Sur un dérivé de la sérine, la O-carbamyl-d -sérine, produit par un Streptomyces

24o

IH()(:IflMICA

ET B I O P H Y S I C A A(:T.\

VOL.

17 (f955)

SUR UN DI~RIVI;2 D E LA S t ~ R I N E , LA ()-CARBAMYL-D-SEI{INF~, PRODUIT

P A R UN S T R E P T O M Y C E S par

G. H A G E M . \ N N ,

L. I ' I : ' N : \ S S E

1~:'r J . T E I I . L O N

Services de Recherches Roussel-Uch~/, Romainvilh', Seine (Frallcc)

Au cours d'dtudes effectudes pour isoler un antibiotique prdsent dans les milieux de culture d'une souche nouvelle de Streplomyces, nous avons d6tectd, par chromatographie sur papier, un composant particuli6rement abondant, mais d@ourvu d'activitd antibiotique. Le fair que ce corps r6agisse avec la ninhydrine et forme facilement un complexe cuivrique rendait probal)le llt pr('sence d'un arrangement a-amino-aeide dans sa mol6cule. Des essais de chromatographic stir papier dans divers solvants ne permirent toutefois pas de l'identifier avec un des acides amin6s h notre disposition. Apr& isolement du compos6 it l'6tat cristallis6, notts avons rdussi ~t 6tablir qu'il s'agissait de la O-carbamyl D-sdrine, d6rivd de la D-s6rine non identifi6 jusqu'ici dans les milieux naturels. Nit_,

CO

O

CIf 2

CH

I

COOH

Ntt 2 ( ) - c u r b a n l y l I)-s('rinc

La production, ici ddcrite, de O-carbamyl D-sdrine par tm Streplomyces, re&ire d'etre rapproch6e de la ddeouverte %cente d'un autre ddrivd, d'origine dgalement fongique, l'azas6rine 5. Elle parait devoir souligner l'importance des fi-hydroxy a-aminoacides dans le mdtabolisme intermddiaire de certains miero-organismes. I'ARTIE

EXPt;;RIM 1'2NTALI';

Le Streptomyces producteur de la O-carl)amyl D-s~rine est tin microorganisme non d6crit jusqu'h prdsent, isol6 d'un sol du V&16zu(qa. I1 figure dans notre collection de souches sous la r(,fdrence T 4473 et le nora de Streptomyces polychromogenus lui a dtd attribud, en raison des variations caractdristiques de sa pigmentation.

Oblention de la O-carbamyl t)-sdrine Un milieu de culture h base de farine de soja deshuilde (2.6°o), dextrine (go%), glucose massd (r.o%), sulfate de magn6sium h 7 H20 (o.3%) et carbonate de calcium (o.2%) est ensemene6 h l'aide d'un inoculum constitud par des spores de Streptomyces polychromogenus, en suspension dans l'eau stdrile. Lit fermentation en culture ilnmergde est poursuivie dans les conditions habituelles de st6rilit6 et d'ad, ration, it 28-3 o°, pendant cinq jours. On verse un litre de bouillon filtr6 sur une colonne de 3oo g d'6changeur de cations, Bibliographic p. :4,3.

voI.. 17 ( 1 9 5 5 )

O-CARBAMYL-D-SERINE

241

Amberlite I R 12o, forme acide. Apff's lawtge par 500 ml d'eau, l'dlution est effectude par 8oo ml d'une solution aqueuse de pyridine ~ ioo~, ,,o. L'dluat renferme le nouveau compos6, ainsi que diverses substances neutres ou faiblement basiques. On eoncentre sous pression r6duite k 5o ml environ, puis ajoute 25 ml de m6thanol et abandonne pendant 24 heures k o °. Un pr6cipit6 cristallin se ddpose. Apr~.s filtration et lavage au m6thanol k 5 o °'o on recristallise deux fois dans l'6thanol "k j*o°,/o. Rendement' environ 1 g. La substance obtenue se prdsente sous forme de fines aiguilles incolores; F. lente: 226-234 ° (ddc.); F. instantande: 2380 (ddc.); laid . . . . . 19.6 ° (c := 2%, acide chlorhydrique N) et + 2 ° (c 2%, eau). Elle est trbs soluble dans l'acide chlorhydrique diln6 et dans l'eau chaude, soluble dans l'eau froide, trbs peu soluble dans l'dthanoI et le m6thanol, insoluble dans l'6ther. Formol-litration. La formol-titration 3 effectllde sur 3 ° mg de substance indique un poids moldculaire de 144 (148 pour la carbamyl-s6rine).

Analyse. C4HsO4N 2

148.1

Calculd: Trouv6 :

C%32.4 32.4

H%

5.4 5.5

N % 18. 9 18.8

Le dosage de l'azote selon "Ckx SL'ZI¢~ a fourni, en dix minutes, 9.6 !'o d'azote et en une henre 18.O°o d'azote, ce qui correspond respectivement "k un et deux atomes d'azote par mol6eule-gramme.

Rdactions colordes avec la ninhydrine avec les sels cuivriques avec te rdactif de Nessler avec la benzidine selon Sakaguchi (guanidines substitu(~es)2, 9 selon Pauly (imidazole) 11 selon Barrenschen-Weltmann (ur6es monosubstitu6es)l, ~

positive positive n6gative n6gative ndgative ndgative positive

Chromatographic sur papier. La substance chromatographide dans les solvants suivants, sur papier Whatman No. 1, ne fournit qu'une seule tache avec la ninhydrine. Solvants Ph6nol-tampon borate, pH 9.36 Phenol-tampon phosphate, pH 11.2 G Pyridine 80, alcool isoamylique 4o, eau 7° Butanol 75, acide formique 15, eau IO

Rl,, o.4x o.~ 7 0.33 o.oS

Elablissement de la structure Hydrolyse. L'hydrolyse acide de la substance libbre, en quantitds stoechiom6triques, de la s6rine, de l'ammoniac et de l'anhydride carbonique. (a) I g de produit est chauff6 k reflux dans 2o ml d'acide chlorhydrique 6 N pendant trois heures et demie. On 6vapore sous vide, reprend par l'eau et 6vapore de nouveau. On dissout alors dans 25 ml d'eau et verse sur une colonne renfermant 12 g d'Amberlite I R 12o, forme acide. La r6sine est lav6e ~ l'eau jusqu'k fin d'acidit6 chlorhydrique, puis Bibliographic p. 243.

242,

<. H.',.
VOI,.

17 (rq55)

dlu6e p a r I s o ml d ' a m m o n i a q u e 3 N. Cet dluat est dvapord "t sec sous vide, puis le rdsidu est recristallisd deux fois en ('thanol dilud. R e n d e m e n t : o.0 g de grandes aiguillcs incolorcs; F. 2 2 q ' (ddc.); [iaill~ -I3.2 ° (c :- I%,, acidc c h l o r h y d r i q u c N). F~SC:Ht~R1 indique un p o u v o i r r o t a t o i r e voisin p o u r la l>sdrine: - I4. 3 .

Analyse. CaHvOaN

Io5.I

Calculd: "l'rouvd :

C",, 34.3 34-5

H°i,

6.7 6.8

0 % 45-7 46. I

N",', I3.3 *3. I

(b) IO mg de p r o d u i t sont hydrolysds en tube scelld p a r z ml d ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e 0 N, it too ° p e n d a n t eo heures. Aprbs alcalinisation p a r le c a r b o n a t e de sodium, un e n t r a i n e m e n t it la v a p e u r p e r m c t de titrer, d a n s le distillat, une substance basique volatile (ammoniac ou amine) r c p r d s e n t a n t 5 o % de l ' a z o t e total. (c) zoo mg de p r o d u i t sont soumis it l ' h y d r o l y s e p a r ro ml d ' a c i d e sulfurique 6 N it reflux. L ' c n s e m b l e des gaz entraind p a r un c o u r a n t d ' a z o t e , e x e m p t d ' a c i d e carbonique, est captd dans 2o ml de soude 2 N. Au bout de 4 heures, llt solution sodique est transvasde dans role time c?mique, additi~mndv de Io ml de chlorurc d ' a m m o n i m n it ~o'!o, portde "t l'6bullition, pnis a d d i t i o n n d e de io ml de chlorure de b a r y u m it ~o%. l.e prdcipitd form(., filtrd et l a r d ;t chaud, est alors repris p a r ro ml d ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e N d o n t on titre l'exc~'~s p a r la soude N. La valeur trouv6e c o r r e s p o n d a o.¢)7 moldcule d ' a n h y d r i d e c a r b o n i q u e p o u r mac moldcule d ' a i n m o n i a c libdr('e p a r hydrolyse. L a sdrine, traitde d a n s ces conditions, ne lib6re pas d ' a n h y d r i d e carboniquc. I . ' d t h y l u r 6 t h a n e , p a r contre, cn fournit 0.9o moldcule. ()xrdalion ~eriodiqm~. l.a f o r m a t i o n d ' a m m o n i a c t)ar o x y d a t i o n periodiquc de lit s(,rine est Iide au fait que cettc substance prdsente sur d e u x c a r b o n e s voisins ml g r o u p e amin(' ct un groupe h y d r o x y l e librcs. Le n o u v e a u compos6, soumis 5 cette o x y d a t i o n , nc d o n n e pas naissance it dc l ' a m n l o n i a c : i l prdsente donc mm s u b s t i t u t i o n sur le NH2, ou sur I'OH, ou sur les deux g r o u p e m e n t s . P a r contre, lorsqu'on op6re sur un h y d r o l y s a t acide, i)r('par(' c o m m e ci-dessus et ddbarrass(, des p r o d u i t s basiques volatils p a r e n t r a i n e m e n t ~t la va])eur d'eau, on lib6rc 5o% de I'azotc total, sous forme d ' a m m o n i a c . Formation de dearly? 2,4-dinitro /)hdn3,hL En proc('dant selon S.\N(;ICR"), on dissout i o o mg du n o u v e a u compos6 et 2oo mg de c a r b o n a t e de s o d i u m dans i o ml d'eau, puis a j o u t e I5 o mg de o,,4-dinitro fluorobenz~ne dissous dans 5 ° m l d'dthanol. Aprbs a g i t a t i o n p e n d a n t e heures, on dwtpore sous pression rdduite, lave ~t l'dther, puis acidifie p a r quehlues g o u t t e s d ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e concentrd. Lc ddrivd dinitrophdnyld qui prdcipite aussit6t est recristallisd dans l'alcool dilud et fournit des aiguilles jaunes, F. z(~6°. I1 prdsente une acidit6 qui ndcessite p o u r ~tre neutralistic ~ ml de soude N p o u r 3 I o mg de substance.

AJtalysc.

CloHIoOsN 4

Calcuh:: Trmlvd :

2~I4.2

C % 3S.e 38.o

H % 3.e 3.4

N '% ~7.8 *7 .0

On h y d r o l y s e 20 mg de ce ddrivd p a r 3 mi d ' a c i d e chlorhydriqm'. 6 N en t u b e scell6 p e n d a n t 4 heures 5 Ioo% e x t r a i t i~ l'6ther, dvapore ce solvant, puis c h r o m a t o g r a p h i c sur p a p i e r le r('sidu. Le p r o d u i t ainsi o b t e n u est i d e n t i q u e au ddriv6 dinitrophdnyl6 de la s~.rine v. I1 en rdsMte quc le n o u v e a u compos6 prdsente une fonction amine libre et q u ' a v a n t h y d r o l y s e le groupe h y d r o x y l e dtait substitud. IH[diographie p. 24, 3.

rOE. 17 (I955)

O-CAR1L\MYL-D-S~;RINE

243

Un hydrolysat acide, prdpar6 comme ci-dessus, puis alcalinis6 et soumis h un entrainement "t la vapeur, permet h nouveau de titrer I millimoldcule d'ammoniac pour 3Io mg de d6riv6. Le substituant fix6 h l'oxyg6ne n'a done pas 6td dlimin6 au cours de la f o r m a t i o n du ddriv6 dinitroph6nyld. Formation de complexe cuivrique. On chauffe IOO mg du n o u v e a u compos6 et 2o0 m g de c a r b o n a t e de euivre f r a i e h e m e n t prdeipit6, dans I o ml d ' e a u , au b a i n - m a r i e . 11 a p p a r a i t i m m d d i a t e m e n t une coloration bleue intense. Aprbs filtration et rcfroidissement, la sohltion laisse d6poser des p e t i t s e r i s t a u x bleus, F. 257 ° (d6e.). L ' e n s e m b l e de ces rdsultats m o n t r e que le n o u v e a u eompos6 est un d d r i v 6 0 - s u b s t i t u d de la sdrine, dans lcquel le s u b s t i t u a n t p e u t 5tre facilement dlimind p a r h y d r o l y s e en l i b d r a n t line moldeule d ' a m m o n i a e et une moldeule d ' a n h y d r i d e earbonique. Ce s u b s t i t n a n t ne conff, re pas de propri6tds basiques fl la mol6eule et fournit la r6aetion de B a r r e n s c h e n - W e l t m a n des ur6es substitu6es. Le seul groupe r 6 p o n d a n t h ees d i v e r s caractSres est le groupe c a r b a m y l e ( N H 2 - - C O - - ) . R~SUME Un n o u v e a u ddrivd de la sdrine, la O - c a r b a m y l D-sdrine, a 6t6 isol6 des m i l i e u x de c u l t u r e d ' u n e so uche n o u v e l l e de Slreptom),ces, p a r a d s o r p t i o n sur A m b e r l i t e I R 12o e t 61ution h la p y r i d i n e . l.a s t r u c t u r e de ce compos6 a 616 4 t a b l i e p a r l ' 6 t u d e des p r o d u i t s d ' h y d r o l y s e , p a r o x y d a t i o n periodique, ainsi que p a r f o r m a t i o n du d6riv6 d i n i t r o p h d n y l 6 e t du c o n l p l e x e c u i v r i q u e .

SUMMARY A serine d e r i v a t i v e , O - c a r b a m y l D-serine, h a s been i s o l a t e d from c u l t u r e m e d i a of a ne w Nlr@tomyces s t r a i n b y a d s o r p t i o n on A m b e r l i t e I R 12o a n d e l u t i o n w i t h p y r i d i n e . The s t r u c t u r e w a s e s t a b l i s h e d b y h y d r o l y s i s , p e r i o d i c acid o x i d a t i o n a n d p r e p a r a t i o n of t he d i n i t r o p h e n y l d e r i v a t i v e a n d the c o p p e r c o m p l e x .

ZUSAMMENFASSUNG Aus der K u l t u r l O s u n g eines n e u e n S l r e p l o m y c e s - S t a m m e s w u r d e d u r c h A d s o r p t i o n an A m b e r l i t 1R 12o u n d E l u t i o n m i t l ' y r i d i n ein Serinderiw~t, O - C a r b a m y l D-Serin, isoliert. Die S t r u k t u r der V e r b i n d u n g folgt aus der U n t e r s u c h u n g der H y d r o l y s e n p r o d u k t e , f e r n e r a us d e m E r g e b n i s der P e r j o d s ~ t u r e o x y d a t i o n sowie der D a r s t e l l u n g des D i n i t r o p h e n y l d e r i v a t e s u n d des Kupferk01nplexes.

BI B L I O G R A P H I E 1 H. K. BARRENSCHEN ET O. \VELTMAN) Biochem. Z., 131 (1922) 591. 2 C. DUMAZERT ET R. POGGI, Bull. soc. chim. biol., 21 (1939) I38I. 3 M. S, DUNN ET A. LOSHAKOFF, J. Biol. Chem., 113 0 9 3 0 ) 359. •t E . FISCHER ET \V. :\. JACOBS, Ber. deut. chem. Ges., 39 (19o6) 2942. 5 ,%. A. FUSARI, T. H. |~IASKELL, R. P. FROHARDT ET Q. R. BARTZ, .[. ~411l. Chem. Soc., 70 (1954) 288i. 6 1i. F. McFARREN, d n a l . Chem., 23 (1951) 168. 7 R. MON1ER ET L. Pt~;NASSE, Compt. rend., 230 (195 o) 1170. s D. M. ['. PHILtPPS, Biochim. Biophys. dcta, 13 (1954) 500. 9 j . ROCHE ET M. EYSSERIC-LAFON, Bull. soc. chim. biol., 33 (1951 ) 1437. to F. SANGER, Biochem. J., 39 (1945) 507 . 11 F. SANGER ET H. TuPpY, Biochem. J., 49 (E951) 463 •

Re~u le Io janvier 1955