Temperatureinflüsse auf Chlorella pyrenoidosa unter besonderer Berücksichtigung der Zellentwicklung

Flora, Bd. 153, S. 554--592 (1963) Aus dem Pflanzenphysiologischen Institnt der LTninrsitiit Giittingen

Temperatureinflusse auf Chlorella pyrenoidosa unter besonderer Berucksichtigung der Zellentwicklung Von HARALD LORENZENl) :\Iit ?8 Abbildungen im Text !Eingegangen am 30. Miirz 1963)

Einleitung Bei der KultUl' der von WARBURG (1919) als Standardobjekt der Photosyntheseforschung in die Pflanzenphysiologie eingefiihrten Griinalge ChIarella wurde nebell der Suche nach einem optimalen Nahrmedium besonderer Wert auf die Untersuchung des Lichtfaktors (u. a. MYERS 1946; AACH 1952) und der CO:J-Versorgung (u. a. MYERS 1951; STEEMANN NIELSEN 1955) gelegt. Demgegeniiber ist iiber den EinfluB der Temperatur vergleichsweise wenig berichtet worden (lh VIS und Mitarb. 1953; TAl\fIYA und Mitarb. 1955). 1m FaIle eines sog. "Hochtemperatur-Stammes" wurde von SOROKIN (u. a. 1960) mit Temperaturen bis 40°C gearbeitet; der iiblicherweise gewahlte TemperatUl'bereich liegt zwischen 20 und 25°C. Bei cinem der meist verwendeten Stamme von ChIarella pyrenoidosa ist jedoch nach unseren Erfahrungen cine TemperatUl' von 30°C fiir die Substanzproduktion vorteilhafter. Vergleichsversuche bei verschiedenen Licht-Dunkel-Wechseln, Beleuchtungsstarken und Temperaturen (LORENZEJ\" 1957, PIRsoJ\" und LORENZEN 1958a) ergaben das Vorliegen einer die Zellteilung bestimmenden endogenen Zeitkomponente: der jeweils vom Lichtbeginn bestimmte Teilungssatz wird von del' Temperatur (20, 25 und 30°C) nul' unwesentlich beeinfluBt, obwohl die Substanzausbeute und damit die Zahl del' gebilde· ten Tochterzellen in stal'kem Mal30 verandort wil'd. Seitdem verschiodeno Methodon del' Synchronkultur von ChIarella entwickelt worden sind (TAl\UYA und Mital'b. 1953; SOROKIN und MYERS 1954; LORENZEN 1957) besteht die zusatzliche Moglichkeit, Einzelfaktoren del' Zellentwicklung zu verfolgen. Die genauere Untersuchung von Temporaturwirkungen, besonders an del' oberen und unteren Toleranzgrenzc, erschien unter dies em Gesichtspunkt von erheblichem Interesse. Erstc Versuche zur Wirkung von Kalteschocks auf verschiedene Entwick1) Habilitationsschrift sitiit Glittingen (1962).

de~

Mathematisch-l'Iaturwissenschaftlichen Fakultiit der UniveT-

Temperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

555

lungsstadien hatten eine uberraschende Empfindlichkeit der sonst fur sehr stabil und resistent gehaltenen Alge ergeben (LORENZEN und RUPPEL 1958; PIRSON, LoRENZEN und KOEPPER 1959). Eine Bearbeitung solcher Temperaturschocks (Kalte und Hitze) fUgt sich der hier vorliegenden Problematik ein. 1m Rahmen diesel' Arbeit stehen die speziellen Probleme del' verschiedenen Synchronisierungsverfahren fUr Chlorella nicht zur Debatte (vgl. zuletzt TAMIYA und Mitarb. 1961); doch muB hervorgehoben werden, daB wir- uns stets del' sog. Dauersynchronisation bedient haben, die im gleichmaBig intermittierenden Licht eine rasche und beliebig hiiufige Reproduzierbarkeit der Zellentwicklung sichert. Dauersynchronisation liegt dann vor, wenn die im gleichen Zeitraum erfolgenden Teilungen aller Zellen (Teilungsschube) in gleichem Abstand und in gleichel' Rohe (Zahl del' Tochterzellen) beliebig hiiufig aufeinandel'folgen. Dies wird durch einen dem kiil'zestmoglichen Entwicklungszyklus der Zelle angepaBten Licht-Dunkel-Wechsel el'l'eicht (LORENZEN 1957; PIRSON und LORENZEN 1958 a; LORENZEN und RUPPEL 1960; LoRENZEN 1962); dabei muB dul'ch eine in jeder Periode einmal durch Verdiinnung mit frischer Niihrlosung erfolgende Einstellung einer konstanten Zellzahl der optimale LichtgenuB aller Zellen sichergestellt werden. Methodik

Chlorella PYJ'enoidosa, Stamm Emerson (Algensammlung des Pflanzenphysiologischen Instituts der Universitat Gottingen Nr. 21l-8b) wurde in 300 ml fassenden Kulturrohren in Lichtthermostaten (LORENZEN 1959) bei verschiedenen Temperaturen kultiviert. Die Beleuchtungsstarke (5 Philips-Leuchtstoffrohren, 3 Warmton und 2 Tageslicht) betrug 9000 Lux; es wurde mit einem konstanten Gemisch von 1,5 Vol.-% CO 2 in Luft begast. Die minel'alische Niihrlosung mit Spurenelementen (KUHL 1962) enthieIt zur gleichmiiBigeren Versorgung der Zellen mit Eisen einen Fe-EDTA -Komplex (Titriplex III). Die Algen wul'den unter stel'ilen Bedingungen yom Schriigagarrohrchen in eine Kulturl'ohl'e gesptilt und sofort den normalen Versuchsbedingungen (Licht-DunkelWechsel boi 30°C und 9000 Lux) ausgesetzt. Sobald die Kultur so weit herangewachsen war, daB mit del' Verdunnung zu Lichtbeginn (Einstellung auf die konstante Ausgangszellzahl von 1,56 .106 Zellen pro Milliliter Suspension = relative ZellzahllOO) angefangen werden konnte (meist nach 2 Perioden), war die Kultur vollsynchron, d. h., in der vorangehenden Dunkelzeit hatten sich mehr als 98 % alIef Zellen geteilt. Unter normalen Versuchsbedingungen ist ein weiteres steriles Arbeiten nicht erforderlich, da das Wachstum der Algen so optimal ist, daB auch bei langerer Kulturdauer (4-6 Wochen) keine nennenswerten Verunreinigungen mit Mihoorganismen zu beobachten sind. Bei Abweichungen von den Normalverhiiltnissen mussen die

556

HARALD LORENZEN

Kulturen auf jeden Fall steril gehalten werden. Mittels einer besonderen Kulturrohre ist dies aueh bei hiiufiger Verdiinnung moglieh (LORENZEN 1963). Bei den zu besehreibenden Versuehen wurde also meist steril gearbeitet, zumindest wttrden in Parallelversuehen unter sterilen Bedingungen die vorherigen Befunde kontrolliert. Un sere Versuehe erstre~kten sieh ii ber einen liingeren Zeitraum, der einige Verbesserungen der Synehronisierungsmethode mit sieh braehte. Damit ist es zu orklaren, da13 bei der Normalanzueht versehiedene Ausbeuten an Zellzahl und Substanz aufgefiihrt sind. Aueh wurde anfangIieh der Lieht-Dunkel-Wechsel von 16: 12 Std. benutzt, wahrend spiiter meist versuehsteJhnisch giinstigere Perioden gewahlt wurden (v or all em 14: 10 Std.). Unter den bisher giinstigsten Bedingungen ergibt sieh f01gendes Bild fUr die Normalkulturen 16: 12- und 14: 10 Std. (Abb. 1 und 2). 16:;"2. 30 0

relative Z.flzahl

,

, - 2020

f

400

j

100 0

16

1 b s

d t

1600

800

s

z m

2230

1200

U

( R s

9000 Lux

2400 2000

I

b d p

6

I

i

..1

j

-.' 28

;6

28

16

28 Vers uchs stundrn

14:10.30·.9000Lux relative Z.IIZi1hl

• 1600

1570

1200

r

1 i ._i

800

400 100

o

r

1650

1550

24

I

•.!

24 Vrrsuchss lundrn

Abb. 1. und 2. Verlauf del' ZelIzahl von Oklorella pyrenoidosa in dallrrsynchronen WechseJIichtkulturen (16: 12 nnd 14: 10).

A te n

Temperatureinfliisse auf ChIarella pyrenoidosa usw.

557

Die durchschnittIiche Zellzahl in jeder Periode ist ziemlich konstant und schwankt nur im Bereich der ZiihIfehler, die Freisetzung von Autosporen dauert maximal 4 bzw. 3 Std. Eine schiirfere Synchronisation konnte bisher nicht erreicht werden; die Zeit der Autosporenfreisetzung beansprucht jedoch weniger als 15% d'er gesamten Periode (vgl. KUHL und LORENZEN 1963). Tabelle 1 gibt an, in welchem Umfang und Ausma13 die ZahI der pro Mutterzelle gebildeten Tochterzellen in einer Periode schwankt. Abb.3 zeigt eine Zelle nach 14 Std. Licht und die aus ihr gebildeten 16 Tochterzellen (Autosporen) 2 Std. vor dem Beginn einer weiteren Periode. Abbildungen vieler Zellen einer Kultur vor und nach einer vollsynchronen Teilung'finden sich bei PIRSON (1961) sowie bei KUHL und LORENZEN (1963). Die Bestimmungsmethoden sind schon frliher ausflihrIicher beschrieben worden (photosynthetische 0"- Produktion: LORENZEN 1959; analytische Bestimmungen: RUPPEL 1962). Nur die abgewandelte Chlorophyllbestimmung sei in Klirze beschrieben. 10 ml AIgensuspension werden flir 5 Min. bei 4000 UmdrehungenjMin. abzentrifugiert und der Bodensatz in weniger als 10 ml 96 %igem Methanol aufgenommen. Bei 65 DC wird 30 Min. lang extrahiert (ausreichend zur quantitativen Erfassung des Chlorophylls in allen Entwicklungsstadien), nach dem Abklihlen nochmaIs zentrifugiert und auf 10 ml aufgeflillt; die Absorptionsbanden werden bei 650 nm und 665 nm mit einem Zeiss-Spektralphotometer gegen Methanol gemessen. Der GesamtTabelle 1

Die prozentuale Verteilung der pro Mutterzelle gebildeten Tochterzellen in dauersynchronen Kulturen von ChIarella pyrenJidosa

, If ~

Anzahl der gebildeten Tochterzellen

Licht-Dunkel-Wechsel 14: 10 16: 12

8 ]6 24 32 andere

8,5 78.0 2,0 6,0 5.5

a

4,0 51,0 5,5 18,5 :21.0

b I

Abb. 3. ChIarella-Zelle aus einer Wechsellichtkultur vor (a) und'uach (b) der Teilung in 16 Tochterzellen (= Autosporen). (Von der Mutterzellmembran bleibt bei normal en Kulturbedingungen nichts iibrig.) Vergro]3erung etwa 650fach. 38

~·lora.

Md. 153

558

HA BALD LORENZEN

gehalt an den Chlorophyllen a und b wurde nach MACKINNEY (1941) berechnet. Bei einem Teil der Versuche wurde nur bei 665 nm gomessen; in den betreffenden Kurven sind dann nur die Extinktionswerte fUr 1 cm-Kiivetten angegeben. Bei der Untersuchung der Temperaturwirkung konnen einmal kurzzeitige Temperaturschocks (Kalte- oder Hitzeschocks) zu verschiedenen Zeiten des Entwicklungsganges der Zellen gegeben werden, zum anderen kann die Dauerwirkung niedrigerer oder hoherer Temperaturen als 30 DC auf die Wachstumsvorgange erfaf3t werden; ferner kann auch die langfristige Kombination verschiedener Temperaturen bei der Kultur von Chlorella sinnvoll erscheinen (etwa derart, daf3 Licht- und Dunkelzeit bei verschiedenen Temperaturen ablaufen). Zu diesen verschiedenen Punkten wurden Versuche durchgefiihrt. Als Ausgangsmaterial dienten immer die Zellen einer bei 30 DC dauersynchron kultivierten Anzucht. Niemals wurden Zellen von Temperaturversuchen als Ausgangsmaterial fiir weitere Experimente verwendet.

I. Die Einwirkung von niedrigen Temperaturen auf Synchronkulturen

1. Kultur bei tieferen Dauertemperaturen Wird bei einer normalen Kultur (Licht-Dunkel-Wechsel von 14: 10 Std.), unmittelbar bevor die Zellteilung erfolgt, die Temperatur von 30 auf 12,5 DC erniedrigt, so vermogen sich die grof3en Zellen bei der niedrigen Temperatur zwar stark verzogert zu teilen, die Teilungsprodukte jedoch sterben abo Uberfiihrt man 30 DC_ Autosporen in 12,5 DC, so wachsen diese im Wechsellicht langsam heran; nach insgesamt 10 Tagen konnten die ersten Zellteilungen bei ungeniigender Synchronisationsschiirfe festgestellt werden. Die Kultur erscheint auffallend gelbgrlin, kann aber in 30 DC innerhalb weniger Stunden voll ergriinen. Selbst bei einer Temperatuf von 14 DC konnen sich Autosporen erst nach insgesamt 8 Perioden von 14 : 10 Std. toilen. Grof3e 30 DC-Zellen (nach 12 Std. Licht) vermogen sich nur mit Miihe bei 14 DC im Wechsellicht zu teilen. 1m Dauerlicht sind die Zellen bei dies en niedrigen Temperaturen von 12,5 und 14 DC unter sonst gleichen Auf3enbedingungen wie bei der Normalkultur wesentlich starker gehemmt und sterben zum grof3ten Teil abo Wegen der niedrigen Wachstumsrate sind die Versuche nicht weiter ausgedehnt worden und es wird auf die Wiedergabe quantitativer Daten verzichtet. Es handelte sich lediglich um ein ungefahres Feststellen der Minimaltemperaturen des Wachstums beim Versuchsansatz mit vollsynchronen 30 DC-Zellen. Von Bedeutung ist der Nachweis, daf3 bei niedrigen Temperaturen Dauerlicht im Vergleich zu Wechsellicht zu einem vorzeitigen Absterben' der Zellen fUhrt (vgl. dazu den Einfluf3 von Dauerlicht im Bereich der oberen Temperaturgrenze des Wachstums auf S. 579ff.

T b

0 1 2 3 4 6

T b

3 8 9

Ternperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

559

In spater zu beschreibenden Versuchen (vgl. S. 561) wurden die Zellen Temperaturschock s von 4 °C ausgesetzt, die flir ein bestimmtes Entwicklun gsstadium der Zellen nach Umhangen in die Normaltem peratur und weiterer Belichtung einen markanten Chlorophyllverlust zur FoIge hatten. Es war daher von Interesse ~u erfahren, wie sich die verschiedenen Entwicklun gsstadien bei einer Dauereinwirkung von 4 0C im Hinblick auf den Chlorophyllgehalt verhalten wlirden (Tabelle 2). Dazu wurden von einer 16 : 12 Std. - Kultur in 30°C Autosporen, 4, 8, 12 und 16 Std. alte Zellen in 4 °C gebracht und einem Licht-DunkeI-WechseI von 12 : 12 Std. ausgesetzt. Innerhalb von 5 Tagen war bei allen Zellen mit Ausnahme der 16-Std.-Zellen ein nahezu vollkommenes Ausbleichen zu beobachten , wobei die Zellen mit weniger Chlorophyll (Autosporen, 4-Std.-Zellen) offensichtlich eher ausgeblichen waren. Dies liegt abel' vermutlich, jedenfalls bei den Autosporen, nicht an einer besonders starken Schadigung, sondern in erster Linie an der relativ geringen Chlorophyllmenge, die in den Zellen bei Versuchsbeginn vorhanden war. Nach weiteren 2 Tagen wurden die farblos erscheinenden Kulturen in 30°C umgehangt und weiter imLicht-Dunkel-Wechsel von 12: 12 belassen. Nach 5-6 Tagen ergrlinten die Kulturen wieder. Die Autosporen erholten sich am schnellsten, die 4-Std.-Zellen am schlechtesten. Dieser Versuch wurde, um eine hohere Ausgangschlorophyllmenge zu haben, mit der doppelten relativen Zellzahl angesetzt (200 statt 100). Wahrscheinlich verhinderte dies ein volIkommenes Ausbleichen der 16-Std.-Zellen in der Versuchszeit. Die Suspension dieser Zellen ist relativ dicht, der durchschnittliche LichtgenuB pro Zelle wird dadurch Tabelle 2 ChlorophyllgehaIt (Extinktion bei 665 nrn) von Chlorella pyrenoidosa bei Kultur in 40C, 9000 Lux Ausgangsrna terial: Zellen (relative Zellzahl 200) einer voIIsynchronen 16: 12-Kultur 30 ° C, 9000 Lux Tage in 4 DC bei 12: 12 0 1 2 3 4 6

Stun den bis zur Entnahrne der Zellen aus 30 DC 0

4

8

12

0,093 0,033 0,011 0,013 0,013 -0,0

0,179 0,067 0,022 0,011 0,015 -0,0

0,436 0,259 0,132 0,019 0,013 - 0,0

0,610 0,525 0,343 0,135 0,020 - 0,0

0,644 0,640 0,601 0,601 0,566 0,417

-0,0 0,136 0,585

- 0,0 0,02G 0,19G

-0,0 0,104 0,438

- 0,0 0,055 0,278

0,487

16

Tage in 30 DC bei 12: 12 3 8 9 3S'

560

HARALD LORENZEN

herabge!\et2it. Vber die Bedeutung der Beleuchtungsstiirke fUr den Ausbleicheffekt nach ,ku:rzzeitigem Kiilteschock wird weiter llnten mehr zu sagen sein (vgl. S.568). Fernerist bekannt (LORENZEN und RUPPEL 1960; RUPPEL 1962), daB die 16-Std..Zellen einen hohen Kohlenhydratgehalt haben, der seinerseits einer physiologischen Schiidigung bei niederen Temperaturen entgegenwirken konnte (vgl. u. a. HEBER 1958). 2. Kurzzeitlge Temperaturschocks a) Grundversuche LORENZEN und RUPPEL (1958), sowie PIRSON, LORENZEN und KOEPPER (11,)59) hatten tiber eine vom Entwicklungsstadium abhiingige Kiilteempfindlichkeit von Chlorella bei Anzucht im vollsynchronen Licht-Dunkel-Wechsel von 16: i2 Std. berichtet. Die Versuchewurden im Hinblick auf die an den' Zellen zu beobachtenden Veriinderungen wesentlich erweitert, z. T. in Zusammenarbeit mit A. KOEPPER (1960). Eine detaillierte Vorstellung, warum jedoch eine derartige empfindliche Phase auftritt und ob man sie an einer bestimmten analytisch faBbaren Konstellation von Zellbestandteilen erkennen kann, ist noch nichtmoglich. Detailuntersuchungen sollen erst nach den nunmehr moglich gewordenen Verbesserungen der Synchronisierungsmethode vorgenommen werden. Ein 2- oder 3sttindiges Abktihlen auf 4 °C bewirkt vor all em bei Zellen der 7. und 8. bzw. der 8. und 9. Stunde einer Periode ein starkes Ausbleichen des Chlorophylls; die geringsten Schiiden treten bei Zellen auf, die in den erst en beiden Lichtstun den sowie in der 13. und 14. und der 15. und 16. Lichtstunde (im FaIle des LichtDunkel-Wechsels von 16: 12 Std.)4 °C ausgesetzt waren. Ohne sonstige Veriinderung der AuBenbedingungen beginnt eine neue Chlorophyllsynthese 20-36 Std. nach Ende der Kiiltebehandlung (vgl. Abb. 4). Die ersten Zellteilungen erfolgen nach etwa :30-60 Std. desynchron. Bei Tetrahymena fand THORMAR (1959) ebenfalls Verzogerungen der Zellteilungen nach 15miniitigen Temperaturschocks (Kultur 28,5 DC; Schocks 7 oder 34°C), die sich mit zunehmendem Zellalter verstiirkten. 1m Extremfall (3sttindiger Kiilteschock) stirbt von den Chlorella-Zellen ein hOherer Prozentsatz .ab (gelegentlich wohl bis zu 90 %). Leider laBt sich dieser Prozentsatz bisher nicht exakt bestimmen, da bei einer Weiterkultur die starker geschadigten Zellen, die sich relativ spat von den Auswirkungen des Kalteschocks erholen, infolge der zunehmenden Zellteilungen der weniger gescbiidigten Zellen kaum mehr erfaBt und beobachtet werden konnen. Nach 6 Tagen waren aber in den Kulturen noch ausgeblichene Zellen vorhanden; ihre Zahl nahm vermutlich durch Vberwinden der Schadigung dauernd abo Eine Trennung dieser geschadigten Zellen von den bereits wieder erholten ware durch fraktiollierte Zentrifugation sicher moglich; diese dtirfte aber geschadigte Zellen u. U. zum

Temperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

561

Absterben bring en und kann deshalb keine genauereAuskunft iiber die wirkliche Zahl der durch Kiilteschock abgetoteten Zellen geben. Ebenso erschien die Durchfiihrung von Agarplattentests wenig sinnvoll, daangenommen werden mu13, da13 die geschiidigten Zellen nicht mehr in der Lage sind, an das neue Medium zu adaptieren. Der Nachweis von Vitalitiitsunterschieden an Einzelzellen mit Hilfe der oft verwendeten Tetrazoliumsalzmethode (vgl. JAMBOR 1960) konnte im Lichtmikroskop nicht erbracht werden. Mit Hilfe einer unterschiedlich starken Formazanbildung konnte jedoch schon vor dem Ausbleichen des Chlorophylls der zu erwartende Schiidigungsgrad einer K ultur angenahert ermittelt werden. Eine zukiinftige fluoreszenzoptische Untersuchung diirfte aber zur Kliirung dieses Punktes geeignet sein. Eine kiiIteempfindIiche Entwicklungsphase findet sich auch in den Synchronkulturen anderer Arten und Stiimme von Ohlorella (Ohlorella ellipsoidea und Ohlorella pyrenoidosa, Hochtemperaturstamm 7-11-05); ein Versuch mit Ankistrodesmus braunii verlief dagegen negativ. Bei einigen Kalteschockversuchen wurde die photosynthetische O~-Produktion (Bestimmung der photosynthetischen Maximalleistung bei 16000 Lux und 30°C mit der Hg-Tropfelektrode; vgl. SCHON 1955; LORENZEN 1959) gem essen. Abb. 5 gibt den Normalverlauf einer Periode der 16 : 12-Kultur wieder (ohne Beriicksichtigung des Verhaltens wiihrend der Dunkelzeit) und eben so den Verlauf der 02-Produktion nach KiiIteschock in der 1. und 2. Std. und der 6. und 7. Std. Nach dem Schock E

relative Zellzahl

800 700 600 0,40

.<>

I

0,30

I

I

'00

I

,P ,,

0,20

~

.'

I

,,

.' ... --....... . .'

0.10

~-

28

.'

300

I

,

:

500

I

I

200

......... .100 56 Versuchsslunden

Abb.4. Vergleich von Zellzahl und Chlorophyll einer Normalkultur und einer Kultur, die in der 7. und 8. Lichtstunde dem Kalteschock yon 4 DC ausgesetzt war, bei Anzllcht im LichtDunkel-Wechsel von 16 : 12 Std. Zellzahl

0,

Chlorophyll ., Kontrolle - - , Kaltebehandelt ____ .

562

HARALD LORENZEN

in der 1. und 2. Versuchsstunde steigt die trockengewichtsbezogene Sauerstoffproduk~ tion im weiteren Verlauf der Kultur mit 30 DC etwa parallel zu der Normalkultur an, ein Verhalten, das nach dem frUher beschriebenen Versuch (PIRSON, LORENZEN und KOEPPER 1959) zu erwarten war. Wahrend der 2stUndigen Kiiltebehandlung verlieren die Zellen in diesem Fall etwa die Halfte ihrer photosynthetischen Leistungsfahig' keit. Wesentlich starker (etwa 80%) ist dieser Verlust bei Kaltewirkung in der 6. und 7. Versuchsstunde. Die 02-Produktion erreicht nach wenigen Stunden unter Normalbedingungen den Wert O. Dies ist al~o schon vor dem fast vollstandigen Aus, bleichen der Zellen der Fall (vgl. Abb. 4). Der Pigmentabbau kann als Folgewirkung gehemmter Assimilation auftreten (STALFELT 1960). Die geschockte Kultur wurde weiter in Dauerlicht gehalten und von Zeit zu Zeit die Photosynthese gemessen. Man erkennt in der Abbildung die allmahliche Erholung der Zellen in bezug auf die zunchmende photosynthetische 02-Produktion; die Erholung verlauft im Wechsel, licht etwas schneller. Erst nach dem durch den Pfeil gekennzeichneten Zeitpunkt konnten die erst en Zellteilungen beobachtet werden. Einige Atmungsmessungen ergaben keine Anhaltspunkte fUr eine wesentlich erhohte Atmung der geschwachten Zellen. Mit eingezeichnet sind in Abb. 5 einige Werte der photosynthetischen Sauer, stoffproduktion einer Probe, die von der 6. Std. an nur 172 Std. dem Schock ausgesetzt war. Hier ist der schockbedingte Leistungsabfall nur gering, der spatere

200 160

.• 2

~1

120

n. _

/'~2

I! , i

.

i\o-/ .:,

\

40

1

Y /

80

\/' \ •

IliI

o

I

IKI\

'.-

3 6 9 12

16

28

56

62 StUndM n.ch V~rsuchsb~ginn

(mm 3 0 2!mg.

Abb. 5. Vergleich der maximalen Photosynthes h) einer Normalkultur (16: 12) mit derjenigen von Kiilteschockkulturen. 1. + 2.: Kiilte (4 00) in der 1. und 2. Std. 6. + 7.: Kiilte (4°0) in der 6. und 7. Std. 1 Y2: Kiilte ab der 6. Std. fUr nur 1 Y2 Std. ~ Beginn der ersten Zellteilungen. (Nur die unbehandelte Kontrolle [= N] wurde nach der I.ichtzeit verdunkelt.)

Temperatureinfliisse auf ChIarella pyrenoidosa usw.

563

Anstieg ist aber deutlich gegeniiber der Kontrolle verlangsamt. Bei dieser Probe fiel auch der Chlorophyllgehalt nur wenig ab; eine Zunahme des Chlorophylls konnte jedoch erst nach der 16. Versuchsstunde sicher nachgewiesen werden. Die Erholung der Photosynthese scheint in diesem Fall unabhiingig von der Zunahme des Chlorophyllgehaltes in den Zellen vor sich zu gehen. Inwieweit photosynthetische Aktivitat Voraussetzung fUr eine verstiirkte N eusynthese von Chlorophyll in den geschwachten Zellen ist, kann nach den bisherigen Untersuchungen nicht beurteilt werden. Der GehaIt an Gesamtstickstoff andert sich nach dem KaIteschock in den Zellen praktisch nicht und steigt erst im Zuge der Wiederergriinung langsam an; die analytischen Daten sollen in einer spiiteren Arbeit publiziert werden. Aus Abb. 6 ist zu ersehen, da13 auch in einer durch 24stiindig erfolgende Verdiinnung synchron erhaltenen DauerIicht-KuItur (RUPPEL 1962) eine wachstumsabhiingige Kalteempfindlichkeit auftritt. Wahrend 3stiindige 4 °C-Behandlung, 2 Std. nach der letzten Verdiinnung einsetzend, nur einen relativ geringen Ausbleicheffekt hervorruft, verliert eine 4 Std. nach der letzten Verdiinnung geschockte Kultur innerhalb von 24 Std. mehr als die Halfte ihres Chlorophylls, sie bleicht aber im weiteren VerIauf der Kultur nicht vollkommen aus. 7-Std.-Zellen der gleichen AusgangskuItur werden zwar auch geschiidigt, sie verIieren aber innerhalb von 20 Std. nach der KaItebehandlung nur etwa 20 % des Pigments. Dieser Versuch gibt einen Hinweis, da13 die empfindliche Phase nicht etwa durch spezifische Prozesse des LichtDunkel-Stoffwechsels bedingt wird, sondern vielmehr der normalen Zellentwicklung E

0,22 0,20 O,lfJ

0.16 0,14

0.12 0.10 0,04 0,06 0.04

·4

0.02

a

2 4 6 {} /0 12 U 16 18 20 22 <1' 26 2fJ 30 32 34 36 SlundM nllch

Abb. 6. Einflu.6 von 3stiindigem KiUteschock (4 0 C) auf den Chlorophyllgehalt einer Dauerlichtkultur von ChIarella, die durch Verdiinnung (aIle 24 Std.) synchron erhalten wurde. Die Ziffern an den Teilkurven geben die Stundenzahl von der letzten Verdiinnung bis zum Einsetzen der KiiJtebehandlung an,

564

HARALD LORENZEN

zuzurechnen ist. Da13die empfindliche Phase im Dauerlicht zeitlich vorverlagert ist, ist durch das schon vor der Verdiinnung erfolgende Anwachsen von Autosporen zu erklaren; sie haben zum Zeitpunkt der Verdiinnung nicht das Alter 0 wie die Autosporen der Licht-Dunkel-Wechsel-Kulturen. Ebenso verstiindlich ist die Tatsache, da13 das Ausbleichen insgesamt weniger stark als in synchronen Licht-Dunkel-WechselKulturen ist; denn es Iiegen, bedingt durch die geringere Synchronisationsschiirfe, immer etliche Zellen vor, die nicht in der empfindlichsten Phase durch den Kiilteschock getroffen werden. Auch ineiner kaltegeschockten nichtsynchronen Dauerlichtkultur lassen sich immer einige ausgeblichene Zellen beobachten. Wird die Kaltezeit auf weniger als 2 Std. beschriinkt, so kommt es zu einem partiellen Pigmentschwund oder nur zu einem Stillstand der Chlorophyllsynthese fUr einige Stunden (vgJ. beziiglich der photosynthetischen 02-Produktion Abb. 5); auch sind am Ende der Periode die ZeIlzahlen etwas niedriger; die starkste Wirkung wird bei 4 °C in der 9. Std. beobachtet. Gerade diese "kurzgeschockten" Kulturen bestatigen die Tatsache, da13 es die gleichen Zellen sind, die nach dem Kiilteschock unter konstanten Au13enbedingungen ausbleichen und dann wieder ergriinen. Man beobachtet aIle Ubergange von einem bloB en Stillstand der Chlov Chlorophyll

mi

10

9 8 7

6

5

,

1112 Sid. K

3

---"."-\

2

,.-2SId.K

\

o

,

"

\

\

'i.,

_ - - - ..... '

------------

8

12

16

20

24

28

32

.3SId.K

36

,0

"

S/undM nach

Versuchsb~inn

Abb.7. Chlorophyllgehalt einer Synchronkultur (30°C, 14: 10) von Cltlorella nach verschieden langer Dauer des von der 8. Std. an gegebenen Kalteschocks. (Nur die unbehandelte Kontrolle = N wurde nach der Lichtzeit verdunkelt.)

Temperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

565

rophyllsynthese (bzw. gleicher Rate von ab- und aufbauenden Prozessen) und einem nahezu vollkommenen Ausbleichen; an der Reversibilitiit dieses Vorganges kann es somit keinen Zweifel geben. Abb. 7 gibt diese Beziehungen flir einen 14 : 10Std.-Versuch wieder, bei dem die Zellen mit dem Beginn der 8. Std. flir 1; 2 und 3 Std. in 4°C kamen. Die zweisttindig vorgenommenen Chlorophyllbestimmungen lassen die auftretenden Unterschiede und ihre Entstehung deutlich werden. Wiihrend des Schocks selbst veriindert sich der Chlorophyllgehalt (wenigstens in den beiden erst en Stunden) nicht. Die Zellen mit nur einsttindigem Kiilteschock zeigen danach ein weiteres Ansteigen des ChlorophyllgehaItes. Die Synthese ist vielleicht etwas niedriger als beider Kontrolle; es konnte aber aucn sein, daB neben der normalen Synthese auch uoch abbauende Vorgange geringeren AusmaBes in einigen starker geschiidigten Zellen ablaufen. Die Zellzahl nach 24 Std. ist im Normalversuch (14: 10), im DauerIicht und bei der Kultur mit einsttindigem Kalteschock gleich (jede Zelle teiIte sich in durchschnittlich 16 Tochterzellen). Nach 1 %sttindigem Kalteschock fiilIt der Chlorophyll wert nach einem leichten Anstieg in den ersten 1 % Std. nach dem Schock bis zur 10. Std. geringfligig abo Dann tiberwiegt die Pigmentsynthese mehr und mehr tiber evtl. weiter verlaufende Abbauprozesse; die Zellteilungen setzen hier mit Verzogerung ein. 2 Std. bei 4 °C sind die Bedingungen des friiheren Grundversuches. Etwa 12 Lichtstunden nach dieser Behandlung ist die Kultur praktisch farblos (22. Versuchsstunde). Es wurde dann auf weitere Probenahmen verzichtet, da der Restchlorophyllgehalt auBerordentIich gering ist. Erst nach weiteren 10-12 Std. ist eine Chlorophyllzunahme in den weiterhin ungeteiIten ZelIen zu beobachten. Innerhalb von 6 Std. bleicht eine KuItur, die von der 8. Std. des Entwicklungsganges an 3 Std. bei 4 °C gehaIten wurde, volIkommen aus. In diesem Fall verzogert sich auch eine Erholung sehr; erst 62 Std. nach Versuchsbeginn erreicht der ChlorophylIgehaIt den Wert, den die 2sttindig geschockte Kultur zur 22. Std. hat. 1m Vergleich wurde der Kiilteschockversuch mit Chiorophyllbestimmungen an einer 33 °C-Kultur durchgefiihrt (Abb. 8). Die Proben wurden auch nach dem Schock wieder in 33°C gebracht. 1m Prinzip ergeben sich die gleichen Befunde wie beim vorangehenden Versuch; es ist jedenfalls nicht so, daB die Auswirkungen des 4 °C-Schocks bei diesen an hohere Temperatur angepaBten Zellen schneller oder in verstiirkter Form auftreten. Nach dem Schock in 20°C statt in 30 oder 33°C gebrachte Kulturen bleichen nachhaItiger aus; die Ursachen daflir sind noch unbekannt. Gibt man in der empfmdlichen Phase Kalteschocks m~t weniger n;edrigen Temperaturen (zwischen 7 und 20°C), so beobachtet man bei Schocks mit 7°C eine Verzogerung des Teilungsschubes um 7-8 Std. und eine VerIangsamung der ChI orophyllsynthese gegeniiber der unbehandelten Kontrolle in den Stunden unmittelbar nach dem Einwirken der tieferen Temperatur. Bei Schocks mit 10 und 15°C betragt die Schubverzogerung noch 4 Std. und weniger, 20°C blieb ohne erkennbare Wirkung auf die Zellteilung.

566

HARALD LORENZEN

Bei 2stundiger Abkuhlung auf 4 °C wahrend der Dunkelzeit gab es lediglich eine kleine Verzogerung des sonst normal verlaufenden Teilungsschubes, wenn die Behandlung in den ersten beiden Dunkelstunden erfolgte. Waren die in dieser Zeit offensichtlich fur die spatere Zellteilung notwendigen einleitenden Schritte bei 30°C im Dunkel abgelaufen, so begann die Zellteilung unmittelbar nach Beendigung des Kalteeinflusses, auch wenn dieser 8 oder mehr Stunden andauerte. Wurde eine Normalkultur unmittelbar vor Einsetzen der Zellteilungen fur eine volle Periode im Dunkel bei 4 °C gehalten, so erfolgte die schubartige Teilung sofort nach ErhOhung der Temperatur auf 30°C und in gleicher Rohe wie bei der Parallelen 24 Std. vorher. Eine 4stundige Vorbehandlung der Autosporen im Dunkel bei 4 °C hatte keine Wirkung; eine Abhartung wurde durch diese Behandlung nicht erreicht: auch diese ZeIlen wurden in der empfindlichen Wachstumsphase durch einen 2stiindigen KiiIteschock von 4 °C stark geschadigt. Ein vollstandiges Einfrieren (- 20°C) der Zellen in der Dunkelzeit unmittelbar vor Beginn der Zellteilungen blieb bei nachfolgender NormaIkuItur ohne jede Wirkung. Schon 1 Std. nach dem erneuten Dberfuhren in 30°C begann die schubartige Teilung aller Zellen. Erst wenn die Zellen 12 Std. oder langer bei - 20°C gehalten worden waren, starben sie bei schnell em Auftauen in 30°C nach der Ruckuberfiihrung abo

r==:J

yChlorophyll ml 11,0

,' ____ ·N

·~W.Sld.K /' . '/, " ,,07 V2 SId. K I"I I'

70.0

9/0

"

,'/

~,

I

"

8,0

/~ " "

I

7,0

,',' I,

~

5,0

/ II

I I

'

"

~

I,. • I

I

'

I

,: I / /

6,0

" I

I /

/"

lj ,tI 4,0 3,0 2,0

7,0

/

"0'

'~(--:'-'~'" \

\

\

" ,

.

o

\,

'.\

,

8

72

'\',

...,,

'

'

',,- "

'''---.-0 -o2S1d.

,,--- 3 /d. 16 20 2'

28

K

32 Slund.n n.ch Vrrsuchsbrginn

Abb.8. Wie Abb. 7, nur 33 °0.

Temperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

567

Gibt man in del' empfindlichsten Phase den Kiilteschock mit Temperaturen zwischen 1 und 2°C, so ist die Schiidigung wesentlich geringer als bei Temperaturen zwischen 4 und 5°C. Dber die Ursachen diesel' auffiilligen Tatsache miissen weitere Untersuchungen AufschluB bringen. b)

EinfluB von Verdunklung und verschiedenen Beleuchtungsstiirken

Abb.9 gibt einen Versuch wieder, bei dem wiihrend del' Kiiltebehandlung verdunkelt wurde. Diese MaBnahme verhindert ein Ausbleichen, del' Chlorophyllgehalt del' so behandelten Parallelen steigt vielmehr wie del' einer Normalkultur an; die Verzogerung von 2 Std. wird im beobachteten Zeitraum nicht aufgeholt. Nach Kiilteschock im Licht (sonst iibliche Applikation des Schocks) bleichen die Zellen bereits innerhalb der hier wiedergegebenen 9 Std. deutlich aus. Dieser Versuch gab AnlaB zur Untersuchung des Einflusses del' Beleuchtungsstiirke wiihl'end del' 4 °C-Behandlung auf den Ausbleicheffekt. Bereits ab 4000-5000 Lux erhiilt man den vollen Ausbleicheffekt unter nachfolgenden Normalbedingungen (30°C, 9000 Lux); bei 3000 Lux blieb nur etwa die Hiilfte der Zellen stiirker geschiidigt; einige Zellen kamen sogar noch innerhalb der laufenden Periode zur Teilung. Beim Schock mit einer Belichtung von nur 2000 Lux gab es einen geringeren Chlorophyllverlust; die Hohe des Teilungssehubs war auf etwa die Hiilfte der Kontrolle herabgesetzt. Bei 1000 Lux und bei 500 Lux wiihrend der Kiiltebehandlung ergab sieh ebenso wie bei Kiiltebehandlung im Dunkel ein noch geringerer Effekt. Tabelle 3 gibt die gesehilderten Verhiiltnisse wieder. In Abb. 10 ist ein Versueh wiedergegeben, bei dem naeh 2stiindiger KiilteE Kiill~

0,500

N

0,'50

0,' 00

,112 Std

'0,

0

,,,.'"

0.350 0.300 0,250

,,

,

, ,,

,,r'

,0

, ,,

0.200 0,150

".,0

--;..:::----~ ...

0.100 0.050

o

2

,

6

II

10

12

"

16 StundM nilch Versuchsbeglnn

/

Abb. 9. Chlorophyllgehalt einer Synchronkultur (16: 12) von Chlorella nach Kalteschock illl Licht (L) und im Dunkeln (D). Unbehandelte Kontrolle ~= N.

568

HARALD LORENZEN

Tabelle 3 ChIarella pyrenoidosa. 16: 12 Std. Licht-Dunkel-Wechsel, 30 ° C, 9000 Lux, Chlorophyll und Zellzahl am Ende der Periode Beleuchtungsstarke (Lux) wahrend der Kalte behandlung (8. und 9. Std. bei 4°C) Kontrolle ohne Kalte 500 1000 2000 3000 4000 9000 E zu Beginn der Kalte behandlung

E bei 665 nm

Zellzahl

0,85 0,68 0,65 0,46 0,18 0,08 0,09

1700 1180 850 650 420 100 100

0,12

1'"9 Chlorophyll

;;;

11,0 10,0

9,0 8,0 7,0 6,0

5,0 4,0

3,0 2,0 I,D

o

8

12

16

20

24

28 Siunden nach V~rsuchsb~ginn

Abb. 10. EinfluB der Beleuchtungsstarke auf den Chlorophyllgehalt einer Synchronkultur von Chlorella (14: 10) nach 2 Std. 4 °e. (Nur die unbehandelte Kontrolle = N wurde nach der Licht· zeit verdunkelt.)

Temperatureinfliisse auf Chiarella pyrerwidosa usw.

569

behandlung (4°C) in 30 °C bei 4000 und 9000 Lux weiterkultiviert wurde. Wahrend wiederum bei 9000 Lux das normale Ausbleichen zu beobachten ist (Grundversuch), wird bei 4000 Lux nur ein verhaltnismaBig geringer Chlorophyllabbau konstatiert. 16 Std. nach dem Schock ist der Ausgangswert gerade wieder erreicht; zu diesem Zeitpunkt ist die Parallele bei 9000 Lux praktisch vollkolllmen ausgeblichen. Grundsatzlich wichtiger aber ist die Frage, ob nach der Temperaturbehandlung ein Pigmentverlust im Dunkeln bei 30°C zu beobachten ist. Aus Abb. 11 ersieht man, daB auch hier ein langsamer Chlorophyllabbau eintritt. Nach verschieden langen Dunkelzeiten (18--41 Std. nach dem Kalteschock) wurden die Kulturen erstmalig nach der Kaltebehandlung dem Licht (9000 Lux) ausgesetzt. Selbst nach 41 Std. Dunkelheit bleicht die Kultur schon innerhalb von 3 Lichtstunden betrachtlich aus. Nach 20 oder mehr Lichtstunden ist dann in allen Fallen wieder eine Chlorophyllzunahme zu konstatieren. Wurden Zellen, die nach dem Kalteschock ins Dunkel gekommen waren und die innerhalb einer Dunkelzeit von 43 Std. etwa 20 % ihres Chlorophyllgehaltes verloren hatten, nach diesen 43 Std. belichtet, so war erst nach weiteren 17 Lichtstunden der Chlorophyllwert erreicht, der zu Beginn dieser Belichtung bestimmt wurde. Durch eine sofortige Verdunklung nach dem Kalteschock (in diesem Fall von 3sttindiger Dauer; vgl. Abb. 11) wird somit ein Pigmentschwund nach Wiederbelichtung nicht verhindert, die Empfindlichkeit der Zellen bleibt vielmehr tiber eine lang ere Zeit erhalten. LaBt man nach der Kalteeinwirkung die Kulturen zunachst bei 30 °C i~ Licht und verdunkelt erst 6-9 Std. nach dem Schock, so ergeben sich die Verhiiltnisse E

K

0.10

~", - ~

0.09 0.08

0.07

'~36

'.

0.06

II

\ \

0.05

,

\

\

0

\

0.04

,-I

I

\ 0

'.

" \

I

I \

0

0,03

0.02 0,01

6

10

"

16

20

24

28

32

36

'0

"

48 Slund~n ~ch V~rsuc"sb~ginn

Abb. 11. EinfluB verschieden langer Dunkelzeiten auf den Chlorophyllgehalt einer Synchronkultur von Chiarella (16: 12) nach einem 3stiindigen Kiilteschock (4 0 C). Die Ziffern geben die Dunkelstunden bis zur ersten Belichtung nach dem Kiilteschock an.

570

HARALD LORENZEN

del' Abb. 12; dieserVersuch wurde (um von einem hoheren Chlorophyllgehalt auszugehen) nicht mit del' relativen AusgangszeIIzahI 100, sondern mit 150 begonnen. Man beobachtet auch hier nach dem Schock im Licht ein Ausbleichen del' Zellen, das innerhalb von 24 Std. fast vollkommen wird. 1m Dunkeln wird das Ausbleichen wesentlich verlangsamt, ein geringer Abfall ist abel' doch festzusteIIen. Erneute Belichtung hat ein starkes Ausbleichen zur FoIge (vgl. auch Abb. 11), das abel' nach einigen Stunden zum Stillstand kommt und dann vom Uberwiegen del' ChlorophyIIsynthese abgelOst wird. E 0,28 0.24 0.20 0,16

7\

0.12

8\ 0,08

.

9. ,

0,04

'

,, DL "',0..

...... -clt-ooo- __ o______ o 2

6

10

"

16

22

26

30

34

38 StundM nach V('rsuchsb('ginn

Abb.12. EinfluL\ yon Dunkelheit nach verschieden langen Lichtzeiten (anschlieL\en an dem 2stiindigem Kiilteschock bei 4 °C) auf den Chlorophyllgehalt einer Synchronkultur von Chlorella. (16: 12). Die Ziffern geben die Zahl der Lichtstunden in 30°C nach dem Kalteschock an. DL = Kiilteschockkultur im nachfolgenden D311erlicht (N = Grundversuch).

c) Einflu13 von Sauerstoff (N2-Begasung) Werden die Kulturen wahrend del' iiblichen Kaltebehandlung kraftig mit N z begast, so ist del' nachfolgende Ausbleicheffekt aufgehoben, del' ChlorophyIIgehalt ist trotz del' wieder normalen Begasung am Ende del' Lichtzeit nul' wenig gegeniiber der KontroIIe erniedrigt. Auch wenn eine derartig wahrend des Kalteschocks mit N2 begaste Kultur fiir 9 Std. nach dem Schock (= Lichtzeitrest) verdunkelt wurde, blieb del' Chlorophyllgehalt annahernd konstant. Nach Wiedereinsetzen del' Belichtung stieg er mit fast normaler Rate an (Abb. 13). Ein weiterer Versuch zu diesem Komplex (Ma13nahmen zur Verhinderung des Ausbleichens nach normalem Kiilteschock) zeigt, da13 N 2-Begasung im Licht nach dem iiblichen Kalteschock das Ausbleichen des Chlorophylls stark mildert. Die kalteinduzierte Lichtempfindlichkeit ist

Temperatureinfliisse auf Chiarella pyrenoidosa usw.

571

somit unter aeroben Bedingungen wesentlich starker; im Sinne von CLAES (1961) konnte sie vielleicht mit einer Sttirung der Karotinoidsynthese in Zusammenhang stehen. E 0,50 0,40 0,30 0,20 0.10

o

5

8

14

17

21

31

36 SlundM nJlch / Versuchsbeginn

Abb.13. EinfluB des Kalteschocks (3 Std. 4°C) bei gleichzeitiger N 2 -Begasung auf den Chlorophyllgehalt einer Synchronkultur von Chiarella. N = unbehandelte Kontrolle, K = 3 Std. ± °C mit N 2-Begasung, KD = 3 Std. 4°C mit N 2 -Begasung und nachfolgende 9stiindige Verdunklung.

II. Die Einwirkung von hohen Temperaturen auf Synchronkulturen

1. Kurzzeitige Temperaturschocks Nach den Ergebnissen bei der Kalteschockbehandlung lag es nahe, auch Versuche mit Schocks bei hoher Temperatur durchzufiihren. Bei diesen Versuchen wurde in erster Linie Wert auf die Auffindung empfindlicher Entwicklungsstadien gelegt. In Vorversuchen hatte sich eine 15miniitige Behandlung mit 46 DC als glinstigste Applikation von Hitzeschocks herausgestellt. Der Temperaturausgleich beim Umsetzen der Kulturrtihren war innerhalb von maximal 2 Min. erreicht. Ahnlich wie \ bei der Untersuchung des Kiilteeffektes wurde als auffiilligstes Symptom nach dem Hitzeschock ein Ausbleichen der Zellen beobachtet. Unter den geschilderten Bedingungen ist die Versuchsserie der Abb. 14 vorgenommen, die mit Zellen aus einer 16: 12-Kultur begonnen wurde. Die Zellen wurden nach einer bestimmten Lichtstundenzahl (an jeder Teilkurve rechts angefiihrt) dem Hitzeschock ausgesetzt und dann im Dauerlicht unter normalen Versuchsbedingungen (30 DC, 9000 Lux) belassen. Autosporen, die mit Beginn der Lichtzeit in 46 DC kamen (0), begannen erst nach etwa 16 Lichtstunden merklich Chlorophyll zu synthetisieren. Sie waren so weit geschadigt, daB s e erst nach insgesamt 36 Lichtstun den gerade den Chlorophyllgehalt erreicht hatten, den die nicht einem Hitze-

572

HARALD LORENZEN

schock ausgesetzte Kultur bereits nach 16 Lichtstunden aufwies. 5 Std. alte Zellen (5) wurden am starksten geschiidigt und blicheIi so stark aus, daB sie hei Versuchsende fast chlorophyllfrei waren; in dieser Kultur starben zwar viele Zellen ab, doch ergrtinten die Restzellen im Laufe von rund 2 Tagen und teilten sich anschlieBend. Bei 10 Std. lang unter Normalbedingungen angewachsene Zellen (10) gab es infolge des Hitzeschocks einen nur leichten Abfall des Chlorophyllgehaltes; etwa 12 Std. nach der Hitzebehandlung macht sich ein deutliches Uberwiegen der Chlorophyllsynthese tiber evtl. andauernde Abbauvorgange bemerkbar. 16-Std.-Zellen (16) wurden relativ am wenigsten geschiidigt. Nach zusatzlichen 2 Lichtstunden (18) ist eine erneute Zunahme der Empfindlichkeit gegentiber dem Hitzeschock erkennbar. Moglicherweise beruht dies auf der unmittelbaren Vorbereitung der Zellteilungsvorgange. Bei allen geschilderten Hitzeschockversuchen fan den innerhalb der 28 sttindigen Periode keine Zellteilungen statt; diese erfolgten stark verzogert mit geringer Synchronisationsschiirfe. Ein naheres Verstandnis der physiologischen Grundlagen des reversiblen Ausbleichens nach Hitzeschock vermitteln die geschilderten Versuche noch nicht; auch hier mtissen analytische Untersuchungen, verbunden mit genauen stoffwechselphysiologischen MeBreihen, abgewartet werden. Einen wichtigen Ansatzpunkt flir weitere Versuche ergaben jedoch Experimente, bei denen die 46°C-Behandlung bei Dunkelheit (ebenfalls 15 Min.) durchgef~hrt wurde. Der Chlorophyllverlust ist hier erheblich starker; die Belichtung wahrend der hohen Temperatur tibt also einen gewissen Schutz auf das Pigment aus. In weiE 1.0 16

0.9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

8

12

16

20

2'

28

32

36

40SI'Jndrn nach Vrrsuchsbrginn

Abb.14. EinfluJ.ldes Hitzeschocks (15 Min. 46°C) zu verschiedenen Zeiten im Verlaufe des Entwicklungszyklus von Chlorella in Synchronkultur (16 : 12) auf den Chlorophyllgehalt. Die Ziffern geben die Zahl der Lichtstunden bis zum Beginn des Hitzeschocks an. N = unbehandelte Kontrolle; nur diese wurde nach 16 Lichtstunden verdunkelt.

573

Temperatureiufliisse auf ChIarella pyrenaidasa usw.

teren Versuchen konnte der verstarkende Einflu13 der Dunkelheit wahrend des Hitzeschocks auf den folgenden Pigmentabbau gesichert werden. Wurde wahrend des Hitzeschocks bei weiterer Belichtung mit rein em N2 begast, so resuItierte ein starkeres Ausb leichen als beim Parallelversuch mit normaler Begasung. Abb. 15 gibt einige Befunde zusammenfassend wieder, die, wie aIle Experimente, in mehreren Versuchsserien reproduziert wurden. ZeIlen nach 7 bzw. 9 Std. des Anwachsens wurden unter verschiedenen Bedingungen dem Hitzeschock unterworfen: Einmal wurde im Licht wie ublich oder mit N2 begast, zum anderen wurde der Schock im Dunkeln bei den unterschiedlichen Begasungen durchgefiihrt (D = Dunkel mit CO 2/Luft-Begasung, ND = Dunkel mit N2-Begasung). Eine besonders ausgepragte und schnelle Schadigung erfolgte bei Begasung mit N2 wahrend des E 0.50

N

0,'0

0,30

/ "', , .~'

\

,

''''\

0,20

\

"

\

0'/0

/

"

"

'\

",. \-.~~~~-~-~.~-~---",',,',

. o

" \

---

~,

7

9

" -------_ .. _-_ .... _--------31

Stund.n IIMh V.rsuchsbrginn

Abb.15. EinfluJ.l des Hitzeschocks (15 Min. 46°C) unter verschiedenen Bedingungen auf den Chlorophyllgehalt einer Vollsynchronkultur von ChIarella (14; 10). 7,9 Hitzeschock im Licht nach 7 bzw. 9 Std. 7 D, 9 D = wiihrend des Hitzeschocks verdunkelt, 7 ND, 9 ND = wiihrend des Hitzeschocks verdunkelt und N 2 -Begasung, 7 N, 9 N = wahrend des Hitzeschocks im Licht N2 -Begasung, N = unbehandelte Kontrolle. 39

Flora, Bd. 153

574

HARALD LORENZEN

Hitzeschocks im Licht (7 N, 9 N). Dagegen ist die Schiidigung im Dunkeln nicht so groB, obwohl auch in diesem Fall die N2-Begasung einen ungtinstigen EinfluB austibt (7 ND und 9 ND im Vergleich zu 7 N und 9 N). Ganz klar ist aber zu erkennen, daB die Zellen relativ wenig geschiidigt werden, die im Licht wahrend der Temperaturwirkung normal begast werden (7, 9). 1m Gegensatz zur Ausbleichwirkung nach dem Kalteschock ist hier im Dunkeln keine weitere Verminderung des Pigmentgehaltes zu beobachten; es findet sogar eine geringe Chlorophyllsynthese statt, obwohl die ungeteilten Zellen nach erneutem Lichteinsatz weiter ausbleichen. 31 Std. nach Versuchsbeginn waren aIle Kulturen mit Ausnahme von 7 und 9 voIlkommen ausgeblichen; ein Wiederergrtinen erfolgte erst spater. Wurde schlieBlich nach dem normal (im Licht mit CO 2/Luft-Begasung) durchgeftihrten Hitzeschock 2 Std. mit N2 begast (bei 30°C im Licht), so war eine leichte Schutzwirkung festzustellen. Belichtung bei weiterer CO 2-Versorgung wahrend der Hitzebehandlung ist von Vorteil, nach der Hitzebehandlung hat sie jedoch in Ver. bin dung mit aerober Begasung einen ungtinstigen EinfluB auf die Zellen und bepg Chlorophyll

ml 9,0

8,0 7,0

6,0

. ! .:.

5,0 4,0

: ",J

3,0

.' "

o

"

8

12

16

20

2'

28

32

36 StUndM nllch • V('rsuchsb('ginn

Abb. 16. Chlorophyllgehalt einer Synchronkultur von Chlorella (14: 10) nach Hitzeschock (15Min. 46 0 C) im Licht und im Dunkel. 3 = nach Hitzeschock Licht, 1 = nach Hitzeschock 24 Std. Dunkel, dann Licht, 2 = nach Hitzeschock 4 Std. Licht, dann Dunkel, N = unbehandelte Kontrolle.

Temperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

575

8chleunigt das reversible Ausbleichen. Letzteres wird auch durch Abb. 16 verdeutlicht: eine Kultur, die nach dem Hitzeschock 24 Std. im Dunkeln gehalten wurde, bleicht bei Wiederbelichtung nicht aus (1). 4 Std. Licht nach der 46°C-Einwirkung haben bei nachfolgender Verdunklung ebenfalls kein Ausbleichen zur Folge (2); auch in diesem :F'all erfolgt im Licht sofort eine deutliche Chlorophyllzunahme. Bei Dauerbelichtung dagegen bleichen die geschockten Zellen innerhalb von 18 Std. vl>llkommen aus (3). 2. Kul tur in hoheren Dauertemperaturen a) Wirkung auf die Substanzproduktion, den ChlorophyIlgehalt und die photosynthetische 02-Produktion Unter hOherer Temperatur wird im vorliegenden Zusammenhang eine tiber dem Normalwert von 30°C liegende Temperatur verstanden. Schon 30°C ist ein ftir die allgemeine Algenanzucht relativ hoher Wert. Bei dem verwendeten Ohlorella-Stamm ist aber bei 30°C die Produktivitat noch sehr hoch; deshalb ist eine Untersuchung bei Wachstumstemperaturen von tiber 30°C von Interesse. In einer frtiheren Arbeit (PIRSON und LORENZEN 1958a) ist das Wachstum bei 20°C, 25 °C und 30°C untersucht worden. Ftir aIle Versuche bei erhOhten Temperaturen dienten Autosporen einer vollsynchronen Kultur (14 : lV, 30°C; vgl. Abb. 2 und LORENZEN 1962) als Ausgangsmaterial. Diese MaBnahme erlaubt eine beliebige Reproduktion von Versuchen. Eine lang ere Kultur bei hOheren Temperaturen konnte Ada ptionserscheinungen zur Folge haben und evtl. dazu fiihren, daB temperaturstabile Mutanten selektioniert werden (vgI. den "high temperature strain" von Ohlorella. SOROKIN und MYERS 1953). Abb. 17 gibt die Trockengewichtszunahme von Ohlorella innerhalb von 14 und von 24 Std. bei jeweiIs9000 Lux und den Temperaturen von 30, 33, 36, 39 und 40,5°C

mgt]

10ml

f1 r--

10

. 5

Abb 17 •

1

,....

I I

I I I

I I I I I

II I

I

:

-'

r

· ·: · I

I I I I I

10

n !

· ·: ,...... - · r-I I

I

II

5

1rtX:llwtgrNkhtszunahm. ron ~f}yr!f!oidpsq nach U

• b2w.:M Uchl$tund.n. rv.,gl.ich mit Eugl.na. nach WOLKeN

L ___J24Std. r:==I "Sid. r------, 39*

r--

I

1961)

c:::=:::JEugiMa

576

HARALD LORENZEN

vergleichend wieder. Die Werte sind Mittelwerte mehrererVersuchsserien; jeder der Einzelversuche laBt prinzipiell den gleichen Gang erkennen. Zumweiteren Vergleich sind zufallig verfligbare Werte von Euglena, die von WOLKEN (1961) ermittelt wurden (Messung der optischen Dichte), angegeben. Der 30 ° C-Wert nach 24stiindigem Wachs~ tum wurde mit dem entsprechenden Trockengewicht von Chlorella gleichgeset~t. Bei Chlorella liegt das Temperaturoptimum flir die Substanzproduktion bei 33°C, bei hoheren Temperaturen wird das Wachstum schon deutlich gehemmt. Der Unterschied zwischen 14- und 24stiindiger Belichtung wird mit zunclhmender Temperatur kleiner und zeigt somit an, daB die lang ere Belichtung bei diesen aus Wechsellichtkultur kommenden Zellen einen ungiinstigen EinfluB auf das Wachstum hat. Es ist jedoch bemerkenswert, daB in 40,5 °c die Substanzproduktion flir 14 bzw. 24 Std. noch deutlich hoher liegt als bei der "Normaltemperatur" von 30°C. Euglena wurde im Gegensatz zu Chlorella in mixotropher Kultur angezogen; bei ihr beobachtet man einen Substanzproduktionsanstieg bis 39°C. Die Abb. 18 stellt die Chlorophyllzunahme der gleichen Versuchsserie von Chlm'ella dar. Fiir 14stiindiges Wachstum liegt das Maximum bei 36°C, flir 24stiindiges bei 33°C. Auch beim Chlorophyll verringert sich der Abstand zwischen den beiden Werten der gleichen Temperatur immer mehr und zeigt klar die relativ ungiinstige Wirkung der langeren Belichtung bei hoheren Temperaturen an. Besonders deutlich wird das bei 40,5 DC. Hier ist nach 24 Std. sogar weniger Chlorophyll nachweisbar als (bei dem gleichen Zellmaterial) nach 14stiindigem Wachstum; in den letzten 10 Std. iiberwiegt also bereits ein Chlorophyllabbau. Abb. 19 zeigt das Verhiiltnis von Chlorophyll/Trockengewicht. Hier sind ebenso wie schon in Abb. 18 die Werte fiir Euglena zum Vergleich aufgezeichnet. Bei der 14stiindigen Belichtung von Chlorella steigt das Verh~ltnis bis 36°C deutlich an und fallt dann ziemlich steil ab, dagegen liegt das Maximum der 24stiindigen Belichtung schon bei 30°C, der einzigen Temperatur, bei welcher der 24-Std.-Wert iiber dem pgChI

,.-.,,

pro ml

20

,

~--,

I I I I I

,

.! i Ir--,I iiI: I

I:rI

r-I

I

10

I

I

-'

A bb. 18

330

r"'''',

! ~ r-I : i i i! ! : 1 - .._, i I I

'

I

I

I

:

I

:

. I

:

t

I

:

I

:~

300

I

~:;

~

36 0

I

39 0

I

'°.5 0

Chlotopfrllzunahmp WIn Chlnlg pyrMOirknD nach " bzw. 24 LichlstundM

c=:J"SId.

r------,

L_____ J245td.

Temperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

577

14-Std.-Wert liegt. Auch bei Euglena faIIt das VerhiiItnis von ChlorophyUJTrockengewicht von 30°C an ab, vor allem bedingt durch den bei 33 °C beginnen~en Pigmentschwund. Die unglinstige Wirkung langer Belichtung wird weiter unten (vgl. S.581) noch deutlicher, wenn libel' die Wirkung hoher Temperatur auf die ZeIlteilungen berichtet wird. Der mit allem Vorbehalt geflihrte Vergleich mit Euglena sollte in erster Linie dazu dienen, die eigenen Befunde auf eine etwas breitere Basis zu stellen; zudem diirfte Euglena nach Chlarella der meistuntersuchte grline Mikroorganismus sein. Aus einer Reihe von Stoffwechselv€fsuchen seien 2 typische E'iille wiedergegeben. Abb.20 zeigt die reinen Me13werte (Ausgangswert 30°C = 100) im Verlauf del' 14: 10 Stundenperiode fiir 30°C sowie flir 36°C Wechsellicht (14: 10) und Dauerlicht. Del' Verlauf der 02-Kurve beim 30 °C-Versuch entsprach ganz den friiher ermitteIten (LORENZEN 1959, vgl. auch METZNER und LORENZEN 1960, Abb. 3). Schon unmittelbar nach dem Dberfiihren in 36°C zeigen die Zellen eine erhohte photosynthetische Leistung. Der Kurvenverlauf bei 36°C in den ersten 14 Std. deutet in seiner Hohe die gegenliber 30°C gesteigerte Substanzproduktion an (vgl. Abb. 17). Dann aber fallen die O2-Werte absolut ab und lassen die ungiinstige Wirlmng del' hohen Temperatur klar erkennen. 1m Dauerlicht (36°C DL) ist dieser Abfall gegenliber der Wechsellichtkultur (36°C WL) deutlich beschleunigt; auch bei den Stoffwechselmessungen ist somit der schiidigende Einflu13 langerer Belichtung offensichtlich. Dies ist im 39 °C-Versuch der Abb. 21 noch starker ausgepragt. Schon in den ersten 14 Lichtstunden ist der Leistungsunterschied nicht mehr so gro13 wie beim Vergleich von 30°C mit 36 °C. 1m Dauer,icht bei 39°C (39°C DL) ist del' nachfolgende }Jog Chi mgTGW'

--,, , ,,

20

,I ,, ,

--,,

,

:

I

..

I!

10

30°

Abb. 19.

33°

36°

390

···,

--,

,

h

·

h

40.5 0

ChlorophylilTrockpng~wichl von Chlo'~lIa ey'~noidosa nach

" bzw.24 Lichlslundpn (V~,g/~ich mil Eug/~na nach WOLKEN 1961)

c::=J "Sid.

L~~~~-y,sld. c:::=J Eug/~na

578

HARALD LORENZEN

Abfall der photosynthetischen Leistung SO groB, daB eine nunmehr dichte Algensuspension (etwa 30fache Trockengewichtsmenge der Ausgangssuspension) nach 38 Lichtstun den etwa den gleichen Wert der photosynthetischen 02-Produktion aufweist wie die dtinne Ausgangskultur der Autosporen. Auch bei 39°C ist der Leistungsabfall im Wechsellicht (39°C WL) geringer. Vber das weitere Schicksal der Zellen bei einer Dauertemperatur von 39°C wird erst nach den Untersuchungen tiber das Verhalten der Zellteilung berichtet (vgl. S. 58J). Allgemeine Angaben tiber die temperaturbeeinfluJ3ten Leistungsgrenzen der Photosynthese von hoheren und niederen Pflanzen finden sich bei RABINOWITCH (1956).

r~.

Einh.

'-

1500

'~,

1000

500 36 0 DL

lao

o

• 62 Slund.n

48

38

Abb.20 Photosynthetische 02-Produktion einer vor Versuch synchronen Kultur von Chlorella unter verschiedenen Temperatur- und Lichtbedingungen (vgl. Text). Anfangswert 30°C = 100 = 40 mm 3 2 /10 ml Std.

°

r~l.

Einh.

100 _'--~""Oo WL

'~~ \

\

500

\ \ \

\

\ \ \

39°OC

100

a Abb. 21 wie Abb. 20. Anfangswert 30°C

38 S/undM

=

100

=

52 mm

3

°

2 /10

ml/Std.

Temperatureinfliisse auf Chiarella pyrenoidosa usw.

579

b) Wirkung auf die Zellteilung Die bisherige Betrachtung der Einfliisse erhOhter Kulturtemperatur auf Chlorella bleibt unter Vernachlassigung der Zellteilung sehr unvollkommen; denn es treten sehr auffallige Storungen der Zellteilungen ein. Da als Ausgangsmaterial nur Zellen einer vollsynchronen Kultur dienten, bietet sich auch bei mikroskopischer Betrachtung ein iibersichtliches Bild (Abb. 22-26); die Auspragung einer Schiidigung ist so genau erfaBbar. Bei Eintreten ungiinstiger Kulturbedingungen muB allerdings mit einer Verringerung der Synchronisationsschiirie (Tendenz der Desynchronisietung) gerechnet werden. Tabelle 4 Verhalten der Zelltpilung bei verschiedenen Temperaturen im 14: 10- Std.-Wechsellicht und im Dauerlicht

30 0 e 33°e 34°e 36°e 3g e e

Wechsellicht

Dauerlicht

normal normal verziigert teilweise stillgelegt stillgelegt

normal verziigert teiIweise stillgelegt stillgelegt stillgelegt

Tabelle 4 gibt zunachst stark vereinfacht eine Dbersicht tiber die Beeinflussung der Zellteilung bei hoheren Temperaturen im Wechsellicht (14: 10) und Dauerlicht. Als normal betrachten wir den vollsynchronen Entwicklungsablauf aller Zellen innerhalb von 24 Std.; er ist unter den gegebenen sonstigen Bedingungen bei 30 DC im Wechsellicht und Dauerlicht, bei 33 DC jedoch nur noch im Wechsellicht mogJich. Bei 33 DC im Dauerlicht macht sich schon eine erhebliche Verzogerung im Einsetzen und AbschluB der Zellteilungen bemerkbar: die Verzogerung kann fiir einen Teil der Zellen schon das Doppelte des normalen, kiirzestmoglichen Entwicklungszyklus betragen; es tritt eine deutliche Desynchronisierung ein. Eine weitere Temperaturerhohung (34 DC im Dauerlieht und 36 DC im Wechsellicht) hat fiir einen Teil der Zellen den irreversiblen Verlust der Teilungsfahigkeit zur Folge; bei hOheren Temperaturen vermag sich keine Zelle in der Kultur mehr zu teilen, die Stillegung ist vollstandig. Einige Abbildungen (22-26) sollen die in Tabelle 4 zusammengefaBten Befunde belegen. Abb. 22 zeigt die Zellen einer Dauerlichtkultur bei 34 DC nach 48stiindigem Anwachsen und (urn aIle noch teilungsfiihigen Zellen zur Teilung zu veranlassen) einer folgenden 12sttindigen Dunkelzei t. Dber 20 % der urspriinglich vorhahdenen Zellen sind vollkommen teilungsgehemmt, die anderen haben sich geteilt. Man erkennt an der GroBe der frischgebildeten Tochterzellen, daB es sich urn Autosporen handelt, deren Mutterzellen Hinger als 14 oder 16 Std. im,Ji-icht angewachsen sind (vgl. die im Dunkel freigesetzten Autosporen der Abb. 3 imiVerhiiltnis

580

HARALD LORENZE1\;

zur GroBe der Mutterzelle), ferner an ihren unterschiedlichen GroBen die desynchronisierende Wirkung der hohen Temperatur. Abb. 23 zeigt vergleichsweise eine Wechsellichtkultur in 34°C ebenfalls nach 48 Std.; ein groBer Teil der Zellen verbleibt in einem "Himbeerstadium"; es ist aber deutlich zu erkennen, daB bei allen Zellen die Protoplastenteilungen abgelaufen sind. Die endgiiltige Freisetzung der Tochterzellen scheint der am starksten durch hohere Temperatur gehemmte Teilungsvorgang zu sein. 1m Wechsellicht bei 36°C ist die Schadigung wesentlich starker (Abb. 24). Die Kultur hat ebenso wie die der Abb. 24 2 Perioden von 14 : 10 Std. hinter sich. Die Zellen "qualen" sich formlich zur Teilung, nur ein kleiner Teil von ihnen ist noch in der Lage, in Tochterzellen zu zerfallen.

Abb. 22. Zellen einer vor Versuch synchronen Kultur von Chlorella nach 48 Lichtstunden in 34 °c und nachfoIgenden 12 DunkeIstunden bei gIeicher Temperatur. VergriiBerung der Abb.22-26 etwa 200fach.

Abb.23. Zelleu einer vor Versuch synchronen Kultur von Chlorella nach 48 Std. bei WechseIlicht (14: 10) in 34 0 C.

Temperatureinfliisse auf Chiarella pyrenoidosa usw.

581

1m Dauerlicht bei 36°C sterben schon nach 36 Std. einige Zellen abo Sie sind als klein ere und bleiche Zellen in der Abb. 25 deutlich zu erkennen. Die Absterbequote nimmt weiter zu; nach 4-5 Tagen sind aIle Zellen tot. Einzelne Zellen vermogen noch relativ lange zu wachsen und werden zu RiesenzeIlen, die 50 f.l im Durchmesser erreichen konnen (Abb. 26). Uber eine ahnliche Zellteilungshemmung bei Chlamydomonas chlamydogama durch hiihere Temperatur (34°C) berichtete kiirzlich TRAINOR (1961). Die geschilderten Versuche zeigen, daB an der oberen Temperaturgrenze des Wachstums der normale Entwicklungsgang der Zellen im Dauerlicht eher gehemmt wird als im Wechsellicht gleicher Temperatur. In einem bestimmten Temperaturbereich (etwa 33-34 °C) wird der Licht-Dunkel-Wechsel fUr ChloreUa obligato Es sei noch kurz auf die irreversibel teilungsgehemmten Zellen eingegangen. 1m Dauerlicht (vgl. Tabelle 5) und etwas spater auch im Wechsellicht sterben die

Abb. 24. Zellen einer vor Versuch synchronen Kultur von Chiarella nach 48 Std. beilWechsellicht (14: 10) in 36°C.

Abb. 25. Zellen einer vor Versuch synchronen Kultur von Chlorella nach 36 Lichtstunden in 36°C.

582

HARALD LORENZEN

Abb. 26. Zellen einer vor Versuch synchronen Kultur von Chiarella nach 72 Lichtstunden in 36 0 C.

Zellen unter erheblichem Substanzverlust und Ausble:chen in einigen Tagen abo Selbst bei einer so hohen Temperatur wie 39°C findet noch eine DNS-Synthese statt, die allerdings im Vergleich mit der ParaIlelkultur bei 30°C deutlich gehemmt ist (vgl. Abb. 27, nach RAUCHE 1961). Am Ende der Periode haben die Zellen bei 39°C fUr etwa 12 Autosporen DNS synthetisiert, die Zellen bei30 °C aber fUr mindest'ens 16. Es hat den Anschein, als ob einer der Syntheseendschritte gehemmt ware; wird eine Kultur nach 16 Std. Licht in 39°C fUr die 12sttindige Dunkelzeit in 30°C tiberfUhrt, so erreicht die DNS-Menge in dieser Dunkelzeit noch den Wert der Kultur bei andauernd 30°C. Dennoch vermogen sich im FaIle dieses Temperaturwechsels innerhalb der 28sttindigen Periode nur 15 % aller Zellen zu teilen. In der zweiten Lichtzeit bei 39°C findet in den Zellen eine weitere starke Substanzvermehrung statt, hierbei nimmt die DNS-Menge noch urn mehr als das Doppelte des Endwertes nach einer Periode zU. In weiteren Perioden wird nur noch wenig DNS gebildet, insgesamt synthetisieren so behandelte Zellen im Durchschnitt eine DNS-Menge, die fUr etwa 30 Tochterzellen ausreichen konnte. Tabelle 5 Chiarella pyrenoidosa. 39 0 C, 9000 JJux. Eine Periode Licht-Dunkel- W echsel16: 12-Std., dann Dauerlicht Trockengewicht rug/10 ml . nach 16 Std. Licht nach 12 Std. Dunkel Zeit im Dauerlicht in Tagen

1 2 3

6,1 6,2 4,9 4,5 2,1

4

t

Temperatureinfliisse auf ChIarella pyrenoidosa usw.

583

Beim Abbau der Zellen im Verlaufe der weiteren Behandlung mit 39 DC bleibt dann die DNS-Menge (im Gegensatz zur sehr stark abnehmenden RNS; vgl. RAUCHE 1961) nahezu konstant. Es ist hisher nicht moglich gewesen, diese gehemmten Zellen auf irgendeine Weise zur Teilung zu bringen. So blieb ein Zusatz von Spurenelementen und der Vitamine Bs und B12 ohne Wirkung. Nach den Untersuchungen von HUTNER und Mitarb. (1957) an Ochromonas hatte man hier mit einem Erfolg rechnen konnen; denn bei hoherer Temperatur steigt bei diesem Objekt der Nahrstoffbedarf in quantitativer und qualitativer Hinsicht. AhnIiche Erfahrungen sammelte SHERMAN (1959) bei Hefe. Ebenso blieb eine Erhohung des Sulfat- und Nitratgehaltes (vgl. HASE und Mitarb. 1959) ohne jeden Erfolg. Mit der Feulgenmethode (vgl. LORENZEN 1958) konnte festgestellt werden, daB die Riesenzellen viele Kerne enthalten. Ob die Zahl der Kerne dem Anstieg der DNSMenge jeweils entspricht, lieB sich wegen der reichlich vorhandenen Reservesubstan zen nicht feststellen.

3

2

o

'6

8

10

12

"'6

19

22

25

28

/

Slunden nach Versuchsbeginn

Abb. 27. EinfluB verschiedener Temperaturbedingungen auf die DNS-Synthese einer Synchron. kultur von ChIarella innerhalb einer Periode im Licht-Dunkel-Wechsel von 16: 12 Std.

In. Die Wirkung von

Temperaturwechseln

1. EinfluB auf die tagIiche Ausbeute Der Vorteil hOherer Substanzproduktion bei Temperaturen, die im FaIle der Dauereinwirkung die Zellteilung bereits irreversibel ausschalten, kann ausgenutzt werden, wenn man rechtzeitig eine Anderung der Temperatur vornimmt. Die hohe Substanzproduktion ist dann gekoppelt mit einer entsprechend hoheren Ausbeute an Tochterzellen (LORENZEN 1961); dabei sollen im vorliegenden Rahmen nur die FaIle

'.

584

HARALD LORENZEN

von Interesse sein, die eine Dauersynchronisation mit gleicher Ausbeute in jeder Periode ermoglichen. So liefern beispielsweise die Zellen einer Vollsynchronkultur nach 14stiindiger Belichtung in 36°C durchschnittIich 24 Autosporen, wenn die 10sttindige Dunkelzeit bei 30°C ablauft (Tabelle 6). Unter diesen Bedingungen ist tatsachlich eine Dauersynchronisation moglich; innerhalb jeder Periode von 24 Std. bildet eine Mutterzelle durchschnittlich 24 Tochterzellen. Als weiteres Beispiel dient Tabelle 7. Bei einem Licht-Dunkel-Wechsel von 13: 11 Std. wurde einmal bei 30°C allein, zum anderen in den ersten 10 Lichtstunden bei 37°C und im Rest der Lichtzeit sowie der gesamten Dunkelzeit bei 30°C kultiviert. Auch hier ist eine beachtliche ErhOhung der taglichen Autosporenzahl festzustellen. Trockengewicht und Chlorophyll steigen in jeder Periode innerhalb der Bestimmungsfehler im gleichen Verhiiltnis wie die Zellzahl an; die Ausgangszellen fUr jede Periode sind also morphologisch und physiologisch weitgehend identisch und erfUllen somit die Anforderungen der Dauersynchronisation. Einmalige hohe Zellteilungsschiibe mit durchschnittlich bis zu 36 Autosporen pro Zelle sind auch moglich (z. B. 4 Std. Licht bei 30°C, 8 Std. Licht bei 39°C Tabellr Ii

Chlorella pyrenoidosa. Licht-Dunkel- Wechsel14 : 10 Std. (Endwerte nach einer Periode)

Zahl der Lichtstunden in 36°C, sonst 30°C

TGW Zellzahl (Ausgang 100) mg/ml

Chlorophyll rlml

nur 30°C 2

1340 1335 1490 1520 1670 1960 1960 2135 2440

7,66 7,32 8,28 10,32 12,08 12,77 11,99 13,06 12,20

4

6 8 10 12 13 14

0,39 0,37 0,39 0,45 0,51 0,57 0,53 0,58 0,55

Tabelle 7 Chlorella pyrenoidosa. Licht-Dunkel-Wechsel 13: 11 Std., 9000 Lux a) bei 30°C b) 10 Std. 37°C, Licht; 3 Std. 30°C, Licht; 11 Std. 30°C, Dunkel prozentualer Anstieg innerhalb einer Periode a) b) Zellzahl Trockengewicht Chlorophyll

1520 1440 1500

2330 2240 2320

585

Temperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

und abermals 4 Std. Licht bei 30 DC; Dunkelzeit immer bei 30 DC), doch vermogen diese Autosporen in der nachfolgenden Periode bei vollig gleichen Bedingungennicht abermals die gleichen Leistungen zu vollbringen; die Zahl der pro Mutterzelle gebildeten Tochterzellen liegt dann namlich nur bei etwa 16.

2. EinfluB auf die Freisetzung der Autosporen Werden die Zellen einer Vollsynchronkultur (30 °C, Licht-Dunkel-Wechsel von 14 : 10 Std.) nach der Lichtzeit tieferen oder hOheren Temperaturen ausgesetzt, so ergeben sich folgende Beobachtungen: bei 25 DC ist nur eine geringe Verzogerung der Zellteilungen urn etwa 1 Std. zu beobachten (vgl. Abb. 28). Bei einer Dunkeltemperatur von 20 DC beginnen die Zellteilungen schon urn einige Stunden verspiitet und am Ende der 24stiindigen Periode hat sich erst ein kleiner Prozentsatz der Zellen geteilt, bei 15 DC ist der Teilungsbeginn noch urn einige weitere Stunden verzogert und d e Dauer der Teilung betrachtlich in die Lange gezogen. Bei 10 DC schlie13lich konnen sich die Zellen nicht mehr teilen. Erst nach erneutem Dberfiihren in 30 DC treten Teilungen ein. Werden die Zellen mit Beginn der Dunkelheit in 33 DC gebracht, so teilen sich die Zellen zeitgleich mit der Kulttu bei 30 DC (Abb. 28). Bei einer Dunkeltemperatur von 35 DC erfolgen innerhalb der Periode von 24 Std. keine Zellteilungen, bei 36 DC wird schon ein groBer Teil der Zellen irreversibel geschadigt. r~/ativ~

Zellzahl 1600

~"""""""""~~~'.~O

,._ -

(30°;

DO)

1690 ( 25° )

1200

800

400

100

o

I

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Dunkelstunden

Abb. 28. EinfluJ.\ versehiedener Dunkeltemperaturen auf die Freisetzung der Autosporen beim Lieht-Dunkel-Wechsel von 14: 10 Std., 30 °C, 9000 Lux. (Der Unterschied der Endzellzahlen bei .30 0 C und 25 0 C liegt im Bereich des Zahlfehlers.)

586

HARALD LORENZEN

Nur bei Dunkeltemperaturen zwischen 25 und 33°C bleibt unter den gegebenen Bedingungen die Vollsynchronisation innerhalb der 24sttindigen Periode erhalten.Da die Substanzproduktion bei 33°C im Wechsellicht am hochsten ist, kann diese Temperatur als optimal fUr den verwendeten Stamm angesehen werden; bei einem LichtDunkel-Wechsel von 14: 10 Std. werden bei 33°C durchschnittlich 20 Tochterzellen pro Mutterzelle in jeder Periode gebildet.

Diskussion

Es seien zunachst einige Betrachtungen angestellt tiber die obere und untere Temperaturgrenze von Wachstum und Vermehrung, die sich aus unseren Daten ergeben. Dabei muB sogleich festgestellt werden, daB hier nur von dem verwendeten Chlorella-Stamm die Rede ist; bekanntlich konnen einzelne Stamme vor allem beztiglich ihrer oberen Temperaturgrenze des Wachstums stark variieren. Als Extrem kann bisher unter den Chlorellen der von SOROKIN und M'!ERS (1953) beschriebene "high temperature strain" (7-11-05) von Chlorella pyrenoidosa gelten, der bei 39°C im Dauerlicht noch eine maximale Produktivitat entfaltet. Der Begriff Temperaturgrenze ist auBerdem problematisch, weil sowohl nach oben wie nach unten das Lichtregime entscheidend mitwirkt. In beiden Richtungen konnen Wachstum und Vermehrung durch das Einschalten von Dunkelpausen erhalten werden, wo Dauerlicht schon zu einer Beeintrachtigung des Wachstums und einer Stillegung der Vermehrung flihrt. Nach hOheren Temperaturen zu kann man sogar noch eine absolute PIOduktivitatserhOhung erzielen, wenn Licht und Dunkelheit im richtigen Verhaltnis verabfolgt werden. Bei einigen Algen, wie H ydrodictyon (NEEB 1952; PIRSON und DORING 1952) und Micrasierias (KALLIO 1953), wird ein Licht-Dunkel-Wechsel als 0 bligatorisch betrachtet; auch flir Synchronkulturen von Chlorella gilt dies bei extremeren Temperaturen, wiihrend im Normalbereich der Licht-Dunkel-Wechsel immerhin gtinstig auf die Produktivitiit wirkt (PIRSON und LORENZEN 1958b; LORENZEN 1959, RUPPEL 1962, SoROKIN und KRAUSS 1962). Es handelt sich daher insgesamt beim Verhalten verschiedener Algen offenbar mehr urn graduelle als um grundsatzliche Unterschiede. 1m Bereich hOherer Temperaturen zeigt sich, daB einzelne Funktionen im Stoffwechsel und Wachstum recht verschiedene Temperaturmaxima besitzen. Am empfindlichsten ist hier der Mechanismus der Zellteilung, offen bar besonders in seinen letzten Phasen. DNS-Produktion und Kernteilung sind dagegen noch bei hoherer Temperatur moglich, so daB man in diesem Bereich mehrkernige Zellen erMlt. Auch bei der Photosynthese sind - wenigstens im kurzfristigen Versuch - bei recht hohen Temperaturen (39°C) Maximalleistungen zu erzielen. Schon das auBere Aussehen der Zellen

Temperatureinfliisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

587

zeigt aber, daB die Photosyntheseproduktion nur noch unvollkommen in die Umsetzungen des plasmatischen Wachstums eingehen. Als weiterer Faktor flir die Erhaltung der Zellvermehrung bei hoheren Temperaturen ist neben dem Licht-DunkelWechsel auch eine zeitweiIige Temperatursenkung von Bedeutung. Bis zu einer gewissen Grenze kann man in Kulturen, die im Licht bei hohen Temperaturen gehalten waren, durch rechtzeitige Senkung der Temperatur in normale Bereiche noch Teilungen ermoglichen und einen solchen Temperaturwechsel sogar ausnutzen, um die Produktivitat auf ein Maximum zu bringen. Durch geeignete Kombination von Licht- und Dunkelzeiten mit Temperaturwechseln im Verlaufe der Zellentwicklung kann man die hohe Photosynthese selbst noch bei 39°C in den Dienst der Zellvermehrung stellen. Solche Versuche setzen allerdings synchronisiertes Zellmaterial voraus, bei dem aIle Zellen in der zweiten Halfte ihrer Entwicklung auf Verdunklung mit einem kraftigen Umbau von Kohlenhydraten in EiweiB reagieren (LORENZEN und RUPPEL 1960, MULLER 1961; RUPPEL 1962; KOWALLIK 1962). Synchronisierung des Zellmaterials ist auch die Voraussetzung flir einen sicheren Nachweis sensibler Phasen der Zellentwicklung (LORENZ~N und RUPPEL 1958, PIRSON, LORENZEN und KOEPPER 1959, SOROKIN 1960, RIED und SOEDER 1961, PIRSON und RUPPEL 1962).In der vorliegenden Arbeit ist die Reaktion auf eine schockartige Applikation niederer und hOherel' Temperatur naher verfolgt worden. Bei den Kalteschocks, die in einem begrenzten Stadium der heranwachsenden Zelle einen markanten Hemmeffekt auslOsen (Teilungsstillstand, Chlorophyllschwund), ist bemerkenswert, daB die Wirkung mit Erhohung der Temperaturdifferenz nicht kontinuierlich zunimmt. Das Maximum der Empfindlichkeit ist bei Schocks mit 4 °C festzustellen. wahrend niedrige Schocktemperaturen (I-2°C) wieder l:>esser vertragen werden. Scharf zu trennen ist bei den Schockeffekten der induzierende Vorgang, der auf einer tiefgreifenden Umstellung in der strukturellen Konstitution der Zelle beruhen muB und den nach dieser Umstellung ablaufenden Folgeprozessen. Dies wird besonders daran deutlich, daB Kalteschocks nur bei Applikation im Licht wirksam s nl, wahrend die am Chlorophyllschwund erkennbaren Folgeproze3se grundsatzlich keine BeIichtung erfordern, wenn sie auch durch Licht betrachtIich gefordert werden. Der induzierende Vorgang ist an die Anwesenheit von Sauerstoff gebunden, hat also moglicherweise photooxydativen Charakter. Doch sind verhaItnismaBig niedrige Beleuchtungsstarken bereits voll wirksam, die weit unter den sonst bei Photooxydation an intakten Zellen wirksamen Intensitaten liegen (KANDLER und SCHOTZ 1956; SIRONVAL und KANDLER 1958, EGLE 1960). Der in der Folge des Kalteschocks bei wieder norm ,ler Temperatur eintretende Pigmentschwund ist in Gegenwart von Sauerstoff wesentlich starker als unter anaeroben Bedingungen. Bei diesem Abbau handelt es sich offen bar nicht urn einen so weitgehenden und allgemeinen ProzeB, als daB wesentIiche Strukturen der Zelle zerstOrt wilrden. Der Gesamtstickstoff wird namlich wahrend des Ausbleichens nicht merkIich erniedrigt. Damit ist die Voraussetzung fur

588

HARALD LORENZEK

eine rasche Behebung der Schockfolgen gegeben. Vielleicht ist das Pigmentsystem allein betroffen und kann bei Erhaltung der ubrigen Zellstrukturen leicht wieder regeneriert werden. Allerdings fUhrt zu lange Applikation der tiefen Temperatur zum Zelltod. Dem Pigmentschwund geht eine Photosynthesehemmung voraus; er ist also offenbar nicht das Anfangsglied in der Kette der durch den Schock ausgelOsten Schadigungen. Die kurzfristige Applikation hohet Temperaturen (Hitzeschocks) wirkt sich zwar ebenfalls in einem reversiblen Ausbleichen des Chlorophylls aus; dieser Effekt liiBt sich jedoch ohne Zweifel nicht auf gleicher Grundlage erklaren wie die Wirkung des Kalteschocks. Zuniichst liegt die empfindliche Phase in einem fruheren Stadium der Zellentwicklung bald nach dem Einsetzen der Wachstumsvorgange in den offensichtlich zunachst verhiiltnismaBig resistenten Autosporen. Die durch den Schock hervorgerufene Umstellung in der Zelle ist hier nicht von der Belichtung abhlingig; sie wird im Gegensatz zum Kalteschock sogar durch Verdunklung gefOrdert. Umgekehrt sind - anders als bei Kalteschocks -. die am Ausbleichen feststellbaren Folgevorgange im Dunkeln weitgehend stillgelegt; dennoch ist nach 12stundiger Verdunkelung der durch den Schock erzeugte empfindliche Zustand der Zelle noch erhalten, so daB eine nun einsetzende Belichtung sogleich den Pigmentabbau einleitet. Lang andauernde Verdunklung (24 Std.) vermag die Stabilitat der Zelle wiederherzusteUen. Auch hinsichtlich des Einflusses von Sauerstoff liegt ein erheblicher Unterschied vor. Sauerstoffentzug (N2-Atmosphiire) verstarkt die Wirkung des Hitzeschocks, und zwar bemerkenswerterweise im Licht noch starker als im Dunkeln. Wie bereits eingangs erwahnt, haben bisher Erfahrungen uber Temperatureinflusse auf die Zellentwicklung von Chlorella noch weitgehend gefehlt. Die vorliegende Arbeit, die der Sammlung solcher Erfahrungen diente und dabei die Miiglichkeiten der Synchronisation erstmalig einsetzen konnte, hat zunachst nur den Rahmen fur weitere Untersuchungen abgesteckt. Es ergaben sich eine Reihe von Einzelproblemen in verschiedenen Forschungsbereichen, wobei die Erfahrungen an Chlorella vergleichend auf andere Pflanzen ausgedehnt und damit auf ihre allgemeine Bedeutung hin gepriift werden mussen. So wird im Detail zu verfolgen sein, in welchem AusmaBe die verschiedene Temperaturabhiingigkeit einzeIner biochemischer Reaktionssysteme an den Temperaturgrenzen zum Auseinanderfallen der harmonischen Regulation in der ZeUentwicklung fiihrt. Untersuchungen solcher Art sind besonders beim Vergleich von Zellen verschiedener Resistenzgrade von Interesse (BUNNING und HERDTLE 1946); sie soUten nicht nur auf Messungen von Photosynthese und Atmung beschrankt bleiben. Aus unseren Befunden ergibt sich erneut, wie differenziert die empfindlichen Phasen innerhalb der Entwicklung einer Zelle sind. Die fruher oft angenommene allgemeine Sensibilitat im Zusammenhang mit hoher Aktivitat ist jedenfalls fUr den

TemperatureinfJiisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

589

Verlauf der Zellentwieklung nieht diskutabel, da sieh die sensiblen Phasen fiir versehiedene AuBenfaktoren keineswegs deeken. Offenbar findet jeder extreme AuBeneinfluB bei einer anderen Konstellation in den Strukturverhaltnissen seinen Angriffspunkt. Es ist eine wiehtige Aufgabe, diese speziellen Bedingungen in der Struktur der waehsenden Zelle mit indirekten oder direkten Methoden jeweils genauer zu kennzeiehnen. Dabei werden sieh moglieherweise allgemeine Prinzipien fUr die Bearbeitung der Phanomene von Resistenz und Sensibilitat finden lassen, die bisher in erster Linie an Geweben hoherer Pflanzen bearbeitet worden sind (LEVITT 1958; BIEBL 1962).

Zusammenfassung Mit synchronisierten Zellen von Chlorella pyrenoidosa (211-218 b) aus Kulturen bei 30 °G (Licht-Dunkel-WechseI16: 12 oder 14: 10 Std.) wurde der EinfluB niedriger und hoherer Temperaturen mit besonderer Beriicksichtigung der Temperaturgrenzen von Wachstum und Vermehrung untersucht. AuBerdem wurde die Einwirkung von kurzfristigen Temperaturschocks verfolgt. 1. Wahrend zwischen 14 und 32 °e Zellentwicklung und -teilung im Dauerlicht ablaufen konnen, ist sowohl bei niedrigeren als auch bei hoheren Temperaturen eine Einschaltung von Dunkelzeiten erforderlich.

2. Beim verwendeten Licht-Dunkel-Wechsel von 14: 10 Std. ist eine Temperatur von 33 °e optimal: innerhalb der 24stiindigen Periode teilen sich alle Zellen in durchschnittlich 20 Autosporen. Bei hiiheren Temperaturen wird zunachst eine Verzogerung, dann eine Stillegung der Teilung festgestellt. Die Kernteilung erweist sich hierbei weniger empfindlich als die Zellteilung. 3. Die hohe Produktion von Trockensubstanz zwischen 33 und 40 °e kann fiir eine voIlstandige Zellentwicklung ausgenutzt werden, wenn die Hemmung der Zellteilung durch rechzeitiges Erniedrigen der Temperatur aufgehoben wird. 4. In der 8. und 9. Std. der Lichtzeit eines Licht-Dunkel-Wechsels befinden sich die in 30 0 e synchronisierten Zellen in einer kaIteempfindlichen ,Entwicklungsphase. KaIteschocks (4-5°e, 2 Std.) schalten zunachst die Photosynthese aus. AnschlieBend tritt ein reversibler Pigmentschwund ein. Niedrigere Schocktemperaturen (1-2 00) rufen fast kein Ansbleichen hervor. Dasselbe gilt fiir Kalteschocks bei Verdunklung oder N 2-Begasung im Licht. Verdunklung nach dem Kalteschock vermindert den Pigmentverlust; selbst nach mehr als 24 Dunkelstunden ist jedoch noch eine Lichtempfindlichkeit des Pigmentsystems nachweis bar. 5. Schon in der 5. und 6. Std. der Zellentwicklung im Licht sind die Zellen gegen hohe Temperaturen empfindlich. Nach Hitzeschocks (46°e, 15 Min.) tritt ein ebenfalls reversibler Pigmentschwund ein. N2-Begasung oder (und) Verdunklung wahrend des Hitzeschocks verstarken (anders als beim KaIteschock) die Schadigungssymptome. 12stiindige Verdunklung nach dem Hitzeschock hebt dessen Folgen weitgehend auf. Meinem hochverehrten Lehrer, Herrn Prof. Dr. A. PIRSON, danke ich vielmals fiir sein stetes Interesse am VerIauf der Untersuchungen und fiir kritische Diskussionen, der Deutschen Forschungsgemeinschaft fiir eine Sachbeihilfe.

590

HARALD LORENZEN

Literatur AACH, H. G., 1952. Uber Wachs tum und Zusammensetzung von ChIarella pyrenoidosa bei unterschiedlichen Lichtstarken und Nitratmengen. Archiv Mikrobiol. 17, 213-246. - BIEBL, R., 1962. Protoplasmatische Okologie der Pflanzen. Wasser und Temperatur. Protoplasmatologia 12, 1. 344 S. - BUNNING, E., und HERDTLE, H., 1946.Physiologische Untersuchungen an thermophilen Blaualgen. Z. Naturfor~chg. 1, 93-99. - CLAES, H., 1961. Energielibertragung von angeregtem Chlorophyll auf C4D-Polyene mit verschiedenen chromophoren Gruppen. Z. Naturforschg. 1Gb, 445-454. - DAVIS, E. A., DEDRICK, J., FRENCH, C. S., MILNER. H. W., MYERS, J., SMITH, J. H. C., and SPOEHR, H. A., 1953. Laboratory experiments on Chlorella culture at the Carnegie Institution of Washington Department of Plant Biology. In Algal Culture ed. J. S. Burlew, Carnegie Institution of Washington Publication 600, 105-153. EGLE, K., 1960. Menge und Verhiiltnis der Pigmente. In Handbuch d. Pflanzenphysiol. V, 1 444-486. Berlin, Giittingen, Heidelberg. - HASE, E., OTSUKA, H., MIHARA, S., and TAMIYA, H., 1959Role of sulfur in the cell division of ChIarella studied by the technique of synchronous culture. Biochim. Biophys. Acta 30m, 180-189. - HEBER, U., 1958. Ursachen der Frostresistenz bei Winterweizen. 1. Mitt. Die Bedeutung der Zucker fiir die Frostresistenz. Planta 1)2, 144-172. - HUTNER, S. R., BAKER, H., AARONSON, S., NATHAN, H. A., RODRIQUETZ, E., LOCKWOOD, S., SANDERS, M., and PETERSEN, R. A., 1957. Growing Ochromonas malhamensis above 35°U. J. Protozool. 4, 259-269. - JAMBOR, B., Tetrazoliumsalze in der Biologie. Jena 1960. 152 S. - KALLIO, P., 1953. The effect of continued illumination on the desmids. Archivum Soc. Zool. Bot. Fenn. "Vanamo" 8, 58-74. - KANDLER, 0., und SCHOTZ, F., 1956. Untersuchungen liber die photooxydative Farbstoffzerstiirung und Stoffwechselhemmung bei Chlorella-Mutanten und panaschierten Oenotheren. Z. Naturforschg. 11 b, 708-718. - KOEPPER, A., Untersuchungen liber eine kalteempfindliche Phase im Entwicklungsverlauf der ChIarella-Zelle. Staatsexamensarbeit Giittingen 1960. - KOWALLIK, W., 1962. Uber die Wirkung des blauen und roten Spektralbereichs auf die Zusammensetzung und Zellteilung synchronisierter Chlorellen. Plant a 08, 337 bis 365. - KUHL, A., Zur Speicherung kondensierter organischer Phosphate in ChIarella. Vortrage aus dem Gesamtgebiet der Botanik N. F. 1, 157-166. - Ders., und LORENZEN, H., Handling and culturing of ChIarella. In "Methods in Cell Physiology" (ed. D. M. Prescott) Academic Press, New York 1963 (im Druck). - LEVITT, J., Frost, drought, and heat resistance. Protoplasm atologia 8, 6, 87 S. 1958. - LORENZEN, H., 1957. Synchrone Zellteilungen von ChIarella bei verschiedenen Licht-Dunkel-Wechseln. Flora 144, 473-496. - Ders., 1958. Periodizitiit von Nuklealreaktion und Kernteilung in ChIarella. Ber. dtsch. bot. Ges. 71, 89-97. - Ders., 1959. Die photosynthetische Sauerstoffproduktion von ChIarella bei langfristig intermittierender Belichtung. Flora 147, 382-404. - Ders., 1960. Uber den Einflu13 von Glukose auf Synchronkulturen von ChIarella pyrenoidosa. Naturwissenschaften 47, 477-478. - Ders., 1961. Neue Erfahrungen mit synchronisierten Chlorellen. Ber. dtsch. bot. Ges. 73, (58)-(59). - Ders., 1962. Das Verhalten synchroner Kulturen von ChIarella pyrenoidosa an der oberen Temperaturgrenze des Wachstums. Vortrage aus dem Gesamtgebiet der Botanik E. F. 1, 231-238. Ders., Synchroni7a i n of ChlJrella with light-dark changes and periodical dilution to a standard cell num ber in "Synchrony in Cell Division and Growth' '( ed. E. Zeuthen). Interscience Publishers, New York (1963, im Druck). - Ders., und RUPPEL, H. G., 1958. Periodische Resistenziinderung in einer synchronen Kultur von ChIarella. Naturwissenschaften 40, 553-554 (1958). - Dies., Versuche zur Gliederung des Entwicldungsverlaufs der Chlorplla-Zelle. Planta 04, 394-403 (1960). - MACKINNEY, G., Absorption of light by chlorophyll solutions. J. bioI. Chem. 140, 315322 (1941). -- METZNER, H., und LORENZEN, H., Untersuchungen liber den PhotosyntheseG( swechsel an vollsynchronen Chlorella-Kulturen. Ber. dtsch. bot. Ges. 73, 410-417 (1960). -

Tern peratureinfilisse auf Chlorella pyrenoidosa usw.

591

MULLER, H.-M., 1961. Uber die Veranderung der chemischen Zusammmensetzung von Scenedesmus MYERS, J., Culture conditions and the development of the photosynthetic mechanism III. Influence of light intensity on cellular characteristics of ChIarella. J. gen. Physipl. 29, 419-427 (1946). - Ders., 1951. Physiology of the algae. Ann. Rev. Microbiol. a, 157-180. - NEEB, 0., 1952. Hydrodictyon als Objekt einer vergleichenden Untersuchung physiologischer GriiJ3en. Flora 139,39-95. - PADILLA, G. M., and JAMES, T. W., 1960. Synchronization of cell division in Astasia longa on a chemically defined medium. Exp. Cell. Res. 20, 401-415. - PIRSON, A., Sur l'application de la synchronization a la physiologie cellulaire des algues vertes. Colloque Internat. C. N. R. S. Dinard 1960, 92--109 (1961). - Ders., und DiiRING, H., Induzierte Wachstumsperioden bei Griinalgen. Flora 139, 314-328 (1962). - Ders., und LORENZEN, H., 1958a. Ein endogener Zeitfaktor bei der TeiIung von ChIarella. Z. Bot. 46, 53-67. - Dies., 1958b. Photosynthetische Sauerstoffentwicklung von ChIarella nach Synchronisation durch Licht-Dunkel-Wechsel. Naturwissenschaften 4a, 497. - Dies., and KOEPPER, A., 1959. A sensitive stage in synchronized cultures of ChIarella. Plant PhysioI. 34, 353-355. - PIRSON, A., und RUPPEL, H. G., 1962. Uber die Induktion einer TeiIungshemmung in synchronen Kulturen von ChIarella. Arch. MikrobioI. 42,299-309. - RABINOWITCH, E. I., Photosynthesis II, 2. Interscience Pub I. New York (1956). - RAUCHE, G., Untersuchungen tiber die Wirkung hoher und supraoptimaler Temperaturen auf Synchronkulturen von ChIarella pyrenoidosa. Staatsexamensarbeit Giittingen 1961. RIED, A., und SOEDER, C. J., Wirkungen erhiihter Salzkonzentration auf den Gaswechsel synchron kultivierter ChIarella pyrenoidosa. Naturwissenschaften 48, 106-107 (1961). - RUPPEL, H. G., 1962. Untersuchungen iiber die Zusammensetzung von ChIarella beI Synchronisation im LichtDunkel-Wechsel. Flora la2, 113-138. - SCHON, W. J .. Periodische Schwankungen von Photosynthese und Atmung bei Hydrodictyon reticulatum. Flora 142, 3-17-380 (1955). - SENGER, H., Uber die Wirkung von Glukose und Kohlensaure auf das Wachstum synchroner Chlorella-Kulturen. In: Beitrage zur Morphologie und Physiologie der Algen (Vortrage aus dem Gesamtgebiet der Botanik, Neue Folge Nr.l), 205-216. Stuttgart 1962. - SHERMAN, F., The effects of elevated temperatures on yeast. I. Nutrient requirements for growth at elevated temperatures. J. of Cellular and Comparat. Physiol. 04, 29-52 (1959.) - SIRONVAL, C., and KANDLER, 0., 1958. Photooxidation processes in normal green ChIarella cells. I. The bleaching process. Biochim. Biophys. Acta 29, 359-368. - SOROKIN, C., 1960. Injury and recovery of photosynthesis. The capacity of cells of different developmental stages to regenerate their photosynthetic activity. Physiol. Plant. 13, 20--35 (1960). - Ders., 1960. Kinetic studies of temperature effects on the cellular level. Biochim. Biophys. Acta 38,197-204. - Ders., and KRAUSS, R. W., 1962. Effects of temperature and illumination on ChIarella growth uncoupled from cell division. Plant PhysioI. 37, 37-42. - Ders., and MYERS, J., 1953. A high-temperature strain of ChIarella. Science 117,330-331. Dies., 1954. Characteristics of a high-temperature strain of ChIarella. Ann. Rep. of the Director of the Dept. of Plant. BioI Stanford, Calif. (Carnegie Inst. of Washington) 1953-1954, 177-179. - STALFELT, l\f. G., 1960. Vorleben, Aktivierung, Inaktivierung, "Ermiidung", Wundreiz. In Handb. d. Pflanzenphysiol. V, 2, 186-212. Berlin, Giittingen, Heidelberg (1960). - STEEMANN NIELSEN, E., 1955. Carbon dioxide as carbon source and narcotic in photosynthesis and growth of ChIarella pyrenoidosa. Physiol. Plant. 8, 317-335. -- TAMIYA, H., IWAMURA, T., SHIBATA, K., HASE, E., and NIREI, T., 1953. Correlation between photosynthesis and light-independent metabolism in the growth of ChIarella. Biochim. Biophys. Acta 12, 23-40. -Ders., SASA, T., AIREl, T., and ISHIBASHI, S., 1955. Effects of variation of day-length, day and night-temperatures, and intensity of daylight upon the growth of Chiarella. J. Gen. Appl. Microbiol. 1, 298-807. - Ders., MORIMURA, Y., and KUNIEDA, R., Mode of nuclear obliquus bei synchroner Kultur im Licht-Dunkel-WechseI. Planta a6, 555-574. -

592

HARALD LORENZEN, Temperatureinfltisse aufChlorella pyrenoidosa usw.

division in synchronous cultures of Chlorella: comparison of various methods of synchronization. Plant and Cell Physiol. 2, 383- 403 (1961). - THORMAR, II., 1959. Delayed division in Tetrahymena pyriformis induced by temperature changes. Compt. rend. des Trav. du Laboratoire Carlsberg 31,207- 225. - TRAINOR, F. R., 1961. The effect of temperature shift on mating in Chlamydomonas chlamydogama. Am. J. Bot. 48, 544. - W ARBURG, 0., 1919. Uber die Geschwindigkeit der photochemischen Kohlensaurezersetzung in lebenden Zellen. Biochem. Zschr. 100, 230- 262. - WOLKEN, J. J., 1961. Euylena. An experimental organism for biochemical and biophysical studies. Institute of l\Iicrobiology, Rutgers State University. 173 S. - ZEUTHEN, E., 1961. Synchronized growth in Tetrahymena cells. Int. Symp. Purdue Univ. 1960: "Growth in living systems" 135- 158. Anschrift des Verfassers: Dr. H. LORENZEN, 34 Giittingen, Untere Karspiile 2. Zur Zeit Dept. Biological Sciences, State University, Newark, Delaware. USA.

Verantwortl'ch Hir d'. r edal t'on: fref. Dr. K, M 0 the s, Falle/Saale;!tir denAnzcigen!eil: DEWAG-Werbung, FilialeLeipzig, Leipzig C I, Friedrieh-Ebcrt-StraOe 110, Ruf 7851; zur Zeit gilt Anzeigen-Preislis ' e Nr. 3. Verlag VEB Gustav Fischer Verl&g Jcna, Villengang 2. Ruf: 4141,4142. Satz und Druck: Druckerei "Magnus Poser" Jena, Printed in the German Democratic Republic. Lizenz-Nr. l067 Textkarte MdJ der DDR Nr. 1143 /63