Thermodynamische Betrachtungen über die reversible Reaktionssequenz Glutaminsaure ⇌ Prolin

Institut fur Allgemeine Botanik und Pflanzenphysiologie der Justus-Liebig-Universitat und Institut fur Pflanzenokologie der Justus-Liebig-Universitat, D-6300 Gieflen

Thermodynamische Betrachtungen liber die reversible Reaktionssequenz Glutaminsaure ~ ProHn Thermodynamic Considerations on the Reversible Interconversion of the Glutamic Acid ~ Proline Sequence E. P AHLICH, H.- J. JAGER':- und E. KASCHEL Mit 3 Abbildungen Eingegangen 12. August 1980 . Angenommen 2. September 1980

Summary The energy profile of the proline biosynthetic sequence has been calculated. This results in a AGo' -value of -55.4 kJ! mole for the overall reaction. The mass action ratios for the in vivo system have still to be determined. The equilibrium constant for the last step of the reaction sequence has been evaluated experimentally. For the Ll-pyrroline-5-carboxylate reductase reaction a value of 2.2 X 10-14 mole/l was found for the pH-independent constant. From the rate constants and the reversibility of this reaction it is assumed that the «proline dehydrogenase» in fact is a A-pyrroline-5-carboxylate reductase (E.C. 1.5.1.2.). From this it might be argued that proline oxidation proceeds via a different reaction than the synthesis. The results show that fundamental knowledge is still missing in order to understand the mechanism of proline accumulation under stress conditions. Key words: Phaseolus vulgaris, proline biosynthesis, energy profile, P-5-C reductase.

Einleitung Es ist seit tingerem bekannt, dag in dlirrebelasteten oder wassergestregten Pflanzen freies Prolin akkumuliert wird (BARNETT und NAYLOR, 1966; HSIAO, 1973; PALEG und ASPINALL, 1980). Dies gilt auch flir das Versuchsobjekt Phaseolus vulgaris (JAGER und MEYER, 1977). Als Ursache flir die Prolinanhaufungen werden diskutiert: 1. Hemmung des Prolinabbaues (BOGGESS et a!., 1975; STEWART et aI., 1977; HUBER und SCHMIDT, 1978), 2. Aktivierung der A-Pyrrolin-5-Carboxylat(P-5-C)Reduktase (HUBER, 1974; HUBER et a!., 1977), 3. Veranderung der Feedback-ReguAbbreviations: Pro, Prolin; Glu, Glutaminsaure; GluSA, Glutaminsauresemialdehyd; P-5C, A-Pyrrolin-5-Carhoxylat; AspP, Asparaginsaurephosphat; AspSA, Asparaginsauresemialdehyd; PDH, Prolindehydrogenase. ':. To whom offprint requests should be addressed. Z. Pflanzenphysiol. Bd. 101. S. 137-144. 1981.

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E. PAHLICH, H.-J. JAGER und E. KASCHEL

lation der Enzyme in der Prolinsynthesekette (BOGGESS et ai., 1976), 4. Hemmung der Proteinsynthese und Stimulierung der Proteinhydrolyse, was zur Erhohung des Prolinpools ftihren soll (SINGH et ai., 1973; HUBER, 1979; vgi. aber auch GUPTA und SHEORAN, 1979). Unter Verwendung markierter Metaboliten ist nachgewiesen worden, daB im in vivo-System Aktivitat aus Glutaminsaure in Prolin erscheint und umgekehrt (STEWART, 1972; BOGGESS et ai., 1976; STEWART und BOGGESS, 1978; IWAI et ai., 1979). Die Sequenz scheint also als anaboler und kataboler Vorgang zu funktionieren. Wie bereits von STRECKER (1957) ftir E. Coli nachgewiesen, kann Prolin tiber einen zusatzlichen sauerstoffabhangigen Weg abgebaut werden. Dieser membrangebundene oxydative Abbau ist inzwischen auch in weiteren Organism en gefunden worden (BALBONI und HECHT, 1977; BOGGESS et ai., 1978; SCARPULLA und SOFFER, 1978; HUANG und CAVALIERI, 1979), woraus sich grundsatzlich die Frage herleitet, ob Synthese und Abbau des Prolins eventuell auf verschiedenen Wegen erfolgen. Eine Losungsmoglichkeit dieser Frage eroffnet sich mit einer thermodynamischen Betrachtung dieser Sequenz. Denn nur die Ermittlung von AG-Werten gibt Auskunft dartiber, in welcher Richtung eine Sequenz ablauft. Eine solche Betrachtung eroffnet daneben noch die Moglichkeit, Gleichgewichts- von Ungleichgewichtsschritten zu unterscheiden und somit die Regelstellen dieses Reaktionsablaufes zu ermitteln. Damit laBt sich auch die Frage klaren, ob die Prolindehydrogenase (MAZELIS und FOWDEN, 1971; MAZELIS und CREVELING, 1974) ein regulatorisches Enzym ist und ob die Stimulierung der P-5-C-Reduktase (HUBER, 1974) ftir die Prolinakkumulation unter WasserstreB verantwortlich ist. Wir haben deshalb versucht, das Energieprofil der Sequenz Glutaminsaure - Glutaminsauresemialdehyd - Pyrrolin-5-Carboxylat Prolin zu ermitteln. Es existiert eine groBe Ftille an Literatur, die die Existenz und Regulation dieser Sequenz, sowie deren BeeinfluBbarkeit durch WasserstreB betrifft. Doch ist bemerkenswert, daB bisher ftir keinen dieser Schritte Gleichgewichtskonstanten bzw. AG-Werte vorliegen.

Material und Methoden Fiir die Untersuehung wurden etwa vier Woehen alte Pflanzen von Phaseolus vulgaris L. ev. St. Andreas verwendet (JAGER und MEYER, 1977). Die Extraktion, Anreicherung und Aktivitatsbestimmung der «PDH" erfolgte wie bereits friiher besehrieben (JAGER und MEYER, 1977). Fiir die Relaxationsmessungen wurden zunaehst Standardsatze mit angereichertem Enzym so lange inkubiert, bis das Gleichgewicht eingestellt war. Der pH-Sprung wurde durch Zugabe von 4 M Glycinlosung erreicht, einer Komponente des MeBpuffers. Ergebnisse und Diskussion

Energieprofil der Sequenz Glutaminsaure ::; Pro lin Energieprofile ftir Reaktionssequenzen physiologischer Systeme werden nach der Beziehung AG = AGO' + R X T X In K ermittelt. Aus dieser Gleichung geht hervor, daB fur die Berechnung AGo'-Werte und der Massenwirkungsquotient K bekannt sein Z. P/lanzenphysiol. Bd. 101. S. 137-144. 1981.

Energieprofi! der Sequenz G!utaminsaure

:;=':

Pra!in

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mussen. In der vorliegenden Arbeit haben wir versucht, LlGo'-Wertc flir die einzelnen Reaktionsansatze zu errechnen. Folgende Reaktionsansatze wurden berlicksichtigt. 1. Reaktion der Glutaminsauresemiald dehydrogenase Fur diese Reaktionen liegen keine experimentellen Daten in der Literatur vor. Eine vorlaufige Berechnung der Gleichgewichtslage dieser Reaktion ergibt sich aus folgender Dberlegung: G!u

+ NADH + H+ + ATP -+ G!uSA + NAD+ + ADP + Pi; LlGo'

=

-14,3 kJ/Ma!.

Der LlGo'-Wert ergibt sich in Analogie zu der Reaktion der Asparaginsauresemialdehyddehydrogenase (E.C. 1.2.1.11). AspP + NADPH + H+-+ AspSA + NADP+ + Pi; LlGo' = - 36,9 kJ/Mo! Asp + Pi • AspP + HP ; LlGo' = + 53,2 kJ IMo! ATP + H 20 -+ ADP + Pi ; LlGo' = -30,6 kJ/Mo! XAsp + ATP + NADPH + H+-+ AspSA + NADP+ + ADP; LtGo' = -14,3 kJ/Mo!.

Der LlGo'-Wert weist aus, dag unter Standardbedingungen das Gleichgewicht weit auf der Seite der Reaktionsprodukte liegt. Die unter thermodynamischen Gesichtspunkten groge Ahnlichkeit zwischen Glutaminsaure und Asparaginsaure rechtfertigt nach unserer Ansicht die Annahme, dag die Glutaminsaurealdehydbildung sehr ahnlich verlaufen muK 2. Cyclisierung des Glutaminsauresemialdehyds zu P-5-C Dieser Vorgang ist ein spontan ablaufender Prozeg, was auf einen negativen LlGo,Wert hinweist. In Analogie zur Cyclisierung von Aldosen ist ein Wert von AGo' = -12,6 kJ/Mol oder negativer anzunehmen. 3. Reaktion der P-5-C-Reduktase Dieser Wert wurde experimentell ermittelt (siehe unten). P-5-C

+ NADH + H+ ~ Pro + NAD+; jGo' =

-28,5 kJ/Ma!

Somit ergibt sich flir Standardbedingungen (pH = 7) folgendes Energieprofil der Reaktionssequenz (Abb. 1). Die Sequenz ist nach diesem Energieprofil (Abb. 1) stark exergon, der LlGo'-Wert betragt mindestens -55,4 kJ/Mo!' Die Massenwirkungsquotienten flir die einzelnen Reaktionsschritte unter in vivo-Bedingungen sind bisher nicht ermittelt worden. Folgende Oberlegungen scheinen gerechtfertigt. Wegen der in vivo zu erwartenden h5heren Konzentrationen von ADP, Pi und NAD+ (gegenuber denen von NADH2 und ATP) ist mit einem Massenwirkungsquozienten zu rechnen, der den LlGO'-Wert der ersten Reaktion eher zum positiven Bereich hin verschiebt, diese Energiestufe also verringert. Diese Stufe kann also in die Nahe eines Gleichgewichtsschrittes rlicken. Fur ahnliche Reaktionen aus der Glykolyse, namlich die Reaktion der Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase bei E. coli, liegt diese SiZ. Pjlanzenphysiol. Bd. 101. S. 137-144. 1981.

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E.

PARLICR,

H.-J.

JAGER

und E.

KASCREL

Glu ~-14,3

kJ (-3,4kcal)

GluSA

...

~

-12,6 kJ(-3kcal)

P~5-C

-28,S kJ (-6,8 kcall

Pro

Fig. 1: Energy profile of the biosynthetic sequence glutamic acid (Glu) -+ proline (Pro). GluSA = Glutamic acid semialdehyde, P-S-C = L/-Pyrroline-5-carboxylate.

tuation vor. Damit ist fraglich, ob dieser Reaktionsschritt als Kontrollpunkt der Sequenz dienen kann. Ob diese Reaktion im Sinne eines offen en Regelkreises kontrolliert werden kann, muB bisher offen bleiben. Da weder liber die zellinternen Konzentrationen von GluSA noch P-S-C Angaben vorliegen, kann dieser 2. Reaktionsschritt z. Z. schlecht diskutiert werden. Flir die Reaktion der P-S-C-Reduktase gilt Ahnliches wie fUr die Semialdehydreaktion. Die anzunehmenden hoheren Konzentrationen von Pro und NAD+ gegenliber von P-S-C und NADH + H+ solI ten eine Verringerung des Energiesprunges dieser Reaktion bewirken. Damit ist auch fraglich, ob dieser Reaktionsschritt eine KontrolIstelIe sein kann. Inwiefern eine Rlickreaktion nach dem Reaktionsschema der sog. Prolindehydrogenase (Pro + NAD+ -+ P-S-C + NADH + H+) moglich ist, muB bezweifelt werden. Dazu mliBte der Massenwirkungsquotient einen Wert von> 28,5 kJ/Mol annehmen, was schwer vorstellbar ist, zumal man berlicksichtigen muB, daB ein Teil des Prolins in der Vakuole deponiert ist. Damit wird fraglich, ob die Prolinoxidation liber eine Dehydrogenasereaktion erfolgt.

Gleichgewicht der P-5-C-Reduktase Die Analyse der Reaktion der «PDH» ist ein erster Schritt, das gcnannte Energieprofil durch experimentelle Daten zu belegen. Folgende Reaktion wurde bchandelt: Pro

kvor

+ NAD+ ~P-S-C + NADH + H+ k riick

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(1)

Energieprofil der Sequenz Glutaminsaure :;:=: Prolin

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kyor(k y) und kriilck(kr) sind die Geschwindigkeitskonstanten fiir die Vor- und Riickreaktion, Keq ist die pH-unabhangige Gleichgewichtskonstante, Kapp die pHabhangige. Wie in Abb. 2 gezeigt, wurde zunachst die Prolinoxidation mit einer angereicherten «PDH»-Praparation (JAGER und MEYER, 1977) vollzogen, und dann durch Saurezugabe das Gleichgewicht auf die Prolinseite verschoben. (Eine Volumenanderung des Ansatzes fand dabei praktisch nicht statt!) Obwohl die in der ersten Reaktionsphase gebildeten Mengen an P-5-C und NADH, verglichen mit dem im Ansatz enthaltenen Pro und NAD+, verschwindend gering sind, verlief die Reaktion nach den H+ -Zugaben sehr schnell ab, ein erster Hinweis, dag diese Reaktionsrich tung sehr gut katalysiert wird. Dies ist auch in Einklang mit Befunden von NOGUCHI et al. (1966) und RENA und SPLITTSTOSSER (1975) .

•w ~

pH.l0,3

1.0

pH=9,4

I

;i

PRO· NAn· p

0.5 PSC + NAOH + H+

PRO .HAO· I

120

I[min[

60

,-

10

Fig. 2: Determination of the equilibrium constant of the P-5-C reductase. A partially purified «PDH»-preparation was used to convert Pro + NAD+ into P-5-C + NADH + H+. When equilibrium was achieved the reaction was reversed by the addition of H+-ions.

Aus den Daten der Abb.2 errechnet sich eine pH-unabhangige Gleichgewichtskonstante Keq = 2,2 X 10- 14 Mol/I. Der apparente K-Wert (Mittelwerte aus 8 Bestimmungen) bei pH = 9,23 ist Kapp = 4,3 X 10-5 (LlGo, = + 28,5 kJ/Mol).

Geschwindigkeitskonstanten fur die Vor- und Ruckreaktion der P-5-C-Reduktase Die durch den pH-Sprung hervorgerufene Relaxation ermoglicht die Ermittlung der Relaxationszeit T (WONG, 1975; PECHT und RIEGLER, 1977), aus der wiederum die Geschwindigkeitskonstanten fiir die Vor- und Riickreaktion erfagbar sind. Es gilt: a)

1

r=

kyor

.,

+ kriick'"

und b) Kapp

=

kyor ~ ruck

=

P-5-C X NADH Pro X NAD+

kyor ':. Fiir diese Betrachtung ist also der einfachste Fall des Dberganges A - - > B angek riick nommen, ohne Beriicksichtigung der Katalysatorkonzentration und -cler Tatsache, daB zwei Substrate und zwei Produkte am ProzeB beteiligt sind. Eine detaillierte Analyse mit hochreinem Enzym ist in Arbeit. Z. P/lanzenphysiol. Bd. 101. S. 137-144. 1981.

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E.

PAHLlCH,

H.-J.

..:i.

JAGER

und E.

KASCHEL

-<\3

~

..5

Fig. 3. Determination of the relaxation time r from the data of Fig. 2. The corresponding kl function for the reversible interconversion A ~ B (NAD <= NADH) is In x/xo = k_1 - (kl + k_ l ) . t, where x = absorbancet - absorbance equilibrium' Xo = absorbance o - absorbanceeQuil. r = k

1

I

+k

-I

is determined from the slope of the graph.

Die Ermittlung des T-Wertes ist in Abb.3 dargestellt. Der Wert! ergibt sich aus T

der Steigung der Geraden und betragt 46,5 X 10-3 Min-I. Hieraus und aus dem reziproken Wert der Gleichgewichtskonstanten (die Reaktion verlauft ja in Richtung P-5-C -+ Pro) lassen sich leicht k yor und k riick ermitteln. Sie betragen k yor = 2,02 X 10-6 und k riick = 46,5 X 10- 3 • Sie belegen nochmals, daB die P-5-C-Reduktion mit wesentlich besserer Effizienz erfolgt als die Pro-Oxidation. Fur den Fall einer NettoProlinoxidation im Stoffwechsel durch die «PDH» muBte nach diesen Zahlen und kYor P-5-C X NADH . h d er Bezle ung - ..k P X NAD+ das Produkt aus CPro und rurk ro CNAD+ urn mehrere GroBenordnungen hoher liegen als das Produkt aus C P5 C und CNADH. Experimentelle Messungen werden zeigen mussen, ob dies unter in vivo-Bedingungen uberhaupt moglich ist. Zur Beantwortung dieser Frage spielt zudem die Kompartimentierung von Substraten und Produkten eine wesentliche Rolle. Soweit das Enzym betroffen ist konnten wir nachweisen, daB die «PDH» praktisch ausschlieBlich im Cytosol lokalisiert ist. Die vorliegenden Ergebnisse sprechen also dafur, daB die «PDH» eine P-5-C-Reduktase ist (E.C. 1.5.1.2. L-Prolin: NAD 5oxidoreduktase), die im Gegensatz zu den Neurospora und Leberenzymen aber deutlich auch die Ruckreaktion katalysiert. Damit wird auch klar, daB fruhere Resultate (JAGER und MEYER, 1977) nicht in das von HUBER aufgestellte Schema (HUBER und SCHMIDT, 1978; HUBER, 1979) passen. AuBerdem erklaren die obigen Daten die Unstimmigkeiten hinsichtlich der Korrelation von «PDH»-Aktivitat und Prolinkonzentration, indem einmal hohe Pro-

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Energieprofil der Sequenz Glutaminsaure :;::: Prolin

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linkonzentration mit erhohter «PDH»-Aktivitiit (EDER und HUBER, 1977), zum anderen hohe Prolinkonzentration mit verringerter Aktivitat (HUBER und SCHMIDT, 1978) korreliert. Die Bestimmung der Massenwirkungsquotienten ftir das Energieprofil Glutaminsaure - Prolin des in vivo-Systems wird exakte Auskunft tiber den Mechanismus der Prolinanhaufung unter Wasserstre6 liefern. Entsprechende Untersuchungen sind in Vorbereitung. Literatur BALBONI, E. and R. I. HECHT: Studies on the inner mitochondrial membrane localization of proline dehydrogenase. BBA 462,171-176 (1977). BARNETT, N. M. and A. W. NAYLOR: Amino acid and protein metabolism in Bermuda grass during water stress. Plant Physiol. 41, 1222-1230 (1966). BOGGESS, S. F., L. G. PALEG, and D. ASPINALL: ,11-Pyrroline-5-carboxylic acid dehydrogenase in barley, a proline accumulating species. Plant Physiol. 56, 259-262 (1975). BOGGESS, S. F., D. ASPINALL, and L. G. PALEG: Stress metabolism IX. The significance of end-product inhibition of proline biosynthesis and of compartmentation in relation to stress-induced proline accumulation. Aust. J. Plant Physiol. 3, 513-525 (1976). BOGGESS, S. F., C. R. STEWART, D. ASPINALL, and L. G. PALEG: Effect of water stress on proline synthesis from radioactive precursors. Plant Physiol. 58, 398-401 (1976). BOGGESS, S. F., D. E. KOEPPE, and C. R. STEWART: Oxidation of proline by plant mitochondria. Plant Physiol. 62, 22-25 (1978). EDER, A. und W. HUBER: Zur Wirkung von Abscisinsaure und Kinetin auf biochemische Veranderungen in Pennisetum typhoides unter StreBeinwirkungen. Z. Pflanzenphysiol. 84, 303-311 (1977). GUPTA, P. and I. S. SHEORAN: Effect of water stress on the enzymes of nitrate metabolism in two Brassica species. Phytochem. 18, 1881-1882 (1979). HSIAO, T. c.: Plant responses to water stress. Ann. Rev. Plant Physiol. 24, 519-570 (1973). HUANG, A. H. C. and A. J. CAVALIERI: Proline oxidase and water stressinduced proline accumulation in spinach leaves. Plant Physiol. 63, 531-535 (1979). HUBER, W.: Uber den EinfluB von NaCl- und Abscisinsaurebehandlung auf den Proteinmetabolismus und einige weitere Enzyme des Aminosaurestoffwechsels in Keimlingen von Pennisetum typhoides. Planta 121, 225-235 (1974). - Die Rolle von Abscisinsaure und Cytokininen in Pflanzen unter StreBeinwirkungen. Ber. Deutsch. Bot. Ges. 92, 193-207 (1979). HUBER, W., F. KREUTMEIER, and N. SANKHLA: Eco-physiological studies on indian arid zone plants VI. Effect of sodium chloride and abscisic acid on amino-acid and protein metabolism in leaves of Phaseolus aconitifolius. Z. Pflanzenphysiol. 81, 234-247 (1977). HUBER, W. und F. SCHMIDT: Zur Wirkung verschiedener Salze und von Polyathylenglykol auf den Prolin- und Aminosaurestoffwechsel von Pennisetum typhoides. Z. Pflanzenphysiol. 89, 251-258 (1978). IWAI, S., N. KAWASHIMA, and S. MATSUYAMA: Effect of water stress on proline catabolism in tobacco leaves. Phytochem. 18, 1155-1157 (1979). J.~GER, H.-J. and H. R. MEYER: Effect of water stress on growth and proline metabolism of Phaseolus vulgaris L. Oecologia 30, 83-96 (1977). MAZELIS, M. and L. FOWDEN: The metabolism of proline in higher plants. II. L-proline dehydrogenase from cotyledons of germinating peanut seedlings. J. Exp. Bot. 22, 137145 (1971).

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