950 la prdsence d'un phosphag~ne inconnu, diffdrent par les caract~res de son hydrolyse de la phosphoarginine et de la phosphocrSatine. Nous avons rdussi isoler et ~ identifier la glycocyamine chez un certain nombre de Polych~tes Errantes et la taurocyamine chez des Polych~tes Sddentaires (Thoai et Robin, 1954a), puis ~ extraire du muscle les phosphag~nes correspondants, la phosphoglycocyamine et la phosphotaurocyamine (Thoai et al., 1953a, b). Par la suite, l'isolement de deux guanidines monosubstitudes nouvelles: la lombricine de Lumbricus terrestris L. (Oligoch~te)--dont nous avons d&ermind la structure (diester guanido~thylsdrylphosphorique) et extrait le d~riv~ phosphorique labile, prdsent dans le muscle du Lombric (Thoai et Robin, 1954b)--et l'hirudonine d'Hirudo medicinalis L. (Hirudin6e), dont l'identification est en cours (Robin, et al. 1957a), ont encore ajout6 fi l'extr~me diversit6 des phosphag6nes pr6sents chez les Vers. Nous avons cherch6 fi compl&er notre travail sur les Ann6lides Polych~tes, limit6 jusqu'ici ~t des esp~ces atlantiques r6colt6es en baie de Concarneau, par l'6tude d'esp~ces mdditerran6ennes. Nous avons pu examiner, au cours d'un s6jour fi la Station Zoologique de Naples, sept Ann61ides Polych6tes, diff6rentes pour la plupart des esp~ces 6tudi6es en Bretagne. Les quantitt~s de mat6riel obtenu n'ont permis que dans un seul cas d'isoler le phosphag~ne musculaire, mais nous avons d6termin6 par chromatographie sur papier la nature des d&iv6s guanidiques prfsents dans les tissus de ces animaux, afin de rechercher l'existence 6ventuelle de variations individuelles dues fi l'habitat, ou la pr6sence de phosphag~nes nouveaux, diff6rents de ceux d6j~ identifi6s chez les Vers, soit: la phosphoglycocyamine, la phosphotaurocyamine (Thoai et al., 1953a), la phospholombricine (Thoai et Robin, 1954b) et la phosphocr6atine (Baldwin et Yudkin, 1950; Greenwald, 1946; Robin, 1954; Hobson et Rees, 1955; Roche et al., 1957). Nous indiquons ici les techniques suivies et les r6sultats obtenus, que nous comparons fi ceux 6tablis sur des Ann6lides Polych~tes pr6c6demment &udi6es Concarneau. Un autre probl~me que nous d6sirions tenter de r6soudre &ait celui de la formation et de la signification biologique de l'arcaine chez les Invert6br~s. Ce d&iv6 guanidique, isol6 pour la premiere lois du Mollusque Arca noae L. par Kutscher et al. (1931) ~t~ signal~ ensuite chez d'autres Invert~br6s: Cristaria plicata (Suzuki et Muraoka, 1954), Audouinia tentaculata Mtg. (Robin et al., 1956) et Hirudo medicinalis L. (Robin et al., 1957b). Malgr6 ces travaux, la signification physiologique de l'arcaine demeurait obscure et les faibles quantitds que nous avions d6cel~es chez la Sangsue et chez Audouinia rendaient ce matfiriel inapte une &ude plus approfondie. Nous esp~rions trouver dans Arca noae un materiel plus abondant, plus riche en arcaine et renfermant peut-&re d'autres guanidines dont la presence nous aiderait ~ comprendre celle de la premiere. C'est dans ce but que nous avons entrepris, sur A r c a noae L. r~colt6s ~ Tarente par les soins de la Station Zoologique de Naples, l'6tude des d6riv~s guanidiques prfisents dans les tissus, ainsi que l'isolement et l'identification du phosphag~ne musculaire. Nous rapportons ici les rfisultats obtenus.

46

J. ROCHE, Y. ROBIN, N.-v. THOAI ET L. A. PRAI)EL

1. E T U D E DES C O N S T I T U A N T S G U A N I D I Q U E S DE Q U E L Q U E S A N N E L I D E S P O L Y C H E T E S DE LA BAIE DE N A P L E S E T I D E N T I F I C A T I O N DU P H O S P H A G E N E DE SPIROGRAPHIS SPALLANZANII V I V I A N I

Partie Expdrimentale (1) Etude chromatographique des ddriv& guanidylds Les extraits destin& ~ la c h r o n m t o g r a p h i e sur papier ont 6t6 pr4par4s par b r o y a g e des organismes entiers (Eunice sp., Hal& parthenopeia Delle Chiaje, Marphysa sanguinea Mtg., Perinereis sp., Protula intestinum Link.) ou des muscles et des tractus s6par4s par dissection (Diopatra napoleitana Delle Chiaje, Spirographis spallanzanii Viviani) avec 2 3 volumes d'acide ac4tique 5 2 p o u r cent. L ' h o m o g 4 n a t a 4t4 chauff4 5 rain au bain-marie bouillant, puis centrifugal. Les extraits ainsi obtenus ont 4t4 c h r o m a t o g r a p h i 6 s (vole descendante) sur papier W h a t m a n n ° 1 dans deux solvants: (1) n-butanol acide ac6tique-eau 73: 10: 17) et (2) pyridine alcool isoamylique-acide a c & i q u e - e a u ( 8 0 : 4 0 : 1 0 : 4 0 ) . Aprhs s4chage, les c h r o m a t o g r a m m e s ont 4td rdv61& par la r4action de Sakaguchi, p o u r la caract4risation des guanidines monosubstitu4es, et par ]a r4action au diac6tyle-,~-naphtol ou par la r6action de Jaff4, pour la recherche de ]a cr4atine (Roche et al., 1957). I,es r&ultats obtenus sont r4sumds dans le Tableau 1. TABLEAU I--]~TUDE DES DI~RIVt~SGUANIDIQUESPRESENTSDANS LES TISSUS DE QttELQUES ANNI~LIDESPOLYCttI~TESR]~(',OLTI~ESEN BAIEDE NAPI.ES Guanidines monosubstitudes Ver 6tudi6

Tissu

(;lycocyamine

Taurocyamine

Cr6atine

Argininc

Muscle Tractus di~. An. entier

0 + traces

0 0 0

0 0 0

+ + +

Marphysa sanguinea Mtg. Perinereis sp.

An. entier An. entier An. entier

traces traces traces

0 0 +

0 0 0

+ ÷ traces

Polych4tes S6dentaires Protula intestinum (Lmk.)

An. entier

traces

0

+

+

+ +

0

0 0

0

Polych4tes Errantes

Diopatra napoleitana Delle Chiaje

Eunice sp. Halla parthenopeia Delle Chiaje

S'pirographis spallanzanii Viviani

Muscle Tractus dig.

0

0

(2) Isolement et identification du phosphag~ne de Spirographis spallanzanii Viviani 800 g de spirographes entiers d6barrass& de leurs tubes ont 6t6 b r o y & au W a r i n g - b l e n d o r avec u n v o l u m e d'acide trichlorac~tique ~ 15 p o u r cent refroidi - 10°C. I,e m61ange a 6t6 agit6 p e n d a n t 15 min/a - 10°C, puis centrifug6 h 0°C. L e liquide surnageant a 6t6 neutralis6 i m m f d i a t e m e n t par la soude h 30 p o u r cent.

SUR LES DERIVI~SGUANIDIQUES ET LE PHOSPHAGI~NE DE QUELQUES ANN]~LIDES POLYCHI~TES

47

Le rgsidu a 6t6 extrait ~t nouveau par un volume d'acide trichlorac&ique ~ 10 pour cent, agit6 10 min, centrifug4 et le liquide surnageant neutralis4. Les extraits rassemblgs oat 6t6 additionn6s d'un volume d'gthanol h 95 ° et abandonn4s une nuit h 0°C. Le pr6cipit6 form6, s6par6 par centrifugation, constitue la fraction I. Le liquide surnageant a 6t4 additionn6 de 4t) ml de bromure de baryum ~ 20 pour cent et d'un volume d'&hanol; le pr6cipit6 prenant naissance, recueilli par centrifugation, constitue la fraction II. La fraction I a gt6 broy6e avec du sable et extraite par 300 ml d'eau glac6e: le r6sidu insoluble a 6t6 61imin6 et le liquide surnageant additionn6 de deux volumes d'alcool. I1 se forme un pr6cipit6, que l'on a r6uni ~t la fraction II et l'ensemble a 6tg dissous dans 450 ml d'eau et additionng de deux volumes d'alcool. Apr~s une nuit ~ 0°C, le pr6cipit6 a 6t6 recueilli par centrifugation et dissous dans 400 ml d'eau. I1 y donne une solution laiteuse riche en glycog~ne, qui a 6t6 acidifi6e ~ pH = 3 avec de l'acide trichloracdtique 20 pour cent en refroidissant h - 1 0 ° C , additionn6e de deux volumes d'4thanol et centrifugde immgdiatement. Le liquide surnageant a 6t6 neutralis6 ~ pH = 7,6 par de l'ammoniaque et additionn6 d'un volume d'&hanol. Le pr~3cipit6 obtenu, s6par6 par centrifugation, a 6t6 extrait pendant 15 rain avec 20 ml d'eau bidistillge; apr6s centrifugation, le liquide surnageant a 6t6 filtr6 ~ travers une petite colonne (1 x 10 cm) de permutite C 50, pr6alablement activ6e par traitement h l'acide chlorhydrique 2 N, lavage h l'eau, traitement ~ l'ammoniaque 2 N, et refroidie environ +5°C. Cette colonne fixe le baryum et laisse passer le phosphag&ne, prgsent dans l'efiquent ~ l'6tat de sel d'ammonium. La colonne a 6t6 lav6e avec 60 ml d'eau bidistillde; l'efftuent initial et les eaux de lavage ont 6t6 conccntr6s sous vide ~ environ 4 ml. Nous avons identifi6 le phosphag~ne sur cette solution, au moyen de la chromatographie sur papier. l,a chromatographic a 6t6 rdalis6e par voie ascendante et h 0~'C, sur papier Whatman n ° 1 (pr6alablement lay6 ~ l'acide ac&ique 2 N, puis h l'eau et s6ch6) dans les solvants : (1)pyridine-6thanol-ammoniaque eau (3:3:3: 1)et (2)pyridine alcool isoamylique-eau (4:2:3,5), en prenant comme corps de r6f6rence l'argininephosphate de lithium chromatographiquement pur pr6par6 par synth6se (Thiem et Thoai, 1959). Les chromatogrammes ont 6t6 r6v61&: par la rgaction de la ninhydrine, qui caract&ise le groupement c,-amin4 de l'argininephosphate; par la r6action des esters phosphoriques (Hanes et Isherwood, 1949), qui caract6rise le groupement ,-~P de l'argininephosphate ; par la r6action de Sakaguchi, sp6cifique des guanidines monosubstitu6es, op6r6e apr&s pulvdrisation du chromatogramme avec de l'acide chlorhydrique N e t chauffage ~ 100°C pendant 5 rain, afin de lib&er l'arginine de sa combinaison phosphorique labile*. L'extrait contenant le phosphag6ne a 6t~ soumis ~ une purification pr6alable par chromatographie dans le solvant (1) sur papier Whatman n ° 1 lav6; la b a n & correspondant au phosphag6ne a 6t6 61u6e 'h 0°C par de l'eau ammoniacale et lc * P o u r compenser l'acidit4 du papier, la r6v61ation usuelle (Roche et al., 1957) a 6t6 modifi6e de la mani6re suivante. La premihre pulv6risation est op6rfe avec un mflange de soude '~ 40 p o u r cent (2 ml), de solution alcoolique d'e-naphtol '~ 1 p o u r cent (0,2 nal), de solution d ' u r f e fi 40 p o u r cent (0,2 ml) et d'eau distill6e (q.s.p. 10 ml). On s6che dans u n courant d'air froid et l'on pulv6rise la solution d ' h y p o b r o m i t e de sodium selon la technique habitue|le.

48

J. ROCHE,Y. ROBIN, N.-v. THOAIET L. A. PRADEL

liquide, concentr6 sous vide, a Et6 rechromatographi6 dans les solvants (1) et (2) selon le mode op6ratoire d6crit ci-dessus. Dans les deux solvants, la tache du phosphag~ne r6v616e par la reaction de la ninhydrine, par la r6action des esters phosphoriques et par la r6action de Sakaguchi apr~s hydrolyse du chromatogralmne, occupait une position identique ~ celle de l'argininephosphate tdmoin. Nous pouvons donc conclure fi l'identitd du phosphag~ne de Spirographis spallanzanii Viviani et de l'argininephosphate.

Discussion des Rdsultats La pr6sence d'un phosphag~ne nouveau chez les Anndlides avait 6t6 envisagde d~s 1933 par Arnold et Luck qui, au cours d'un travail d'ensemble sur la r6partition de l'arginine dans le muscle des Vert6br6s et des Invert6br6s, avaient 6t6 frappds des faibles quantitds de ce d6riv6 existant dans les tissus de certains Vers. Ires 6tudes syst6matiques rdalisEes par la suite chez ces animaux (Baldwin et Yudkin, 1950; Hobson et Rees, 1955) 6talent basdes sur les caract6res de l'hydrolyse acide du phosphag~ne en prdsence de molybdate, beaucoup plus que sur l'identification de la base guanidique li4e au phosphate labile. Aussi nos premiers travaux sur les Anndlides (Roche et al., 1952) ont-ils port6 sur la caractdrisation du d6riv6 guanidique participant ~ la formation du phosphag?me et abouti ~ l'isolement et l'identification de la glycocyamine et de la taurocyamine (Thoai et Robin, 1954a), puis des phosphaghnes correspondants (Thoai et al., 1953b; Thoai et Thiem, 1957), chez diverses AnnElides Polychhtes Errantes et Sddentaires. Par la suite, nous avons &endu syst6matiquement l'6tude de la r6partition naturelle des ddrivEs guanidiques (guanidines monosubstitu4es et cr4atine) h de nombreuses esp6ces marines, rant atlantiques (Robin, 1954; Roche et al., 1957) que m4diterran4ennes. I.es r6sultats de leur ensemble ont EtE report6s dans les Tableaux 1 et 2. I.a comparaison de ces deux Tableaux permet de constater que les Ann41ides Polychhtes du bassin m4diterran6en et celles du bassin atlantique poss6dent des caract6res communs. Chez les unes comme chez les autres, la pr6sence de fortes quantit6s de glycocyamine n'est observ4e que chez des Polychhtes Errantes tandis que la taurocyamine ne se rencontre que chez des Polych6tes SEdentaires; la cr6atine, par contre, se trouve indiff4remment dans l'un ou l'autre groupe, off sa presence exclut d'ordinaire celle de la glycocyamine ou de la taurocyamine. Cependant, nous avons pu noter certaines diff6rences entre les animaux dtudids respectivement 5 Naples et ~ Concarneau. Tout d'abord, le nombre des esphces h cr6atine semble beaucoup plus Elevd dans le premier groupe que dans le second; sans tenir compte des traces de crEatine observEes chez Perinereis et qui proviennent vraisemblablement de produits g4nitaux (Greenwald, 1946; Roche et al., 1957). Le Tableau 1 montre, en effet, que cinq sur sept des animaux rdcolt6s Naples renferment de fortes quantit6s de cr6atine dans leurs tissus. A l'exception de ce que l'on observe chez Protula intestinum, la cr~atine existe seule (muscle de Diopatra napoleitana) ou associde ~ des traces d'arginine (Eunice, Halla parthenopeia, Marphysa sanguinea) dans les esp&ces &udi~es; il est donc probable que, chez celles-ci, la crdatine constitue la base du phosphag~ne nmsculaire. Le

SUR LES DERIVI~SGUANIDIQUES ET LE PHOSPHAGI~NE DE QUELQUES ANNI~LIDESPOLYCHI~TES 49

T a b l e a u 2 m o n t r e , par contre, q u e s u r les d i x - n e u f esp6ces r6colt6es ~ C o n c a r n e a u , six s e u l e m e n t r e n f e r m e n t de la cr6atine c o m m e c o n s t i t u a n t g u a n i d i q u e essentiel du muscle. T-ABLEAU2--]~TUDE DES DI~RIVI~SGUANIDIQUESPRI~SENTSDANS LES TISSUSDE QUELQUES ANNI6.LIDES POLYCH~TES DE LA BAIE DE CONCARNEAU Guanidines monosubstitu4es Arginine

Glycocyamine

An. entier Muscle Tractus dig. An. entier

+ traces + +

+ 0 0 +

0 + + 0

Muscle Tractus dig. Muscle Tractus dig. Muscle Tractus dig. Muscle Tractus dig. An. entier

traces + traces + 0 + 0 + +

0 + + + + +

0 0 0 0 0 0

+ + + + 0 0 0 0 0

+

+

0

Muscle Tractus dig. Muscle Tractus dig. Muscle Tractus dig. Muscle Tractus dig. An. entier An. entier

0 + traces + 0 + traces + + +

0 0 traces traces 0 0 0 0 0

+ + 0 0 + + 0 0 0 +

0 0 + + 0 0 + + 0 0

An. An. An. An.

+ + + traces

+

0 0 0 +

Ver 4tudi6 Polych6tes Errantes Eulalia viridis Miiller Glycera convoluta Kfst.

Halosydna gelatinosa

Tissu

Taurocyamine

M. Sars.

Lumbriconereis Blainville

~'l/Iarphysa sanguinea Mtg. Nephthys Hombergii Nereis diversicolor Mfiller Ophiodromus flexuosus

Cr4atine

Delle Chiaje

Platynereis dumerilii

An. entier

Aud. et Edw. Polych6tes S6dentaires

drenicola marina L. ~4udouinia tentaculata Mtg. Clymene lumbricoides Qfg. Dasybranchus caducus (;rtibe

Lanicea conchilega Pallas 2VIyxicola infundibulum Renier

Nerine foliosa Aud. et Edw. Sabella pavonina Say. Sabellaria alveolata L. Scolophos armiger

entier entier entier entier

0

0

+ 0

O. F. Mailer

U n autre fait particulier, observ6 d a n s l ' u n e des A n n d l i d e s napolitaines, est la prdsence chez Protula intestinum, de q u a n t i t d s i m p o r t a n t e s de t a u r o c y a m i n e associde 5 la crdatine. Chez les A n n d l i d e s Polych6tes 6tudides j u s q u ' i c i , la prdsence de crdatine s e m b l a i t exclure celle des autres d6rivds g u a n i d i q u e s , ~ l ' e x c e p t i o n de traces d ' a r g i n i n e et, parfois, de g l y c o c y a m i n e (Audouinia tentaculata). N o u s avons,

50

J. ROCHE, Y. ROBIN, N.-v. TrloAi ET L. A. PRADEL

il est vrai, caract~ris6 la taurocyamine dans les oefs d'Audouinia tentaculata (Robin et al., 1956) mais le muscle de ce Vet en est totalement d6pourvu et sa pr6sence aurait sans doute pass6 inaperque sur des extraits de l'animal entier. L'association de taurocyamine et de cr~atine en quantit6s ~quivalentes n'a 6t~ jusqu'~ pr6sent observ~e que chez une Eponge, Thetia lyncurium L., off nous avons identifi6 le phosphagbne ~ la phosphocr6atine (Roche et Robin, 1954). 11 est difficile de conclure en ce qui concerne la signification biologique de la taurocyamine et de la cr6atine chez Protula intestinum; elle ne pourra ~tre 6claircie que par l'6tude de la r~partition de ces deux d6riv6s dans les diff6rents tissus et l'isolement du phosphag~ne musculaire. Une derni~re difference avec les r6sultats observ6s ~t Concarneau est l'identification de la phosphoarginine dans le muscle de Spirographis spallanzanii Viviani, confirm6e par la presence d'arginine comme unique constituant guanidique des tissus chez cet animal. Bien que ce phosphag~ne soit de beaucoup le plus r~pandu chez les Invert6br6s, il ne nous avait pas 6t6 donne3 de le rencontrer chez les Ann61ides Polych~tes marines ~tudi6es pr~c6demment*.

Conclusions L'analyse chrSmatographique des extraits de sept Ann61ides Polych~tes r6colt6es dans la bale de Naples a montr6 la pr6sence d'arginine, de glycocyamine, de taurocyamine et de cr~atine chez celles-ci. [,es m~mes d6riv~s avaient 6t6 rencontr6s chez les Ann61ides Polych~tes pr~c6demment ~tudi6es en Bretagne (Concarneau). Seules certaines differences ont 6t6 not~es dans la r6partition de ces guanidines, en particulier le plus grand hombre d'esp6ces h cr~atine chez les Ann61ides m6diterran6ennes et la presence d'argininephosphate dans le muscle de l'une d'elles, Spirographis spallanzanii Viviani*. Aucun d6riv6 guanidique nouveau ou identique h ceux d6jh isol6s chez des Vers d'une autre classe (hirudonine, lombricine) n'a 6t6 observC Le groupe des Ann61ides Polych~tes parait donc assez homog~ne en ce qui concerne la nature des d6riv~s guanidiques pr6sents dans les tissus et il semble d6j~ possible de syst~matiser certains des r6sultats obtenus, entre autres la r~partition exclusive de la glycocyamine chez des Polych~tes Errantes et celle de la taurocyamine chez des Polych~tes S6dentaires. II. ETUDE DES CONSTITUANTS GUANIDIQUES ET DU PHOSPHAGENE

D'MRCA NOdE L. Partie Exp(rimentale (1) Etude chromatographique des constituants guanidiques A. Preparation des extraits. Les animaux, r~colt~s fi Tarente, ont ~t~ d6barrass~s de leurs coquilles; 1000 g de tissus frais ont ~t~ homog~n~is~s avec 1500 ml *Toutefois, la pr6sence d'une forte proportion d'arginine dans les tissus de Lanicea conchilega, et de Sabella pavonina permet d'envisager que l'argininephosphate serait ~galement le phosphag~ne musculaire chez ces Ann~lides.

SUR LES DERIVI~S GUANIDIQUES ET LE PHOSPHAGI~NE DE QUELQUES ANNI~LIDES POLYCHI~TES

51

d'eau, ammen6s h p H = 3 par l'acide sulfurique et port6s 5 l'6bullition pendant 10 min. Apr~s refroidissement, le m61ange a 6t6 centrifug6 et le r6sidu extrait nouveau par 1000 ml d'eau. Les liquides surnageants rdunis ont 6t6 d6fdqu6s par l'acdtate basique de plomb et l'exc~s de plomb 61imind par traitement h l'hydrog~ne sulfur6. L'extrait ainsi pr6par6 a dt6 concentr6 sous vide ~ environ 1 1. et purifi6 par passage sur rdsines 6changeurs d'ions: on l'a tout d'abord filtr6 h travers une colonne d'Amberlite IRC 50 H +. L'effluent de cette colonne ainsi que les lavages l'eau ont ~t6 rassemblds et r6serv& pour un traitement ult6rieur. Les d~rivds guanidiques fixds ont fit6 6luds par l'acide acdtique M ; l'dluat ac&ique, concentrfi 5 sec sous vide et repris par l'eau, a dtd traitd ~ nouveau sur Amberlite IRC 50, employde alternativement sous forme sodique, tamponn6e 5 p H = 7,0, et sous forme H + (Robin et al., 1957a). La fraction ainsi obtenue (fraction I) a fit6 analysde par chromatographie sur papier. Une autre fraction (fraction II) a fitd obtenue en filtrant l'effluent aqueux de la premi+re colonne d'Amberlite IRC 50 H + travers une colonne de Permutite C 50 H + et en dluant avec de l'ammoniaque 2 N les guanidines fix6es. La fraction I I I a &6 constitude par l'effluent et les lavages ~ l'eau de la colonne de Permutite C 50; cette fraction, tr~s acide, a ~td neutralis6e avant chromatographie sur papier par passage sur Permutite A 300. Le fractionnement sur ces diff6rentes r~sines et les rdsultats obtenus sont sch6matisfis dans la Fig. 1. Extrait d'Arca noae L.

I

Amberlite IRC 50 H + H~O I AcOH M

I

Permutite C 50 H + [

HzO [ AmOH 2N

I

I

Amberlite IRC 50 H + H20 [ AcOH 0,5 M

Permutite A 300 H20 fraction III aucun d6riv~ guanidique

I

Amberlite IRC 50 Na + pH = 7,0 H20 [ AcOH 0,5 M

fraction II 2 guanidines monosubstitudes non identifi~es (traces) FIG. 1.

fraction I arginine (+ + + ) agrnatine (traces) arcaine (traces)

B. Chromatographie sur papier des extraits et rdsultats obtenus. Ira chromatographie des extraits a 6t6 opdr6e sur papier Whatman n ° 1, dans les solvants suivants: (1) n-butanol-acide acdtique-eau (73:10:17); (2) pyridine-alcool isoamylique-acide ac6tique-eau (80:40 : 10 : 40) ; (3) pyridine-alcool isoamyliqueeau (80: 40: 70) ; (4) pyridine-alcool isoamylique-ammoniaque-eau (80: 40:10:40) ; (5) n-propanol-acide acdtique-eau (73:10: 17); (6) n-propanol-ammoniaque-eau (73:20:7). Apr&s s6chage, les chromatogrammes ont 6t6 r6v61ds par la rdaction

52

J. ROCHE, Y. ROBIN, N.-v. THOAI ET L. A. PRADEL

de Sakaguchi, pour la recherche des d6rivfis guanidiques monosubstitu~s, et par la r6action de Jaff6 ou celle au diac&yle-c~-naphtol, pour la recherche des d6riv6s guanidiques disubstitu6s asym&riques (cr6atine) (Roche et al., 1957). Les r~sultats peuvent ~tre ainsi r6sum~s: la fraction I renferme des quantitfis tr6s importantes d'arginine, accompagn6e de traces d'arcaine et d'une autre guanidine monosubstitu6e qui pr6sente dans t o u s l e s solvants utilis~s le m~me R! que l'agmatine t~moin et qui, comme cette derni~re, donne une r6action positive la fois/i l'hypobromite-c~-naphtol et ~ la ninhydrine. La fraction II renferme, l'&at de traces, deux guanidines monosubstitu6es que nous n'avons pas pu identifier, &ant donnfies les trop faibles quantitds pr~sentes; leur R! pourrait correspondre dans les solvants (1) et (2) respectivement ~ celui de la glycocyamine et de la tombricine. La crdatine qui, d'apr+s ses caractbres de fixation sur r6sines, devrait se trouver dans cette fraction, n'a pas 6tfi d6cel~e dans les extraits &udi~s. Enfin la troisi+me fraction, ainsi que les effluents aqueux des deux derni~res colonnes d'Amberlite, ne semble contenir aucune guanidine substitute. En r6sumfi, les d~riv6s guanidiques des tissus d'Arca noae sont constitufis essentiellement par de l'arginine, ~t c6t6 de laquelle nous avons d6cel6 des traces d'arcaine, d'agmatine, et de deux guanidines monosubstitu~es qui n'ont pas pu ~tre identifi6es. (2) Isolement et identification du phosphag~ne d'Arca noae L. 500 g de muscles d'Arca noae, recueillis dans la glace, ont ~t6 homog~n~is~s au Waring-blendor avec 600 ml d'acide trichlorac6tique ~ 20 pour cent pr~alablement refroidi 5 - 10°C. Le m61ange a 6t6 agit6 ~ - 10°C pendant 15 rain, puis centrifug6 fi 0°C. Le liquide surnageant a 6t6 recueilli et neutralis6 imm6diatement pH =7,6, par de la soude ~ 30 pour cent. Le r~sidu a ~t6 repris par 500 ml d'acide trichlorac6tique fi 10 pour cent glac6, agit6 10 rain et centrifug~ 5 0°C; le liquide surnageant a &6 neutralis~ par la soude fi 30 pour cent. Les extraits neutralists ont 6t6 rassembl6s (volume total 1200 ml) et additionn~s de 30 ml d'une solution de bromure de baryum h 25 pour cent, puis de deux volumes d'alcool 5 95 ° glac6. Apr~s une nuit h 0°C, le pr6cipit6 form~ a ~t6 recueilli par centrifugation; il renferme le sel de baryum du phosphag+ne. Repris par l'eau et extrait par acidification chlorhydrique jusqu'h pH =2,0 ~l - 1 0 ° C , il a laiss6 un r6sidu insoluble que l'on a 61imin~ par centrifugation. I.e liquide surnageant a ~t6 additionn~ d'une goutte d'acide sulfurique pur et le sulfate de baryum form6 a 6t6 centrifug6. La solution a &d ammen6e ~ pH =7,6 par de l'ammoniaque concentr6e, afin d'~liminer les phosphates min6raux qui pr~cipitent et sont centrifug6s. Le liquide surnageant a alors ~t6 additionnd de deux volumes d'6thanol 95 °. Le pr6cipit~ blanc et g61atineux form6 a 6t6 recueilli par centrifugation et extrait par 100 ml d'eau distill~e et le r~sidu insoluble trait~ h nouveau par 50 ml d'eau. Les deux extraits aqueux rassembl6s ont ~t6 concentr~s h environ 10 ml sous vide. Nous avons r6alis6 dans cette solution l'identification du phosphag~ne par chromatographie sur papier, selon la technique decrite plus haut pour l'identification du phosphag6ne de Spirographis spallanzanii Viviani.

SUR LES Dt~RIVES GUANIDIQUES ET LE PHOSPHAGENE DE QUELQUES ANNELIDES POLYCHI~TES

53

Dans tous les solvants et pour toutes les r~vdlations utilisdes (ninhydrine, esters phosphoriques et Sakaguchi apr~s hydrolyse acide du chromatogramme), la tache du phosphag~ne isold occupait la mSme position que celle de l'argininephosphate tdmoin. Nous pouvons donc conclure h l'identitd dn phosphagSne d' A r c a noae L. et de l'argininephosphate. Discussion des Resultats

L'dtude des constituants guanidiques d ' A r c a noae L., dont nous esp~rions tirer des 6claircissements sur le r61e biologique de l'arcaine chez lez Invert~br~s, est loin de nous avoir apport6 les renseignements que nous en attendions. L'identification du phosphag+ne ~ l'argininephosphate ne nous a pas surpris, car les ]VIollusques semblent former un groupe homog+ne quant ~ la nature de leur phosphag~ne musculaire; de plus, les quantit6s d'arcaine isol~es par Kutscher et Ackermann (1931), soit 62,5 mg par kg de tissu frais d'Arca noae L., ne permettaient pas d'envisager la participation de cette guanidine fi la formation d'un unique ddriv~ phosphorique labile. Mais nous avons par contre 6tfi frapp6s par la faible teneur en arcaine des animaux frais ~tudifis ~t Naples off, sur un kg de tissus trait6s, nous n'avons pu mettre en fividence, malgr6 la sensibilit6 des techniques employdes, que des traces de ce d6riv6. Nous avons comparfi par chromatographie sur papier les extraits d'Arca noae L. pr6par6s au cours de ce travail fi des extraits de Sangsue pr6par~s ~ Concarneau et d'oh nous avons isol~, ~ c6td de l'hirudonine, environ 13 mg de sulfate d'arcaine par kg de tissu frais; ces extraits 6taient sensiblement plus riches en arcaine que ceux d'Arca noae L. L%tude d ' A r c a noae L. nous a montrd une dnorme disproportion entre les quantitds d'arginine et d'arcaine prdsentes; elle nous a 6galement rdv616 l'existence, c6t6 des traces d'arcaine, de faibles quantit6s d'agmatine et de traces ~ peine d6celables de deux guanidines monosubstitu6es que nous n'avons pu identifier. L'interprdtation de ces r6sultats est difficile car ni l'arcaine ni l'agmatine ne sont des m6tabolites courants chez les Invertdbr6s. La formation d'arcaine ~ partir de l'arginine n'a jamais 6t6 observ6e chez ces animaux et celle de l'agmatine ne l'a 6t6 qu'~ un faible taux et de mani+re inconstante (Thoai el al., 1953); les essais de d6gradation par des tissus d'Invert6brds eux-mSmes ont 6t6 pour la plupart n6gatifs (Guggenheim, 1951) Ces deux guanidines sont, au contraire, activement m6tabolis6es par des enzymes d'origine bact6rienne: l'agmatine peut se former par d6carboxylation de l'arginine par l'arginined6carboxylase d'E. coli (Gale, 1946) et par hydrolyse de l'arcaine, que r6alisent les bact6ries de la putrefaction (Linneweh, 1931a, b; 1932) avec formation interm6diaire de carbamylagmatine; une hydrolyse plus pouss6e aboutit ~ la carbamylputrescine et ~ la putrescine. De plus, l'arcaine et l'agmatine ont 4td identifides par Hayashi (1953) dans les produits form6s au cours de la putrdfaction d'organismes de poissons, c'est-~-dire h partir d'un milieu oh la seule guanidine monosubstitude prdsente initialement dtait l'arginine. II est donc permis de se demander si l'arcaine ne se formerait pas dans le tractus digestif, ~ partir de l'arginine et par action de bact&ies ingdr6es, chez les animau

54

J. ROCHE, Y. ROBIN, N.-v. THOA1 ET L. A. PRADEL

Off elle a ~t~ identifi~e. E n effet, t o u t au m o i n s dans le cas d'Hirudo medicinalis et d'_/ludouinia tentaculata, les a n i m a u x que n o u s avons r6colt~s v i v a i e n t dans la vase et, l o r s q u ' i l n o u s a gtg p o s s i b l e de localiser l ' a r c a i n e (_/tudouinia), c'est p r e s q u ' e x c l u s i v e m e n t d a n s le t r a c t u s d i g e s t i f q u e nous l ' a v o n s trouv~e ( R o b i n et al., 1956). Ira p r e s e n c e d ' a g m a t i n e ~ c6tg de l ' a r c a i n e ne p e u t que r e n f o r c e r cette h y p o t h b s e . L a f o r m a t i o n de l ' a g m a t i n e et de l ' a r c a i n e ~ p a r t i r de l ' a r g i n i n e sous l ' a c t i o n des bact~ries putr~fiantes p o u r r a i t alors ~tre envisag6e selon le s c h g m a : arginine -+ agmatine ~ carbamylagmatine ~ arcaine carbamylputrescine putrescine

Conclusions L e p h o s p h a g b n e m u s c u l a i r e d'Arca noae L. a dtd isol6 et identifid h l ' a r g i n i n e p h o s p h a t e ; ~trca noae L. ne se diffdrence d o n c pas ~ cet ~gard des a u t r e s M o l l u s q u e s . L ' a n a l y s e c h r o m a t o g r a p h i q u e des extraits tissulaires de cet a n i m a l n o u s a m o n t r d la p r d s e n c e de fortes q u a n t i t d s d ' a r g i n i n e , a c c o m p a g n 6 e de traces d ' a r c a i n e , d ' a g m a t i n e et de d e u x g u a n i d i n e s m o n o s u b s t i t u d e s non identifides, d o n t la signification b i o l o g i q u e est obscure. L e s faibles q u a n t i t d s d ' a r c a i n e caract~risdes et la p r d s e n c e associ~e de l ' a g m a t i n e font envisager p o u r ces d e u x ddrivds la possibilit~ d ' u n e o r i g i n e bact~rienne.

BIBLIOGRAPHIE ARNOLD A. et LUCK J. • . (1933) Studies on arginine. [II. The arginine content of vertebrate and invertebrate muscle. J. Biol. Chem. 99, 677-691. BALDWIN E. et YUDKIN W. H. (1950) T h e annelid phosphagen: with a note on phosphagen in Echinodermata and Protochordata. Proc. Roy. Soc. B 136, 614-631. GALE E. F. (1946) The bacterial aminoacid decarboxylases. Advanc. Enzymol. 6, 1-32. GREENWALD I. (1946) Presence of creatine in the testes of various invertebrates. Preparation of creatine phosphoric acid from fish testes. J. Biol. Chem. 162, 239-250. GUGGENHEIM M. (1951) Die biogenen Amine (4e 4dition) Karger, Bale. HANES C. S. et ISHERWOOD F. A. (1949) Separation of the phosphoric esters on the filter paper chromatograms. Nature, Lond. 164, 1107-1112. HAYASHI M. (1955) Investigations on food poisoning caused by ordinary putrefaction. V. Detection of histamine in poisoned "Samma-Sakuraboschi". J. Pharm. Soc. Japan 75, 1-4. HOBSON G. E. et REES K. R. (1955) The annelid phosphagens. Biochem. J. 61, 549-552. KUTSCHER F. et ACKERMANN D. (1931) l~ber das Arcain. Hoppe-Seyl. Z. 203, 132-134. KUTSCHER F., ACKERMANN D. et FL/3SSNER O. (1931) Ober das Arcain, eine bisher unbekkannte tierische Base. Hoppe-Seyl. Z. 199, 273-276. LINNEWEH F. (1931a) l~ber die Spaltung des Arcains durch Mikroorganismen. Hoppe-Seyl. Z. 200, 115-118. LINNEWEH F. (1931b) l]ber die Spaltung des Arcains durch Mikroorganismen. II. Mitteilung. Itoppe-Seyl. Z. 202, 1-7. LINNEWEH F. (1932) ~)ber die Spaltung des Arcains durch Microorganismen. III. Mitteilung: Der biologische Abbau des Agmatins zum Carbamyl-Putrescin. HoppeSeyl. Z. 205, 126-132.

SUR LES DI~RIVI~SGUANIDIQUESET LE PHOSPHAGI~NEDE QUELQUESANNI~LIDESPOLYCHI~TES 55 ROBIN Y. (1954) R6partition et m6tabolisme des guanidines monosubstitu6es d'origine animale. Th~se de Doctorat de Sciences Naturelles, Paris. ROBIN Y., THOAI N.-v. et PRADEL L. A. (1957a) M6tabolisme des d6riv6s guanidyl6s VII. Sur une nouvelle guanidine monosubstitu6e biologique: l'hirudonine. Biochim. Biophys. Acta 24, 381-384. ROBIN Y., THOAI N.-v., PRADEL L. A. et ROCHE J. (1956) Sur les constituants guanidiques des ceufs d'Audouinia tentaculata Mtg. C.R. Soc. Biol., Paris 150, 1892-1894. ROBIN Y., THOAI N.-v. et ROCHE J. (1957b) Sur la pr6sence d'arcaine chez la Sangsue, Hirudo medicinalis L. C.R. Soc. Biol. Paris 151, 2015-2017. ROCHE J. et ROBIN Y. (1954) Sur les phosphag~nes des Eponges. C.R. Soc. Biol. Paris 148, 1541-1543. ROCHE J., THOAI N.-v., GARCIA I. et ROBIN Y. (1952) Sur la nature et la r6partition des guanidines monosubstitu6es dans les tissus des Invert6br6s. Pr6sence de d6riv6s guanidiques nouveaux chez des Ann61ides. C.R. Soc. Biol. Paris 146, 1902-1905. ROCHE J., THOAI N.-v. et ROBIN Y. (1957) Sur la pr6sence de cr6atine chez les Invert6br6s et sa signification biologique. Biochim. Biophys. Acta 24, 514-519. SUZUKI T. et ~[URAOKAS. (1954) New guanidyl derivatives and aminoacids in the extract of Shellfish Cristaria plicata Leach. J. Pharm. Soc. Japan 74, 171-173. THIEM N.-v. et THOAI N.-v. (1959) Travaux non publi6s. THOAI N.-v. et ROBIN Y. (1954a) Mdtabolisme des d6riv6s guanidyl6s. II. Isolement de la guanidotaurine (taurocyamine) et de l'acide guanidoac6tique (glycocyamine) des Vers matins. Biochim. Biophys. Acta 13, 533-536. THOAI N.-v. et ROBIN Y. (1954b) M6tabolisme des d6riv6s guanidyMs. IV. Sur une nouvelle guanidine monosubstitu6e biologique: l'ester guanido6thyls6rylphosphorique (lombricine) et le phosphag~ne correspondant. Biochim. Biophys. Acta 14, 76-79. THOAI N.-v., ROCHE J. et ROBIN Y. (1953) M6tabolisme des d6riv~s guanidyl6s. I. D6gradation de l'arginine chez les Invertdbr6s matins. Biochim. Biophys. Acta 11 403-411. THOAI N~-v., ROCHEJ., ROBIN Y. et THIEM N.-v. (1953a) Sur la prdsence de la glycocyamine (acide guanidylac6tique), de la taurocyamine (guanidyltaurine) et des phosphag~nes correspondants dans les muscles de Vers matins. Biochim. Biophys. Acta 11, 593-593. THOAI N.-v., ROCHEJ., ROBIN Y. et THIEM N.-V. (1953b) Sur deux nouveaux phosphag~nes : la phosphotaurocyamine et la phosphoglycocyamine. C.R. Soc. Biol., Paris 147, 1241-1243. THOAI N.-v. et THIEM N.-v. (1957) Sels d'ammonium de phosphoglycocyamine et de phosphotaurocyamine, phosphag~nes de Vers matins. Isolement et synth~se. Bull. Soc. Chim. Biol. 39, 355-362.