Trennungsgang zur quantitativen bestimmung von keto- und aminosäuren in kleinen mengen des liquor cerebrospinalis

498

CLINICA

TRENNUNGSGANG KETO-

USD

ZUR

CHIMICi4

QUANTITATIVEN

AMINOSACREN LIQUOR

IN

BESTIMMUNG

KLEINES

MENGEN

VON DES

CEREBROSPINALIS ELSE

Medizivlisch-Chevnisclzes

ACTA

GRCXDIG

Imtitut

(Eingegangen

dev Unioersitiit

den ‘4.

Januar,

We&z

(kweich)

1962)

Bei Erkrankungen des Zentralnervensystems taucht haufig die Frage auf, inwieweit diese einen Einfluss auf die Konzentration einzelner Metaboliten, speziell im Liquor cerebrospinalis haben, der ja der am leichtesten zugangliche Teil des Zentralnervensystems ist. Ausserdem besteht die Miiglichkeit, etwaige regelmassig vorkommende Abweichungen von den als normal angesehenen Durchschnittswerten diagnostisch oder prognostisch auszuwerten. Die grijsste Schwierigkeit eines solchen Vorhabens liegt darin, dass es bei Serienuntersuchungen an Patienten mit cerebralen Storungen, speziell bei Kindern, in den seltensten Fallen mijglich ist, grossere Mengen Liquor zu gewinnen; man ist meistens gezwungen, mit 3-4 ml auszukommen. Deshalb wurde ein Analysengang entwickelt, der es erlaubt, Keto- und Aminosauren nebeneinander in kleinsten Mengen in Liquor, Serum oder Gewebe nachzuweisen. PRINZIP

DER

METHODE

Liquor bzw. Serum wird enteiweisst und auf pH 7.2 eingestellt. Mit dieser Liisung werden jeweils z mit Al,O, geftillte Mikrokolonnen beschickt. Ketosauren, Asparaginsaure und Glutaminsaure werden adsorbiert, die iibrigen Aminosauren laufen durch. Aus den Kolonnen wird die Glutaminsaure mit Hilfe von 0.5 N Essigsaure eluiert und quantitativ bestimmt, hierauf werden Asparagin- und Ketosauren mit I N NH, aus den RGhrchen ausgewaschen. Im Eluat eines Rijhrchens wird die Konzentration der Ketosauren gemessen, im Eluat des anderen die der Asparaginsaure. Zur Bestimmung der Aminosauren, die nicht durch Al,O, adsorbiert werden, verfahrt man wie folgt: Die LGsungen werden eingeengt, Glutamin und Asparagin durch einsttindiges Erhitzen auf 100’ im Wasserbad in 2 N HCl zu den entsprechenden Aminosauren hydrolysiert 1, mit Hilfe des Kationenaustauschers Dowex 50 x 4 entsalzt und die Aminosauren papierchromatographisch, eindimensional mit Phenol pH 12 bzw. Collidin-Lutidin-Puffer getrennt2. Die Auswertung der Chromatogramme erfolgt nach Farbung mit Ninhydrin mit Hilfe des Spinco Analytrol Model1 RB (Beckman) 3. Enteiweissung

und TYenutung ax Al ,O,-Kolonvteutl~ 4

Liquor oder Serum werden mit dem halben Volumen 15% TCE versetzt und das Eiweiss scharf abzentrifugiert. Hierauf werden 4 ml der enteiweissten Losung mit 5 N Natronlauge ohne Verwendung eines Indikators auf pH 7.2 eingestellt (Endpunktbestimmung durch Ttipfeln auf mit Bromthymolblau getranktem Filterpapier oder potentiometrisch) und auf 4.8 ml aufgeftillt. Je z ml dieser Losung werden Clin.

Ckim.

A&,

7 (IgG2)

498-505

QUANTITATIVE

BESTIMMUNG

VON KETO-

Liquor,

499

UND AMINOShUREN

Serum J neutralisieren

enteiweissen,

4 Al,O,-Kolonne

I I 4

Filtrat

Adsorbat 0.5 N E. S

i

4

Eluat

Adsorbat

I

i

I

NINH,

Bestimmung der GlutaminsHure

4 Eluat

hydrolysieren,

4 entsalzen i

I’apierchromatographie

i

4

Bestimmung der Ketosiuren

Papierelektrophorese Bestimmung der AsparaginsXure Fig.

I. Schematische

Darstellung

des Analysenganges

tiber eine mit I N HCl vorbehandelte A&O,-Kolonnel geschickt und mit z ml Wasser nachgewaschen. Das Filtrat wird in 1Messeprouvetten aufgefangen. In der Kolonne bleiben zurtick: Ketosauren, Cystin, Asparaginsaure, Glutaminsaure sowie ein nicht identifiziertes Peptid mit dem RF-Wert 0.46 (Phenol pH I), alle anderen Aminosauren rinnen durch5. Bestimmung

dev Glutawinsiwe

Die Bestimmung der Glutaminsaure erfolgt, wie schon frtiher beschrieben*, nach Elution der Al,O,-Rbhrchen mit 0.5 N Essigsaure tiber die nach Erhitzen mit Ninhydrin entstehende ,&Formylpropionsaure als z,4-Dinitrophenylhydrazon. Bestinwnung dev Aspavaginshwe Die nach Elution der Glutaminsaure im A&O,-Rdhrchen verbliebenen Substanzen werden mit 4 ml I N NH, eluiert. Zur Bestimmung der Asparaginsaure wird das Eluat zur Trockene verdampft. Es ist vorteilhaft, die Eprouvetten schrag iiber ein siedendes Wasserbad zu stellen und mit Hilfe einer Kapillare einen heftigen LuftStrom iiber die Liisung zu leiten. Nun wird mit wenig Wasser aufgenommen und die Asparaginsaure papierelektrophoretisch von den anderen mit Ninhydrin farbbaren Substanzen (Spuren Glutaminsaure, Peptid) abgetrennt3. Zur Verwendung gelangte eine Papierelektrophoreseapparatur Spinco Model1 R (Beckman). Die asparaginsaurehaltige Losung wird sorgfaltig in die Mitte eines passenden Filterpapierstreifens Schleicher und Schtill zoz3a aufgetragen und in Acetatpuffer PH 3.8 (z 1 0.2 N Naacetat + 700 ml 2 N Essigsaure) bei konstanter Spannung von 300 V 24-3 Std. der Elektrophorese unterworfen. Die Asparaginsaure wandert unter diesen Bedingungen am weitesten zur Anode. Das Papier wird im Trockenschrank bei 80” getrocknet, durch eine Ninhydrinlosung gezogen (IO mg Ninhydrin + 0.7 ml Eisessig ad IO ml wassergesattigtes pz-Butanol), 20 Min. im Luftstrom und 20 Min. im Trockenschrank Clin. Chim.

Acta,

7 (1962) 4g8-5o5

E. GRiiNDIG

500

bei 80” getrocknet2. Die Farbtiefe des Asparaginsaurefleckes wird sofort mit Hilfe eines Extinktionsschreibers (Spinco Analytrol RB, Cam B-z 500 rnp) quantitativ bestimmt. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe einer Eichkurve. Zur Kontrolle kann bei jeder Bestimmung ein Teststreifen mitgefarbt werden, auf dem eine bestimmte Menge Asparaginsaure aufgetragen worden ist.

80-

60-

40-

20-

I

I

1

2

4

6

Fig. 2. Eichkurve

I

I

I

8

10

12

zur Bestimmung

der Asparagins%ure.

Es ist vorteilhafter, die Farbtiefe der Ninhydrinfarbung direkt zu messen, als erst nach iiberftihren in den Kupfer- oder Cadmiumkomplex, da die Gefahr besteht, dass die Flecken etwas verlaufen kbnnten, was zu Fehlern in der Auswertung ftihren kann. Steht kein Extinktionsschreiber zur Verftigung, empfiehlt es sich, die Flecken auszuschneiden, das Papier in 4 ml methanolischer Cu(N0,) 2 Lijsung zu eluieren und die Extinktion der Losung mit einem beliebigen Photometer bei 503 rnp zu messens.

Bestimnamg

der Ketosiiuren

Die zweite A&O, Mikrosaule wird, wie oben beschrieben, mit 4 ml I N NH, eluiert, das Eluat in einer Messeprouvette aufgefangen und auf z ml eingeengt. Ein weiteres Eindampfen ist sorgfaltig zu vermeiden, da sonst Verluste an Ketosauren auftreten. Die Menge der Ketosauren kann nun tiber die 2,4_Dinitrophenylhydrazone ermittelt werden’. Mit Vorteil kann man such eine enzymatische Bestimmung durchftihren: Die Liisung wird mit I M K,HPO, auf PH 7.2 gebracht, auf 3 ml aufgeftillt und zur Bestimmung z ml in die Ktivette eines Photometers gefiillt (z.B. Photometer Elko III, o.5-cm Kiivette). Nach Zuftigen von 0.05 ml 3 . 10-3 M DPNH* in 1% Na-Bicarbonat wird die Extinktion bei 366 rnp gemessen. Nun setzt man 0.05 ml Laktatdehydrogenase * zu, das gemessene AE, entspricht der Brenztraubensaure. Nach Beendigungder Reaktion werden 0.05 mlGlutamatdehydrogenase * hinzugeftigt, ilE, ist ein Mass fur die Konzentration der Ketoglutarsaure. Schliesslich erhalt man AE, nach Zugabe von 0.05 ml Malatdehydrogenase”, woraus die Menge der vorhandenen Oxalessigsaure berechnet wird. Berechnung8: AE = 0.100 entspricht 5.6 ,ug Brenztraubensaure, 9.3 ,ug Ketoglutarsgure oder 8.4 ,~g Oxalessigsaure im Ktivetteninhalt von 2.1 ml (0.0303 pMo1 *

BOEHRINGER LJND S~HNE, GMBH,

Mannheim

(Deutschland). Clin. Chim. Acta, 7 (1962) 4g8-5o5

QUANTITATIVE

BESTIMMUNG

VON

KETO-

UND

AMINOSdUREN

501

DPNH/ml) bei r-cm Schichtdicke. Folgende Faktoren sind zu berticksichtigen: I ml Liquor ergibt nach dem Enteiweissen I#/IOO ml Fliissigkeit, I ml Blut 1x4/100. Da bei der Neutralisation vor dem Aufbringen der Substanz auf das A&O,-Rbhrchen im Verhaltnis 5 : 6 verdtinnt wurde, beim Neutralisieren auf pH 7.2 vor der enzymatischen Bestimmung im Verhaltnis z : 3, ferner z ml der Liisung in die 0.5cm Ktivette pipettiert wurden, ergibt sich als weiterer Verdiinnungsfaktor 615 x 312 x I/Z x 2 = IS/IO. Da bei der saulenchromatographischen Trennung ein konstanter Verlust an Ketosauren von 10% * 0.5% eintritt, erhalt man: mg% BTS Liquor= AEl mgO/’

BTSB~~~=

AE,

x x

-rqg/Ioo

134/1oo

x x

18/1o

IS/IO

100/90 x 5.6 = AE,

x x

loo/go

x

5.6

=

AE/

x x

16.7.

15.0.

Wegen der weiteren Verdiinnung, die durch Zugabe der Enzymlosungen ist AE, noch mit 2.15/2.10 und dE, mit 2.20/2.10 zu multiplizieren. “9% KGS Liquor= AE, mg’/’ KGSB~~~= AE, mg%

0~

Liquor=

mg% OESB~~~=

x

x

AE, AE,

x

14g/Ioo 134/1oo

x

x x

r4g/Ioo

1341100

IS/IO IS/IO

x x

x x

IS/IO

IS/IO

x x

Ioo/go 100/90

x x

100/90

loo/go

x x

9.3 x

9.3

x

8.4

8.4

x x

2.15/2.10

2.15/2.10

= =

2.20/2.10

2.20/2.20

= =

AE,

AE,

x x

AE,

AE,

entsteht,

28.4.

25.5. x 26.2.

x 23.6.

Vovbereitwag der Liisungen ZUYPa~ierchromatograPhie Das bei der Abtrennung der Ketosauren U.S.W. durch die A&O,-Kolonnen abgetropfte und mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat wird auf I ml eingeengt, mit 0.5 ml 6 N HCl versetzt und zur Hydrolyse des Asparagins und Glutamins eine Stunde im siedenden Wasserbad erhitzt. Die Losung wird auf pH 2 gebracht und mit Hilfe des Kationenaustauschers Dowex 50 x 4 (200-400 mesh) entsalzen9. Kleine Chromatographierijhrchen 8 x 0.6 cm werden mit Austauscherharz beschickt, das mit 0.01 M HCl im Gleichgewicht steht (PH 2). Die Liisung wird aufgebracht, mit z ml O,OI M HCI und hierauf mit 5 ml destilliertem Wasser nachgewaschen. Das Filtrat wird verworfen. Die Elution erfolgt mit 4 ml I N NH,, wobei die Aminosauren quantitativ erhalten werden. Das Eluat wird zur Trockene verdampft, mit wenig Wasser aufgenommen und im Falle der Liquoranalyse quantitativ auf die vorbereiteten Papierstreifen aufgebracht, bei Serumanalysen nur die Halfte. Papierchvomatographie Filterpapier (PH 12, pH

I, pH

der Aminosiuren

Whatman No. 6.2) getrankt2,

I wird mit den entsprechenden Pufferlosungen getrocknet und wie aus Fig. 3 ersichtlich zuge-

schnitten. Nach Auftragen der Substanzen auf der mit - - - - bezeichneten Linie wird absteigend eindimensional chromatographiert. Der lange Abstand von IO cm zwischen Losungsmittelwanne und Startpunkt der Substanz ist zur Erzielung eines einwandfreien Papierleerwertes bei der nachfolgenden photometrischen Auswertung der Streifen unerlasslich. Als Lijsungsmittel wahlt man zweckmassig2 Phenol PH 12 sowie Lutidin-Collidin-Wasser. Steht mehr Liquor zur Verfiigung, noch Phenol pH I (siehe Lit. 2) und tert.-Butanol-Methylathylketon-Wasserl”. Die einzelnen Streifen werden nach dem Trocknen vom oberen gemeinsamen Rand abgeschnitten, wie bei der Bestimmung der Asparaginsaure beschrieben gefarbt, und die Farbintensitat der einzelnen Flecken im “Analytrol” ausgemessen. Die erhaltenen Kurven werden nun wie folgt ausgewertet : Clin. Chim.

Acta,

7 (x962) 498.5oj

E. GRBNDIG

502

(I) Man bestimmt mit Hilfe einer Mikromethode, z.B. mit Hilfe eines KoppNatelson Mikrogasometers, wozu nur 0.5 ml Liquor oder Blut nijtig sind, den gesamten a-Aminosaurestickstoffll. Setzt man wie bei der Auswertung der Pherogramme zur Serumelektrophorese die Gesamtflache unter der Kurve gleich IOO~/~, geben die Flachen unter den einzelnen Zacken die Konzentration der einzelnen

.

i__ -_-_I_‘~I~ .

.

r

t

4

----

-3cm ,____ Fig. 3. Schnittmuster

Aminosauren

__-_

fiir das zur quantitativen

in relativ-Prozenten mg% AS =-

.L

l’apierchromatographie

an. Daraus

verwendete

Filterpapier.

kann man nach

Molekulargew. AS x mg% a-Amino-N

x rel.%

14 x IO0

die Menge der vorliegenden Aminosauren berechnen. Hierbei ist zu beachten, dass der molare Extinktionskoeffizient der einzelnen mit Ninhydrin umgesetzten Aminosauren bei 500 rnp nicht identisch ist12. Der Unterschied ist fur die meisten Aminosauren, mit Ausnahme von Prolin, Oxyprolin, Tryptophan sowie Glukosamin nicht grosser als IO%, sodass fur viele Fragestellungen eine Beurteilung des Aminosaurespektrums auf die geschilderte Art ausreichend erscheint. (2) Fur genauere Bestimmungen empfiehlt sich auf einem Streifen eine Testliisung, die der durchschnittlichen Zusammensetzung des Normalliquors bzw. Serums entspricht, aufzutragen. Folgende Mischungen haben sich bewahrt : Liquor: I mg Gly, 3 mg Ala, 2 mg Val, 2.5 mg Leu, 0.5 mg y-NH,-Bs, I mg Asp, 5 mg Glu, I mg Cys, I mg Met, 2 mg Ser, I mg Thr, 5 mg Arg, 2.5 mg His, 5 mg Lys, 1.5mg Phe, 1.5mg Tyr ad 5 ml Wasser. Serum: 1.8 mg Gly, 4 mg Ala, 2.8 mg Leu, I mg Asp, S mg Glu, 1.4mg Cys, 0.8 mg Met, 2 mg Ser, z mg Thr, 2.2 mg Arg, 1.4mg His, 3 mg Lys, 1.4mg Phe, 1.5mg Tyr ad IO ml Wasser. Es wird aufgetragen zur Bestimmung des Liquors 0.06 ml, entsprechend 1.2 ml Liquor, zur Bestimmung des Serums 0.05 ml entsprechend 0.5 ml Serum. Die Vergleichslosungen sind, mit etwas Thymol konserviert, im Eisschrank monatelang haltbar. Clin. Chim. Acta, 7 (1962)

498-50:

QUANTITATIVE

503

BESTIMMUNG VON KETO- UND AMINOS;iUREN ERGEBNIS UND DISKUSSION

Mit Hilfe der oben-angefiihrten Methode wurden zahlreiche Liquoruntersuchungen durchgeftihrt. Die erhaltenen Werte stimmen mit den in der Literatur angegebenen

(Tab&e

Uberein,

fiir einige

Substanzen

I). Beim oben besc~riebene~

konnten

keine

Tre~nungsgang TABELLE

(in

BESCHRIEBENEN

ANALYSENGAKGES

ms%f

-

______.

_p~~,$~g,L7>‘~-~7 Li&w 13,14,18--zv 6-7 0.4-x.1 0.1--0.5

Oxalessigsaure

0.18-0.38

Gluta~~~s~urc Asparaginsiure Glutamin

0.63-3.58

Asparagirr

werden

Wert auf die

SBBSTANZEN

Gefundene

IPLder Liteuatur angegebens Normalwerte

ix-Amino-Stickstoff BrenztraubensXure Ketoglutarssure

gefunden

I

NORMALWERTEIN BLUT UND 1,rQUOlZDER MIT HILFE DES BESTIMMTEN

Angaben

wurde besonderer

0.8-2.7

0.6-2.0 -

0.4-1.26 0.08

0.2-1.2

2.6-8.8 -..

2.0-7.0 -

-

Werte431

Pdasma

Liquor

4.1-5.0 0.5-0.7 0.12-0.18

0.4-0.7 0.03-0.29

0.12-0.18

0.08-0.11

0.8-2.5 0.4-1.8

0.8-2.4 0.2-0.5

9.0-13.0

‘j.5-10.2

I.I-1.5

0.2-0.4

Alanin Arginin Cystin

2.5-5.” 0.6-1.7 0.6-1.2

o.or-0.06 0.16-0.30 0.37-0.57 0.07-0.15

1.8-3.5 I.Z-2.2 0.5-0.8

0.04-0.06 0.24-0.60 0.34-0.69 o.og-0.23

Glycin Histidin Isoleucin Lysin

1.8-2.5 0.9-1.7 x.8-3.5 1.3-3.1

0.05-o.og 0.18-0.28 0.17-0.28 0.36-0.62

1.1-2.3 1.0-3.0 1.5-4.2

0.05-0.1~

Methionin P~enylalan~n Serin Taurin

0.1-0.6 0.8-1.2 1.44 I.0

0.05-0.09 o.11-0.19

Threonin Tyrosin Vaiin

1.3-2.0 0.8-1.4 7.9-2.9

0.24-0.3s

1.2-2.1

O.II-0.19

0.8-1.2

0.13~-0.21

I.Z-2.4

~-Am~nob~~tters~ure

+ Leucin

0.21

0.09-0.15

i

0.82-1.56

1.1-2.8

0.4 -0.7

o-4-0.9

0.14-0.49 0.15-0.34 -

o.g-2.

-

1.9-2.5

I

0.6-1.8

0.15-0.41 o.ra-0.36 0.1g-0.39

Bestimmung der Keto- und Aminosguren gelegt, von denen bekannt ist, dass sie mit dem Stoffwechsel der Glutaminsgure in engem Zusammenhang stehen, ngmlich Brenztraubensgiure, Oxalessigs&re, Ketoglutars&ne, Asp~ragins~ur~, Asparagin, Glutamin. Die Genauigkeit der Bestimmung der oben erwghnten Substanzen betr;igt mindestens 5%, die der iibrigen Substanzen IO%, ist also hinreichend, urn signiftkante Abweichungen von den als normal angesehenen Durchschnittswerten mit Sicherheit nachzuweisen. Die Dauer der Analysen ist relativ km-z. Folgende Zeiteinteilung ist zu empfehlen. I. Tag: Entnahme der Korperfltissigkeiten, Enteiweissung, Adsorption an der

Al,O,-Kolonne, El&ion mit 0.5 N Essigsgure. Z. Tag: Bestimmung der Glutaminsgiure, Elution mit I N NH,, Bestimmung der Ketosauren, eindampfen, hydrolysieren und entsalzen des Filtrates aus der Al,O,-Kolonne. 3. Tag: Bestimmung der AsparaCl-&. C&n. A&,

7 (rg6zj 498-505

E.

504

GRCNDIG

ginsaure, Vorbereitung der Papierchromatographie der Aminosauren (Laufzeit etwn 16 St., tiber Nacht). 4. Tag: Trocknen und Auswerten der Papierchromatogramme. Da in der Literatur ausfiihrliche Angaben iiber die RF-Werte der Amino&u-en in den angewandten Liisungsmitteln fehlen, seien diese anschliessend noch mitgeteilt. (Tabelle II). TABELLE

II

RF-WERTE DER AMINOSAURENIN DEN ANGEWANDTEXSTEIG~ITTELJ Phenol $H IZ= PhenolP@Vgesdttigt + IO% Phenol

Phenol pH I= PhenolPU@?Vgesiittigt + IO% Phenol

Glycin Alanin Valin Leucin Isoleucin

0.18 0.45 0.69 0.78 0.79

0.30 0.33

0.14 0.36

0.71

0.24

0.82

0.60

Phenylalanin Asparaginsaure Asparagin Glutaminsaure Glutamin

0.79 0.09 0.31

Avninosiiuren

Methyliithyl-ketontevt.-ButanolWusser (z : 2 : .)I0

0.76

0.40

0.94 0.18 0.33

0.40 0.01 0.06

COllidiW-

Puffer

: I : I)2

(I

pH 6.2 0.11 O.Ij

0.29 0.46 0.36

0.18

0.30

0.03

0.36 0.07 0.07 0.10

0.50

0.52

0.16

0.21

Serin Threonin Cystin Methionin Taurin

0.21

0.25

0.22

0.43 0.07 0.73 0.28

0.39 0.19 0.80 0.25

0.13 0.01 0.38 0.42

Tyrosin Tryptophan Arginin Lysin Histidin

0.64 0.95 0.54 0.51 o-75

0.64 0.80 0.49 0.31 0.42

0.32

Prolin Oxyprolin y-Aminobuttersaiure B-OH-y-Aminobutters~iure Glukosamin

0.84 0.62 0.69 0.36 0.42

0.83 0.55 0.62 0.38 0. I4

Puffer pn 12 Puffer pn I Puffer pn 6.2

Lutidin-

0.15 0.18 0.04 0.38 0.30 0.47 0.47

0.21

0.08 0.06 0.09

0 0

0.15 0.20 0.14 0.11 0.08 0.22

0.24 0.19 0.15

0.08 0.35

: 50 ml 0.067 M Na,HPG,, 50 ml 0.067 M NaOH. : 50 ml 0.2 M KCl, 97 ml 0.2 M HCl. : 80 ml 0.067 M KH,PO,, 20 ml 0.067 M Na,HPO,,

200 ml Wasser

ZUSAMMENF_4SSUNG

Es wird ein Analysengang beschrieben, der es erlaubt, pug-Mengen Keto- und Aminosauren nebeneinander zu bestimmen; er ist besonders geeignet fiir Liquoruntersuchungen, da 3-4 ml Liquor zur Analyse auslangen. SUMMARY SEPARATION

AND

MICRO-DETERMINATION IN

CEREBROSPINAL

OF

KETO-

AND

AMINO

ACIDS

FLUID

A method is described which permits to analyse lug amounts of different ketoand amino acids simultaneously. This method is especially suitable for the analysis of cerebrospinal fluid from which only 3-4 ml are used. Clin. Chins.

A&Z,

7 (1962)

498-505

QUANTITATIVE

BESTIMMUNG

VON KETO-

UND AMINOSdUREN

505

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