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Vergleich einiger methoden zur bestimmung des gesamteiweisses im liquor und anderen stark verdünnten lösungen
voL. 3 (1958)
CLINICA CHIMICAACTA
VERGLEICH DES UND
EINIGER
METHODEN
GESAMTEIWEISSES
ANDEREN
STARK
H. P. Forschungslaboratorium und der Newologischen
455
ZUR
BESTIMMUNG
IM LIQUOR
VERDUNNTEN
I&SUNGEN
RIEDER
der Psychiatrischen
U&ersitiits-Klinik
UnLsersitiits-Poliklinik*,
Base1 (Schweiz)
Die Bedeutung des Eiweissgehaltes im Liquor cerebrospinalis ist fur die Diagnostik vieler Erkrankungen, wie such fur die Verfolgung des Krankheitsverlaufes unbestritten. Im Laufe der Jahre wurde jedoch immer wieder Kritik geiibt an den bisher tiblichen Routinebestimmungen. So weisen NAGELI und ROEDER~ schon 1939 und 1942 darauf hin, dass die volumetrische Eiweissbestimmung nach KAFKA keinen Anspruch erheben kann, ein im chemischen Sinne quantitativ genau arbeitendes Verfahren zu sein. In neueren Arbeiten 3--8,27wurden die Zweifel, die an dieser am weitesten verbreiteten Methode angemeldet wurden, durch vergleichende Untersuchungen mit modernen chemischen, colorimetrischen oder spektrophotometrischen Methoden vollauf bestatigt. Der Wunsch nach exakteren und feiner differenzierenden Methoden ist deshalb verstlndlich. Unter diesen nimmt, seit ihrer raschen Verbreitung in den letzten Jahren, die Spektrophotometrie an Bedeutung standig zu. Nachdem schon verschiedene Versuche unternommen wurden, Uro- und Plasmaproteine”, Proteine aus verschiedenen andern KGrpersaftenlO, Antikijrperproteine”, Faserproteine12 u.a.m. durch ihre Spektren im UV-Licht zu charakterisieren und quantitativ zu bestimmen, lag es nahe, diese Methodik such zur Liquoreiweissbestimmung heranzuziehen. Dabei ergaben sich allerdings, wie z.B. DEN HARTOG-JAGER et aZ.5, STEGER~ und BAUER~~ berichten, einige Schwierigkeiten, die hauptsachlich mit der im Gegensatz zum Serum niedrigen Eiweisskonzentration des Liquors und dem im Vergleich dazu hohen Gehalt storender Begleitsubstanzen zusammenhangen. Die Anforderungen, welche an neue Methoden zur Liquoreiweissbestimmung zu stellen sind, konnen, soweit klinische Serienuntersuchungen in Frage stehen, wie folgt umrissen werden : I.
moglichst grosse Exaktheit und Differenzierbarkeit, 2. mijglichst kleine benotigte Liquormenge, 3. mijglichst geringer Arbeitsaufwand, 4. keine chemischen Veranderungen, die ihrerseits schlecht kontrollierbare Variablen in die Bestimmung hineinbringen, 5. wenn tiberhaupt chemische Umsetzungen ndtig, dann mijglichst eiweiss-spezifische, so dass der Fehler durch Nicht-Eiweissbestandteile praktisch vernachlassigt werden kann. * Leiter: Prof. F. Georgi. Literatur S. 4691470
450
H. I’. RTI-I)lilZ
\.OI.. 3 (I’).+)
au& in der ~~Iocli~kation van Xm~rti~ &,dit> BeObwohl die Kjeldahl-~~cttrodc, dingungen z und 3 nicht erfiillt, gilt sic doch nllgemein als bishcr zuverl%ssigstc I&,stimmung und wird nach wit, vor zur Eichung und zum Vergleich mit ncucn Methoden verwrndet, jedoch kaum zur Iioutinebestimmung in der Klinik. Bcsondercs Intcressc vcrdient hingegen die Eiweissbestimmung im l_JV-Licht, wit sic van STE(;RR” IX,schrieben wurde, da hirr die Punkte 4 und j zum vorncherein wcgfallen. Es wird ja nach der Vorschrift von STECXI: lediglich I ml Liquor mit rincm ~~li(l~~ot~~~ Tcil o. ri1 HCI vermischt (bei den iiblichen 3.5 ml fasscnden IO mmCi.ivctten entsprechend mchr) und unmittelbar anschliesscnd der Extinktionswert bei 27~) mp direkt abgelescn, wobei u prim+ einzig noch die relativ grosse Liquormenge van I 2 ml bcanstandet werden kijnnte. In einer spatern Modifikation (IIoFMxNN~) ist die vcrwcndctc HC‘II~onzcn~ration auf o.gN 1ler~L~lfgesetzt worden. Die Zugabe von H(‘1 hat den Zweck, die im Nativliquor mrist ii&r langc &it ~InI~est~~ndig~~Estinktion im (;tbiet vott 280 rnp sofort auf einen bcstimmten Endwert zu fisieren. Als uns vor cu. Iahresfrist die STEGERsche Arbeit zu Gesicht kam, war in unserm mit ahnlicher Methodik im Forschungslaboratorium eine analoge Untersuchung Gange, welche die Befunde des genannten Autors im Prinzip bestatigte. Urn die uner~~~nschte Extinktiolls~~er~nde~ng von ~ativli[luor allszuschliessen und die Mcssung von kleineren pH-Verschiel>~lngen unabhangig zu machen, verwendeten wir, vorerst den Angaben von GITI.,IN~’ folgend, Essigsaure als “Stabilisator”. Spater gingen wir jedoch wegen deren grosserer optischer Leere im Gebiet zwischen zoo-300 rnp auf HCl tiber, da es uns darauf ankam, such die mit dem Zeiss-Spektrophotometer PM Q II gut erfassbaren I5 Wcrtc unter 240 rnp mitzuiiberpriifen. Die Besonderheit unserer Metbodik bestand ledigtich da&, class wir-urn unsere 3.5 mi fassende Kiivetten zu fiillen und doch nicht mehr als I ml Liquor zu l)rauchen~~~~iclveils2 ml einer o.Tu/,igen SaCl-Liisung (Chloridkonzentration im Nativliqubr) mit I ml IA’+ GCI -3 I ml Liquor versetzten. Dies err&t beziiglich HCl-Konzentration die gleichen VerhXltnisse wie bei HO’FMANNund STEGER, be&glich X&iss-Konzentration die gena;e HPlfte. Da jedoch die Verdiinnung mit NaCl-J,&ung im iibrigen keine weiteren Folgen hat, als die nach STEGERsCher Methodik gemessene FZxtinktion auf extakt die HIlfte zu reduzieren und da wir such unter diesen ~edinglIngen no& immer in eincm optimalen Messbereich arbeiten jmeist zwischen E = 0.1 -+x4), kann unsere Methodik als praktisch mit der STacERschen i&eilfisch hetrachtet werden. \Vegen des &was unterschiecllichen Ansatzes bezcichnen wir sie deshalb im folgenden als “modifizicrte STEGER-Methods".
Im Laufc unserer Untersuchungen gelang es uns, einige Befunde zu erheben, die &was mehr Licht werfen sowohl auf die Inkonstanz des ~at~vliq~lors als such auf die Genauigkeit und Brauchbarkeit der %RGER-&thode im Vergleich ZLI verschiedenen anderen Methoden. I. DIE INKONSTANZ DES NATIV-LIQUORS IM UV-LIGHT
Die gri5sste Schwierigkeit bei der direkten spektrophotometrischen Messung im UV-Licht besteht darin, dass der frisch entnommene Nativliquor im Bereich des Eiweissmaximums urn 280 m,u eine kontinuierliche Verminderung des Extinktionswertes und zudem kein Maximum zeigt, so dass eine definierte Messung unmoglich ist. An dieser Tatsache scheiterte bereits die Untersuchung von DEN HARTOG-JAGEK et aLs, w$ihrend es, wie gesagt, STEGER und uns gelang, diese Klippe durch Ansauerung des Liquors zu umgehen. Wir selbst begniigten uns jedoch nicht mit dieser Feststel-
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BESTIMMUNGDES GESAMTEIWEISSESIM LIQUOR
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lung; vielmehr versuchten wir herauszufinden, welcher Mechanismus resp. welche Faktoren dieser Stabilisierung des Eiweissmaximums zugrundeliegen. Reine Eiweisslosungen zeigen ja im liquor-neutralen Bereich (pH 7.3-7.5) eine vollkommene Konstanz des maximums bei 280 rnp. Bei Nativliquor hingegen findet sich im allgemeinen ein ausgesprochenes Maximum bei 265 m,u. Es lag darum nahe, die Ursache der Inkonstanz bei Nicht-Ei~eissk&pem, die als Begleitsubstanzen in Liquor auftreten, zu suchen. Hierbei kommen naturgemass gewisse Vitamine sowie die freien aromat&hen Aminosauren mit ihren z.T. recht hohen Extinktionswerten in erster Linie in Betracht. Serum- und Liquorproteine wie such die freien aromatischen Aminos&rren zeigen zwar je nach pH der Test&sung Maxima zwischen 290-278 m,u, jedoch nie ein solches bei 265 rnp. Die Versuche von SCHAUENSTEINl* iiber die Veranderlichkeit des Absorptionsspektrums von Ascorbinsaure, die Versuche von SPIEGEL-ADOLF et al. l7 iiber mogliche Einfltisse von Vitamin C, Proteinen und Purinkorpern, sowie die Versuche von DEN HARTOG-JAGER et al. 5 iiber veranderte Absorptionsspektren nach Vorbehandlung der Patienten mit verschiedenen Vitaminen sprechen sehr dafiir, dass es vor allem die Ascorbins%_rre und vielleicht such das Aneurin sein werden, denen die Verantwortung fur den unerwtinschten Effekt zukommt. Wir haben darum die verschiedenen Begleitsubstanzen des Liquors einer nahern spektrophotometrischen Priifung unterzogen.
Die Extinktionswerte einiger Vitamine, unter den Bedingungen, wie sie im frisch entnommenen Liquor einerseits herrschen, und nach Zugabe von HCl gem&s der Methode von STEGER anderseits geprtift, sind in den Figuren ra bis xe dargestellt. Aneur&~ (B,); 0.5 + IO-* M = 1.69 mg% : zeigt hei pH 7.3 zwei Absorptionsmaxima, ein kleineres bei 26: rnp und ein grosseres bei 234 rnp; bei pH I und darunter (o.zN HCl) vereinigen sich die beiden Maxima in ein einziges, wesentlich hoheres bei 246 rnp. Die Lijsungen in Phosphatpuffer und HCl sind konstant ; nach rqstiindigem Stehen werden noch praktisch dieselben Kurvenwerte gemessen. LaclofEavin (B,) ; 0.95 . ro-6 M = 0.36 mg”/o :* zeigt sowohl bei pH 7.3 wie such in o.zN HCl zwei ausgeprLgte Maxima, das eine bei 267 m,u, das andere &was niedrigere bei 223 rnp; beide Maxima verBndern weder durch die pH-Verschiebung, noch durch rjstiindiges Stehen ihre Lage und absolute Hohe urn merkliche Betr&ge. Adermin (Ppridoxin, B,); 0.5 f 10-4 M = 0.85 mg%: zeigt bei pH 7.3 drei Absorptionsmaxima, ein erstes bei 325 rnp, ein zweites bei 255 m/A und ein drittes, sehr hohes bei 220 m,u. In 0.2N HCl findet sich nur noch ein ausgeprLgtes Maximum bei zgo mp; die beiden andern sind weitgehend “ausgeebnct” resp. in den nicht mehr erfassbaren Rereich unter zoo rn,u verschoben.
Nicotinanzid; 0.5. IO-~ M = 0.61 mg0/b: zeigt bei pH 7.3 sowohl wie in o.zN WC1 ein Absorptionsmaximum bei 261/262 rnp und ein zweites hiiheres bei zrz--214 my, also praktisch keine Verschiebung der Lage, jedoch eine bedeutende, geger&uhge Verschiebung der absoluten Werthohe, wenn das pH vom neutralen Pbosphatpuffer nach der stark sauren Seite hin verschoben wird. .4scorbinsii7tr~ (C) : 0.5 . IO-~ M = 0.88 rng”,h : zeigt ein scharfes Maximum in neutralem Dereich bei 264/265 rnp, in o.zN HCl bei 243 m/h. WPhrend jedoch such nach rqstiindigem Stehen in HCI die Kurvenwerte konstant bleiben, stellt man im neutralen Milieu eine vollst%ndige Zerstiirung der Ascorbinslure und damit ein Absinken des hfaximums auf praktisch Null fest. En Modellversuch mit reiner Ascorbinsaure in gepufferter Losung van pH 6.8 hat ergeben, dass nach einer Zeitspanne van nur ungef&hr 20 min das Absorptionsmaximum bei 264 rnp in einer schwach verflachenden Kurve bereits auf etwa die HIlfte des Ausgangswertes abgesunken ist. * Ungefahre Ldslichkeitsgrenze gerechnet auf 0.2 . IO-* M. Litevatur
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in H,O dest.
; zur bessern graphischen Vergleichbarkeit
um-
E
0.8
0.7 0.6. 0.5
OA
0.3 0.2
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Vergleicht man die Wahrscheinlichkeit, mit welcher die hier im Einzelnen geprtiften Vitamine an der Inkonstanz des Nativliquors resp. an der Kurvenverschiebung bei Ansauerung beteiligt sein konnten, so mtissen vorerst einmal Lactoflavin und Adermin aus unsrer Betrachtung wegfallen. iiber deren quantitatives Vorkommen unter normalen und pathologischen Bedingungen sind uns bisher keine Angaben bekannt, so dass wir nicht in der Lage sind, die Grosse ihres moglichen Einflusses abzuschatzen. Lactoflavin win-de zwar, wie die Fig. rb beweist, als Komponente, die den Kurvenverlauf des Liquors verandern konnte, ohnehin wegfallen, da es unter allen gepriiften Bedingungen die gleiche Absorptionskurve zeigt. Uber Aneurin gehen die Literaturangaben auseinander; mit chemischen Methoden werden zwischen 1-2 y% Gesamt-Aneurin (inkl. Cocarboxylase), mit biologischen Methoden hingegen
TABELLEI ASCORBINSkURE-ZERSTGRUNG
Min E 264
I
0.697
BE1
NEUTRALEM
3
5
7
0.640
0.597
0.55'
pH IO
0.492
19 0.342
bis 18 y% nachgewiesen 18.Setzt man such die hiichste Konzentration von 18 y% ein, SOist doch die Menge noch immer so klein, dass die Extinktion kaum messbar ist und damit nicht ins Gewicht fallen kann. Eine ganz andere Situation ergibt sich nattirlich, wenn der Patient, wie in den Versuchen von DEN HARTOG- JAGER et al. 5, durch mehrfache Verabreichung hoher Vitamindosen mit Aneurin quasi “gesattigt” wird; dies entspricht zwar nicht mehr den nattirlichen Bedingungen, ist jedoch im Falle therapeutischer Verabreichung von B-Vitaminen im Zeitpunkt vor der Liquorentnahme in Rechnung zu stellen. Fiir Nicotinamid im Normalliquor werden Mittelwerte von 18 j$o'" und 26 y% 19, im Durchschnitt also etwa 22 y% angegeben. Auch diese Quantitat kann nur unbedeutende Veranderungen des Liquorspektrums zur Folge haben. So verbleibt schliesslich nur noch die Ascorbinsiiure als “Hauptstorefried” ; ihr Vorkommen schwankt zwischen 0.9-1.7 mg%, d.h. in der Jugend finden sich eher die hoheren, im Alter eher die tieferen Werte (wahrscheinlich in Abhangigkeit von der Ernahrung). Eine durchschnittliche Menge von 1.5 mg% gibt an der Reinsubstanz gemessen eine Extinktion von 1.360 bei 264 m,u im neutralen Milieu und eine solche von 0.710 bei 243 m,u im sauren Milieu. Es sind dies Betrage, die durchaus geniigen, urn das Verschwinden des Maximums von 265 mp im frischen Nativliquor sowohl bei Ansauerung als such beim Stehenlassen zu erklaren. Wie man aus Tabelle I ersieht, geht die Zerstijrung der Ascorbinsaure bei neutralem pH sehr rasch von statten, dtirfte allerdings im starker gepufferten und weitere reduzierende Substanzen (Glutathion etc.) enthaltenden Liquor-w0 eine analoge Verminderung erst nach Halbstunden oder Stunden gemessen wird-langsamer vor sich gehen. Sie scheint somit weitgehend verantwortlich zu sein fur die allgemein festgestellte Inkonstanz der Liquorwerte im Bereich zwischen 250-300 m,u, ganz besonders dann, wenn der Patient im Zeitpunkt der Liquorentnahme unter therapeutischer oder prophylaktischer Verabreichung von Vitamin C gestanden hat. Citeraw s. 4691470
Unter den iibrigcn, nicht eiweissartigen Licluorbcstandteilc~l fallen dmch hdhere I~onzentration die in Tabellc II aufgef~hrten Stoffe auf (die llngef~hre~l Durch-
schnittswerte, die nach FLASCHENTR~ER et al. lx, HOPPE-SEYLER VSL) THIEKFELI)EK~~ und RAUEN~~ im Normalliquor zu erwarten sind, stehen jeweils dahinter). Bei allen bier aufgezahlten Substanzen handelt es sich aher urn Stoffe, deren optische Eigenschaften bedeutend
im fraglichcn
Spektralgebiet
sind, so dass ihr stiirender
Falfe abweichender
bei der vorgegebenen Einfluss
~~engen~rerh~ltnisse,
Konzentration
recht un-
auf die Eiweissbestinlmung,
such im
nur sehr gering sein kann.
0.;
Anders verhalt es sich mit einer Reihc weitcrer Stoffe, die zwar nur in Konzentrationcn unter r m&y; vorkommen, die aber z.T. betr~chtliche Absorptionen aufweisen. Wir denken hier zuerst an die freien Aminosauren (vgl. Tabelle III), von denen die drei aromatischen-Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan-, welche such fur die Extinktion der Eiweissliisungen grijsstenteils verantwortlich sind, natiirlich stark ins Gewicht fallen. Im Gegensatz zum Serum, wo neben der sehr grossen Eiweissmenge die tibrigen Bestandteile bei der spektrophotometrischen Bestimmung fast vijllig Lilcmtwr S. +5q/go
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vernachlassigt werden kijnnen, sind z.B. die freien Amino&men im Liquor, imvergleich zum jeweiligen Gehalt an Eiweiss, in etwa 10-20 ma1 hijherer Konzentrierung vorhanden. Von den restlichen, meist nur in Spuren vorhandenen Begleitstoffen, wie Cholesterin (0.1 mg%), Zitronensaure (0.04 mg%), Bernsteinsaure (0.35 mg%) und Harnsaure (0.8 mg%) kann nur letztere wegen ihrer zugleich grossen Absorption und relativ grossen Konzentration noch als stiirend in Frage kommen. Die Fig. z gibt die Verhaltnisse wieder, wie sie unter den Bedingungen des Nativliquors und nach Ansauerung gemessen wurden. Die beiden recht hohen Maxima bei 291 rnp und 235 rnp werden durch Ansauern nur urn weniges verkleinert und etwas nach den kleinern Wellenlangen hin (285 und 321 rnp) verschoben, im tibrigen bleiben die Werte tiber mehrere Stunden (soweit geprtift) unverandert. Mit der Inkonstanz des Nativliquors hat die Harnsaure infolgedessen nichts zu tun; hingegen macht schon die Absorptions-
Fig. 2. Extinktion
van Harnstoff
in der mittleren, im Liquor Konzentration van 22 mgy’.
cerebrospinalis
vorkommenden
hijhe der normalerweise im Liquor vorkommenden Harnsaure einen so grossen Betrag aus, dass ein betrachtlicher Anteil des vermeintlichen “Eiweisswertes” (nach STEGER bei 279 m,u gemessen) zu ihren Lasten gehen muss. Urn einen Eindruck von der G&se der Gesamt-Extinktion zu erhalten, welche allein durch die Nicht-Eiweiss-Stooe des Liquors im ultravioletten Messbereich bedingt ist, haben wir alle in diesem Abschnitt b erwahnten Substanzen (mit Ausnahme des wasserunliislichen Lecithins und Cholesterins) in den angeftihrten Konzentrationen* im neutralen und sauren Milieu gemessen. Das Ergebnis ist dargestellt in Fig. 3a. Dasselbe Gemisch unter Zusatz der im Abschnitt a diskutierten Vitamine, in der Grossenordnung ihres Vorkommens im Liquor, ist in Fig. 3b wiedergegeben. Man achte dabei auf die deutliche Kuppe bei 265-267 rnp, welche nach Ansauerung vollkommen verschwindet und an welcher nach all unsern bisherigen Vergleichen zur Hauptsache die Ascorbinsaure beteiligt ist ; beim Gemisch ohne Ascorbinsaure (Fig. 3a) fehlt eine entsprechende Kuppe an dieser Stelle. Angaben, ob im Normalliquor Abbauprodukte aus dem Nucleinsaurestoffwechsel zu erwarten sind, waren uns keine zuganglich; es ist aber zu bedenken, dass unter gewissen pathologischen Bedingungen I7 such Purin- und Pyrimidinkorper die Extinktionswerte verfalschen kiinnen. * Fiir Tryptophan wurde der Wert van 0.1 rngyb eingesetzt. (Pathologischerweise Konzentrationen bis iiber 1 mg% vorkommenlO). Litcratur
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sol1 es in
‘l‘hcoretisch solltca man die :~bsorI)tionskurv~~ zincs durcl~scl~~~ittlicl~ normalcn 12iquors reproduziercn kiinncn, indem man cinfach die lZctr@ dcr an Einzclstoffcn oder an Stoffgemischcn gemesscncn Extinl
\ 20
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1.0
\\ \
\\
\
zoo
250
300
v
Fig. 3:~. Estinktion dcr im Liquor cerebrospinalis uorkommen Substanzen ohne Vitamine und ohne Ewe&e.
300
I:ig. 31). LXesclben Substanzen plus ne. -~ ~-~-in 1/3oM I’hosphatpuffer - - in o.rN HCI.
mp
VitamipH 7.3,
cinc Versnderung dcr individuellen Extinktionsbeitrgge zur Folge haben. Solche Umsetzungen sind jedoch nicht zu erwarten, da ja bei der chemischen Analyse des Gcsamtliquors alle Stoffe noch als solche wiederzufinden sind. Damit darf aber such die Voraussetzung zur Summation der Einzel- und Gruppenextinktionen, die wir in den bisherigen Untersuchungen erhalten haben, als gegeben betrachtet werden. Werden nun dem kiinstlichen Gemisch, dessen additiv gewonnene Gesamtextink-
I;&. 4. listinktion der in IGg. 3b aufgefiihrten Substanzen plus Iiiweiss in 1/3oM I’hosphatpnffer pH 7.3, - - - - in o.z,X’ HCI.
tion in Fig. 31) wiedergcgeben ist, zusgtzlich noch die zg rng% Eiweiss des Normallicluors (Alb./Glob. = j7/43ui;, ; vgl. spgter) beigeftigt, so haben wir alle Substanzen vereinigt, deren Vorkommen im Liquor cerebrospinalis gesichert ist. Wir gelangen so zu den Kurven der Fig. 4 und stellen fest, dass wir tat%chlich das Bild eines nativen I~itcratuv
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4’53
Liquors vor uns haben. Damit haben wir aber zugleich such einen tiefern Einblick in die Verhgltnisse gewonnen, welche bei der spektrophotometrischen Messung von Liquores im ultravioletten Bereich zu gewgrtigen sind. Greifen wir im speziellen nochmals die Bedingungen heraus, wie sie bei Anwendung der STEGERschen Methodik vorherrschen, und vergleichen wir die Kurven eines willkiirlich herausgegriffenen, nativen Liquors und seines durch Druckfiltration enteiweissten Filtrates mit den je identischen Portionen unseres “kiinstlichen Liquors” (Fig. ga und 5b), so stellen wir eine auffallende .&hnlichkeit in den Proportionen der
Fig. ga.
Fig. gb.
Fig. ga und gb. Vergleich eines kiinstlich zusammengesetzten Liquors mit einem nativen Liquor van ungefghr mittlerem normalen Eiweissgehalt (26 mg%). Fig. ga. Kiinstlich zusammengesetzter Liquor. Fig. gb. Nativer Liquor. ~ Gesamtextinktion in saurem Milieu (o.zN HCl), -- - derselbe Liquor nach Entfernung des Eiweiss mittels Druckfiltration (in o.zN HCl), . . . . . . die aus der Differenz zu erhaltende “Eiweisskurve”.
beiden Kurvenbilder fest. Dariiber hinaus gelangen wir aber zum Schluss, dass die STEGER-Methode nicht eigentlich “Eiweiss” misst, sondern eine vermutlich recht variable Summe von Extinktionen verscheidenster Liquorbestandteile; mindestens die Hglfte des Gesamtbetrages geht schon bei einem normalen Liquor zu Lasten niedermolekularer KBrper. Die Eichung mit Normalliquor selbst-wie von STEGER vorgeschlagen-anstatt mit reinen Eiweissen kiinnte diesen unerwiinschten Fehler zwar zu einem systematischen und damit tiberbriickbaren machen, sofern die Zusammensetzung der Begleitstoffe stets gleich und in ihrer Gesamtheit entweder absolut oder im Verhgltnis zum jeweiligen Eiweissanteil, such bei pathologischen F?illen, konstant bleiben wiirde. Diese Voraussetzung ist aber unseres Wissens nicht gerechtfertigt, und daraus ergibt sich die Folgerung, dass die Steger-Methode der Eiweissbestimmung im Liquor nicht als naturwissenschaftlich
Diese Feststellung Best$tigung.
exakt gelten kann.
findet
in der nachfolgenden
Vergleichsuntersuchung
ihre
II. VERGLEICH VERSCHIEDENER EIWEISS-BESTIMMUNGSMETHODEN
Man kiinnte die Genauigkeit der STEGER-Methode zwar insofern verbessern, als man das Eiweiss aus dem Liquor zuerst fgllen, nach sorgfgltigem Auswaschen wiederLiter&o-
S. 46g/qo
lill~.I)l~li
II. 1’.
-1-o-+ aufliiscn
und dann
feststellen In bcidcn
allein
messc~~ wiirde;
\'( )I.. 3 (IC).jS)
oder wt‘nn man zuerst
die (;csamtrstirlktiorl
und dann nach Entciwrissung diejenigc dcs Filtratt,s davon abzichcn I%llcn wiirdc abcxr die Erfiillung dcr cingangs gcstclltcn Fordcrungen
3 Trcrloren
wiird(B. 2 nnd
gehen.
IVir habcn uns darum gefragt, crwrihnten Kritcricn 1-3 geniigen, im C\‘-Licht
welche andcrcn Mcthoden, noch in Fragc kommen,
direktcn
Messung
Angaben Autoren
van EGGSTIXN 11~1) KKE~JTZ:~ resp. T,OWRU et nl.22 gestosscn. I)iese beiden vcrwcnden das iibliche Keagens nach Folin AXocnlteau, abcr ureter Zusatz van
I
such
zur Extinktion Folin-Keaktion” Mcthode”
Es hat die iibrigcn
sich als triigerisch
dies mit
der gemesst’ncn gleichkommt
hezcichnen.
zur Folgc,
Hestimmung
Arbcitsaufwand
minim
nicht
T
jcwcils
tcuren
sind wir auf die
die phcnolischen
A4minos%urcn
dcs
Kbrper, PIiweisscs
ist. 9ach
Vorteil
dicscr
Mcthode
liegt frrner
z--,tiindigerFarbentwicklung abcr
wcrdcn
im I’mstand, und dass drr
bci Z.T. zeigt die IAsung vollst%ndig stabiles Es-
Licluormengc~
IVcrte
\ron
der
Gr6ssenordnung wie die STEc;Eri-Jiethode liefert. Dass natiirlich einc routinrMessung im sichtbaren Licht rein betrieblich (krin IT\‘T-Zllsatzgcriit, keine Wasserstofflampcn)
Der sondcre
nur
WAY0.1 ml Liyz~ov gebraucht
im (;ebiet dcr Wcllenkingen 73o-7ho rnp ein flaches, tinktionsmaximum, das trotz dcr To-ma1 kleincrn gleichen massige
hat. I)abei
Liisung beitragen, was eincr Art “koml)inicrter Hiurct; wir werden sic im folgcnden km-z mit “FolinAu-
Ein cminenter
dass zu jeder
dass
crwicscn
dicl zum mindesten den nachdcm dcr \I’cg dcr
FoliIi~Cu-Rlethode Aufmerksamkeit
bcdcutcnd haben geschcnkt
billigcr wir aber
kommt , sei nur ganz ncbenbci noch
aus
weitern
(iriinden
bemcrkt . unserc
1~
:
als yGlol)rli) Im I:\‘-J,icht zeigt .\ll)umin ein iiber 50”~, niedrigcres :\t~sorptionsm;lrimun~ lin ; nach der I~olil7-Cu-RJethc,de betr&igt diese Different nur noch etwa Lo’:,i,. \C’ir sind damit Ixdcutend unabhiingiger van dcr \-ariablen Znsammensetz~~ng dcr liiweisskomponcnten. ii) Das van ~CSTEIN UNII KREUTZ ieicht modifizierte Reagens ((‘itrat anstatt Pi‘artrat als IAsungspartnetvan CrlX? ,) ist iibcr lange Zeit haltbar. welche nach I~GST'EIN UKII JiREUTZ im iii) Im (;egcnsatz ;5ur Santhoproteil7methode, Vergleicll zur I
Ein L’ergleich dicser Licht, der Triibungsmessung ometrischen Stichproben Literatur S. 4Sr)/470
FolinPCn-Methode mit der STEGERSChen ?rlessung im UVnach Zugabe von SuIfosaIicyIs&re und cinigen kjeldahlsol1 uns nun erlauben, die einzelnen Ergebnisse gegenein-
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465
ander abwggend deren Exaktheit und Zuverlassigkeit zu beurteilen. Zur Eichung der verschiedenen Messkurven haben wir iibrigens weder Normalliquor, noch SerumeiWeiss-wie von STEGER resp. von EGGSTEIN UND KREUTZ vorgeschlagen-verwendet, sondern wir haben alle unsere Bestimmungen geeicht mit einem Gemisch aus reinen Albuminen und Globulinen, da es uns auf die Erfassung nicht nur relativer Werte, sondern absoluter vergleichbarer Quantitaten ankam. Und zwar haben wir die aus verschiedenen Literaturangaben $3I8723-26 zu errechnende durchschnittliche Zusammensetzung von 57% Albumin zu 43”k Globulin als Standard gew5hlt.
.
0 .
Fig. ea. Vergleich der Gesamteiweissbestimmung
nach ABELIN (Abszisse) und Folin-Cu (Ordinate).
. * d ...*. .
2
I ’
v
2b
40’
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.
0‘0
.
fOd+
Fig. 6b. Vergleich der Gesamteiweissbestimmun~ nach ABELIN (Abszisse) fZHung (Ordinate). Literatur
S. 4691470
und S~~lfosalic~ls~ure-
Nach den Angabcn in dcr Arbcit van EGGSTEIN UND KHXIJZ besteht zwischcn der Folin~(‘u-Mcthocle und dcr kjeldahlometrischen Kestimmung des Liquoreiwcisscs einc rccht engc Korrelation. Durch cinc Rcihe von Stichproben habcn wir uns vorcrst iiberzeugt, dass dirsc Aussage zutrifft. Die Ergcbnisse, wclche in Fig. ha zusammcngestellt sind, bestiitigen die gutc I’ebereinstimmung der beiden Methoden, w&rend z.13. die Sulfosalic~lsliurc~f~llung tin Ccl ungiinstigercs Hild priisc~ntirrt (Fig. Obj.
Die \-ergleichbarcn Ergebnissc dieser beiden 13estimmungen sind in drr Fig. 7a zusammengestellt. Die relativ grosse Streuung, d.h. schlechte Korrelation dcr nach der modifizicrtc S,rec;er<-Methodc gewonnenen Wertc fsllt ins Auge, wie such der bcrcits weiter oben erwahntc Umstand, dass bei der direkten Messung in UV-Licht mcist doppelt his mehrfach so hohe Eiwcisswerte gefunden werden wit mit den iibrigen Mcthoden; die Griinde dafiir wurden im Abschnitt IC besprochcn. .4n dieser Stellr mag noch tier folgende, aufsclllussreiclle Versuch angefilhrt werden. Es hantlelt sich um I.iquorcs van A I’atienten, die gleichzeitig bei uns cintrafcn untl sofort in derselben Versuchsrcihe gemessen wurtlen. Nach der Folin-Cu-nlcthode wie anch nach SulfosalicylsBllref%llmng wiesen lxide L’ntienten, innerhalb jeder Methode miteinander verglichen, praktisch gleich hohe \\‘ertc a11f (‘fabellr IV). Sac11 tier modifizicrte STEcEK-~lethode jedoch wird im zwciten Fall
mehr als die doppelte Menge des crsten 1:allcs bestimmt, ganz abgesehcn van den absolut vicl zu hohen Zahlen. Dieser Hefund veranlasste uns, bei beiden Liquores das ganze .L\bsorptionsspektrlIm zwischen zoo-350 ml’ anfzanehmen. Ein ev. Fehler beim Einpipettieren w2re ja denkbar gewescn; dann hgttc sber such die r\bsorptionskurve iiber den ganzen Uereich doppelt so hohe Werte uric diejenige des Falles I licfern miissen. Im kleinwelligen Hereich (205~230 m,u) wax-en die beiden Extinktionen jedoch bis auf wenige l’rozente gleich gross, und zwar in einem Messbereich, wo dass LAMBERT-BEER’sche Gesetz noch weitgehend gilt (unterE = 2.0) Erst bei den hijhern \Vellenl%ngen strebten die Kurven znsehends auseinander und erreichten im Gebiet van 270 m,u ein Maximum der Differenz, welches sich nur urn weniges vcrmindert bis in den Bercich iiber 300 m/t hinzog. Daraus kann eindeutig geschlossen werden, dass es sich nicht urn einen methodischen Fehler bei der Messung, sondern urn eine ganz beachtliche StGrung van im Gebiet um 270 rn,~ such bei saurem pH stark absorbierenden, nicht-eiweissartigen Begleitstoffen handeln musste. Die .I\ngaben in Tabelle IV sind somit gesichcrt mnrl liefern ein weiteres B&spiel fiir die UnznverlSssigkeit der tlirekten Messung im CV-Licht. Ltttvduu s. &q/4 jn
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BESTIMMUNG
c. Folin-Cu-Methode
DES GESAMTEIWEISSES
IRI LIQUOR
467
und Sulfosalicylsaurefallung
Wie aus Fig. 7b ersichtlich, zeigt die Bestimmung mit Sulfosalicylsaure zwar eine betrachtliche Streuung und ist infolgedessen nicht als exakt zu werten. Die Werte fallen such im allgemeinen etwas zu tief aus; sie weisen aber dennoch eine eindeutigere Regression auf als die STEGER-Methode und lassen extrem herausstechende Unstim-
l
’
40
. 120
60
.
200
. 160
rho mQg
Fig, p. Vergleich der Gesamteiweissbestimmung nach Folin-Cu (Ordinate) und “modifiziertem STEGER” (Abszisse).
0
.
0
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J :
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a
.
. Fig. 7b. Vergleich Literate
S. 46g/47o
26
40
6,J
&,
nach Folin-Cu der Gesamteiweissbestimmung sluref%llung (Abszisse).
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(Ordinate)
und Sulfosalicyl-
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II.
I~IHI)lill
1’.
\.( )I..
3 (1qys)
migkcitcn \.rrmissen. Wird die Ablesung des ‘Triibungsgradcs nicht wicxim vor licgendcn Falle durch Yergleich mit Standardkonzcntrationcn von Augc durchgefiihrt, sondern durch einc optische Mcssung crsetzt, so kann vermutlich noch cinigcs an Pr%zision gewonnen wcrdt>n ; such ziihkn win.
dann diirftc
~1. Sul~fsalic~lsiiurefi*‘llu~z~
wd
abrr dicse Mcthodc
modifizievte
nicht unter
dits lwstm
ZII
Steger-Methode
Ein Vergleich dieser beiden Methoden zeigt eine ausserordentlich schlechtc &!rcinstimmung der Ergebnissc (Fig. 8), was auf (;rund drr bisher mitgeteilten Korrcla-
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. .
*...
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L l;ig. 8. Vergleich
tionen-bei
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e . ..
29
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40
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.
(;esallrteiweissbestilnmung “modifiziertem
Annahme
120
160
nach STEGEK”
ao"PC
200
Suliosalicpls~inre~illung (Abszisse).
also, dass die Folin-Cu-Bestimmung
(Ordinate)
und
exalzt sei-naturgem&
ZLIcrwarten ist. Wiirde n5mlich die schlechte Ubereinstimmung in den Fig. 7a und 7b in erster Linie durch Fehler auf Seiten der Folin-Cu-Methode zustande kommcn, oder durch Begleitfaktoren bedingt sein, die sich in ghnlicher Weise auf die beiden andern Verfahren auswirkten, so w%re eine bessere Ubereinstimmung von SulfosalicylsBureund STEGER-Methode ohne weitercs gegeben. Das viillig ungeordnete Bild der Fig. 8 beweisst jedoch, dass dieser Einwand nicht zutrifft.
DISKUSSION
Eine iiberblick iiber die Gesamtheit der Ergebnisse fiihrt somit zur Feststellung, dass unter den hier gepriiften Methoden zur Bestimmung von Licluoreiweiss sich diejenige mit dem Folin-Cu-Reagens s fiir klinische Routineuntersuchungen eindeutig am besten bewghrt. Bei der Sulfosalicyls%uretriibung ist mit einer vie1 griisseren Streuung und mit gelegentlich ZLI tiefen Werten zu rechnen, w%hrend dir direkte Messung IAwtuY
S. _~hrj/qp
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BESTIMMUNGDES GESAMTEIWEISSESIM LIQUOR
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im UV-Licht nach Ansguerung gem&s den Angaben von STEGER Anlass zu gefghrlichen Trugschliissen geben kann. Zugunsten der Folin-Cu-Methode fgllt ausser der grossen Exaktheit im Vergleich mit Kjeldahlbestimmungen such die gusserst geringe Liquormenge und der einfache Arbeitsgang ins Gewicht. Aus einer Serie von 32 Doppelbestimmungen berechnet sich die Standardabweichung des methodischen Fehlers zu c = ~_t0.0094 Extinktionseinheiten; dieser Betrag entspricht einer Eiweissmenge von 1.88 mg%. Setzt man den methodischen Streubereich mit & 2 g fest, so gelangt man zur Aussage, dass wir imstande sind, die Eiweissmenge und Unterschiede in deren Konzentration such dann noch messbar zu erfassen, wenn uns von der in Frage stehenden Fliissigkeit nur 0.1 ml, in welchem mindestens 3.8 y Eiweiss gel&t ist, zur Verfiigung steht. Unter diesen Bedingungen verdient die Folin-Cu-Methode, ganz besonders wo die Bestimmung von Eiweiss in hochverdtinnten Lijsungen im Vordergrund steht, vollste Beachtung. DANK Die vorliegende Arbeit konnte mit Unterstiitzung des E. Barell-Fonds durchgefiihrt werden, wofiir such an dieser Stelle bestens gedankt sei. Die exakte Aufnahme der vielen Extinktionskurven, sowie die Eiweissmessungen im UV-Licht und nach der Methode von EGGSTEIN UND KREUTZ verdanke ich der Mithilfe von Frgulein F. SCHMID. Die Kjeldahlbestimmungen wurden im Privatlaboratorium von Prof. ABELIN als Doppelanalysen durchgeftihrt. Die Werte der Sulfosalicyls$uremethode verdanken wir dem klin. Laboratorium der Heil- und Pflegeanstalt “Friedmatt”. ZUSAMMENFASSUNG In einer vergleichenden Untersuchung einiger Methoden zur Bestimmung van Eiweiss im Liquor (Kjeldahl, Sulfosalicyls%ure, Folin-Cu, direkte Messung im UV-Licht) hat sich die spektrophotometrische Folin-Cu-Methode wegen ihrer grossen Exaktheit und wegen der kleinen benijtigten Fliissigkeitsmengen als die fiir Routinebestimmungen geeignetste herausgestellt. Es wurden die Griinde untersucht und diskutiert, warum die direkte Messung im UV-Licht nicht als zuverltissig gelten kann. Die Inkonstanz des Nativliquors im Gebiete von 260-280 rnp und das Verschwinden der Kuppe bei 265 rnp nach AnsLuern konnte auf das Verhalten von Ascorbinsgure zuriickgefiihrt werden. SUMMARY Various methods of determining protein in cerebrospinal fluid were compared. Of the methods investigated (Kjeldahl, sulphosalicylic acid and Folin-copper methods, and direct measurement in UV light), the spectrophotometric Folin-copper method proved to be the most suitable for routine determinations, because of its high accuracy and the small amount of liquid required. An attempt was made find the reasons why direct measurement in UV light cannot be considered as reliable, and the results were discussed. It was possible to relate the lack of constancy of the extinction of fresh untreated spinal fluid in the region 260-280 mp, and the disappearance of the peak at 265 rnpLafter acidification, to the behaviour of ascorbic acid. LITERATUR I 2 3 4 5 6
W. NAGEL, Schweiz. med. Wochxhr., 20 (1939) 431. F. ROEDER, Die Cerebrospinal~iissigkeit, Springer-Verlag, Berlin, 1942. M. EGGSTEIN UND F. H. KREUTZ, Klin. Woch.schr., 33 (1955) 879. J. GLEISS UND K. HINSBERG, Arch. Kinderheilk., 139 (1950) 65. W. A. DEN HARTOG-JAGER UND J. FAHRENFORT,FO~~~ Psychiat. neerl., 55 (1952) 364, A. HOFMANN, Dissertation, Wiirzburg, 1956.
Im \~‘crlaufe unsertr ~~ntcrs~lcl~~~~~~(~nmit der l~~l~n-~ll-~~eth~d~ wurdr IWOhachtct, da.ss aus bisher noch nicht eruierbaren Griindcn gelcgentlich au& dcr Rlindwert cinc. Blauf~rl~ung aufweist. Es stellt sich die Frage, oh diese ISrscheimmg im Zusammenhang mit andcrn chemischen Reaktionen steht, die gleichzritig im seltxn Lahoratoriumsranm ausgefiihrt warden mussten (IXimpfe von (‘hrom:1 to~r~rnrncn und ~~)r~~l~itt~!ln ?)_ Auf allc I%lle lkinncn Eiwcisswertc, die gcgcn solchc Ihuc Hlindwertc gcmcssen werden, mit Fchlcrn his zu 20 mg”, behaftet scin : sic sind :/II climinicrcn und die Hcstimmung ist zu wicdcrholrn. 13inc Al~l&rung tlct i!rsachcn dicscr gt~lcgvntliclii~n “\‘ersag~r” ist im tkngf.
CLINICA CHIMICAACTA
VERGLEICH DES UND
EINIGER
METHODEN
GESAMTEIWEISSES
ANDEREN
STARK
H. P. Forschungslaboratorium und der Newologischen
455
ZUR
BESTIMMUNG
IM LIQUOR
VERDUNNTEN
I&SUNGEN
RIEDER
der Psychiatrischen
U&ersitiits-Klinik
UnLsersitiits-Poliklinik*,
Base1 (Schweiz)
Die Bedeutung des Eiweissgehaltes im Liquor cerebrospinalis ist fur die Diagnostik vieler Erkrankungen, wie such fur die Verfolgung des Krankheitsverlaufes unbestritten. Im Laufe der Jahre wurde jedoch immer wieder Kritik geiibt an den bisher tiblichen Routinebestimmungen. So weisen NAGELI und ROEDER~ schon 1939 und 1942 darauf hin, dass die volumetrische Eiweissbestimmung nach KAFKA keinen Anspruch erheben kann, ein im chemischen Sinne quantitativ genau arbeitendes Verfahren zu sein. In neueren Arbeiten 3--8,27wurden die Zweifel, die an dieser am weitesten verbreiteten Methode angemeldet wurden, durch vergleichende Untersuchungen mit modernen chemischen, colorimetrischen oder spektrophotometrischen Methoden vollauf bestatigt. Der Wunsch nach exakteren und feiner differenzierenden Methoden ist deshalb verstlndlich. Unter diesen nimmt, seit ihrer raschen Verbreitung in den letzten Jahren, die Spektrophotometrie an Bedeutung standig zu. Nachdem schon verschiedene Versuche unternommen wurden, Uro- und Plasmaproteine”, Proteine aus verschiedenen andern KGrpersaftenlO, Antikijrperproteine”, Faserproteine12 u.a.m. durch ihre Spektren im UV-Licht zu charakterisieren und quantitativ zu bestimmen, lag es nahe, diese Methodik such zur Liquoreiweissbestimmung heranzuziehen. Dabei ergaben sich allerdings, wie z.B. DEN HARTOG-JAGER et aZ.5, STEGER~ und BAUER~~ berichten, einige Schwierigkeiten, die hauptsachlich mit der im Gegensatz zum Serum niedrigen Eiweisskonzentration des Liquors und dem im Vergleich dazu hohen Gehalt storender Begleitsubstanzen zusammenhangen. Die Anforderungen, welche an neue Methoden zur Liquoreiweissbestimmung zu stellen sind, konnen, soweit klinische Serienuntersuchungen in Frage stehen, wie folgt umrissen werden : I.
moglichst grosse Exaktheit und Differenzierbarkeit, 2. mijglichst kleine benotigte Liquormenge, 3. mijglichst geringer Arbeitsaufwand, 4. keine chemischen Veranderungen, die ihrerseits schlecht kontrollierbare Variablen in die Bestimmung hineinbringen, 5. wenn tiberhaupt chemische Umsetzungen ndtig, dann mijglichst eiweiss-spezifische, so dass der Fehler durch Nicht-Eiweissbestandteile praktisch vernachlassigt werden kann. * Leiter: Prof. F. Georgi. Literatur S. 4691470
450
H. I’. RTI-I)lilZ
\.OI.. 3 (I’).+)
au& in der ~~Iocli~kation van Xm~rti~ &,dit> BeObwohl die Kjeldahl-~~cttrodc, dingungen z und 3 nicht erfiillt, gilt sic doch nllgemein als bishcr zuverl%ssigstc I&,stimmung und wird nach wit, vor zur Eichung und zum Vergleich mit ncucn Methoden verwrndet, jedoch kaum zur Iioutinebestimmung in der Klinik. Bcsondercs Intcressc vcrdient hingegen die Eiweissbestimmung im l_JV-Licht, wit sic van STE(;RR” IX,schrieben wurde, da hirr die Punkte 4 und j zum vorncherein wcgfallen. Es wird ja nach der Vorschrift von STECXI: lediglich I ml Liquor mit rincm ~~li(l~~ot~~~ Tcil o. ri1 HCI vermischt (bei den iiblichen 3.5 ml fasscnden IO mmCi.ivctten entsprechend mchr) und unmittelbar anschliesscnd der Extinktionswert bei 27~) mp direkt abgelescn, wobei u prim+ einzig noch die relativ grosse Liquormenge van I 2 ml bcanstandet werden kijnnte. In einer spatern Modifikation (IIoFMxNN~) ist die vcrwcndctc HC‘II~onzcn~ration auf o.gN 1ler~L~lfgesetzt worden. Die Zugabe von H(‘1 hat den Zweck, die im Nativliquor mrist ii&r langc &it ~InI~est~~ndig~~Estinktion im (;tbiet vott 280 rnp sofort auf einen bcstimmten Endwert zu fisieren. Als uns vor cu. Iahresfrist die STEGERsche Arbeit zu Gesicht kam, war in unserm mit ahnlicher Methodik im Forschungslaboratorium eine analoge Untersuchung Gange, welche die Befunde des genannten Autors im Prinzip bestatigte. Urn die uner~~~nschte Extinktiolls~~er~nde~ng von ~ativli[luor allszuschliessen und die Mcssung von kleineren pH-Verschiel>~lngen unabhangig zu machen, verwendeten wir, vorerst den Angaben von GITI.,IN~’ folgend, Essigsaure als “Stabilisator”. Spater gingen wir jedoch wegen deren grosserer optischer Leere im Gebiet zwischen zoo-300 rnp auf HCl tiber, da es uns darauf ankam, such die mit dem Zeiss-Spektrophotometer PM Q II gut erfassbaren I5 Wcrtc unter 240 rnp mitzuiiberpriifen. Die Besonderheit unserer Metbodik bestand ledigtich da&, class wir-urn unsere 3.5 mi fassende Kiivetten zu fiillen und doch nicht mehr als I ml Liquor zu l)rauchen~~~~iclveils2 ml einer o.Tu/,igen SaCl-Liisung (Chloridkonzentration im Nativliqubr) mit I ml IA’+ GCI -3 I ml Liquor versetzten. Dies err&t beziiglich HCl-Konzentration die gleichen VerhXltnisse wie bei HO’FMANNund STEGER, be&glich X&iss-Konzentration die gena;e HPlfte. Da jedoch die Verdiinnung mit NaCl-J,&ung im iibrigen keine weiteren Folgen hat, als die nach STEGERsCher Methodik gemessene FZxtinktion auf extakt die HIlfte zu reduzieren und da wir such unter diesen ~edinglIngen no& immer in eincm optimalen Messbereich arbeiten jmeist zwischen E = 0.1 -+x4), kann unsere Methodik als praktisch mit der STacERschen i&eilfisch hetrachtet werden. \Vegen des &was unterschiecllichen Ansatzes bezcichnen wir sie deshalb im folgenden als “modifizicrte STEGER-Methods".
Im Laufc unserer Untersuchungen gelang es uns, einige Befunde zu erheben, die &was mehr Licht werfen sowohl auf die Inkonstanz des ~at~vliq~lors als such auf die Genauigkeit und Brauchbarkeit der %RGER-&thode im Vergleich ZLI verschiedenen anderen Methoden. I. DIE INKONSTANZ DES NATIV-LIQUORS IM UV-LIGHT
Die gri5sste Schwierigkeit bei der direkten spektrophotometrischen Messung im UV-Licht besteht darin, dass der frisch entnommene Nativliquor im Bereich des Eiweissmaximums urn 280 m,u eine kontinuierliche Verminderung des Extinktionswertes und zudem kein Maximum zeigt, so dass eine definierte Messung unmoglich ist. An dieser Tatsache scheiterte bereits die Untersuchung von DEN HARTOG-JAGEK et aLs, w$ihrend es, wie gesagt, STEGER und uns gelang, diese Klippe durch Ansauerung des Liquors zu umgehen. Wir selbst begniigten uns jedoch nicht mit dieser Feststel-
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3 (1958)
BESTIMMUNGDES GESAMTEIWEISSESIM LIQUOR
457
lung; vielmehr versuchten wir herauszufinden, welcher Mechanismus resp. welche Faktoren dieser Stabilisierung des Eiweissmaximums zugrundeliegen. Reine Eiweisslosungen zeigen ja im liquor-neutralen Bereich (pH 7.3-7.5) eine vollkommene Konstanz des maximums bei 280 rnp. Bei Nativliquor hingegen findet sich im allgemeinen ein ausgesprochenes Maximum bei 265 m,u. Es lag darum nahe, die Ursache der Inkonstanz bei Nicht-Ei~eissk&pem, die als Begleitsubstanzen in Liquor auftreten, zu suchen. Hierbei kommen naturgemass gewisse Vitamine sowie die freien aromat&hen Aminosauren mit ihren z.T. recht hohen Extinktionswerten in erster Linie in Betracht. Serum- und Liquorproteine wie such die freien aromatischen Aminos&rren zeigen zwar je nach pH der Test&sung Maxima zwischen 290-278 m,u, jedoch nie ein solches bei 265 rnp. Die Versuche von SCHAUENSTEINl* iiber die Veranderlichkeit des Absorptionsspektrums von Ascorbinsaure, die Versuche von SPIEGEL-ADOLF et al. l7 iiber mogliche Einfltisse von Vitamin C, Proteinen und Purinkorpern, sowie die Versuche von DEN HARTOG-JAGER et al. 5 iiber veranderte Absorptionsspektren nach Vorbehandlung der Patienten mit verschiedenen Vitaminen sprechen sehr dafiir, dass es vor allem die Ascorbins%_rre und vielleicht such das Aneurin sein werden, denen die Verantwortung fur den unerwtinschten Effekt zukommt. Wir haben darum die verschiedenen Begleitsubstanzen des Liquors einer nahern spektrophotometrischen Priifung unterzogen.
Die Extinktionswerte einiger Vitamine, unter den Bedingungen, wie sie im frisch entnommenen Liquor einerseits herrschen, und nach Zugabe von HCl gem&s der Methode von STEGER anderseits geprtift, sind in den Figuren ra bis xe dargestellt. Aneur&~ (B,); 0.5 + IO-* M = 1.69 mg% : zeigt hei pH 7.3 zwei Absorptionsmaxima, ein kleineres bei 26: rnp und ein grosseres bei 234 rnp; bei pH I und darunter (o.zN HCl) vereinigen sich die beiden Maxima in ein einziges, wesentlich hoheres bei 246 rnp. Die Lijsungen in Phosphatpuffer und HCl sind konstant ; nach rqstiindigem Stehen werden noch praktisch dieselben Kurvenwerte gemessen. LaclofEavin (B,) ; 0.95 . ro-6 M = 0.36 mg”/o :* zeigt sowohl bei pH 7.3 wie such in o.zN HCl zwei ausgeprLgte Maxima, das eine bei 267 m,u, das andere &was niedrigere bei 223 rnp; beide Maxima verBndern weder durch die pH-Verschiebung, noch durch rjstiindiges Stehen ihre Lage und absolute Hohe urn merkliche Betr&ge. Adermin (Ppridoxin, B,); 0.5 f 10-4 M = 0.85 mg%: zeigt bei pH 7.3 drei Absorptionsmaxima, ein erstes bei 325 rnp, ein zweites bei 255 m/A und ein drittes, sehr hohes bei 220 m,u. In 0.2N HCl findet sich nur noch ein ausgeprLgtes Maximum bei zgo mp; die beiden andern sind weitgehend “ausgeebnct” resp. in den nicht mehr erfassbaren Rereich unter zoo rn,u verschoben.
Nicotinanzid; 0.5. IO-~ M = 0.61 mg0/b: zeigt bei pH 7.3 sowohl wie in o.zN WC1 ein Absorptionsmaximum bei 261/262 rnp und ein zweites hiiheres bei zrz--214 my, also praktisch keine Verschiebung der Lage, jedoch eine bedeutende, geger&uhge Verschiebung der absoluten Werthohe, wenn das pH vom neutralen Pbosphatpuffer nach der stark sauren Seite hin verschoben wird. .4scorbinsii7tr~ (C) : 0.5 . IO-~ M = 0.88 rng”,h : zeigt ein scharfes Maximum in neutralem Dereich bei 264/265 rnp, in o.zN HCl bei 243 m/h. WPhrend jedoch such nach rqstiindigem Stehen in HCI die Kurvenwerte konstant bleiben, stellt man im neutralen Milieu eine vollst%ndige Zerstiirung der Ascorbinslure und damit ein Absinken des hfaximums auf praktisch Null fest. En Modellversuch mit reiner Ascorbinsaure in gepufferter Losung van pH 6.8 hat ergeben, dass nach einer Zeitspanne van nur ungef&hr 20 min das Absorptionsmaximum bei 264 rnp in einer schwach verflachenden Kurve bereits auf etwa die HIlfte des Ausgangswertes abgesunken ist. * Ungefahre Ldslichkeitsgrenze gerechnet auf 0.2 . IO-* M. Litevatur
S. 4691470
in H,O dest.
; zur bessern graphischen Vergleichbarkeit
um-
E
0.8
0.7 0.6. 0.5
OA
0.3 0.2
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BESTIMMUNG
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Vergleicht man die Wahrscheinlichkeit, mit welcher die hier im Einzelnen geprtiften Vitamine an der Inkonstanz des Nativliquors resp. an der Kurvenverschiebung bei Ansauerung beteiligt sein konnten, so mtissen vorerst einmal Lactoflavin und Adermin aus unsrer Betrachtung wegfallen. iiber deren quantitatives Vorkommen unter normalen und pathologischen Bedingungen sind uns bisher keine Angaben bekannt, so dass wir nicht in der Lage sind, die Grosse ihres moglichen Einflusses abzuschatzen. Lactoflavin win-de zwar, wie die Fig. rb beweist, als Komponente, die den Kurvenverlauf des Liquors verandern konnte, ohnehin wegfallen, da es unter allen gepriiften Bedingungen die gleiche Absorptionskurve zeigt. Uber Aneurin gehen die Literaturangaben auseinander; mit chemischen Methoden werden zwischen 1-2 y% Gesamt-Aneurin (inkl. Cocarboxylase), mit biologischen Methoden hingegen
TABELLEI ASCORBINSkURE-ZERSTGRUNG
Min E 264
I
0.697
BE1
NEUTRALEM
3
5
7
0.640
0.597
0.55'
pH IO
0.492
19 0.342
bis 18 y% nachgewiesen 18.Setzt man such die hiichste Konzentration von 18 y% ein, SOist doch die Menge noch immer so klein, dass die Extinktion kaum messbar ist und damit nicht ins Gewicht fallen kann. Eine ganz andere Situation ergibt sich nattirlich, wenn der Patient, wie in den Versuchen von DEN HARTOG- JAGER et al. 5, durch mehrfache Verabreichung hoher Vitamindosen mit Aneurin quasi “gesattigt” wird; dies entspricht zwar nicht mehr den nattirlichen Bedingungen, ist jedoch im Falle therapeutischer Verabreichung von B-Vitaminen im Zeitpunkt vor der Liquorentnahme in Rechnung zu stellen. Fiir Nicotinamid im Normalliquor werden Mittelwerte von 18 j$o'" und 26 y% 19, im Durchschnitt also etwa 22 y% angegeben. Auch diese Quantitat kann nur unbedeutende Veranderungen des Liquorspektrums zur Folge haben. So verbleibt schliesslich nur noch die Ascorbinsiiure als “Hauptstorefried” ; ihr Vorkommen schwankt zwischen 0.9-1.7 mg%, d.h. in der Jugend finden sich eher die hoheren, im Alter eher die tieferen Werte (wahrscheinlich in Abhangigkeit von der Ernahrung). Eine durchschnittliche Menge von 1.5 mg% gibt an der Reinsubstanz gemessen eine Extinktion von 1.360 bei 264 m,u im neutralen Milieu und eine solche von 0.710 bei 243 m,u im sauren Milieu. Es sind dies Betrage, die durchaus geniigen, urn das Verschwinden des Maximums von 265 mp im frischen Nativliquor sowohl bei Ansauerung als such beim Stehenlassen zu erklaren. Wie man aus Tabelle I ersieht, geht die Zerstijrung der Ascorbinsaure bei neutralem pH sehr rasch von statten, dtirfte allerdings im starker gepufferten und weitere reduzierende Substanzen (Glutathion etc.) enthaltenden Liquor-w0 eine analoge Verminderung erst nach Halbstunden oder Stunden gemessen wird-langsamer vor sich gehen. Sie scheint somit weitgehend verantwortlich zu sein fur die allgemein festgestellte Inkonstanz der Liquorwerte im Bereich zwischen 250-300 m,u, ganz besonders dann, wenn der Patient im Zeitpunkt der Liquorentnahme unter therapeutischer oder prophylaktischer Verabreichung von Vitamin C gestanden hat. Citeraw s. 4691470
Unter den iibrigcn, nicht eiweissartigen Licluorbcstandteilc~l fallen dmch hdhere I~onzentration die in Tabellc II aufgef~hrten Stoffe auf (die llngef~hre~l Durch-
schnittswerte, die nach FLASCHENTR~ER et al. lx, HOPPE-SEYLER VSL) THIEKFELI)EK~~ und RAUEN~~ im Normalliquor zu erwarten sind, stehen jeweils dahinter). Bei allen bier aufgezahlten Substanzen handelt es sich aher urn Stoffe, deren optische Eigenschaften bedeutend
im fraglichcn
Spektralgebiet
sind, so dass ihr stiirender
Falfe abweichender
bei der vorgegebenen Einfluss
~~engen~rerh~ltnisse,
Konzentration
recht un-
auf die Eiweissbestinlmung,
such im
nur sehr gering sein kann.
0.;
Anders verhalt es sich mit einer Reihc weitcrer Stoffe, die zwar nur in Konzentrationcn unter r m&y; vorkommen, die aber z.T. betr~chtliche Absorptionen aufweisen. Wir denken hier zuerst an die freien Aminosauren (vgl. Tabelle III), von denen die drei aromatischen-Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan-, welche such fur die Extinktion der Eiweissliisungen grijsstenteils verantwortlich sind, natiirlich stark ins Gewicht fallen. Im Gegensatz zum Serum, wo neben der sehr grossen Eiweissmenge die tibrigen Bestandteile bei der spektrophotometrischen Bestimmung fast vijllig Lilcmtwr S. +5q/go
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vernachlassigt werden kijnnen, sind z.B. die freien Amino&men im Liquor, imvergleich zum jeweiligen Gehalt an Eiweiss, in etwa 10-20 ma1 hijherer Konzentrierung vorhanden. Von den restlichen, meist nur in Spuren vorhandenen Begleitstoffen, wie Cholesterin (0.1 mg%), Zitronensaure (0.04 mg%), Bernsteinsaure (0.35 mg%) und Harnsaure (0.8 mg%) kann nur letztere wegen ihrer zugleich grossen Absorption und relativ grossen Konzentration noch als stiirend in Frage kommen. Die Fig. z gibt die Verhaltnisse wieder, wie sie unter den Bedingungen des Nativliquors und nach Ansauerung gemessen wurden. Die beiden recht hohen Maxima bei 291 rnp und 235 rnp werden durch Ansauern nur urn weniges verkleinert und etwas nach den kleinern Wellenlangen hin (285 und 321 rnp) verschoben, im tibrigen bleiben die Werte tiber mehrere Stunden (soweit geprtift) unverandert. Mit der Inkonstanz des Nativliquors hat die Harnsaure infolgedessen nichts zu tun; hingegen macht schon die Absorptions-
Fig. 2. Extinktion
van Harnstoff
in der mittleren, im Liquor Konzentration van 22 mgy’.
cerebrospinalis
vorkommenden
hijhe der normalerweise im Liquor vorkommenden Harnsaure einen so grossen Betrag aus, dass ein betrachtlicher Anteil des vermeintlichen “Eiweisswertes” (nach STEGER bei 279 m,u gemessen) zu ihren Lasten gehen muss. Urn einen Eindruck von der G&se der Gesamt-Extinktion zu erhalten, welche allein durch die Nicht-Eiweiss-Stooe des Liquors im ultravioletten Messbereich bedingt ist, haben wir alle in diesem Abschnitt b erwahnten Substanzen (mit Ausnahme des wasserunliislichen Lecithins und Cholesterins) in den angeftihrten Konzentrationen* im neutralen und sauren Milieu gemessen. Das Ergebnis ist dargestellt in Fig. 3a. Dasselbe Gemisch unter Zusatz der im Abschnitt a diskutierten Vitamine, in der Grossenordnung ihres Vorkommens im Liquor, ist in Fig. 3b wiedergegeben. Man achte dabei auf die deutliche Kuppe bei 265-267 rnp, welche nach Ansauerung vollkommen verschwindet und an welcher nach all unsern bisherigen Vergleichen zur Hauptsache die Ascorbinsaure beteiligt ist ; beim Gemisch ohne Ascorbinsaure (Fig. 3a) fehlt eine entsprechende Kuppe an dieser Stelle. Angaben, ob im Normalliquor Abbauprodukte aus dem Nucleinsaurestoffwechsel zu erwarten sind, waren uns keine zuganglich; es ist aber zu bedenken, dass unter gewissen pathologischen Bedingungen I7 such Purin- und Pyrimidinkorper die Extinktionswerte verfalschen kiinnen. * Fiir Tryptophan wurde der Wert van 0.1 rngyb eingesetzt. (Pathologischerweise Konzentrationen bis iiber 1 mg% vorkommenlO). Litcratur
S. 4691470
sol1 es in
‘l‘hcoretisch solltca man die :~bsorI)tionskurv~~ zincs durcl~scl~~~ittlicl~ normalcn 12iquors reproduziercn kiinncn, indem man cinfach die lZctr@ dcr an Einzclstoffcn oder an Stoffgemischcn gemesscncn Extinl
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250
300
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Fig. 3:~. Estinktion dcr im Liquor cerebrospinalis uorkommen Substanzen ohne Vitamine und ohne Ewe&e.
300
I:ig. 31). LXesclben Substanzen plus ne. -~ ~-~-in 1/3oM I’hosphatpuffer - - in o.rN HCI.
mp
VitamipH 7.3,
cinc Versnderung dcr individuellen Extinktionsbeitrgge zur Folge haben. Solche Umsetzungen sind jedoch nicht zu erwarten, da ja bei der chemischen Analyse des Gcsamtliquors alle Stoffe noch als solche wiederzufinden sind. Damit darf aber such die Voraussetzung zur Summation der Einzel- und Gruppenextinktionen, die wir in den bisherigen Untersuchungen erhalten haben, als gegeben betrachtet werden. Werden nun dem kiinstlichen Gemisch, dessen additiv gewonnene Gesamtextink-
I;&. 4. listinktion der in IGg. 3b aufgefiihrten Substanzen plus Iiiweiss in 1/3oM I’hosphatpnffer pH 7.3, - - - - in o.z,X’ HCI.
tion in Fig. 31) wiedergcgeben ist, zusgtzlich noch die zg rng% Eiweiss des Normallicluors (Alb./Glob. = j7/43ui;, ; vgl. spgter) beigeftigt, so haben wir alle Substanzen vereinigt, deren Vorkommen im Liquor cerebrospinalis gesichert ist. Wir gelangen so zu den Kurven der Fig. 4 und stellen fest, dass wir tat%chlich das Bild eines nativen I~itcratuv
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BESTIMMUNGDES GESAMTEIWEISSESIM LIQUOR
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Liquors vor uns haben. Damit haben wir aber zugleich such einen tiefern Einblick in die Verhgltnisse gewonnen, welche bei der spektrophotometrischen Messung von Liquores im ultravioletten Bereich zu gewgrtigen sind. Greifen wir im speziellen nochmals die Bedingungen heraus, wie sie bei Anwendung der STEGERschen Methodik vorherrschen, und vergleichen wir die Kurven eines willkiirlich herausgegriffenen, nativen Liquors und seines durch Druckfiltration enteiweissten Filtrates mit den je identischen Portionen unseres “kiinstlichen Liquors” (Fig. ga und 5b), so stellen wir eine auffallende .&hnlichkeit in den Proportionen der
Fig. ga.
Fig. gb.
Fig. ga und gb. Vergleich eines kiinstlich zusammengesetzten Liquors mit einem nativen Liquor van ungefghr mittlerem normalen Eiweissgehalt (26 mg%). Fig. ga. Kiinstlich zusammengesetzter Liquor. Fig. gb. Nativer Liquor. ~ Gesamtextinktion in saurem Milieu (o.zN HCl), -- - derselbe Liquor nach Entfernung des Eiweiss mittels Druckfiltration (in o.zN HCl), . . . . . . die aus der Differenz zu erhaltende “Eiweisskurve”.
beiden Kurvenbilder fest. Dariiber hinaus gelangen wir aber zum Schluss, dass die STEGER-Methode nicht eigentlich “Eiweiss” misst, sondern eine vermutlich recht variable Summe von Extinktionen verscheidenster Liquorbestandteile; mindestens die Hglfte des Gesamtbetrages geht schon bei einem normalen Liquor zu Lasten niedermolekularer KBrper. Die Eichung mit Normalliquor selbst-wie von STEGER vorgeschlagen-anstatt mit reinen Eiweissen kiinnte diesen unerwiinschten Fehler zwar zu einem systematischen und damit tiberbriickbaren machen, sofern die Zusammensetzung der Begleitstoffe stets gleich und in ihrer Gesamtheit entweder absolut oder im Verhgltnis zum jeweiligen Eiweissanteil, such bei pathologischen F?illen, konstant bleiben wiirde. Diese Voraussetzung ist aber unseres Wissens nicht gerechtfertigt, und daraus ergibt sich die Folgerung, dass die Steger-Methode der Eiweissbestimmung im Liquor nicht als naturwissenschaftlich
Diese Feststellung Best$tigung.
exakt gelten kann.
findet
in der nachfolgenden
Vergleichsuntersuchung
ihre
II. VERGLEICH VERSCHIEDENER EIWEISS-BESTIMMUNGSMETHODEN
Man kiinnte die Genauigkeit der STEGER-Methode zwar insofern verbessern, als man das Eiweiss aus dem Liquor zuerst fgllen, nach sorgfgltigem Auswaschen wiederLiter&o-
S. 46g/qo
lill~.I)l~li
II. 1’.
-1-o-+ aufliiscn
und dann
feststellen In bcidcn
allein
messc~~ wiirde;
\'( )I.. 3 (IC).jS)
oder wt‘nn man zuerst
die (;csamtrstirlktiorl
und dann nach Entciwrissung diejenigc dcs Filtratt,s davon abzichcn I%llcn wiirdc abcxr die Erfiillung dcr cingangs gcstclltcn Fordcrungen
3 Trcrloren
wiird(B. 2 nnd
gehen.
IVir habcn uns darum gefragt, crwrihnten Kritcricn 1-3 geniigen, im C\‘-Licht
welche andcrcn Mcthoden, noch in Fragc kommen,
direktcn
Messung
Angaben Autoren
van EGGSTIXN 11~1) KKE~JTZ:~ resp. T,OWRU et nl.22 gestosscn. I)iese beiden vcrwcnden das iibliche Keagens nach Folin AXocnlteau, abcr ureter Zusatz van
I
such
zur Extinktion Folin-Keaktion” Mcthode”
Es hat die iibrigcn
sich als triigerisch
dies mit
der gemesst’ncn gleichkommt
hezcichnen.
zur Folgc,
Hestimmung
Arbcitsaufwand
minim
nicht
T
jcwcils
tcuren
sind wir auf die
die phcnolischen
A4minos%urcn
dcs
Kbrper, PIiweisscs
ist. 9ach
Vorteil
dicscr
Mcthode
liegt frrner
z--,tiindigerFarbentwicklung abcr
wcrdcn
im I’mstand, und dass drr
bci Z.T. zeigt die IAsung vollst%ndig stabiles Es-
Licluormengc~
IVcrte
\ron
der
Gr6ssenordnung wie die STEc;Eri-Jiethode liefert. Dass natiirlich einc routinrMessung im sichtbaren Licht rein betrieblich (krin IT\‘T-Zllsatzgcriit, keine Wasserstofflampcn)
Der sondcre
nur
WAY0.1 ml Liyz~ov gebraucht
im (;ebiet dcr Wcllenkingen 73o-7ho rnp ein flaches, tinktionsmaximum, das trotz dcr To-ma1 kleincrn gleichen massige
hat. I)abei
Liisung beitragen, was eincr Art “koml)inicrter Hiurct; wir werden sic im folgcnden km-z mit “FolinAu-
Ein cminenter
dass zu jeder
dass
crwicscn
dicl zum mindesten den nachdcm dcr \I’cg dcr
FoliIi~Cu-Rlethode Aufmerksamkeit
bcdcutcnd haben geschcnkt
billigcr wir aber
kommt , sei nur ganz ncbenbci noch
aus
weitern
(iriinden
bemcrkt . unserc
1~
:
als yGlol)rli) Im I:\‘-J,icht zeigt .\ll)umin ein iiber 50”~, niedrigcres :\t~sorptionsm;lrimun~ lin ; nach der I~olil7-Cu-RJethc,de betr&igt diese Different nur noch etwa Lo’:,i,. \C’ir sind damit Ixdcutend unabhiingiger van dcr \-ariablen Znsammensetz~~ng dcr liiweisskomponcnten. ii) Das van ~CSTEIN UNII KREUTZ ieicht modifizierte Reagens ((‘itrat anstatt Pi‘artrat als IAsungspartnetvan CrlX? ,) ist iibcr lange Zeit haltbar. welche nach I~GST'EIN UKII JiREUTZ im iii) Im (;egcnsatz ;5ur Santhoproteil7methode, Vergleicll zur I
Ein L’ergleich dicser Licht, der Triibungsmessung ometrischen Stichproben Literatur S. 4Sr)/470
FolinPCn-Methode mit der STEGERSChen ?rlessung im UVnach Zugabe von SuIfosaIicyIs&re und cinigen kjeldahlsol1 uns nun erlauben, die einzelnen Ergebnisse gegenein-
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BESTIMMUNGDES GESAMTEIWEISSESIM LIQUoR
465
ander abwggend deren Exaktheit und Zuverlassigkeit zu beurteilen. Zur Eichung der verschiedenen Messkurven haben wir iibrigens weder Normalliquor, noch SerumeiWeiss-wie von STEGER resp. von EGGSTEIN UND KREUTZ vorgeschlagen-verwendet, sondern wir haben alle unsere Bestimmungen geeicht mit einem Gemisch aus reinen Albuminen und Globulinen, da es uns auf die Erfassung nicht nur relativer Werte, sondern absoluter vergleichbarer Quantitaten ankam. Und zwar haben wir die aus verschiedenen Literaturangaben $3I8723-26 zu errechnende durchschnittliche Zusammensetzung von 57% Albumin zu 43”k Globulin als Standard gew5hlt.
.
0 .
Fig. ea. Vergleich der Gesamteiweissbestimmung
nach ABELIN (Abszisse) und Folin-Cu (Ordinate).
. * d ...*. .
2
I ’
v
2b
40’
6’0
.
0‘0
.
fOd+
Fig. 6b. Vergleich der Gesamteiweissbestimmun~ nach ABELIN (Abszisse) fZHung (Ordinate). Literatur
S. 4691470
und S~~lfosalic~ls~ure-
Nach den Angabcn in dcr Arbcit van EGGSTEIN UND KHXIJZ besteht zwischcn der Folin~(‘u-Mcthocle und dcr kjeldahlometrischen Kestimmung des Liquoreiwcisscs einc rccht engc Korrelation. Durch cinc Rcihe von Stichproben habcn wir uns vorcrst iiberzeugt, dass dirsc Aussage zutrifft. Die Ergcbnisse, wclche in Fig. ha zusammcngestellt sind, bestiitigen die gutc I’ebereinstimmung der beiden Methoden, w&rend z.13. die Sulfosalic~lsliurc~f~llung tin Ccl ungiinstigercs Hild priisc~ntirrt (Fig. Obj.
Die \-ergleichbarcn Ergebnissc dieser beiden 13estimmungen sind in drr Fig. 7a zusammengestellt. Die relativ grosse Streuung, d.h. schlechte Korrelation dcr nach der modifizicrtc S,rec;er<-Methodc gewonnenen Wertc fsllt ins Auge, wie such der bcrcits weiter oben erwahntc Umstand, dass bei der direkten Messung in UV-Licht mcist doppelt his mehrfach so hohe Eiwcisswerte gefunden werden wit mit den iibrigen Mcthoden; die Griinde dafiir wurden im Abschnitt IC besprochcn. .4n dieser Stellr mag noch tier folgende, aufsclllussreiclle Versuch angefilhrt werden. Es hantlelt sich um I.iquorcs van A I’atienten, die gleichzeitig bei uns cintrafcn untl sofort in derselben Versuchsrcihe gemessen wurtlen. Nach der Folin-Cu-nlcthode wie anch nach SulfosalicylsBllref%llmng wiesen lxide L’ntienten, innerhalb jeder Methode miteinander verglichen, praktisch gleich hohe \\‘ertc a11f (‘fabellr IV). Sac11 tier modifizicrte STEcEK-~lethode jedoch wird im zwciten Fall
mehr als die doppelte Menge des crsten 1:allcs bestimmt, ganz abgesehcn van den absolut vicl zu hohen Zahlen. Dieser Hefund veranlasste uns, bei beiden Liquores das ganze .L\bsorptionsspektrlIm zwischen zoo-350 ml’ anfzanehmen. Ein ev. Fehler beim Einpipettieren w2re ja denkbar gewescn; dann hgttc sber such die r\bsorptionskurve iiber den ganzen Uereich doppelt so hohe Werte uric diejenige des Falles I licfern miissen. Im kleinwelligen Hereich (205~230 m,u) wax-en die beiden Extinktionen jedoch bis auf wenige l’rozente gleich gross, und zwar in einem Messbereich, wo dass LAMBERT-BEER’sche Gesetz noch weitgehend gilt (unterE = 2.0) Erst bei den hijhern \Vellenl%ngen strebten die Kurven znsehends auseinander und erreichten im Gebiet van 270 m,u ein Maximum der Differenz, welches sich nur urn weniges vcrmindert bis in den Bercich iiber 300 m/t hinzog. Daraus kann eindeutig geschlossen werden, dass es sich nicht urn einen methodischen Fehler bei der Messung, sondern urn eine ganz beachtliche StGrung van im Gebiet um 270 rn,~ such bei saurem pH stark absorbierenden, nicht-eiweissartigen Begleitstoffen handeln musste. Die .I\ngaben in Tabelle IV sind somit gesichcrt mnrl liefern ein weiteres B&spiel fiir die UnznverlSssigkeit der tlirekten Messung im CV-Licht. Ltttvduu s. &q/4 jn
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BESTIMMUNG
c. Folin-Cu-Methode
DES GESAMTEIWEISSES
IRI LIQUOR
467
und Sulfosalicylsaurefallung
Wie aus Fig. 7b ersichtlich, zeigt die Bestimmung mit Sulfosalicylsaure zwar eine betrachtliche Streuung und ist infolgedessen nicht als exakt zu werten. Die Werte fallen such im allgemeinen etwas zu tief aus; sie weisen aber dennoch eine eindeutigere Regression auf als die STEGER-Methode und lassen extrem herausstechende Unstim-
l
’
40
. 120
60
.
200
. 160
rho mQg
Fig, p. Vergleich der Gesamteiweissbestimmung nach Folin-Cu (Ordinate) und “modifiziertem STEGER” (Abszisse).
0
.
0
. 0 * .
. :
J :
. . f
. :
a
.
. Fig. 7b. Vergleich Literate
S. 46g/47o
26
40
6,J
&,
nach Folin-Cu der Gesamteiweissbestimmung sluref%llung (Abszisse).
’
md:
(Ordinate)
und Sulfosalicyl-
i$bS
II.
I~IHI)lill
1’.
\.( )I..
3 (1qys)
migkcitcn \.rrmissen. Wird die Ablesung des ‘Triibungsgradcs nicht wicxim vor licgendcn Falle durch Yergleich mit Standardkonzcntrationcn von Augc durchgefiihrt, sondern durch einc optische Mcssung crsetzt, so kann vermutlich noch cinigcs an Pr%zision gewonnen wcrdt>n ; such ziihkn win.
dann diirftc
~1. Sul~fsalic~lsiiurefi*‘llu~z~
wd
abrr dicse Mcthodc
modifizievte
nicht unter
dits lwstm
ZII
Steger-Methode
Ein Vergleich dieser beiden Methoden zeigt eine ausserordentlich schlechtc &!rcinstimmung der Ergebnissc (Fig. 8), was auf (;rund drr bisher mitgeteilten Korrcla-
.
. .
*...
. .
L l;ig. 8. Vergleich
tionen-bei
.
e . ..
29
, dcr
40
8b
.
(;esallrteiweissbestilnmung “modifiziertem
Annahme
120
160
nach STEGEK”
ao"PC
200
Suliosalicpls~inre~illung (Abszisse).
also, dass die Folin-Cu-Bestimmung
(Ordinate)
und
exalzt sei-naturgem&
ZLIcrwarten ist. Wiirde n5mlich die schlechte Ubereinstimmung in den Fig. 7a und 7b in erster Linie durch Fehler auf Seiten der Folin-Cu-Methode zustande kommcn, oder durch Begleitfaktoren bedingt sein, die sich in ghnlicher Weise auf die beiden andern Verfahren auswirkten, so w%re eine bessere Ubereinstimmung von SulfosalicylsBureund STEGER-Methode ohne weitercs gegeben. Das viillig ungeordnete Bild der Fig. 8 beweisst jedoch, dass dieser Einwand nicht zutrifft.
DISKUSSION
Eine iiberblick iiber die Gesamtheit der Ergebnisse fiihrt somit zur Feststellung, dass unter den hier gepriiften Methoden zur Bestimmung von Licluoreiweiss sich diejenige mit dem Folin-Cu-Reagens s fiir klinische Routineuntersuchungen eindeutig am besten bewghrt. Bei der Sulfosalicyls%uretriibung ist mit einer vie1 griisseren Streuung und mit gelegentlich ZLI tiefen Werten zu rechnen, w%hrend dir direkte Messung IAwtuY
S. _~hrj/qp
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im UV-Licht nach Ansguerung gem&s den Angaben von STEGER Anlass zu gefghrlichen Trugschliissen geben kann. Zugunsten der Folin-Cu-Methode fgllt ausser der grossen Exaktheit im Vergleich mit Kjeldahlbestimmungen such die gusserst geringe Liquormenge und der einfache Arbeitsgang ins Gewicht. Aus einer Serie von 32 Doppelbestimmungen berechnet sich die Standardabweichung des methodischen Fehlers zu c = ~_t0.0094 Extinktionseinheiten; dieser Betrag entspricht einer Eiweissmenge von 1.88 mg%. Setzt man den methodischen Streubereich mit & 2 g fest, so gelangt man zur Aussage, dass wir imstande sind, die Eiweissmenge und Unterschiede in deren Konzentration such dann noch messbar zu erfassen, wenn uns von der in Frage stehenden Fliissigkeit nur 0.1 ml, in welchem mindestens 3.8 y Eiweiss gel&t ist, zur Verfiigung steht. Unter diesen Bedingungen verdient die Folin-Cu-Methode, ganz besonders wo die Bestimmung von Eiweiss in hochverdtinnten Lijsungen im Vordergrund steht, vollste Beachtung. DANK Die vorliegende Arbeit konnte mit Unterstiitzung des E. Barell-Fonds durchgefiihrt werden, wofiir such an dieser Stelle bestens gedankt sei. Die exakte Aufnahme der vielen Extinktionskurven, sowie die Eiweissmessungen im UV-Licht und nach der Methode von EGGSTEIN UND KREUTZ verdanke ich der Mithilfe von Frgulein F. SCHMID. Die Kjeldahlbestimmungen wurden im Privatlaboratorium von Prof. ABELIN als Doppelanalysen durchgeftihrt. Die Werte der Sulfosalicyls$uremethode verdanken wir dem klin. Laboratorium der Heil- und Pflegeanstalt “Friedmatt”. ZUSAMMENFASSUNG In einer vergleichenden Untersuchung einiger Methoden zur Bestimmung van Eiweiss im Liquor (Kjeldahl, Sulfosalicyls%ure, Folin-Cu, direkte Messung im UV-Licht) hat sich die spektrophotometrische Folin-Cu-Methode wegen ihrer grossen Exaktheit und wegen der kleinen benijtigten Fliissigkeitsmengen als die fiir Routinebestimmungen geeignetste herausgestellt. Es wurden die Griinde untersucht und diskutiert, warum die direkte Messung im UV-Licht nicht als zuverltissig gelten kann. Die Inkonstanz des Nativliquors im Gebiete von 260-280 rnp und das Verschwinden der Kuppe bei 265 rnp nach AnsLuern konnte auf das Verhalten von Ascorbinsgure zuriickgefiihrt werden. SUMMARY Various methods of determining protein in cerebrospinal fluid were compared. Of the methods investigated (Kjeldahl, sulphosalicylic acid and Folin-copper methods, and direct measurement in UV light), the spectrophotometric Folin-copper method proved to be the most suitable for routine determinations, because of its high accuracy and the small amount of liquid required. An attempt was made find the reasons why direct measurement in UV light cannot be considered as reliable, and the results were discussed. It was possible to relate the lack of constancy of the extinction of fresh untreated spinal fluid in the region 260-280 mp, and the disappearance of the peak at 265 rnpLafter acidification, to the behaviour of ascorbic acid. LITERATUR I 2 3 4 5 6
W. NAGEL, Schweiz. med. Wochxhr., 20 (1939) 431. F. ROEDER, Die Cerebrospinal~iissigkeit, Springer-Verlag, Berlin, 1942. M. EGGSTEIN UND F. H. KREUTZ, Klin. Woch.schr., 33 (1955) 879. J. GLEISS UND K. HINSBERG, Arch. Kinderheilk., 139 (1950) 65. W. A. DEN HARTOG-JAGER UND J. FAHRENFORT,FO~~~ Psychiat. neerl., 55 (1952) 364, A. HOFMANN, Dissertation, Wiirzburg, 1956.
Im \~‘crlaufe unsertr ~~ntcrs~lcl~~~~~~(~nmit der l~~l~n-~ll-~~eth~d~ wurdr IWOhachtct, da.ss aus bisher noch nicht eruierbaren Griindcn gelcgentlich au& dcr Rlindwert cinc. Blauf~rl~ung aufweist. Es stellt sich die Frage, oh diese ISrscheimmg im Zusammenhang mit andcrn chemischen Reaktionen steht, die gleichzritig im seltxn Lahoratoriumsranm ausgefiihrt warden mussten (IXimpfe von (‘hrom:1 to~r~rnrncn und ~~)r~~l~itt~!ln ?)_ Auf allc I%lle lkinncn Eiwcisswertc, die gcgcn solchc Ihuc Hlindwertc gcmcssen werden, mit Fchlcrn his zu 20 mg”, behaftet scin : sic sind :/II climinicrcn und die Hcstimmung ist zu wicdcrholrn. 13inc Al~l&rung tlct i!rsachcn dicscr gt~lcgvntliclii~n “\‘ersag~r” ist im tkngf.