Sur une nouvelle guanidine monosubstituée biologique, l'hypotaurocyamine (acide 2-guanidoéthanesulfinique) et le phosphagène correspondant

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

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BBA 3731

S U R U N E N O U V E L L E G U A N I D I N E M O N O S U B S T I T U I ~ E B I O L O G I QUE, L'HYPOTAUROCYAMINE

(ACIDE 2 - G U A N I D O ] ~ T H A N E S U L F I N I Q U E )

ET LE PHOSPHAGI~NE CORRESPONDANT YVONNE

R O B I N ET N G U Y E N V A N T H O A I

Laboratoire de Biochimie marine, Ecole Pratique des Hautes Etudes, Concarneau, Finist~re, el Laboratoire de Biochimie gdndrale et comparde, CollOge de France, Paris (France) (Re~u le 4 avril, I962 )

SUMMARY

A new monosubstituted biological guanidine derivative, hypotaurocyamine (2-guanidoethane sulphinic acid) and the related phosphagen Two new gnanido compounds, hypotaurocyamine (2-guanidoethanesulphinic acid) and the related phosphagen (N'-phosphorylhypotaurocyamine), are shown to be present in the muscle of Gephyrians: Phascolosoma vulgate Blainville and Phascolosoma elongatum Kfst. These tissues also contain small amounts of taurocyamine (2-guanidoethanesulphonic acid). The isolation of the new compounds from Phascolosoma vulgare tissues and their subsequent characterization are described. Small amounts of hypotaurocyamine have been shown to be present in the tissues Arenicola marina L., but taurocyalnine and phosphotaurocyamine are the main guanido compounds present in this marine worm. The biological significance of these new guanido sulphur compounds is discussed.

INTRODUCTION

L'~tude syst~matique des constituants guanidiques du muscle des Invert6br~s nous a d6j~ permis d'isoler et d'identifier chez des Vers quatre guanidines monosubstitu6es nouvelles: la lombricine (acide guanido6thyls~rylphosphorique) chez le Lombric 1, la glycocyamine (acide guanidoac6tique) chez le N6r6is z, la taurocyamine (acide 2-guanido6thanesulfonique) chez l'Ar6nicole 2 et l'hirudonine (diamidinospermidine) chez la Sangsuea, 4. Nous avons 6galement 6tabli que trois de ces bases participent, dans le muscle des animaux qui les renferment, ~ la formation des phosphag~nes correspondants: la phospholombricine 1, la phosphoglycocyamine5 et la phosphotaurocyamine 5, qui y jouent le r61e d6volu ~ la phosphoarginine chez la plupart des invert~br~s. Au cours d'un r6cent travail, nous avons mis ell ~vidence dans le muscle de deux G@hyriens, Phascolosoma vulgare Blainville et Phascolosoma elongatum Kfst., un d6riv6 guanidique monosubstitu~ inconnu, present A une concentration 61ev6e et accompagn6 de faibles quantitds de taurocyamine. Le d6riv6 nouveau a 6t6 isol6 des tissus du Phascolosome et identifi6 ~ l'hypotaurocyamine (acide 2-guanido~thaneBiochim. Biophys. Acta, 63 (I962) 4 8 1 - 4 8 8

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sulfinique) ; il a 6t6 retrouv6 en faibles proportions dans les tissus de l'Ar6nicole, dont les constituants guanidiques prineipaux sont la tauroeyamine et son d6riv~ phosphoryl6, la phosphotaurocyamine2, 5. Le phosphag~ne du Phaseolosome a ~galement 6t6 isol6 et nous l'avons identifi6 ~ la phosphohypotaurocyamine. Nous d6crivons ici l'isolement et l'identification de l'hypotaurocyamine et de la phosphohypotaurocyamine ~ partir du Phascolosome, Phascolosoma vulgare Blainville, et la caract6risation de l'hypotaurocyamine chez l'Ar6nieole, Arenicola marina L. Nous d~crivons accessoirement l'isolement de l'hypotaurine (acide 2-amino6thanesulfinique) des tissus du Phascolosome. PARTIE EXPI~RIMENTALEET Rt~SULTATS

Isolernent et identification de l'hypotaurine et de l'hypotaurocvamine chez le Phascolosorne Pr@aration et purification des extraits ~ Au total, 4 kg de Phascolosomes, Phascolosoma vulgare Blainville, ont 6t6 trait6s. Le protocole suivant a 6t6 adopt6: les animaux sont broy6s avec un volume d'eau distill6e bouillie et l'homog6nat, acidifi6 A pH 3 par l'acide sulfurique, est port6 l'6bullition 5 min sous azote. La pr@aration refroidie est centrifug6e; le liquide surnageant est r6serv6 et le r6sidu est extrait une seconde fois A chaud avec 1/2 volume d'eau distill6e bouillie. Apr~s centrifugation, les liquides surnageants sont r6unis et neutralis6s par la baryte; le pr6cipit6 barytique est 61imin6 par centrifugation. L'extrait limpide obtenu est d6salifi6 par passage sur Permutite-C-5o (H÷), trait6e avant l'emploi par HCI 2 N, H~O, NaOH 2 N, H20, HC1 2 N, H20. La totalit6 de la pr@aration est r6partie sur 4 colonnes de Permutite-C-5o (H +) (500 ml de r6sine par colonne), qui fixe l'hypotaurocyamine, l'hypotaurine et la plupart des d6riv~s basiques; la taurocyamine et la taurine sortent dans l'efltuent aqueux, off etles ont 6t6 caract6ris6es par chromatographie sur papier. Les colonnes sont lav6es $ l'eau distill6e bouillie, puis 61u~es par l'ammoniaque 2 N; les 61uats ammoniacaux, concentr6s sous azote sous pression r6duite, contiennent l'hypotaurocyamine, l'hypotaurine et de nombreux acides amin6s. Le r6sidu est repris par environ 200 ml d'eau, neutralis6 si n6cessaire ~ pH 7.0, puis ajust6 avec de l'eau et de l'acide formique ~ un volume total de 240 ml et ~t une concentration finale 0.02 M e n acide formique. Cet extrait est fractionn6 sur Dowex-5o X2 (H+), lOO-2OO mesh ayant au pr6alable subi ]e cycle: HC14 N, H~O, NaOH 2 N, H20, HC1 4 N, H20. L'ensemble de la pr@aration est r6parti sur 6 colonnes de r6sine (contenant ioo ml de r6sine chacune), 6quilibr6es au moment de l'emploi avec de l'acide formique 0.02 M. Le liquide ~ fractionner (4° ml par colonne) est filtr6 /~ travers la r6sine; on lave avec ioo ml d'acide formique 0.02 M, puis on 61ue avec de l'acide formique 0.5 M. L'efltuent est recueilli par fractions de 5o ml, ~ une vitesse d'6coulement d'environ 75 ml/h. Les fractions sont analys6es par chromatographie descendante sur papier Whatman No. I dans le m61ange pyridine - alcool isoamylique acide ac6tique - eau (80 : 4 ° : IO : 4 o) ; les chromatogrammes sont r6v616s par la r6action ~ la ninhydrine, caract6ristique des groupements amines primaires, par la -

* Toutes les op6rations de purification sur r6sines 6changeuses d'ions (Permutite-C-5o (H+) et Dowex-5o X2 (H+)) ont ~t6 effectu6es dans une chambre refroidie ~ 2o, avec des r6actifs pr6par~s l'eau distill6e bouillie et refroidis /~ 2° avant l'emploi.

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L'HYPOTAUROCYAMINE ET LE PHOSPHAGI~NE CORRESPONDANr

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r@action de Sakaguchi 6, caract@ristique des guanidines monosubstitu@es et par la r@action ~ l'iodoplatinate 7, caract@ristique du soufre lid ~ une fonction r@ductrice. L'hypotaurine sort, absolument s@par@e des autres d@riv@s basiques, dans les fractions 6 ~ IO. Elle donne la r@action ~ la ninhydrine et celle ~t l'iodoplatinate; son RE dans le m@lange solvant Utilis@ ici est 0.22 (RF de la taurine = 0.29). L'hypotaurocyamine sort, en moyenne, dans les fractions 26 ~ 35 ; ]es derni&res de ces fractions, qui sont les moins riches en hypotaurocyamine, sont souill@es de traces d'un acide amin@ de RE ---- 0.09. L'hypotaurocyamine donne la r@action de Sakaguchi et la r@action ~ l'iodoplatinate; son RE est 0.24 dans le solvant indiqu@ ci-dessus (RF de la taurocyamine = 0.34). Isolement et caractdrisation de l'hypotaurine

Les fractions contenant l'hypotaurine sont concentr@es sous azote sous pression r@duite. L'@vaporation est termin@e sous vide, sur P~05 et KOH. Le r@sidu, repris par un petit volume d'eau, est additionn@ d'alcool absolu jusqu'k trouble persistant; apr~s 24 h au frigidaire, il se forme un petit pr@cipit@ jaun~tre qu'on @limine par centrifugation. On ajoute ~t nouveau de l'alcool jusqu'~ trouble persistant et on @limine le pr@cipit@ huileux jaun~tre form@. Le liquide surnageant, parfaitement incolore, est additionn@ d'acTtone; il se forme rapidement un pr@cipit@ cristallin qu'on laisse d@poser pendant 24 h au frigidaire. Ce pr@cipit@ est s@ch@ k l'alcool-@ther, puis sous vide; p.f.---- 174°; th@orie pour l'hypotaurine 171-1720 (voir r@f. 8). Par addition d'ac@tone aux eaux-m~res, on obtient une deuxi~me fraction moins pure (p.f.---169-172°) qui est recristallis@e et rTunie ~ la premiere. Rendement total: 432 mg. L'hypotaurine isol@e des Phascolosomes pr@sente les mTmes caract~res physiques et chromatographiques que l'hypotaurine synth@tis@e par la m@thode de BRICAS

et al. 8, *.

Isolement de l'hypotaurocyamine

Les fractions contenant l'hypotaurocyamine pure sont concentr@es comme d@crit pour l'hypotaurine. Le r@sidu, qui se pr@sente sous forme d'une huile @paisse jaune clair, est repris par environ 3 ml d'eau et additionn@ d'alcool ~. 95 ° jusqu'A trouble persistant. On abandonne plusieurs jours /t - - i o °, on @limine le pr@cipit@ huileux jaun~tre form@ et on r@p@te l'op@ration une seconde fois. Les eaux-m@res sont alors additionn@es d'ac@tone jusqu% trouble persistant; apr~s une nuit ~t - - i o °, il s'est form@ un pr@cipit@ amorphe jaun~tre qu'on s@pare par d@cantation; le liquide surnageant, remis ~ - - i o ° pendant 24 h sans nouvelle addition d'ac@tone, laisse d@poser de magnifiques cristaux d'hypotaurocyamine, qu'on s~che/~ l'alcool-@ther, puis sous vide. Poids du pr@cipit@: 495 rag. L'analyse chromatographique du pr@cipit@ montre qu'il contient des traces de taurocyamine, provenant de l'oxydation spontan@e de l'hypotaurocyamine au cours du fractionnement sur Dowex, et qui sont impossibles A @liminer par recristallisation darts les divers solvants essay@s. On les @limine en fractionnant le m~lange sur des colonnes de P-cellulose, pr@alablement trait@e par NaOH o.i M, H20, HC1 o.I M, H20, et @quilibr@eau moment de l'emploi avec de l'acide ac@tique 0.05 M; une colonne de 50 ml, pr@par@e sous pression normale, permet de purifier IOO A 200 mg de produit, * Nous r e m e r c i o n s le Dr. BRICAS, q u i nous a a i m a b l e m e n t donn6 l ' Tc ha nt i l l on d ' h y p o t a u r i n e de synth@se utilis6 c o m m e p r o d u i t de rTfTrence au cours de ces expTriences.

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qui sont appliqu6s sur la colonne dans le minimum d'acide ac6tique 0.05 M (2 k 3 ml). On d6veloppe la colonne avec de l'acide ac6tique o.o5 M. La taurocyamine et l'hypotaurocyamine sortent toutes deux dans l'effluent acide, mais darts des fractions s6parfies: le pic de la taurocyamine se situe approximativement entre le 38~me et le 48~me ml d'effluent, celui de l'hypotaurocyamine entre le 54+me et le 85~me ml d'effiuent. On suit l'~lution par chromatographie sur papier, selon la technique d6crite ei-dessus. Les fractions contenant l'hypotaurocyamine pure sont r6unies et concentr6es sous vide sur PeO 5 et K O H ; le r6sidu est repris par l'eau et l'hypotaurocyamine est cristallis~e par addition d'alcool et d'ac6tone. On recristallise dans l'eau, l'alcool et l'ac6tone et on s~ehe le pr6cipit6 ~ l'alcooi-~ther, puis sous vide 8o °. Rendement : 36o mg (p.f. = 183-184°).

Identification de l'hypotaurocyamine Le d6riv6 isol6 des Phascolosomes se pr~sente sous forme de plaquettes incolores brillantes (p.f. = 183-184°). n donne la r6action de Sakaguchi ~ et la rfiaction l'iodoplatinate ~, qui montrent la pr6sence d'un radical guanidique monosubstitu6 d'une part et d'une fonction soufr6e r6ductrice d'autre part ; il ne donne pas la r6action la ninhydrine. Par oxydation ~t l'eau oxygfn6e, il se transforme quantitativement en taurocyamine (caract6ris6e par chromatographie sur papier dans divers solvants), et la r6action ~ l'iodoplatinate disparait parall&lement tandis que la r6action de Sakaguchi persiste avec une intensit6 sensiblement 6gale. La comparaison du produit isol6 des Phascolosomes avec l'hypotaurocyamine pr~par6e par guanidylation de l'hypotaurine de synth~se au moyen de la S-m~thylisothiour6e montre que le d6riv6 naturel et celui de synth~se ont le m~me comportement chromatographique sur r~sines et sur papier et la mfime mobilit6 61ectrophor6tique dans divers tampons. L'analyse ~16mentaire a donn6 les r6sultats suivants: C, 24.2 %; H, 6.0%; O, 20. 9 %; N, 27.8 %; S, 22.o % (th6orie pour l'hypotaurocyamine C3H~O~NaS = 151.19: C, 23.83%; H, 6.0%; O, 21.16%; N, 27.79%; S, 21.21%). L'ensemble des caract~res analytiques permet de conclure ~ l'identit6 du d6riv~ isol6 des Phascolosomes ~ l'hypotaurocyamine (acide 2-guanido6thanesulfinique) NH~ HN = C( NH -- CH~ -- CH~ -- SO~H

Caractdrisation de l'hypotaurocyamine chez l'Ardnicole 2o g d'Ar6nicoles entiers, Arenicola marina L., ont 6t6 broyfs avec 2o ml d'acide ac6tique ~ 2 % et l'homog6nat a 6t6 chauff6 pendant io min au bain-marie bouillant. Apr~s centrifugation, l'extrait a ~t~ neutralis6 par l'ammoniaque et filtr6 /~ travers une colonne (volume 25 ml) de Permutite-C-5o (H +) ; la cotonne a 6t6 lav~e/~ l'eau distill6e bouillie, puis 61u6e par l'ammoniaque 2 N ; la fixation et l'61ution ont 6t6 op6r6es A la chambre froide. L'61uat ammoniacal a 6t6 concentr6 sous azote sous pression r6duite et le r~sidu a ~tfi repris par l'eau. L'analyse chromatographique sur papier de l'extrait ainsi obtenu dans diff6rents m61anges de solvants a montr6 l'exisfence d'un d~riv6 r6agissant avec le r~actif de Sakaguchi au diac~tyle ~-naphtol et

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avec le r6actif A l'iodoplatinate, et ayant le m~me RF que l'hypotaurocyamine isol6e des Phascolosomes. Bien que l'hypotaurocyamine se trouve dans les tissus de l'Ar6nicole A une concentration beaucoup plus faible que dans ceux du Phascolosome, et qu'A l'inverse de ce qui est observ6 chez ce dernier elle y soit accompagn~e d'une forte proportion de taurocyamine, sa pr6sence chez l'Ar6nicole ne saurait cependant ~tre raise en doute.

Isolement et identification de la phosphohypotaurocyamine dans le muscle du Phascolosome Isolement du phosphag~ne du Phascolosome 200 g de muscles de Phascolosomes, Phascolosoma vulgare BlainviUe, diss6quds o °, ont 6t~ finement broy6s et extraits A - - 5 ° par 400 ml d'acide trichloroac6tique ~t 5 % froid additionn6 de 0. 5 % d'acide ascorbique comme antioxydant. Aprbs 1/4 d'heure d'agitation, la pr6paration a 6t~ centrifug6e A o °. Le liquide surnageant a ~t6 neutralis6 par la soude jusqu'A pH 6 environ, puis par la baryte jusqu'A virage de la ph6nolphtal~ine, et additionn6 de IO ml d'une solution aqueuse de bromure de b a r y u m A 20%; apr~s I h A o °, le pr~cipit~ form6 a 6t6 61imin6 par centrifugation et le liquide surnageant a dt6 additionn6 de 2 vol. d'6thanol refroidi A - - I O °. La pr6paration a 6t6 abandonn6e pendant 2 h A - - I O ° ; le pr~cipit6 form6 a 6t6 alors recueilli par centrifugation, lavd A l'alcool et s6ch~ A l'alcool-~ther. Nous avons ainsi obtenu 1.2 g de phosphag~ne impur contenant au total 5 mg de phosphore hydrolysable en I rain A ioo ° dans HC1 o.I N. Le phosphagbne brut a 6t6 purifi~ par extraction k o ° avec une solution aqueuse d'acide ascorbique A i % (IO ml/g de phosphag&ne), ~limination du r~sidu insoluble et fractionnement de l'extrait par des concentrations croissantes d'~thanol. Les fractions les plus pures, contenant environ 1% de phosphore labile, ont pr6cipit6 entre 0.25 et 2 vol. d'~thanol; elles ont 6t~ r6unies et utilis6es pour l'identification du phosphag6ne. Identification du phosphag~ne du Phascolosome d la phosphohypotaurocyamine L'identit6 du phosphag~ne du Phascolosome A l'hypotaurocyamine phosphate a ~t6 d6montr6e par deux s6ries d'essais: l'analyse chromatographique du phosphagbne isol6 des tissus d'une part et l'6tude des propri6t6s de la phosphokinase du muscle de Phascolosome d'autre part. Analyse chromatographique du phosphagbne: Une solution aqueuse du phosphag~ne a 6t6 analys6e par chromatographie descendante sur papier W h a t m a n No. I (prdalablement lav6 A l'acide ac6tique 2 N, puis A l'eau et s6ch6), darts le m61ange pyridine - ~ t h a n o l - ammoniaque - H20 (3:3:3: I), comparativement avec divers phosphag~nes de synthbse: la phosphotaurocyamine 9, la phosphoglycocyamine 9, la phosphocr~atine 1° et la phosphoarginine aa. Les chromatogrammes ont 6t6 r6v616s parallblement par le r6actif des esters phosphoriqueslL par le r~actif de SakaguchP avant et apr~s hydrolyse acide du chromatogramme et par le r~actif/t l'iodoplatinate 7. La r6v61ation des esters phosphoriques montre que le RF du phosphag~ne isol6 du Phascolosome se diff6rencie de celui des autres phosphag~nes essay6s, en particulier de celui de la phosphotaurocyamine (voir tableau ci-dessous). La r6action de Sakaguchi, n6gative avant hydrolyse, fait apparaitre, apr~s hydrolyse acide du chromatogramme, une tache au niveau de celle r6v616e par la r6action des esters phosphoriques darts ]e Biochim. Biophys. Acta, 63 (I962) 481-488

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,z. R O B I N , N. V. T H O A I

phosphag6ne du Phascolosome; le groupement phosphorique labile de celui-ci est donc bien fix6 sur le radical guanidique eomme dans les autres phosphag6nes. Enfin, la r6action ~ l'iodoplatinate, n6gative avec les autres phosphag6nes, est positive avec eelui du Phascolosome, ce qui indique la pr6sence d'une fonction soufr6e r6ductrice. Ces caract~res sont r6sum6s dans le Tableau I. TABLEAU

I

RI~ACTIONS DE DIVERS PHOSPHAG~NES

Rdactions d' identit/ Phosphag~nes

RF

Sakaguchi Phosphove

Iodoplatinate Non hydrolysd

HydrolysO

Phosphohypot aurocyamine

o.31

+

--

+

Phosphotaurocyamine

o.42

+

--

+

--

-t-

Phosphoarginine

o.24

+

--

+

--

Phosphocr6atine

o.3 8

+

--

--

--

Phosphoglycocyamine

0.27

+

--

+

--

La solution du phosphag6ne de Phascolosome a 6galement 6t6 chromatographi6e, avant et apr6s hydrolyse par HC1 o.I N pendant I min ~ ioo °, dans le m61ange pyridine - alcool isoamylique - acide ac6tique - H20 (8o :4o : Io : 4o), comparativement avec la taurocyamine de synth6se 9 et l'hypotaurocyamine isol6e du Phascolosome. La r6v61ation du chromatogramme par la r6action de Sakaguchi montre qu'il n ' y a dans la solution non-hydrolys6e aucun corps r6agissant avec le r6actif ~ l'~-naphtolhypobromite, mais que l'hydrolyse acide de celle-ci fait apparaitre de l'hypotaurocyamine accompagn6e de traces de taurocyamine. E,tude de la phosphokinase du Phascolosome: L'6troite sp6cificit6 des guanidines phosphokinases vis-a-vis de leur substrat naturel nous a permis de contr61er la nature du phosphag~ne du Phascolosome par l'6tude des propri6t6s de l'enzyme responsable de son m6tabolisme dans le muscle de cet animal. Nous avons purifi6 partiellement la phosphokinase du muscle de Phascolosoma vulgare Blainville et nous avons 6tudi6 son activit6 vis-a-vis de diff6rents substrats dans la r6action r6versible: base guanidique 2_ ATP ~

phosphag~ne + ADP

comparativement avec celle de la tauroeyamine phosphokinase d'Arenicola marina L. pr6par4e

selon

PRADEL

E T THOA113.

Nous n'entrerons pas ici darts le d6tail de ces exp6riences qui feront l'objet d'une prochaine publication 14, mais nous avons pu constater: (a) que, dans la r6action [i], la phosphokinase du muscle de Phascolosome 6tait beaucoup plus active sur l'hypotaurocyamine que sur la taurocyamine et les autres substrats essay6s; (b) que, dans la r6action [2], le transfert du P labile du phosphag6ne sur I'ADP 6tait plus 61ev6 avec le phosphag6ne isol6 du Phascolosome qu'avec la phosphotaurocyamine de synth6se ; (c) que ces r6sultats 6taient invers6s chez l'Ar6nicole pour la r~action [I]. L'ensemble de ces r6sultats nous permet de conclure ~ l'identit6 du phosphag6ne du Phascolosome ~ la phosphohypotaurocyamine. B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 63 (1962) 4 8 1 - 4 8 8

L'HYPOTAUROCYAMINE ET LE PHOSPHAGENE CORRESPONDANT

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DISCUSSION DES RI~SULTATS

Si la pr6sence de la taurocyamine a d6j~ 6t6 signal6e chez divers Invert6br6s matins ~, 15,16, dans l'urine d'Homme et de Rat 17 et dans le cerveau de Mammif~res is, celle du d6riv6 sulfinique correspondant, l'hypotaurocyamine, n'avait jamais encore 6t6 d~crite. Le d6riv6 sulfinique amin6 correspondant par contre, l'hypotaurine, est bien connu par le r61e qu'il joue dans la biog6n6se de la taurine chez les Mammif~res19,~° et sa pr6sence a 6galement ~t6 d6cel6e chez des Invert6br6s marins 15,31,~2. L'identification de l'hypotaurocyamine chez des Vers matins pose le probl~me de sa signification biologique chez ces animaux. Chez les Phascolosomes, dont les tissus sont riches en hypotaurocyamine et pauvres en taurocyamine, la pr6sence de cette premibre peut s'expliquer par sa participation ~t la formation du phosphag+ne musculaire, la phosphohypotaurocyamine. Toutefois, il n'est pas exclu qu'elle y joue parall+lement, darts la biosynthbse de la taurocyamine, un r61e analogue 5. celui de l'hypotaurine dans la biog6n6se de la taurine: la taurocyamine se formerait ainsi non par amidination directe de la taurine, mais par oxydation de l'hypotaurocyamine formde vraisemblablement par amidination de l'hypotaurine. Cette hypoth&se, qui est actuellement ~ l'6tude dans notre laboratoire ~3, est appuy6e par la pr6sence, dans les tissus de l'Ar~nicole, riches en taurocyamine qui y constitue la base du phosphagbne musculaire, d'tme faible quantit6 d'hypotaurocyamine. L'hypotaurocyamine pourrait doric constituer chez ces deux Vers le pr6curseur direct de la taurocyamine ; mais chez les Phascolosomes, qui vivent dans des fonds matins plus profonds et par cons6quent moins a6r6s que ceux off vivent les Ar6nicoles, l'oxydation de l'hypotaurocyamine en taurocyamine peut ~tre g6n6e, ce qui expliquerait que l'organisme se soit adapt6 ~ utiliser principalemeut le d6riv6 sulfinique. La pr6sence d'hypotaurocyamine dans le muscle n'est pas un caract+re commun /~ tous les G@hyriens: chez le Siponcle, Sipunculus nudus L., en effet, les seules bases guanidiques pr6sentes dans ce tissu sont l'arginine, qui y participe ~t la formation du phosphag~ne musculaire 24, et l'octopine ~5, guanidine monosubstitu~e commun~ment rencontr6e dans le muscle des Mollusques. Enfin, la caract6risation de l'hypotaurocyamine et de son d6riv6 phosphorylfi dans le muscle du Phascolosome apporte une preuve nouvelle de la vari6t6 des constituants guanidiques musculaires chez les Vers. Si l'on consid~re en particulier la r@artition g6ndrale des phosphag~nes chez les Invert6brfis, on constate qu'en dehors des Vers la plupart renferment de la phosphoarginine et un petit nombre de la phosphocr6atine. Chez les Vers, on rencontre non seulement la phosphoarginine, chez un G@hyrien, le Siponcle e4, et chez une Anndlide Polych~te Sddentaire, le Spirographe 26, et la phosphocr~atine chez diverses Ann6lides Polychfites27, mais aussi la phospholombricine chez une Ann61ide O]igoch&te 1, la phosphoglycocyamine chez des Anndlides Polych~tes Errantes 5, la phosphotaurocyamine chez des Ann6lides Polych~tes S6dentaires 6 et la phosphohypotaurocyamine chez un G@hyrien, le Phascolosome, comme nous venons de le d6montrer dans le pr6sent travail. R]~SUMt~

Deux guanidines substitu6es biologiques nouvelles, l'hypotaurocyamine (acide 2guanido6thane sulfinique) et le phosphag~ne correspondant, la phosphohypotaurocyBiochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 481-488

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Y. ROBIN, N. V. THOAI

amine, ont 4t4 identifiies dans le muscle de Giphyriens, Phascolosoma vulgare Blainville et Phascolosoma elongatum Kfst., ~ c6t4 de petites quantitis de taurocyamine. Les techniques d'isolement et d'identification de ces deux dirivds ~ partir des tissus de Phascolosoma vulgare Blainville sont dicrites. L'hypotaurocyamine a 4galement 4t4 caractirisie, bien qu'en proportion beaucoup plus faible, chez une Annilide Polych~te, Arenicola marina L., dont les tissus sont connus pour leur richesse en taurocyamine et en phosphotaurocyamine. La signification de ces nouveaux diriv4s guanidiques soufr4s est discutie. REMERCIEMENTS

Ce t r a v a i l a 4t4 effectu4 a v e c l'assistance technique de Mademoiselle Y. GUILLOU,

que nous remercions de sa collaboration. BIBLIOGRAPHIE 1 N. v. THOAI ET Y. ROBIN, Biochim. Biophys. Acta, 14 (1954) 76. 2 N. v. THOAI ET Y. ROBIN, Biochim. Biophys. Acta, 13 (1954) 533. 3 j . ROCHE, N. v. THOAI, Y. ROBIN ET L. A. PRADEL, Compt. rend. soc. biol., 15o (1956) 1684 . 4 y . ROBIN ET lkT. V. THOAI, Compt. rend., 252 (I961) 1224. 5 N. v. THOAI, J. ROCHE, Y. ROBIN ET 1~. V. THIEM, Compt. rend. soc. biol., 147 (1953) 1241. 6 j . ROCHE, 1W. V. THOAI ET J. L. HATT, Biochim. Biophys. Acta, 14 (1954) 71. H. M. VV'INEGARD, G. TOENNIES ET R. J. BLOCK, Science, lO8 (1948) 5o6. 8 E. BRICAS, F. KIEFFER ETC. FROMAGEOT, Biochim. Biophys. Acta, 18 (1955) 358. 9 N. v. THOAI ET N. V. THIEM, Bull. soc. chim. biol., 39 (1957) 35510 L. A. PRADEL, 1~. V. THIEI~t, P. PIN ET N. v. THOAI, Bull. soc. chim. biol., 41 (1959) 519. 11 N. v. THIEM, iN. V. THOAI ET J. ROCHE, Bull. soc. chim. biol., 44 (1962) 285. 12 C. S. HANES ET F. A. ISHERWOOD, Nature, 164 (1949) 11o7. 13 L. A. PRADEL ET 1~. V. THOAI, Colloq. intern, centre nat. recherche sci. (Paris), 92 (1959) 419 14 N. v. THOAI, Y. ROBIN ET L. A. PRADEL, en p r 6 p a r a t i o n . 15 y . ROBIN ET J. ROCHE, Compt. rend. soc. biol., 148 (1954) 1783. is S. MAKISUMI, J. Biochem. (Tokyo), 49 (1961) 284. IT N. v. THOAI, J. ROCHE E T A . OLOMUCKI, Biochim. Biophys. Acta, 14 (1954) 448. is j . p. BLASS, Biochem. J., 77 (196o) 484 • 19 B. BERGERET, F. CHATAGNER ET C. FRO1MAGEOT, Biochim. Biophys. Acta, 9 (1952) 147. 20 j . AWAPARA, J . Biol. Chem., 203 (1953) 183. 21 S. OUCHI, J. Biochem. (Tokyo), 46 (1959) 765. 22 S. TANAKA, Nagasaki Igakkai Zasshi, 35 (196o) 1666. 23 N. v. THOAI, S. ZAPPACOSTA ET Y. ROBIN, Gomp. Biochem. Physiol., s o u s presse. ~ 4 0 . MEYERHOF, Arch. sci. biol. Napoli, 12 (I928) 536. 2s N. v. THOAI ET Y. ROBIN Biochim. Biophys. Acta, 35 (1959) 446. 26 y . ROBIN, L. A. [PRADEL, N. V. THOAI ET J. ROCHE, Compt. rend. soc. biol., 153 (1959) 54. 27 G. E. HOBSON ET K. R. REES, Biochem. J., 61 ~I955) 549.

Biochim. Biophys. Acta, 63 (1962) 481-488