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Technique de recherche de plectridium téani dans le sol
M6decine
et
Maladies
Infectieuses.
1974
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4
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2
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81-85
Technique de recherche de Pleclridium l( lani dans le soK par C. M E F A N E * * avec la collaboration t e c h n i q u e de I. KORBER Plusieurs m~thodes d'isolement de PI. t e t a n i ont Ot~ ddcrites (1)(5). Darts ce travail nous avons reprls la mdthode de I c h i r o et N i s h i d a ( 2 ) , mais en [aisant s y s t d m a t i q u e m e n t des isolements en suri[aee el surtout en introduisant quelques modi[icoJtions portant n o t a m m e n t sur la lempdralure el la duJrde d'incubation.
MATERIEL
ET
METHODES
D a n s un t u b e /~ essai c o n t e n a n t 5 m l de s o l u t i o n p h y s i o l o g i q u e s t 6 r i l e ~ 8,5 % 0 , on v e r s e e n v i r o n 1,5 g de t e r r e q u ' o n agite e n s u i t e au V o r t e x p e n dant 20 s e c o n d e s . Le t u b e est p l a t 6 10 m i n u t e s au b a i n - m a r i e ~ 60~ Au b o u t de Ce t e m p s et apr6s une n o u v e l l e a g i t a t i o n de 20 s e c o n d e s , on e n s e m e n c e avec un b o u i l l o n c o o k e d m e a t (OXOID) c o n v e n a b l e m e n t r6g6n6r6, a v e c 1,5 m l de s u s p e n s i o n de terre. Le b o u i l l o n est ntis h l ' 6 t u d e ~ 37 ~ C p e n d a n t 48 h e u r e s . On p r o c 6 d e alors & des i s o l e m e n t s en s u r f a c e s u r g61ose au s a n g - - s a n g de m o u t o n d e pr6f 6 r e n c e - - . Les b o i t e s de g61ose s o n t i n e u b 6 e s en A n a e r o b i c J a r (BBL) d o n t le c a t a l y s e u r a 6t6 d 6 s h y drat6 p a r un s 6 j o u r de 90 m i n u t e s /~ 150 ~ C et eonserv6 & 37 ~ C a v a n t l ' e m p l o i , f a u t e de q u o i le syst6me r i s q u e de n e p a s ~tre f o n c t i o n n e l ; cette mesure n ' e s t p a s n 6 c e s s a i r e lors du p r e m i e r e m p l o i du catalyseur. Alors que d ' a u t r e s C'lostridium f o r m e n t des colonies s o u v e n t assez nettes, Pl. tetani (Cl. tetani p o u r les A n g l o - S a x o n s ) a t e n d a n e e h e n v a h i r la g61ose en f o r m a n t un film tr6s m i n c e ; s i c e c a r a c t b r e p e r m e t de le d i f f 6 r e n c i e r m a c r o s c o p i q u e m e n t des autres ana6robies, il p o s e c e p e n d a n t q u e l q u e s p r o b l 6 m e s p o u r l ' o b t e n t i o n de s o u c h e s p u r e s . P o u r o b v i e r vet i n c o n v 6 n i e n t , on p o u r r a i t u t i l i s e r de la g61ose au p h 6 n y l 6 t h y l a l c o o l qui, en 24 h., d i m i n u e l'ext e n s i o n du film. N o u s a v o n s pr6f6r6 p l a c e r les J a r i/ 33 ~ C p e n d a n t 18 "~ 24 h e u r e s , ce q u i p e r m e t de f r e i n e r c o n s i d 6 r a b l e m e n t l ' e n v a h i s s e m e n t sans toutefois l ' i n h i b e r . U n d e u x i b m e et 6 v e n t u e l l e m e n t un t r o i s i 6 m e i s o l e m e n t ~ la m ~ m e t e m p 6 r a t u r e sont n 6 e e s s a i r e s p o u r d 6 b a r r a s s e r la s o u e h e de toute c o n t a m i n a t i o n . D a n s le cas de s o u c h e s n o n e n v a h i s santes ou f o r m a n t un film 6pais, les boites s o n t replac~es en J a r p o u r u n s6jour s u p p l 6 m e n t a i r e d e 24 48 h e u r e s ; la r e c h e r c h e de P l e c t r i d i u m se f e r a p a r t i r de la m o r p h o l o g i e m a c r o s c o p i q u e et l ' o b s e r r a t i o n de s p o r e s t e r m i n a l e s au Gram. D a n s t o u s l e s cas on ne m a n q u e r a p a s de v 6 r i f i e r la c r o i s s a n c e en a n a 6 r o b i o s e s t r i c t e de la s o u c h e isol6e en ensem e n , a n t u n e b o i t e de g61ose au s a n g q u e l ' o n l a i s s e r a h l'6tuve o r d i n a i r e p e n d a n t 5 ]ours. La s o u c h e est r e p i q u 6 e en c o o k e d m e a t ; au b o u t de 48 h e u r e s on v6rifie sa p u r e t 6 au Gram. T r b s s o u v e n t u n e culture 6paisse en b o u i l l o n i n d i q u e u n e c o n t a m i n a t i o n ~ r i t re~u le 10 octobre 1973. ** I n s t i t u t U n i v e r s i t a i r e de Microbiologie Mddicale, 22, quai de l'Ecole de Mfidecine, 1211, Gen6ve 4, Suisse. Adresse actuclle : L a b o r a t o i r e de Sant6 Publique, B.P. 50, Libreville, Rdpublique Gabonnaiseo
p a r d ' a u t r e s CIostridium, Pl. tetani d o n n a n t u n e c u l t u r e assez 16g6re et h o d e u r c a r a c t 6 r i s t i q u e . La r e c h e r c h e du p o u v o i r t o x i g 6 n e se f a i t /~ p a r t i r d ' u n e c u l t u r e de 7 ]ours en c o o k e d m e a t p a r l ' 6 p r e u v e de s 6 r o - n e u t r a l i s a t i o n c l a s s i q u e p r a t i q u 6 e s u r d e u x s o u r i s de 16-20 g r e c e v a n t c h a c u n e 0,2 m l de c u l t u r e a d d i t i o n n 6 e de CaC12 st6rile '~ 5 %, l ' u n e d ' e n t r e elles a y a n t r e ~ u 50 UI de s 6 r u m a n t i t 6 t a n i q u e u n e h e u r e a n p a r a v a n t . D o n s le cos de s o u c h e t o x i g 6 n e , s e u l e la s o u r i s n o n p r o t 6 g 6 e p r 6 s e n t e r a les s y m p t 6 rues du t6tanos. Les s o u c h e s p e u v e n t a l o r s ~tre titr6es d ' a p r 6 s les ua6thodes c l a s s i q u e s (1)(5).
RESULTATS Les t e r r e s e x a m i n 6 e s se r 6 p a r t i s s e n t s u i v a n t les t a b l e a u x I e t II q u i r 6 s u m e n t les d i f f 6 r e n t s r6sultats o b t e n u s ~ Gen6ve et h Neufchfitel. V A L E U R D E LA M E T H O D E N o u s a v o n s v o u l u c o m p a r e r les r 6 s u l t a t s o b t e n u s p a r l ' i s o l e m e n t h e e u x de l ' i n j e c t i o n d i r e c t e de t e r r e . L ' 6 t u d e a 6t6 f a i t e s u r 100 6 c h a n t i l l o n s d e t e r r e d u sud de N e u f c h S t e l q u i & l ' i s o l e m e n t se s o n t r6v616s f o r t e m e n t positifs. L ' o n i n j e c t e p o u r c e l a 0,2 m l de la s u s p e n s i o n de t e r r e (1,5 g darts 5 m l de NaC1 5 8,5 % 0 ) /~ la s o u r i s s u i v a n t le p r o t o c o l e ci-dessus, soit e n v i r o n 60 m g de terre. Les r6sultats s o n t c o n s i g n 6 s d o n s le t a b l e a u III. S t a t i s t i q u e m e n t , il n ' e x i s t e pas d e d i f f 6 r e n e e signif i c a t i v e e n t r e les d e u x m 6 t h o d e s - - p a r le test d e s s6ries a p p a r i 6 e s , 6 c a r t r 6 d u i t i n f 6 r i e u r ~ 1,96 - - . I1 c o n v i e n d r a i t c e p e n d a n t de n o t e r le r61e i m p o r t a n t q u e p o u r r a i t j o u e r la flore a s s o c i 6 e d a n s le t 6 t a n o s e x p 6 r i m e n t a l , t o u t au m o i n s c h e z la s o u r i s : 9 t e r r e s t 6 t a n i g 6 n e s d o n t on n ' a p a s pu << s o r t i r >> le g e r m e et 4 s o u c h e s isol6es de t e r r e s non t 6 t a n i g b n e s p o u r la s o u r i s ; les d i f f 6 r e n t s essais ont 6t6 r6p6t6s q u a t r e fois. ETUDE DE L'INFLUENCE D E LA T E M P E R A T U R E L ' i s o l e m e n t d e Pl. tetani d ' a p r 6 s la m 6 t h o d e i n i t i m e de K i t a s a t o (5) est bas6e s u r la t h e r m o r 6 s i s t a n c e de la s p o r e h 100 ~ C. P o u r r e e h e r c h e r l ' i n f l u e n c e de la t e m p 6 r a t u r e , n o u s a v o n s t r a i t 6 40 t e r r e s en les s o u m e t t a n t c h a c u n e , d ' u n e p a r t h u n e h a u f f a g e de 10 m i n u t e s au b a i n - m a r i e /t 60 ~ C c o m m e p r d c 6 d e m m e n t et d ' a u t r e p a r t ~ 1000 C p e n d a n t 5 m i n u t e s . L ' i s o l e m e n t s'est p o u r s u i v i de la m ~ m e f a ~ o n d a n s c h a q u e cas s u i v a n t la m 6 t h o d e d ~ c r i t e ici. Le t a b l e a u IV r 6 s u m e nos r6sultats. 81
TABLEAU I i s o l e m e n t de P L t e l a n i ~ Gen6ve.
PourcenNbre de Souches toxig&nes tage terres
0rigine des terres Lot z
Quai de l'Ecole-de-M4decine RUe des Maraichers (1)
20
~5
75
Lot Z I
Plainpalais
(1)
~6
13
18
12
87,25 % ~,~ %
20
15
75
Lot I l l Carouge
(7)
Lot IV
HSpital Cantonal Tranch6es (I)
Lot V
~quis (7)
Lot VI
Jardins
(1)-
16
(Mollie-Margot-
6
v i l l ~ t t ~ ) (2)
4o
Lot VII Campagne genevoise
156
TOTAL
I~21 LeScantonLOts & VZdVaud. e S~
%
%
68, 75 % 50
3
%
z~2,5 %
17 86
63,23 %
constitu6s de poussiSres de villes.
T A B L E A U II I s o l e m e n t de P1. t e t a n i h Neuch&tel.
0 r i g i n e des
N b r e de S o u c h e s terres toxis~nes
terres
Groupe Z
V i l l e (bords de route, jardins publics)
42
37
ss
%
Group e ZI
Z o n e s c u l t i v 6 e s des d i s t r i c t s de N e u c h ~ t e l et B o u d r y
58
.37
6.3
%
Sud J u r a (sud des cols de la T o u r n e et de la Vue des Alpes)
4C
27
52,5 %
Val de R u z
Groupe
Ill
.38
12
.3~,7 %
Groupe V
Val de T r a v e r s
~5
17
7.3,.3 %
G r o u p e VZ
N o r d J u r a (Vall6e de la Sagne, des Ponts, de la Br6vine)
47
77
.36, 6 %
240
7.35
56, 25%
Groupe
IV
TOTAL
T A B L E A U III
T A B L E A U IV E t u d e de l ' i n f l u e n c e de la t e m p S r a t u r e s u r l ' i s o l e m e n t de Pl. tetani.
E t u d e c o m p a r a t i v e de l ' i n j e c t i o n de t e r r e et de l ' i s o l e m e n t de s o u c h e s t o x i g 6 n e s .
0rigine des terres
Injection de terre +
m
+
=
-
=
Injection de souche
+ -
+
+ -
79
74
D
Total
%
toxmgene non toxlgene
Effectifs
70 17 4 9
~oo
Poussi~res Ville de Gen&ve Poussi~res Ville de Neuch~tel
Total
Chauffage Chauffage 60~ IOmin 700~ 5 m i n
20
75 (75 %)
9 (4~ %)
20
7 (85 %)
~o (5o %)
DISCUSSION N o u s p e n s o n s que la m 6 t h o d e utilis6e p e r m e t d'obtenir une assez b o n n e i n f o r m a t i o n . Le chauffage h 100 ~ C abaisse les r6sultats de l ' e n q u O e de faqon significative, sans pour autant qu'il y air une relation entre thermor6sistance et toxinog@n@se (2). 83
L a d i f f 6 r e n c e o b s e r v 6 e s e r a i t a t t r i b u a b l e a u fair q u e la t h e r m o r 6 s i s t a n c e d e s s p o r e s d a n s le sol s e r a i t inf6rieure aux valeurs extr6mes obtenues au laboral o i r e (7). D ' a u t r e p a r t , n o u s a v o n s p u c o n s t a t e r q u ' e n s o u m e t t a n t les s p o r e s d e d i v e r s e s s o u c h e s d e Pl. telard ~ d i f f 6 r e n t s t e m p s d ' e x p o s i t i o n h 100 ~ la p e r t e du pouvoir de germination ne s'accompagnait pas f o r e 6 m e n t d e la s u p p r e s s i o n d u p o u v o i r t o x i g 6 n e : il e n est a i n s i d e s s o u e h e s it g e r m i n a t i o n l y s o z y m e d 6 p e n d a n t e , t o u j o u r s t 6 t a n i g 6 n e s p o u r la s o u r i s , el nos r6sultats semblent concorder avec ceux obtenus p a r S e b a l d et coll., C a s s i e r et R y t e r (4)(5). L ' a d j o n c t i o n de l y s o z y m e d a n s le m i l i e u d o n n e d e s t a u x
d e g e r m i n a t i o n s u p 6 r i e u r s -a c e u x o b t e n u s s u r m i l i e u s a n s l y s o z y m e (fig. 1 et 2). I1 n e s e r a i t d o n e p a s e x e l u q u e le m i l i e u e n v i r o n n a n t puisse exercer e e r t a i n e s i n f l u e n c e s s u r la s p o r e , le c h a u f f a g e 100 ~ C p o u v a n t a l o r s se t r a d u i r e p o u r c e r t a i n e s s o u c h e s p a r u n d o m m a g e a u n i v e a u d u c o r t e x (4)(5), ceci entrainant par eons6quent une d6naturation d e c e r t a i n e s e n z y m e s i m p l i q u 6 e s d a n s la p h a s e d ' i n i t i a t i o n d e la g e r m i n a t i o n . D ' a u t r e p a r t les 6 t u d e s d e S h o e s m i t h et H o l l a n d (6) s u r l ' i n f l u e n c e d e la t e m p 6 r a t u r e s u r le t a u x d e g e r m i n a t i o n d e Cl. tetani leur ont permis de eonstater que eette action 6tait n & a s t e i~ p a r t i r de 90-95 ~ C. I1 f a u d r a i t 6 g a l e m e n t
FIGURE 1
FIGUtlE 2
Souche Ramon
E
Souche
IMM117|
%,
(D
"
N ":-. I
5
10
]yS -[ys
+
15
20
25 5 10 15 20 Temps en minutes d'exposition a 1 0 0 ~
Les spores obtenues en m i l i e u Cooked Meat sont chauffdes en tubes non scellds pour respecter les conditions d'isolement. La n u m d r a t i o n est faite en g6lose molle VL et gdlose m o l l e VL q- 2 m e g / m l (Lysozyme Fluka).
t e n i r c o m p t e d u n o m b r e d e s p o r e s q u e c o n t i e n t la t e r r e ; si c e t t e e s t i m a t i o n e s t d i f f i e i l e m e n t r 6 a l i s a b l e au laboratoire, on peut cependant observer qu'un e h a u f f a g e d e 5 m i n u t e s h 100 ~ C d e s p o r e s o b t e n u e s in vitro e n t r a i n e u n e p e r l e d e 2 h 3 log d u n o m b r e d e c e l l u l e s v i a b l e s (fig. 1 et 2) et c e l a s u i v a n t les souches, Nous pensons done que nous avons de b o n n e s r a i s o n s d e p r 6 f 6 r e r la m 6 t h o d e d 6 e r i t e i c i c a r elle n o u s m e t h l ' a b r i d e t o u t e s c e s v a r i a t i o n s . Quant aux r6sultats de l'enqu~te elle-mSme, nous nous trouvons 6videmment ici dans des zones t6tan i g 6 n e s . I1 f a u d r a i t p o u r t a n t r i o t e r q u e la r 6 p a r t i t i o n n ' e s t p a s u n i f o r m e ( t a b l e a u x I e t II), q u e les p o u s s i 6 r e s d e v i l l e s o n t u n e x c e l l e n t r 6 s e r v o i r et q u e 84
25
.........
les t e r r e s d e s f o r 6 t s n e s o n t p a s d 6 p o u r v u e s d e s p o r e s ~ PI. tetani e o I n m e F o n t l a i s s 6 e n t e n d r e c e r t a i n s a u t e u r s . E n effet n o u s a v o n s isol6, ~ N e u f ehfitel, 9 s o u c h e s t o x i g b n e s 5 p a r t i r d e 21 6 c h a n t i l l o n s d e sol d e s f o r 6 t s ( d 6 t a i l s n o n p u b l i 6 s ) . D a r t s c e t t e m 6 m e r 6 g i o n , les i s o l e m e n t s se f o n t p l u s r a r e s a v e c l ' a l t i t n d e ; u n f a i t est c e p e n d a n t h n o t e r : a u n i v e a u d e d e u x v a l l 6 e s se t r o n v a n t p r e s q u e m 6 m e a l t i t u d e , la f r 6 q u e n c e est p l u s 61evge d a n s l ' u n e q u e d a n s l ' a u t r e : 73,3 % p o u r le Val d e T r a v e r s c o n t r e 31,7 % a n V a l d e Ruz. Il n e f a i t d o n e a u c u n d o u t e q u e la v a c c i n a t i o n antit6tanique a contribu6 ~ faire r6gresser de fagon s p e e t a c u l a i r e la m o r b i d i t 6 p a r l e t 6 t a n o s d a n s les
r 6 g i o n s off elle est p r a t i q u S e , c a r '~ G e n 6 v e p a r e x e m p l e , o n e n r e g i s t r e t r 6 s p e u d e c a s p a r an. Mais d e v a n t d e s p o u r c e n t a g e s a u s s i 61ev6s d e t e r r e t6tan i g ~ n e s , l ' o n p o u r r a i t a u s s i se d e m a n d e r si les a n t i -
RESUME
c o r p s a n t i t o x i n e t 6 t a n i q u e c o n s t i t u e n t le seul m6c a n i s m e d e d 6 f e n s e c o n t r e la m a l a d i e et si, j u s t e m e n t , le d 6 t e r m i n i s m e d e c e t t e d e r n i ~ r e n ' i m p l i q u e r a i t p a s d ' a u t r e s f a e t e u r s , n o n e n c o r e 61ueid6s.
L ' i s o l e m e n t d e PI. tetuni d u sol est l o n g et m 6 m e f a s t i d i e u x . N o u s n o u s s o m m e s p r o p o s 6 s d e m e t i r e au p o i n t u n e m 6 t h o d e p e r m e t t a n t d ' o b t e n i r d e s r 6 s u l t a t s v a l a b l e s , d a n s d e s t e m p s r M s o n n a b l e s . 221 s o u c h e s t 6 t a n i g g n e s o n t 6t6 i s o l 6 e s "~ p a r t i r d e 376 6 c h a n t i l l o n s d e t e r r e d e s c a n t o n s d e G e n 6 v e et d e N e u f c h f i t e l . D ' a u t r e p a r t , l ' 6 t u d e d e l ' i n f l u e n e e d e la t e m p 6 r a t u r e f a i t r e s s o r t i r q u e l ' e x p o s i t i o n d e s t e r r e s p e n d a n t s 10 m i n u t e s , au b a i n - m a r i e , ~ 60 ~ C d o n n a i t u n e m e i l l e u r e i n f o r m a t i o n p a r la s u i t e q u ' u n c h a u f f a g e p r 6 a l a b l e h 100 ~ C p e n d a n t 5 m i n u t e s . L ' a l t i t u d e s e m b l e 6 g a l e m e n t j o u e r u n c e r t a i n rSle d a n s la r 6 p a r tition des souches toxig6nes. Mots-clcf : T6tanos - Spores - Thermor6sistance.
SUMMARY
The isolation of PI. t e t a n i f r o m soil is usuallg slow and even fastidious. The authors describe a m e t h o d w h i c h gields useful results w i t h i n a reasonable time. 221 isolates were obtained f r o m 376 soi'l samples. It is s h o w n that the pre-incubation of the soil for 10 m i n u t e s in c~ 6q ~ C water bath leads to better results than pre-heating to 100 ~ C for 5 minutes. Altitudes appears to have some role in the distribution of toxinogenic strains. Key-words :
Tetanos - S p o r e s
- Thermoresistance. Nous r e m e r c i o n s le Profess eur R e g a m e g pour ses conseils et l'int&rdt qu'il a montr~ p o u r Ia r~aIisation de ce travail.
BIBLIOGRAPHIE 1. BUTTIAUX R., BEERENS H., TACQUET A. - - Manuel de Techniques de Laboratoire. F l a m m a r i o n ddit., Paris, 1969, 3~ 6dit., 554-555. 2. ICHIRO S. et NISHIDA S. - - Isolation of Clostridium tetani from soil. d. Bact., 1965, .89, 626-629. 3. CASSIER M. et SEBALD M. - - G e r m i n a t i o n lysozymed~pendante des spores de CI. perfringens ATCC 3624. Ann. Institut Pasteur, 1969, 117, 312-324.
4. GASSIER M. et RYTER A. - - Sur un m u t a n t de CI. perfringens d o n n a n t des spores sans tuniques h germ i n a t i o n lysozyme-ddpendante. Ann. Institut Pasteur, 1971, 121, 717-732. 5. PREVOT A.R., TURPIN A. et KAISER P. - - Les bact6ries nnadrobies. Paris, Dunod ddit., 1967, 1323-1450. 6. SHOESMITH J.G. et HOLLAND K.T. - - The germination of spores of Clostridium tetani. J. Gem Microbiol., 1972, 70, 253-261. 7. SPORES V. - - Ecology of spore forms, ddit6 par Holvorson, Hanson et Campbell, 1972.
85
et
Maladies
Infectieuses.
1974
-
4
-
2
-
81-85
Technique de recherche de Pleclridium l( lani dans le soK par C. M E F A N E * * avec la collaboration t e c h n i q u e de I. KORBER Plusieurs m~thodes d'isolement de PI. t e t a n i ont Ot~ ddcrites (1)(5). Darts ce travail nous avons reprls la mdthode de I c h i r o et N i s h i d a ( 2 ) , mais en [aisant s y s t d m a t i q u e m e n t des isolements en suri[aee el surtout en introduisant quelques modi[icoJtions portant n o t a m m e n t sur la lempdralure el la duJrde d'incubation.
MATERIEL
ET
METHODES
D a n s un t u b e /~ essai c o n t e n a n t 5 m l de s o l u t i o n p h y s i o l o g i q u e s t 6 r i l e ~ 8,5 % 0 , on v e r s e e n v i r o n 1,5 g de t e r r e q u ' o n agite e n s u i t e au V o r t e x p e n dant 20 s e c o n d e s . Le t u b e est p l a t 6 10 m i n u t e s au b a i n - m a r i e ~ 60~ Au b o u t de Ce t e m p s et apr6s une n o u v e l l e a g i t a t i o n de 20 s e c o n d e s , on e n s e m e n c e avec un b o u i l l o n c o o k e d m e a t (OXOID) c o n v e n a b l e m e n t r6g6n6r6, a v e c 1,5 m l de s u s p e n s i o n de terre. Le b o u i l l o n est ntis h l ' 6 t u d e ~ 37 ~ C p e n d a n t 48 h e u r e s . On p r o c 6 d e alors & des i s o l e m e n t s en s u r f a c e s u r g61ose au s a n g - - s a n g de m o u t o n d e pr6f 6 r e n c e - - . Les b o i t e s de g61ose s o n t i n e u b 6 e s en A n a e r o b i c J a r (BBL) d o n t le c a t a l y s e u r a 6t6 d 6 s h y drat6 p a r un s 6 j o u r de 90 m i n u t e s /~ 150 ~ C et eonserv6 & 37 ~ C a v a n t l ' e m p l o i , f a u t e de q u o i le syst6me r i s q u e de n e p a s ~tre f o n c t i o n n e l ; cette mesure n ' e s t p a s n 6 c e s s a i r e lors du p r e m i e r e m p l o i du catalyseur. Alors que d ' a u t r e s C'lostridium f o r m e n t des colonies s o u v e n t assez nettes, Pl. tetani (Cl. tetani p o u r les A n g l o - S a x o n s ) a t e n d a n e e h e n v a h i r la g61ose en f o r m a n t un film tr6s m i n c e ; s i c e c a r a c t b r e p e r m e t de le d i f f 6 r e n c i e r m a c r o s c o p i q u e m e n t des autres ana6robies, il p o s e c e p e n d a n t q u e l q u e s p r o b l 6 m e s p o u r l ' o b t e n t i o n de s o u c h e s p u r e s . P o u r o b v i e r vet i n c o n v 6 n i e n t , on p o u r r a i t u t i l i s e r de la g61ose au p h 6 n y l 6 t h y l a l c o o l qui, en 24 h., d i m i n u e l'ext e n s i o n du film. N o u s a v o n s pr6f6r6 p l a c e r les J a r i/ 33 ~ C p e n d a n t 18 "~ 24 h e u r e s , ce q u i p e r m e t de f r e i n e r c o n s i d 6 r a b l e m e n t l ' e n v a h i s s e m e n t sans toutefois l ' i n h i b e r . U n d e u x i b m e et 6 v e n t u e l l e m e n t un t r o i s i 6 m e i s o l e m e n t ~ la m ~ m e t e m p 6 r a t u r e sont n 6 e e s s a i r e s p o u r d 6 b a r r a s s e r la s o u e h e de toute c o n t a m i n a t i o n . D a n s le cas de s o u c h e s n o n e n v a h i s santes ou f o r m a n t un film 6pais, les boites s o n t replac~es en J a r p o u r u n s6jour s u p p l 6 m e n t a i r e d e 24 48 h e u r e s ; la r e c h e r c h e de P l e c t r i d i u m se f e r a p a r t i r de la m o r p h o l o g i e m a c r o s c o p i q u e et l ' o b s e r r a t i o n de s p o r e s t e r m i n a l e s au Gram. D a n s t o u s l e s cas on ne m a n q u e r a p a s de v 6 r i f i e r la c r o i s s a n c e en a n a 6 r o b i o s e s t r i c t e de la s o u c h e isol6e en ensem e n , a n t u n e b o i t e de g61ose au s a n g q u e l ' o n l a i s s e r a h l'6tuve o r d i n a i r e p e n d a n t 5 ]ours. La s o u c h e est r e p i q u 6 e en c o o k e d m e a t ; au b o u t de 48 h e u r e s on v6rifie sa p u r e t 6 au Gram. T r b s s o u v e n t u n e culture 6paisse en b o u i l l o n i n d i q u e u n e c o n t a m i n a t i o n ~ r i t re~u le 10 octobre 1973. ** I n s t i t u t U n i v e r s i t a i r e de Microbiologie Mddicale, 22, quai de l'Ecole de Mfidecine, 1211, Gen6ve 4, Suisse. Adresse actuclle : L a b o r a t o i r e de Sant6 Publique, B.P. 50, Libreville, Rdpublique Gabonnaiseo
p a r d ' a u t r e s CIostridium, Pl. tetani d o n n a n t u n e c u l t u r e assez 16g6re et h o d e u r c a r a c t 6 r i s t i q u e . La r e c h e r c h e du p o u v o i r t o x i g 6 n e se f a i t /~ p a r t i r d ' u n e c u l t u r e de 7 ]ours en c o o k e d m e a t p a r l ' 6 p r e u v e de s 6 r o - n e u t r a l i s a t i o n c l a s s i q u e p r a t i q u 6 e s u r d e u x s o u r i s de 16-20 g r e c e v a n t c h a c u n e 0,2 m l de c u l t u r e a d d i t i o n n 6 e de CaC12 st6rile '~ 5 %, l ' u n e d ' e n t r e elles a y a n t r e ~ u 50 UI de s 6 r u m a n t i t 6 t a n i q u e u n e h e u r e a n p a r a v a n t . D o n s le cos de s o u c h e t o x i g 6 n e , s e u l e la s o u r i s n o n p r o t 6 g 6 e p r 6 s e n t e r a les s y m p t 6 rues du t6tanos. Les s o u c h e s p e u v e n t a l o r s ~tre titr6es d ' a p r 6 s les ua6thodes c l a s s i q u e s (1)(5).
RESULTATS Les t e r r e s e x a m i n 6 e s se r 6 p a r t i s s e n t s u i v a n t les t a b l e a u x I e t II q u i r 6 s u m e n t les d i f f 6 r e n t s r6sultats o b t e n u s ~ Gen6ve et h Neufchfitel. V A L E U R D E LA M E T H O D E N o u s a v o n s v o u l u c o m p a r e r les r 6 s u l t a t s o b t e n u s p a r l ' i s o l e m e n t h e e u x de l ' i n j e c t i o n d i r e c t e de t e r r e . L ' 6 t u d e a 6t6 f a i t e s u r 100 6 c h a n t i l l o n s d e t e r r e d u sud de N e u f c h S t e l q u i & l ' i s o l e m e n t se s o n t r6v616s f o r t e m e n t positifs. L ' o n i n j e c t e p o u r c e l a 0,2 m l de la s u s p e n s i o n de t e r r e (1,5 g darts 5 m l de NaC1 5 8,5 % 0 ) /~ la s o u r i s s u i v a n t le p r o t o c o l e ci-dessus, soit e n v i r o n 60 m g de terre. Les r6sultats s o n t c o n s i g n 6 s d o n s le t a b l e a u III. S t a t i s t i q u e m e n t , il n ' e x i s t e pas d e d i f f 6 r e n e e signif i c a t i v e e n t r e les d e u x m 6 t h o d e s - - p a r le test d e s s6ries a p p a r i 6 e s , 6 c a r t r 6 d u i t i n f 6 r i e u r ~ 1,96 - - . I1 c o n v i e n d r a i t c e p e n d a n t de n o t e r le r61e i m p o r t a n t q u e p o u r r a i t j o u e r la flore a s s o c i 6 e d a n s le t 6 t a n o s e x p 6 r i m e n t a l , t o u t au m o i n s c h e z la s o u r i s : 9 t e r r e s t 6 t a n i g 6 n e s d o n t on n ' a p a s pu << s o r t i r >> le g e r m e et 4 s o u c h e s isol6es de t e r r e s non t 6 t a n i g b n e s p o u r la s o u r i s ; les d i f f 6 r e n t s essais ont 6t6 r6p6t6s q u a t r e fois. ETUDE DE L'INFLUENCE D E LA T E M P E R A T U R E L ' i s o l e m e n t d e Pl. tetani d ' a p r 6 s la m 6 t h o d e i n i t i m e de K i t a s a t o (5) est bas6e s u r la t h e r m o r 6 s i s t a n c e de la s p o r e h 100 ~ C. P o u r r e e h e r c h e r l ' i n f l u e n c e de la t e m p 6 r a t u r e , n o u s a v o n s t r a i t 6 40 t e r r e s en les s o u m e t t a n t c h a c u n e , d ' u n e p a r t h u n e h a u f f a g e de 10 m i n u t e s au b a i n - m a r i e /t 60 ~ C c o m m e p r d c 6 d e m m e n t et d ' a u t r e p a r t ~ 1000 C p e n d a n t 5 m i n u t e s . L ' i s o l e m e n t s'est p o u r s u i v i de la m ~ m e f a ~ o n d a n s c h a q u e cas s u i v a n t la m 6 t h o d e d ~ c r i t e ici. Le t a b l e a u IV r 6 s u m e nos r6sultats. 81
TABLEAU I i s o l e m e n t de P L t e l a n i ~ Gen6ve.
PourcenNbre de Souches toxig&nes tage terres
0rigine des terres Lot z
Quai de l'Ecole-de-M4decine RUe des Maraichers (1)
20
~5
75
Lot Z I
Plainpalais
(1)
~6
13
18
12
87,25 % ~,~ %
20
15
75
Lot I l l Carouge
(7)
Lot IV
HSpital Cantonal Tranch6es (I)
Lot V
~quis (7)
Lot VI
Jardins
(1)-
16
(Mollie-Margot-
6
v i l l ~ t t ~ ) (2)
4o
Lot VII Campagne genevoise
156
TOTAL
I~21 LeScantonLOts & VZdVaud. e S~
%
%
68, 75 % 50
3
%
z~2,5 %
17 86
63,23 %
constitu6s de poussiSres de villes.
T A B L E A U II I s o l e m e n t de P1. t e t a n i h Neuch&tel.
0 r i g i n e des
N b r e de S o u c h e s terres toxis~nes
terres
Groupe Z
V i l l e (bords de route, jardins publics)
42
37
ss
%
Group e ZI
Z o n e s c u l t i v 6 e s des d i s t r i c t s de N e u c h ~ t e l et B o u d r y
58
.37
6.3
%
Sud J u r a (sud des cols de la T o u r n e et de la Vue des Alpes)
4C
27
52,5 %
Val de R u z
Groupe
Ill
.38
12
.3~,7 %
Groupe V
Val de T r a v e r s
~5
17
7.3,.3 %
G r o u p e VZ
N o r d J u r a (Vall6e de la Sagne, des Ponts, de la Br6vine)
47
77
.36, 6 %
240
7.35
56, 25%
Groupe
IV
TOTAL
T A B L E A U III
T A B L E A U IV E t u d e de l ' i n f l u e n c e de la t e m p S r a t u r e s u r l ' i s o l e m e n t de Pl. tetani.
E t u d e c o m p a r a t i v e de l ' i n j e c t i o n de t e r r e et de l ' i s o l e m e n t de s o u c h e s t o x i g 6 n e s .
0rigine des terres
Injection de terre +
m
+
=
-
=
Injection de souche
+ -
+
+ -
79
74
D
Total
%
toxmgene non toxlgene
Effectifs
70 17 4 9
~oo
Poussi~res Ville de Gen&ve Poussi~res Ville de Neuch~tel
Total
Chauffage Chauffage 60~ IOmin 700~ 5 m i n
20
75 (75 %)
9 (4~ %)
20
7 (85 %)
~o (5o %)
DISCUSSION N o u s p e n s o n s que la m 6 t h o d e utilis6e p e r m e t d'obtenir une assez b o n n e i n f o r m a t i o n . Le chauffage h 100 ~ C abaisse les r6sultats de l ' e n q u O e de faqon significative, sans pour autant qu'il y air une relation entre thermor6sistance et toxinog@n@se (2). 83
L a d i f f 6 r e n c e o b s e r v 6 e s e r a i t a t t r i b u a b l e a u fair q u e la t h e r m o r 6 s i s t a n c e d e s s p o r e s d a n s le sol s e r a i t inf6rieure aux valeurs extr6mes obtenues au laboral o i r e (7). D ' a u t r e p a r t , n o u s a v o n s p u c o n s t a t e r q u ' e n s o u m e t t a n t les s p o r e s d e d i v e r s e s s o u c h e s d e Pl. telard ~ d i f f 6 r e n t s t e m p s d ' e x p o s i t i o n h 100 ~ la p e r t e du pouvoir de germination ne s'accompagnait pas f o r e 6 m e n t d e la s u p p r e s s i o n d u p o u v o i r t o x i g 6 n e : il e n est a i n s i d e s s o u e h e s it g e r m i n a t i o n l y s o z y m e d 6 p e n d a n t e , t o u j o u r s t 6 t a n i g 6 n e s p o u r la s o u r i s , el nos r6sultats semblent concorder avec ceux obtenus p a r S e b a l d et coll., C a s s i e r et R y t e r (4)(5). L ' a d j o n c t i o n de l y s o z y m e d a n s le m i l i e u d o n n e d e s t a u x
d e g e r m i n a t i o n s u p 6 r i e u r s -a c e u x o b t e n u s s u r m i l i e u s a n s l y s o z y m e (fig. 1 et 2). I1 n e s e r a i t d o n e p a s e x e l u q u e le m i l i e u e n v i r o n n a n t puisse exercer e e r t a i n e s i n f l u e n c e s s u r la s p o r e , le c h a u f f a g e 100 ~ C p o u v a n t a l o r s se t r a d u i r e p o u r c e r t a i n e s s o u c h e s p a r u n d o m m a g e a u n i v e a u d u c o r t e x (4)(5), ceci entrainant par eons6quent une d6naturation d e c e r t a i n e s e n z y m e s i m p l i q u 6 e s d a n s la p h a s e d ' i n i t i a t i o n d e la g e r m i n a t i o n . D ' a u t r e p a r t les 6 t u d e s d e S h o e s m i t h et H o l l a n d (6) s u r l ' i n f l u e n c e d e la t e m p 6 r a t u r e s u r le t a u x d e g e r m i n a t i o n d e Cl. tetani leur ont permis de eonstater que eette action 6tait n & a s t e i~ p a r t i r de 90-95 ~ C. I1 f a u d r a i t 6 g a l e m e n t
FIGURE 1
FIGUtlE 2
Souche Ramon
E
Souche
IMM117|
%,
(D
"
N ":-. I
5
10
]yS -[ys
+
15
20
25 5 10 15 20 Temps en minutes d'exposition a 1 0 0 ~
Les spores obtenues en m i l i e u Cooked Meat sont chauffdes en tubes non scellds pour respecter les conditions d'isolement. La n u m d r a t i o n est faite en g6lose molle VL et gdlose m o l l e VL q- 2 m e g / m l (Lysozyme Fluka).
t e n i r c o m p t e d u n o m b r e d e s p o r e s q u e c o n t i e n t la t e r r e ; si c e t t e e s t i m a t i o n e s t d i f f i e i l e m e n t r 6 a l i s a b l e au laboratoire, on peut cependant observer qu'un e h a u f f a g e d e 5 m i n u t e s h 100 ~ C d e s p o r e s o b t e n u e s in vitro e n t r a i n e u n e p e r l e d e 2 h 3 log d u n o m b r e d e c e l l u l e s v i a b l e s (fig. 1 et 2) et c e l a s u i v a n t les souches, Nous pensons done que nous avons de b o n n e s r a i s o n s d e p r 6 f 6 r e r la m 6 t h o d e d 6 e r i t e i c i c a r elle n o u s m e t h l ' a b r i d e t o u t e s c e s v a r i a t i o n s . Quant aux r6sultats de l'enqu~te elle-mSme, nous nous trouvons 6videmment ici dans des zones t6tan i g 6 n e s . I1 f a u d r a i t p o u r t a n t r i o t e r q u e la r 6 p a r t i t i o n n ' e s t p a s u n i f o r m e ( t a b l e a u x I e t II), q u e les p o u s s i 6 r e s d e v i l l e s o n t u n e x c e l l e n t r 6 s e r v o i r et q u e 84
25
.........
les t e r r e s d e s f o r 6 t s n e s o n t p a s d 6 p o u r v u e s d e s p o r e s ~ PI. tetani e o I n m e F o n t l a i s s 6 e n t e n d r e c e r t a i n s a u t e u r s . E n effet n o u s a v o n s isol6, ~ N e u f ehfitel, 9 s o u c h e s t o x i g b n e s 5 p a r t i r d e 21 6 c h a n t i l l o n s d e sol d e s f o r 6 t s ( d 6 t a i l s n o n p u b l i 6 s ) . D a r t s c e t t e m 6 m e r 6 g i o n , les i s o l e m e n t s se f o n t p l u s r a r e s a v e c l ' a l t i t n d e ; u n f a i t est c e p e n d a n t h n o t e r : a u n i v e a u d e d e u x v a l l 6 e s se t r o n v a n t p r e s q u e m 6 m e a l t i t u d e , la f r 6 q u e n c e est p l u s 61evge d a n s l ' u n e q u e d a n s l ' a u t r e : 73,3 % p o u r le Val d e T r a v e r s c o n t r e 31,7 % a n V a l d e Ruz. Il n e f a i t d o n e a u c u n d o u t e q u e la v a c c i n a t i o n antit6tanique a contribu6 ~ faire r6gresser de fagon s p e e t a c u l a i r e la m o r b i d i t 6 p a r l e t 6 t a n o s d a n s les
r 6 g i o n s off elle est p r a t i q u S e , c a r '~ G e n 6 v e p a r e x e m p l e , o n e n r e g i s t r e t r 6 s p e u d e c a s p a r an. Mais d e v a n t d e s p o u r c e n t a g e s a u s s i 61ev6s d e t e r r e t6tan i g ~ n e s , l ' o n p o u r r a i t a u s s i se d e m a n d e r si les a n t i -
RESUME
c o r p s a n t i t o x i n e t 6 t a n i q u e c o n s t i t u e n t le seul m6c a n i s m e d e d 6 f e n s e c o n t r e la m a l a d i e et si, j u s t e m e n t , le d 6 t e r m i n i s m e d e c e t t e d e r n i ~ r e n ' i m p l i q u e r a i t p a s d ' a u t r e s f a e t e u r s , n o n e n c o r e 61ueid6s.
L ' i s o l e m e n t d e PI. tetuni d u sol est l o n g et m 6 m e f a s t i d i e u x . N o u s n o u s s o m m e s p r o p o s 6 s d e m e t i r e au p o i n t u n e m 6 t h o d e p e r m e t t a n t d ' o b t e n i r d e s r 6 s u l t a t s v a l a b l e s , d a n s d e s t e m p s r M s o n n a b l e s . 221 s o u c h e s t 6 t a n i g g n e s o n t 6t6 i s o l 6 e s "~ p a r t i r d e 376 6 c h a n t i l l o n s d e t e r r e d e s c a n t o n s d e G e n 6 v e et d e N e u f c h f i t e l . D ' a u t r e p a r t , l ' 6 t u d e d e l ' i n f l u e n e e d e la t e m p 6 r a t u r e f a i t r e s s o r t i r q u e l ' e x p o s i t i o n d e s t e r r e s p e n d a n t s 10 m i n u t e s , au b a i n - m a r i e , ~ 60 ~ C d o n n a i t u n e m e i l l e u r e i n f o r m a t i o n p a r la s u i t e q u ' u n c h a u f f a g e p r 6 a l a b l e h 100 ~ C p e n d a n t 5 m i n u t e s . L ' a l t i t u d e s e m b l e 6 g a l e m e n t j o u e r u n c e r t a i n rSle d a n s la r 6 p a r tition des souches toxig6nes. Mots-clcf : T6tanos - Spores - Thermor6sistance.
SUMMARY
The isolation of PI. t e t a n i f r o m soil is usuallg slow and even fastidious. The authors describe a m e t h o d w h i c h gields useful results w i t h i n a reasonable time. 221 isolates were obtained f r o m 376 soi'l samples. It is s h o w n that the pre-incubation of the soil for 10 m i n u t e s in c~ 6q ~ C water bath leads to better results than pre-heating to 100 ~ C for 5 minutes. Altitudes appears to have some role in the distribution of toxinogenic strains. Key-words :
Tetanos - S p o r e s
- Thermoresistance. Nous r e m e r c i o n s le Profess eur R e g a m e g pour ses conseils et l'int&rdt qu'il a montr~ p o u r Ia r~aIisation de ce travail.
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