Sur la nouvelle acide adenosine 5′-triphosphorique: guanidine phosphotransferase, l'opheline kinase

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BlOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

SUR LA NOUVELLE ACIDE ADENOSINE 5'-TRIPHOSPHORIQUE:GUANIDINE PHOSPHOTRANSFERASE, L'OPHELINE KINASE

NGUYEN VAN THOAI, F. DI ]ESO. Y.ROBIN ET E. DER TERROSSIAN Laboratoire de Biochimie Generale et Comparee, College de France, Paris et Laboratoire maritime, Concarneaii (France) (Recu Ie 8 juillet, 1965)

SUMMARY

A new ATP:guanidine phosphotransferase, opheline kinase L ATP:guanidinoethylmethylphosphate phosphotransferase (EC Class 2.7.3) (opheline phosphokinase) has been demonstrated in body muscles of Ophel'ia neglecia. The enzyme has been purified by salting out with (NH4)2S04' adsorption on phosphate gel and filtration on dextran gel. 2. The enzyme, freed from ATP phosphohydrolase, has been utilized to prepare the phosphagen 0[0, neglecta, N'-phosphoguanidinoethylmethylphosphate, which has been crystallized as its ammonium salt. The identity of the phosphagen so obtained with the product prepared by phosphorylating ophelin with POCl 3 has been confirmed. 3. The new phosphokinase, specific for opheline and phosphoopheline, exhibits no activity on creatine, arginine, glycocyamine and their corresponding phosphagens. It is very active on taurocyamine (amidinotaurine), lombricine (z-guaniclinoethylphosphoserine) and phosphotaurocyamine. However, the K m of the enzyme towards various substrates confirms the specificity of opheline kinase. 4. The enzyme has the same general properties as other ATP: guanidine phosphokinases (optimum pH, inhibition by SH reagents etc.).

INTRODUCTION

II a ete isole recemrnent des muscles d'une polychete sedentaire, Ophelia neglecia, un nouveau phosphagene denomme phosphoopheline, qui a He identifie au derive N' phosphoryle du diester z-guanidinoethylmethylphosphorique 1

Biochim, Bioplvys. Acta, II3 (19 66) 54 2-55°

OPHELINE PHOSPHOKINASE

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La structure du produit isole est confirmee mainten ant par synthese chimique et par phosporylation enzymatique. En outre, l'enzyme, qui catalyse la reaction reversible: ATP

I

+ opheline ~ ADP + phosphoophdline 2

I'ATP :guanidinoethylmethylphosphate phosphotransferase (EC Classc 2.7.3), (opheline phosphokinase), a ete purifie et caracterise. Ce sont les resultats de ses recherches qui font l'objet du present memoire, METHODES

Synthese de la PhosPhoopMline Le pratocole de synthese est dans l'ensemble le meme qui celui deja decrit pour les autres phasphagenes 2 - 4 . L'opheline synthetisee comme il a ete indique- est dissoute dans l'eau (I mmolejml d'eau distillee) et additiormee de NaOH 17 N (o.r mljmmole dopheline). La solution, placee dans un bain de glace, est traitee, sous agitation mecanique, au goutte a gautte et dans l'ordre, pour chaque rnmole d'opheline par 1.1 ml de NaOH 17 N, 3 ml d' eau et 0.2 ml de POC1 3 fraichement distille. On laisse reagir en poursuivant l'agitation pendant 15 min et on repete encore 3 fois la serie dadditions precedentes. On maintient la temperature entre 0 et 3° et on verifie que le pH reste constamment entre 9 et ro. A la fin an ajoute 1.1 ml de NaOH puis 3 ml d'eau et on laisse l'agitation se poursuivre encore 30 min. Le melange reactionnel est porte a -J:OO puis filtre a cette temperature sur filtre en verre frite, Le precipite de phosphate trisodique est lave a l'eau glacee et filtre a nouveau. Les deux filtrats reunis sont neutralises par HCl jusqu'a pH 7.6, et le volume, mesure. Apres addition d'un volume d'ethanol a 95°, on abandonne a-10° pendant une nuit; on filtre le precipite forme qu'on lave rapidement a l'eau froide. Le filtrat et Ie liquide de lavage reunis sont traites par BaBr2 ' zH 2 0 (20 mmolesj mmole d'cpheline) et additionnes de 4 vol. d'ethanol, Apres une nuit a -100 on recueille le precipite par centrifugation et on le purifie par dissolution dans le minimum d'eau et reprecipitation par de l'alcool (3-4 vol. par volume de solution de phosphagene). On repete cette operation deux fois. Le produit est finalement recueilli par centrifugation, lave a l'alcool et a. lether, desseche sous vide et analyse. Le phosphore mineral est dose par la methode de LOWRY ET LOPEZ 5, le phosphore labile, apres hydrolyse du phosphagene a 100° pendant I min en presence de HCI 0.1 N, a l'aide de la technique de BRIGGS6 • L'opheline, libre ou combinee, est dosee, avant ou apres hydrolyse, au reactif a l'c-naphtol-hypobrornite alcalin 7 , 27 ou au diacetyle-u-naphtol". Le produit obtenu, avant hydrolyse, ne reagit avec aucun de ces derniers reactifs mais il donne la reaction des esters phosphoriques. 11 renferme des quantites negligeables de phosphore mineral. Le rapport P labile/opheline combinee est egal r ;r. Cepenc1ant l'analyse chromatographique sur papier Whatman No. 540 en nbutanol-ethanol-eau (40 :15 :35, vIv) n-propanol-ammoniaque-eau (60:30 :10, v{v) , pyridine-ethanol-ammoniaque-eau (30 :30 :30 :10, vjv) et la revelation des chromategrammes au reactif du phosphore? montrent la presence, a cote de la tache principale de merne R p que le phosphagene isole des muscles d'O. neglecta, d'une autre beaucoup Biochim; Biophys. Acta, II3 (19 66) 542-55 0

544

N. VAN THOAI

et at.

plus faible. Des travaux ulterieurs montrent qu'il s'agit d'une diphosphoopheline qui, a 37°, s'hydrolyse rapidement en phosphate mineral et en phosphoopheline identique au phosphagene naturel-". Preparation de la phosPhoophiline par phosphorylation eneymatique Le melange reactionnel compose d'opheline synthetique 0.05 M, d'ATP et d'acetate de magnesium 0.075 M (vol. 100 ml pH 8.5) est incube It 30° pendant 30 min. On ajoute alors 0.3 ml d'enzyme (36.5 mg/ml) prepare comme il sera indique plus loin. Le pH est maintenu a 8.5 par addition continue de NaOH diluee. Apres 40 et 90 min dincubation on ajoute, chaque fois, I I mg denzyme. Le dosage de phosphore labile montre que la phosphorylation atteint apres 30, 80, 280 et 300 min d'incubation, respectivement , 35, 51,60 et 60% de phosphorylation. La solution est alors rapidement refroidie a 0° et additionnee de 12675 g de BaBr2 ' zH 20 dissous dans 12 ml d'eau distillee, Le pH est reajuste a 8.5 avec quelques gouttes de solution saturee de baryte. Apres IS min de repos a 0°, on centrifuge pour separer la solution de phosphagene du precipite de nucleotides qu'on lave avec de l'eau distillee, Apres avoir reuni l'eau de lavage au liquide surnageant on amene it pH 7.6 avec HCI concentre, on ajoute 4 vol. d'alcool a 95° et on abandonne une nuit a _roo. Le precipite recueilli par centrifugation, lave avec 20 ml d'ethanol a 95°, est redissout dans 190 ml d' eau froide, La solution, pH 7.6, est traitee a nouveau par 4 vol. d'ethanol a 9S0 et abandonnee une nuit a-10°. Cette operation est repetee encore deux fois, pour elirniner le phosphate mineral, les nucleotides et I'opheline libre. Ala fin, le precipite de phosphagene est repris par ISO ml d'eau distillee prealablement bouillie et refroidie a 0°. Ce produit est chromatographie sur papier Whatman No. I en pyridineethanol-ammoniaque-eau. Le chromatogramme revele avec l'c-naphtol-hypobromite alcalin et Ie reactif du phosphore ne montre pas la presence dopheline libre ni de phosphate mineral, ni de nucleotide. I1 ne presents qu'une tache de meme RF que le phosphagene naturel, directement revelable par le reactif du phosphore. et revelable par l'a-naphtol-hypobromite apres sejour du chromatogramme I h a 80°. La solution aqueuse de phosphoopheline de baryum est passee sur une colonne de permutite 50, forme NH 4 + (45 ern X 2.5 cm) a 4°. L'effluent est alcalinise a pH 8.5 avec de I'ammoniaque I N. La colonne est lavee avec I50ml d'eau distillee bouillie froide. L'effiuent est concentre sous vide jusqu'a 5 ml, puis centrifuge pour eliminer un leger precipite blanc insoluble. La solution concentree, ajustee a pH 9.6-IO avec de l'ammoniaque I N, est additionnee progressivement d'cthanol it 95° jusqu'a debut de trouble. Des cristaux blancs se forment qu'on elimine par centrifugation. Le liquide surnageant abandonrie une nuit a -100, laisse precipiter une huile qui cristallise par frottement. Les cristaux recueillis, laves avec del'acool a95 0, puis avec l'alcool-ether sont desseches sous vide sur P 2 0 5 et KOH. Onrecristallise deux fois de la memefacon. On obtient 300 mg d'opheline phosphate dammonium sous forme de cristaux tres'hygroscopiques, renfermant 4 molecules d'eau, 7-4% de P labile (theorie: 8.I%) et 46.5% d'cpheline (theorie: 5I%). Les autres phosphagenes employes: phosphocreatine," phosphoglycocyamines, phosphotaurocyamine-, phosphoarginine- ainsi que certaines guanidines monosubstituees employees: taurocyaminet-, lornbricinew, guanidinoethylphosphate- sont prepares cornrne il a ete indique, Tous les autres produits sont d'origine commerciale. Biochim. BioPhys_ Acta, II3 (1966) 542-550

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OPHELINE PHOSPHOKINASE

Prepa ratio n et pzerifi cati on de l' ophiline k in ase Les muscles d'O. neglecia, deb arrasses soigneusement de l'appareil digest if et genital, sont broyes et extraits dans 3 vol. KCl 0.01 N a 3°. Cette temperature est maintenue tout le long des operat ions. Apres centrifugation pendant IS min a 7000 x g le Iiqu ide surnageant est reserve et le residu reextrait avec 1.S vol. de KCI penda nt IS min . Les deux extrait s reunis sont fracti onnes avec du (NH4hS0 4 cristallise a pH 7. Le produit de precipitation ent re 55 et 75 % de saturat ion en sel est dissous dans I'acetate de magn esium 0 .01 :M (pH 7) (I mlJg tissu ) et la solution agitee pendan t IS min a vec du gel de phosphate' " (23 mg de produit sec/5 g de tissu). Le produit de l'adsorption est centrifuge et le liquide surnageant pr ecipite a 80 % de saturation par une solution froide saturee de (NH 4)2S0 4 a pH 7. Le precipite est repris par de l'acetate de magnesium 0.01 M (0.5 mils g de tissu) et 10. solution (13 mg de proteine) passee sur une colonne de Sephadex G-IOO (38 em X o.g em) equilibr ee au prealable ave c de la glycine 0.01 M (pH 8.3) renfermant KCl o. I M et acetate de magnesium 0.01 M. L' effiuent est recueilli par fractions de 2 ml, la concentration proteique estimee par mesures spectrophotoruetriques a 280 et a 260 mfl (ref. 14) et l'activite enzymatique deterrninee, Celle-ci est definie en dosant le P labile transfere de l' ATP a l' ophelin e dans le sen s direct de la reaction et de la phosphooph eline a I'ADP dans Ie sens in verse . Le melange reactionn el contien t pour un vol. total de I ml, 5 pmoles d'opheline, 5,umoles d 'ATP et d'acet at e de magn esium, 2 0 0 ,umoles de glycine- NaO H (pH 8.5) (rea ction dir eete) ou I pmole de pho sph oopheline, 5 ,umoles d 'ADP et de sel de magnesium, 200 ,um oles de glycylglycinc (pH 6.8) (reaction inverse). Apres preincubation 5 min a la temperature choisie, on ajou te l'enzym e. La concentration en celui-ci varie de 5 a 100 ft g de prot eine, selon l'acti vite de la preparation utilisee , On laisse in cuber 5 min , on ajoute 0 .1 ml H'Cl I N et on p orte a 1 0 0 ° pendant I min , on refroidit a 0° et on dose le ph osph ore mineral libere. On op ere de rneme pour les temoins d'incubati on auxq uels on ajoute l'opheline ou la ph ospho oph eline au moment de I'arret de la reaction.

~ 0.2

ao

IT

.~

o

'2l

'J.

~ 0.\

Cl

~

4.0:~



F ig . 1. D iagramrn e de filtra t ion de I'ophelin e phosphoki n a se sur Sepha dex G-wo. Abscisses : vol. d'e ftluent en m l. Ord onnees : a ga uc he , a bs orption 11. 28 0 (0) et 26 0 ( + ) mJl et conce ntration prot eiqu e (6 ) ; a dro ite, ac tivit e totale cont en ue dans chaq ue fract ion (0) .

Biochirn, Biophvs. A eta. II3 (19 66) 54 2- 55 °

et al,

N. VAN TROAI

TABLEAU I PURIFICATION DE L'OPHELINE PHOSPHOKINASE

Activitc exprrmee en pmoles de P transfere par min/rng de proteine a 30°. Le rendement est calcule par rapport a I'activrte totale mesuree dans le precipite 55-75 % de saturation en (NH.)2S04'

T'raitements

mg proteine

A ciiuite

Rendement

Purifi-

cation

- - - - - - - - - - - - - _.._._._----_._-Fractionnernent a 55-75 % de saturation en (NH.)2S0. 27 0 Adsorption sur gel de phosphate 18g Precipitation a 80% de saturation en (NH.)2S0. 99 Filtration sur Sephadex G-IOO Fraction 4 26·5 Fraction 5 2g·7 Fraction 6 13. 2

3. 0 4. 0

1.3

95

6.6

2.2

80

3·7

21

4·4 II.O

1.4

La Fig. I represente le diagramme de filtration de l' opheline kinase sur Sephadex G-roo. Le Tableau I resume les conditions des fractionnements de l'enzyme et indique le degre de purification atteint. CARACTERISTIQUES DE L'OPHELINE KINASE

pH et temperature optima de reaction Les courbes de la Fig. 2 montrent que le pH optimum est 8.5 dans le sens direct de la reaction et 6.8 clans le sens inverse. La temperature optima de reaction, comme I'indique la Fig. 3, est entre 30 et 35°, temperature superieure a ceUe qui a ete observee pour les phosphokinases de l'arginine'" et de la glycocyamine".

80 50.

70

7

pH

10

20

25

3D

35

~o

Ternper-o tur-e

Fig. 2. Vitesse de la reaction de transphosphorylation a 30° en fonction du pH. 0-0, reaction clirecte; x - X, reaction inverse. Abscisses: pH. Ordonnees: activite relative en % de la vitesse maxima. Fig. 3. Vitesse de la reaction de transphosphorylation en fonction de la temperature. 0-0, reaction clirecte; x - X ; reaction inverse. Abscisses : temperature. Ordonnees : activite relative en % cle Ia vitesse maxima.

Biochim, Biophys. Acta, II3 (1966) 54:<-55°

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OPHELlNE PHOSPHOKI NASE

Cinetique de reacti on La vitesse de reaction en fonction de la conc entrat ion en substrat , mesuree dans le sens de phosphorylation de I'opheline (Fig. 4) et dans celui de la resynthese de l'ATP (Fig. 5), et expr im ee selon LINEWEAVER ET B URKI 7, permet de calculer le K m

16

16 ~

12

I 1"' 12 [

10

10

Yv

1jv 14-

2

100

200

300

400

VeS)

500

1000

1500 VrS) 2000

Fig. 4. Vi tessc de phosphoryl a t ion de l'o p helinc en fon ction de la conce n t ration en substrata . 0 - 0 , op he line : x - x, AT P . Abscisses: I/ [S ] ([S] en o.r NI). Ordon nees : rlv (v : vitesse en pmoles de P t ra ns fere p a r m injmg d 'en zyme a 30°). F ig . 5. Vitesse de phosp horyla t ion de I' ADP en fon ction de In co ncentration en s ubstrat a. X _ . X, AD P; 0 - 0 , phosph ooph dline : 6 - 6 , phosphot aur ocyamine. Abscis ses : I /(S] (S en o.r M) . Ordonnees : r lv (v: ,u mo les de P t ra nsfe r e par m in jrng d'cnay rne a 30°).

de l'opheline kinase vis a vis de di vers substra ts (Tab leau II ). Les va leurs obt enu es ave c la phosph oopheline preparee par synthese chimique sont les memes que celles det erminees avec le produit de phosphorylat ion enzymat ique. On peut essayer d 'appliquer la formule eta blie par H ald ane p our calculer la constante d'cquilibre K e en fonc ti on des constantes d e Michaelis (K ) et des vit esses maxima (V) dans les deux sens de la reaction18 , l O V,·K. K e = --V 2·K,

TABLEAU II CONS T AN T E S DE MICHA E LI S ET V ITESSE S MAXIMA DE L' OPH ELINE PHOS PHO KI N ASE

K m exprirnc en

10-3

M, V max . en p moles d e P trans fen! par min/mg de proteinc cn zymati q ue a 30 °,

S ubstrats

V max .

AT P 3 5.8 Opheline ADP 0 .8 5 P hosp boophelin e L 1 z -Guanidin oeth ylp hosph at e 13 Lo rnbricine 15 50 Ta ur ocy amin e r .8 P hos photaurocya rnine

3 1.6 3 1.6 19. 6 19.6 29.8 59.6 134·c 38.4

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et at.

VI et K 1 etant les vitesses et les cons tantes de Micha elis mesurees dans la re action directe et V 2 et ](2 celles etablies da ns le sens inverse . En ut ilisant les valeurs exp erimentale s du Tableau II, on ob ti ent : 31. 6

J( e

x 1. 1

= - --- - = 19.6 x 5.6

0.3

valeur approximative de la constante dequilibre de la transphosphoryla ti on catalys ee par l'ophelinekinase dans le sens I et K; = r /o.3 dans le sens 2. En prese nce des concentratio ns de Mg2 + de l'ordre de 10-3 a 10-2 M. l'energie libre standard de conversion de la ph osphoopheline en ophe line FO = RTln r /o.3 = 0.7 kcal. serait ainsi proche de celle de la ph osphoargin ine (0.7 a 0.9 kca l) (refs. 20,2r) et de celle de la phosphotaurocyamine (0-4 kca l) (ref. 21). S pecificite L'enzyme ri'est actif ni sur la creatine, ni sur l'arginine, ni sur le guanidin oacetate, ni sur les phosphag enes correspondant s. II present s une act ivit e assez for te sur le guanidinoethylphosphate , la lombricine, la t au rocyamine et par ti culierem ent sur la phospho ta urocyamine (Tableau II). Pour ces derniers produits , la mesure de la

Yv

Y[sl Fig. 6. Vitesse de ph osphoryl ation de s analogues de su bstrat en fanction de leur concent ration . 0 - 0 , 2-guanidinoeth yl p h osphate ; X- x , lombricin e ; D.-D. , taurocya rnin e. Abscisses : I/[S] ([SJ en o . T M). Ord onnees : I /'U (v : pmalcs de P t ransfcre par mi n fmg cl'enz y me a. 30 °).

vitesse de transphosphorylation en fonction de la concentration en substrat (Figs . 6 et 7) montre que le K m calcule pour ces divers corps est plus elev e que celui de l'op h eline au de la phosphoopheline. 1n hibition Comrne to utes les guanic1ines phosphokinases et udiees jusqu 'a present (refs. 14. 23, 25, 28), l'ophelinekinase est inhibee fortement par les differents reacti fs des groupes SH : monoiod oacet ate, N -ethylmaleimic1e, chloroacetophenone et p- chlor omercurib en zoat e (Tableau III). Biochim, Biophys. Acta . II 3 (1966 ) 5'12-55 0

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OPHELI NE PHOSPHOKINASE

TABLE AU III I:-
Inhibition ex pr im ee en % dacti vi t e per due. Concentration d'in hibiteurs en M : iodoaceta te , Nethylm aleim icle, chloroacetcp henone, p-chl oro merc uribenzoa te. T em pe r at ur e d 'exp erience: 300.

-- - - - Con cen -

I nhib ition

tration d'inhibiteurs

[adoace/ate

..

N -etilvlm aW;nide

Chloroacetop henone

p-Chloro -

mercuribenzoate

10 - 7 1 0 -~

3°

10 - ' 10- 2

53 98

10

16

35 79

G(, 94

72 90 95

DISCUSSION

Il a ete trou ve pr ecedernm en t que Ia polych ete marine O. neglecta renferme, outre l'argin ine, de la taurocyamine et du diest er gua ni clinoet hylm ethylphosphorique (opheline). Mais seule cett e derniere est presente dans Ie muscle a l'etat libre ou sous forme N' phosphorylee (phosph agene). L'espece voisine O. bicornis ne renferm e dans le muscle qu e la lombricine (z-gua ni dinoethylphos phose ri ne) ou le phosphagene cor res pondan t -, L 'ATP :guan icline phosphokin ase extraite des muscles d'O . neglecia ri 'est pas active sur la creatine, l'arginine ni le gua nidinoacet at e , mais eUe est tres activ e sur la lombricine, la tauro cyamine et la phosphot aurocyamine ; toutefois ces acti vites deme urent in ferieures a celles observ ees sur le sub strat naturel, l'opheline, dent Ie J(m est egal a 5.8 . 10-3 M, tandis que celui de la lombricine est de 15 ' ro- 3 M et celui de la taurocyamine de 50' 10- 3 M. L'enzym e m erit e b ien a insi le nom d'ophelin e phosphokinase. Cet te specifi cit e a permis de pr eparer la phosphooph elin e par phosphorylation en zymat ique et de confi rmer son ident it e avec le produit de sy nt hese chimique. Nous u 'a von s pas pu pr eparer cet enzym e a l'etat h omogene et examiner d 'une fayon plus detaillee ses proprietes car les animaux qui le renferment sont petits et rares et ne se preterit pas aux gro sses preparations. Mais les faits rapportes dans Ie present memoire montrent qu e cet enzyme presente les caract erist iques generales des ATP :guanidin es phosphokinases : pH optimum, inhibition par les reactifs des grou pes SH. RE ME RCIEM E N T S

J{m

Nous remercions les Drs. L. A. PRADEL et R. K ASSAB pour la verification clu de la ph osphoopheline preparee par voie enzym atique.

I . L' ATP :guanidinoet hylmethylphosphat e ph osphotransferase (E C Classe 2,7.3) (opheline phosphok inase) a He identifiee dans les muscles d' Opheli a neglecia.

B iochim, B iopbys. A eta, II3 (r9 66 ) 54'2- 550

550

N . VAN THOA I

et al.

Ell e a He purifiee par fraetionnement au (NH4)2S0I, Bull. Soc . cu«. Bioi. ,39 (19 57) 35 5· L . A. P RADEL, N. V. THI E:\I, P. P IN ET N . V. T HOAI, Bull, S oc. Chim , B io t., 'I I (19 59) 5 19 . N . V. T HIEM, N . V. T HOAI ET J, RO CHE, B ull. S oc. cu-« . ei«, 44 (1962) 285 . 0 . H . L OWRY ET J. A . L OPEZ, l- B ioi. Cliem ., 16 2 (1945) 4 2 1. 6 A. P . B RIGGS, J. Bioi. cu«; 53 (1922 ) 13 . 7 C. H. D UMAZERT ET H. P OGGI, B ull . Soc. Chim. B ioi., 2 1 (1939) 5 0 0 • B H . ROSENBE RG, A. H. E NNOR ET J . F . MORRISON, B iochem, J., 63 (195 6) 153 . 9 C. S. H ANES ET F . A. ISHERWOOD. Nature, 164 (1949). I 107· 10 N . V. THIEM , G. L ACOMBE ET N . V. TH OAI, trav a u x no n publics. I I N. V. THOAI ET Y . R OBIN, Bioch im, B iophys. A cta, 13 (1954) 533· 12 N. V. THOA1 ET Y . ROBIN, Biochim , Biophys. Acta, 14 (1954) 7 6 . 13 A. T1SELIUS, S . H JERTEN ET 0 , L EVIN, Arch. B iochem . Biopbys. , 65 (195 6 ) 123 . 14 E. L AYNE, in S . P . COLDWICK ET N . 0. KAPLAN, Methods in Eneymology, Vol. 3, Acad em ic Press, New Y ork , rst ed . 1957 , p. 447. 15 P . ELOo I ET E . SZORENYI, Acta Physiol, Acad . Sci . Hung ., 9 (1956) 3 6 7. 16 L. A. PR ADEL. R . I{ As s AB E T N . V . THOAI , B io chim . B iophys, Acta , 81 ( 196 4) 86 . 17 H . LINEWEAVER ET D. B URK, ] . Am. Chern. S oc.• 56 (H)34) 65 8 . 18 J . B. S. H ALDANE, E nzy m es, L ongm ans, G reen and Co, Lond res , 19 30 , p . 80 . 19 R. A. ALBERTY, Adu an, E ney moi. , 17 (r95 6) 1. 20 H . LEHMANN, Biochem . Z ., 285 (19 36) 336. 21 D. E . GRIFFITHS, J . F . MORRISO:ol ET A . H. E NNOR, B iochem, J., 65 (195 7) 153. 22 L. A. P RADEL. These Doc t. S ci. Ph y s., P aris. 19 6 2 . 23 S. A. I(U BY ET E . A, N OLTMANN, in P . D. B OYER, H . L ARDY ET K. MYRBACK, The Enzymes, Vol. 6 , Academic Press , New Y ork, znd . ed. , 1962 , p . 51 6 . 24 L. A. PRADEL, R. KASSAB ET N . V. THOA1, Biochi m , B i op hy s A cta, 89 (19 64) 25 5 , 25 N. V. THOA1 ET L. A. PRADEL, B~,U . Soc. Chim . B iol., 44 (1962) 1089. 26 N . V. THOAI, Y. ROBIN ET L. A. P RADEL, Biochim , B iop hys . Acta, 73 (19 53) 43 7. 27 C. H . DUMAZERT ET R. P OGGI. B ~,ll. Soc. Ch im . B ioi., 2I (193 9) 1381. I 2 3 4 5

B iochi m, Biophys. Acta, 1 13 (1966) 542-5 5°