Trichinella spiralis: Facteurs immunitaires inhibiteurs de la production de larves

EXPERIMENTAL PARASITOLOGY 45, 42-54 (19%)

Ttichinella

spiralis:

Facteurs lmmunitaires Production de Larves

II. Premiere Analyse in Vitro des Facteurs Humoraux chez la Souris, le Rat, et le Miniporc Infest& ERIC JACQUELINE, ALAIN INSERM, V 42, Domaine du D’Ascq, Laboratoires de Me’dicine de Lille Parasitaire,

VERNES, DANIEL

inhibiteurs

de la

et Skcr6toires Actifs ou lmmunisks

Boor, ET JEAN BIGUET

CERTIA, 369 rue Jules Guesde, 59650 Villeneuve Parasitologic des Fact&s de Pharmacie et de et Service d’lmmunologie et de Biologie Institut Pasteur de Lille, France

(Accept& pour publication

le 15 Mars 1978)

JACQUELINE, E., VERNES, A., BOUT,D., ET BIGUET,J, 1978. Trichinek spirah: Facteurs immunitaires inhibiteurs de la production de larves. II. Premiere analyse in vitro des facteurs humoraux et secretoires actifs chez la souris, le rat, et le miniporc infest& ou immunis&. Experimental Parasitology 45, 42-54. L’efficacite in vitro de differents immun&rums de souris de rats et de miniporcs, vis B vis de la reduction de la production de larves de Trichinella spiralis, est Btudike. L’implication des Ig humorales et des Ig secret&es dans l’intestin gr&le est rapport&. Les serums et les secretions des animaux vaccines et efficacement proteges par l’antigene metabolique, sont inactifs in vitro. Par contre, les serums et les s&r&ions des animaux infest& experimentalement ou immunis& par de l’antigene somatique sont inhibiteurs de la production de larves. Au niveau des Ig seriques les plus actives sont les Ig M, puis les Ig G; les Ig A ont un role negligeable. Dans les secretions intestinales ce sont essentiellement les Ig A secretoires qui provoquent Pinhibition de la production. MOTS CLEFS: Nematode; Trichinella spiralis; Larves; Immunoglobulines; in vitro.

(Denham 1966). Cette immunite, chez ces souris reinfest&es, se traduit par une rB duction d’environ 90% du nombre de larves enkystees par rapport a des tkmoins. Par contre, si des souris sont reinfest&es par injection intra-veineuse de larves Ll, l’enkystement des larves n’est pas statistiquement different, ce qui montre que l’immunit& induite par les spades intestinaux est spkcifique de ces stades (James et Denham 1975). Chez la souris, trait&e par un serum antilymphocytaire, le rlombre de larves enkystkes est multiplik par 3 ou 4 tandis que le

Dans un travail preliminaire, nous avons mis en evidence in vitro l’action des facteurs immunitaires sur la production de larves de Trichinella spiralis chez la souris, les resultats obtenus confirmant et completant ceux de Despommier et a2. ( 1977). Les reactions immunologiques declenchees par les nematodes intestinaux sont induites d&s les premiers jours de l’infestation; en effet des souris chez lesquelles l’infestation par T. spiralis est interrompue le 4eme jour (par de la methyridine), presentent neanmoins une immunite notable 42 0014-4894/78/0451-0042$02.00/O Copyright 0 1978 by Academic Press, Inc. All rights OSreproduction in any form reserved.

T&hi&u

spiralis:

INHIBITELJRS DE LA PRODUCTION DE LARVJZS. II

nombre dad&es dans l’intestin est double (jusqu’a 30 jours aprb l’infestation) par rapport a des temoins trait& par du serum normal (Machnicka 1972). Chez les souris thymectomisees, T. spiralis provoque l’apparition d’anticorps T d&pendants et d’anticorps T independants (Ljungstrom et Ruitenberg 1974). En ce qui concerne la tinetique d’apparition des diff &rents an ticorps l’augmentation des globulines est plus prB coce et plus marquee chez la souris que chez le rat (Vernes et al. 1975). Cette augmentation interesse toutes les classes dimmunoglobulines seriques a savoir Ig Gl, Ig G2, Ig M, et Ig A avec un maximum 13 B 15 jours apres linfestation (sauf pour les Ig M qui continuent a augmenter), y compris pour les anticorps seoretoires intestinaux qui sont essentiellment des Ig A (Crandall et Crandall 1972). Chez des rats infest& par Nippostrongylus bras&en&s, des anticorps locaux (essentiellement Ig A secretoires) sont deceles des le 68me jour d’infestation alors que les anticorps seriques ne le sont qu’au 18bme jour (Poulain et al. 1976). A notre connaissance, un seul travail (Kwan 1971) a aborde le probleme de l’efficacitk des immunoglobulines seriques vis a vis de l’infestation; c’est pourquoi nous nous sommes attaches a l’ktude de l’incidence de l’immunit& humorale sur la production de larves de T. spiralis; cette production represente en effet une des &apes primordiales qui conditionne la gravite finale de la trichinose. MATERIELS ET MEXHODES

(A) Souche de Trichinella

spiralis

Obtenue en 1970 chez le Professeur Lamy a l’institut Pasteur de Paris et entretenue dans notre laboratoire par passage sur souris CBA et sur rat Wistar. (B) Animaux (1) Souris. Souris consanguines CBA exemptes d’organismes pathogbnes specifi-

43

ques ( CNRS, 45, Orleans La Source), hgkes d’environ 4 mois et pesant 20 Q 25 g. (2) Rats. Rats Wistar conventionnels kleves dans notre animalerie (a air filtre et condition&) et de 3 mois d’age environ ( origine CNRS ). (3) Miniporcs. Souche Pitmann Moore ages d’environ 4 mois et dun poids moyen de 10 kg (elevage Lessieux, 95710 Braye Lue). (C) Antigdnes (I) Antigdne “dtabolique.” Obtenu en faisant survivre pendant 24 hr a 37°C des larves musculaires, issues de rats infest& depuis un mois, dans du milieu 199 avec des antibiotiques (0.2 mg/ml de Streptomycine Specia et 100 U.I./ml de Specilline G Specia) . Apres elimination des larves par decantation, le milieu est dialyse 72 hr contre de l’eau du robinet (en ecoulement continu) et ensuite lyophylise (Vernes 1976). (2) Antigdne “total” somdque. Obtenu par broyage au Potter de larves musculaires issues de rats infest& depuis un mois, dans du NaCl l%o, puis centrifugation (8OOOg, 1 hr), dialyse du surnageant contre de l’eau et lyophilisation. (D) Infestation et lmmunisation des Animaux (1) Infestation. Les souris, les rats et les miniporcs sont infest& par canulation oesophagienne avec respectivement 200, 2000, et 5000 larves infestantes par animal (doses optimales pour notre souche et nos animaux). Ces larves sont obtenues par digestion chlorhydro-pepsique (3 hr a 37°C) de muscles de souris ou de rats primoinfestks depuis au moins 25 jours. (2) Immunisation. Souris: Elles reGoivent 1 mg dantigene par injection intraperiton&ale; l’antigene ktant diluk dans 0.1 ml de serum physioIogique et emulsionne dans 0.1 ml de Freund incomplet. Par voie orale l’antigene est simplement dilue dans du

44

JACQUELINE

NaCl 9;1/,,. Rats: par infestation oesophagiemre (2000 larves). Miniporcs: soit par infestation oesophagienne (5000 larves) soit par 50 a 150 mg d’antigene metabolique administre per OS. (E) Mcolte des S&wn.s lmmuns et des Immunoglobulines Les serums sont &colt& I3 ou I4 jours apres fimmunisation (ou l’infestation) chez les souris et les rats, temps au bout duquel on trouve le maximum d’arcs en immunoelectrophorese contre les antigenes correspondants. Chez les miniporcs les serums sont &colt& a J 30 (date de leur sacrifice pour une autre experience); ils possedent encore le maximum d’arcs de precipitations. Les secretions de l’intestin grele de souris ou de rats sont recoltees 7 a 11 jour apres I’immunisation (ou I’infestation) par lavage de la moitie anterieure du grele par du NaCl 9z’0; le gr&le est ensuite ouvert longitudinalement et mis en survie sur milieu 199 B 37°C pendant I5 hr. Apres centrifugation (5OOOg, 20 min), le serum physiologique de lavage et le milieu incubi! sont melanges et concentres sur membrane Amicon UM 10 jusqu’a l’obtention de 5 ml pour un grele de rat ou pour trois greles de souris. Les immunoglobulines seriques sont recolt&es par trois precipitations et centrifugations successives au sulfate d’ammonium a 45% de saturation et ensuite dissoutes dnns du NaCl 9%,. (F) Sbparation des Classes d’Immunoglobulines par des M#e’thodes Chromatographiques (1) Sbparation des Ig M et des Ig G. Elle est obtenue par chromatographie ascendante sur gel de SCphadex G-200 en tampon Tris (0.1 M) et NaCl (0.2 M) a pH 8 dans une colonne de 1 m de haut et 5 cm de diametre. Les depots sont de 3 Q 5 ml et les fractions obtenues sont ra-

ET

AL.

men&es par concentration sur membrane Amicon UM 10, au volume initial. (2) Isolement des Ig A se’riques ou se’cr&oires de souris ou de rats. Elles sont obtenues par chromatographie d’affinite sur colonne de gel de Sepharose active au CNBr (Pharmacia) sur lequel sont fixes 20 mg d’immunoglobulines anti Ig A de souris ou de rat par gramme de gel.1 Le temps de contact du serum et du gel est de 1 hr 30’. Le lavage de la colonne est effect& par du NaCl 0.5 M B un debit de 2 ml/hr. L’elution est faite au tampon glycine-HCl 0.2 M et NaCl 0.5 M, pH 2.8. L’eluat est enfin dialyse contre du tampon phosphate 0.1 M, pH 7.2 (24 hr) et ensuite contre du NaCl 9$& (24 hr). 11 est ramen au volume initial par concentration sur membrane Amicon UM 10. Trois millilitres de serum (ou de secretions) sont deposes sur une colonne de 20 ml de gel. La concentration en Ig A est appreciee par la mesure de la densite optique a 280 nm. (3) ContrSle des immunoglobulines. Les poids moleculaires des globulines s&par&es sur Sephadex G-200 sont control& en localisant les pits obtenus par rapport a ceux determines par des proteines calibrees ( Combithek, Boehringer). Chez le rat les fractions Ig M et Ig G sont control&es par immunoklectrophorese avec des anti Ig M (Bazin et aE. 1974) et des anti Ig G specifiques ( Laboratoire Cappel). Enfin les Ig A seriques ou secretoires sont mises en evidence et do&es selon la mkthode d’immunodiffusion radiale de Mancini (Laboratoire MeIoy) chez la souris. (G) Mise en Culture des Trichines Ad&es et Comptage des Larves Lf Produites Les trichines adultes sont r&colt&es chez le rat (deux ou trois rats par manipulation) 5 jours apres leur infestation grace a une 1 Anti Ig A de sow-is, laboratoire Cappel. Anti Ig A de rat: fournies par H. Bazin (voir bibliographie ) .

Trichirda

SpidS:

INHIBITEUBS

technique d&iv&e de la mkthode coprologique de Baerman: l’intestin grele est pr6 leve et ouvert longitudinalement, la decantation (1 hr avec agitation periodique) des trichines se fait a 37°C dans du milieu 199 Q travers un tamis, dans un entonnoir a robinet. Un pool de trichines adultes est ainsi constitue et les femelles peuvent &tre &pa&es des males a la loupe binoculaire. La mise en culture s’effectue sur milieu 199 dans des boites pour culture de cellules (Nuclon Delta 35 ml) contenant 10 ml de milieu. Le fond des boites est grave au prealable selon des traits longitudinaux et paralleles espacks de 2 mm permettant de compter les larves produites au microscope inverse saris interrompre les cultures. Les femelles de trichine sont ainsi mises en culture a raison de 30 a 50 par boite, chaque moyenne de production par femelle &ant effect&e sur deux ou trois boites selon le volume des recoltes. La culture dure 24 hr dans une etuve a 37 C dont l’atmosphere est continuellement renouvelee et saturke en humidite. (H) Calculs Statistiques Pour comparer les moyennes de production de larves des trichines femelles temoins TABLEAU

I

Comparaison de l’Efficacit6, sur la Production de Larves, des Immunisations de Souris par l’Antig8ne “MBtabolique” et l’Antig&ne “Total” de Trichinella spiralis Trois souris pm s&k

Nombre:moyen de larves PM Q (50 0 P&r she)

RBduction

Probabilithsb

(76)

-Thoins Immunes par Ag mt%abolique (1 mg il J-7) Immunes par Ag total (1 mg B J-7)

45.8 27.9

* 4.3 * 0.8

11.5 *

0.6

-39

P = 0.oa8

-74 -

P = 0.002

0 Souris inocuks & J (- 7) par 1 mg d’antighne, J 0 et sacrifi&?s h J 6. RBcolte des femelles et nlise 8ur milieu 199. b SW comparaison des moyennes.

infest&s 8. en culture

DE LA

PRODUCTION

DE LARVES.

II

45

et des trichines en experience, nous avons effect& le t test de Student-Fischer applique a la comparaison de deux moyennes. Nous avons ainsi associe, un coefficient de variation a chaque comparison de moyenne. Dans ces conditions il est generalement admis qu’une difference peut 6tre consider&e significative si la valeur de P est inferieure ou 6gale a 0.05. Cette valeur figure dans les tableaux de resultats afin de se rendre compte de leur degre de significativite. RESULTATS

Pour toutes les experiences nous avons appele J 0 (zero) le jour de l’infestation des animaux, J ( -x) (moins x) le jour dune manipulation effect&e X jours avant l’infestation et J y, y jours apres l’infestation. I. Comparaison 02s E ffets de Plmmunisation par PAntigdne “Mdtabolique” et par l’dntigdne “Total:” Expkrience in Vivo et in Vitro (A) Protocole Expkimental Deux lots de trois souris reqoivent a J ( -7) une injection intraperitoneale d’emulsion de Freund incomplet (0.1 ml) et de NaCl 9%, (0.1 ml) contenant 1 mg (par souris) d’antigene “metabolique” pour un lot, ou d’antigbne “total” pour I’autre lot.’ Trois autres souris (temoins) ne reGoivent que le Freund et le NaCl 9s0. A J 0 les 9 souris sont infest&es par 200 larves chacune et g J 7 les Trichindla spiralis adultes femelles sont denombrb (par lot de trois souris) et mis en culture 24 hr sur milieu 199. Les larves produites sont alors comptees. (B) R&dtats

(Tableau I)

(1) 125 femelles sont 6th rtkolt6es chez les souris temoins contre 93 chez les souris immunisees par l’antigene “metabolique” 2 Protkines: Ag total, 80%; Ag mbtabolique, traces. Azote total: Ag total, 9%; Ag m&abolique, 0.4ylL

46

JACQUELINE

TABLEAU Action

ET

AL.

II

in Vitro de Differents Immunserums de Souris sur la Production de Larves de Femelles de Trichinella spiralis Prelevees sur Souris B J 5

Immunserums

utilises

Nombre moyen de larves pondues par femelle en 24 hr de culture (60 0 par sdrie) Sur milieu 199 apres incubation des femelles (2 hr) dans l’immunserum

Sur milieu 199 contenant 10% d’immunserum

Sur milieu 199 temoin

68.6 * 2.5

70.7 * 2.9

Anti-antigene metabolique (immunisation per OS) Anti-antigene metabolique (immunisation ip)

77.3 + 18

Anti-antigene somatique (immunisation ip)

65.3 f

a Sur comparaison * Non significatif.

0.1

Probabilitesa

-3.1

P = 0.24 NS*

-1

P = 0.47

78.1 z!z 0.4

NS - 16.4

P = 0.0003

des moyennes.

et 33 chez les souris immunisees par l’antigene “total.” L’antigene “total” induit done une inhibition plus importante que l’antigene “mktabolique” vis a vis du development des larves en adultes. (2) L’immunisation par l’antigene “total” provoque une inhibition de production de larves ( -74% ) statistiquement significative (P = 0.002) vis A vis des temoins. Cette inhibition de production est nettement superieure a celle obtenue chez les T. spiralis femelles issues de souris immunisees par l’antigene “metabolique” (-39ojo), la difference de production entre ces deux lots de femelles &ant statistiquement tres significative: P = 0.0002. II. Action in Vitro de Di@rents Immunskums Anti-T. spiralis SW la Production de Larves des Femelles 3 (A) Immudrums

Reduction de la ponte (70) par rapport aux temoins

de Souris (Tableau II)

Nous avons test& dune part des serums anti-antigene “metabolique” et d’autre part 3 Pour ces experiences et pour toutes celles qui suivent nous avons utilise des femelles de T. spiralis pr&vees a J5 sur des rats primo-infest&s.

un serum anti-antigene “total,” ils donnent respectivement 5 et 15 arcs de precipitation en immunoelectrophorese. Ces serums ont et& &colt& sur des souris immunisees per OSou par voie intraperitoneale. Quelle que soit la voie d’administration de l’antigene “mdtabolique” les immunskrums correspondants ne determinent pas de reduction de production de larves statistiquement significative que cela soit apres incubation des femelles dans le serum (60 femelles dans 5 ml, 3 hr) ou par addition de serum au milieu. Par contre l’antigene somatique est a I’origine dun immunserum actif (par incubation) vis a vis de la production ( -16.4% de reduction) de faGon largement significative (P = 0.0003). (B) Zmmunse’rums de Miniporcs (Tableau IZZ) L’antigene “metabolique” (administre per OS) ne donne pas d’immunsQum actif vis a vis de la ponte. Chez un miniporc vaccine par ce m&me antigene puis infesti: un mois plus tard, l’immunserum recolte un mois apres l’infestation s’est avere plus efficace

Trichin&z

spiralis:

INHIBITEURS

DE

TABLEAU Action

in Tiitro de Differents Immunserums de Femelles de Trichinella

Immuns&nns

de pores 1

PRODUCTION

f

47

II

III

Nombre moyen de larves pondues par femelle en 24 h de “culture” (90 femelles par serie)

70

DE LARVES.

de Miniporcs (a J 30) sur la Production spiralis Prelevees sur Rat a J 50

Sur milieu 199 contenant du serum immun Vaccine per OS (antigene metabolique)

LA

Reduction ponte

(%I

de la

de Larves

Probabilitesb

par

rapport aux temoins

Sur milieu 199 (temoins)

7.P

72.6 f

1.1~

-3.7

P = 0.16 NS

Vaccine per OS puis infest6 1 mois plus tard

48.5 f

Infest4 depuis 1 mois

55.8 zt 0.3c

Infeste

60.5 f

depuis 1 mois

-10.9

P = 0.13 NS

70.2 zk 2.7”

-20.5

P = 0.0071

76.8 f

-21.3

P = 0.0030

54.4 f

5.6”

2.0d

l.lc

O.gd

a Voir Materiels et MBthodes. b Sur comparaison des moyennes. N.S., nonsignificatif. c Milieu 199 avec 10% de serum immun ou temoin. d Milieu 199 avec 20yo de serum immun ou temoin.

vis a vis de la production de larves (rkduction de 10.9% ) ; mais l’ecart type assez elevi: (*5,6) de la moyenne de ponte de femelles temoins fait que ce resultat n’est pas statistiquement significatif (p = 0.13). Par contre, un immunserum de miniporc infest& depuis un mois provoque des reductions de production t&s significative: 20.5% quand il est dilue a 10% dans le milieu 199 et -21.3% quand il est dilue a 20% dans le milieu. (C) Cinktique dAction d’lmmunse’rums de Rats R&ok& Entre le 6dme et b 13dme jour aprb Plnfestation (Tableau IV) Cette experience nous a permis de montrer que c’est 8 jours apres l’infes’tation que les immuns&ums sont les plus actifs mais qu’ils le sont d&s le G&me jour; chaque s&urn utilisi: &ant constituit dun pool de trois serums. Quelques &arts types trop elevks font que seul le serum rkcolti: a J 8 (et pratiquement aussi a J 11) provoque

une reduction statistiquement III.

de production significative.

de larves

Action in Vitro des Immunoglobulines Totales Anti-Trichine d.e Rat et de Miniporc ( Tableau V)

Nous avow prepare les immunoglobulines, par precipitation au sulfate Cammonium (pour kliminer en particulier l’albumine), a partir d’immunserums de rats et de miniporcs infest&s respectivement depuis 8 jours et un mois. Ces immunoglobulines comprennent uniquement des Ig G, Ig M et des Ig A (visualiskes en immunoklectrophorkse); ces immunoglobulines provoquent des reductions de production de larves qui vont de 20.6 a 32.6%; tous les resultats &ant statistiquement tres significatifs. Deux gaits sont a noter. Les immunoglobulines anti-trichines provoquent des reductions de production plus importantes que les immunserums correspondants sur-

48

JACQUELINE

ET

tout chez le miniporc: jusqu’a 32.6y0 de rhduction au lieu de 20.5% (Tableau III) ; aux m&mes concentrations (et notamment ?I 10% ) les immunoglobulines de miniporc sont plus inhibitrices que celles de rats.

d’Ig G (visualiskes en immunoklectrophor&se); le second correspond surtout aux Ig G mais aussi a des Ig A et ?I des traces d’Ig M. La partie supkieure du Tableau VI montre que la fraction contenant essentiellement des Ig M est nettement plus active ( -22.2% ) que celle contenant des Ig G ( -12.7% ); seule cette fraction Ig M donne un pourcentage de rkduction de production de larves statistiquement significatif (P = 0.050). Quant au s&urn total du m&me minipore infest&, il s’akre ici encore moins actif ( -137; ) que ses immunoglobulines &par&es.

IV. Actions comparbes des Ig A, Ig M, et Ig G Skriques de Miniporc et de Rats Infest& (Tableau VI) (A) Immunoglobulines

AL.

de Miniporc

Faute d’immunoglobulines anti Ig A spkcifique’s du port nous ne pouvions pas sB parer les Ig A en chromatographie d’affinit& Nous avons done simplement fraction& les immunoglobulines skriques sur gel de Sbphadex G-200. Nous avons ainsi obtenu deux pits (Fig. 1): le premier correspond essentiellement aux Ig M mais aussi j une partie des Ig A et des traces

(B) Immunoglobulines

de Rut

Grace a des anti-Ig A spkifiques nous avons pu &parer les Ig A skriques en

TABLEAU

IV

CinCt,ique d’Action in Vitro sur la Ponte des Trichinella spiralis, des SCrums Immuns du 68me au 13bme jour aprbs 1’Infestation par 2000 LarvesY Immuns~rums a 1

11Cduction de la ponte (%) par rapport, aux t irmoins

Nombre moyen de lnrves pondues par femelle en 24 hr de culture (75 femelles par skrie) Sur milieu 199 contenant lo%, de SI*

de Itat,

Prohal)ilitbs”

Sur milieu 199 cont.enant 10% de STC __~

---15.1

I’ = 0.17 NY

x7.2 zt 4.9

- 13.3

I’ = 0.10 NS

64.5 zk 5.3

84.0 zt 6.0

-23.2

I’ = 0.03

J9

s7.3 f

3.8

‘32.7 rt 8.9

-5.8

I’ = 0.27 NS

J 11

85.8 f

3.8

91.5 & 0.9

-6.2

I’ = 0.06 NS

J 12

74.5 f

2.5

78.4 f

3.0

-4.9

I

J 13

76.9 f

3.3

83.7 f

9.6

-8.1

I’ = 0.17 NS

J6

47.2 rt 8.2

55.6 f

57

75.6 i

8.1

58

6.8

a Les vers femelles sont prblevks sur rat,s & J 5. * SI, &rum immun. c ST, &rum tkmoin. d Sur comparaison des moyennes. N.S., nonsignificatif.

= 0.15 NS

Trichinella

spiralis:

INHIBITEURS

DE LA PRODUCTION

TABLEAU

DE LARVES.

II

49

V

Actions Globales in Vitro des Immunoglobulines de Rat (S&urns RBcoltks B J 8) et de Miniporc (skrums L J 30) Infest& Respectivement par 2000 et 5000 Larves de Trichinellu spiralis, SW la Production des Adultes Femelles Ig utilisees

Ig de rat

Concentrations dans le milieu 199’ (%)

10

Nombre moyen de larves par femelle en 24 hr de culture (60 femelles par s6rie) Sur milieu 199 contenant des Ig

ProbabiliW

TBmoins

48.1 zk 3.3 60.6 f

Ig de miniporc

Reduction de la ponte (%) par rapport aux tkmoins

-20.6

P = 0.0066

-29.3

P = 0.0073

3.@

20

42.8 f

6.3

10

58

f

4.7

86.2 f

8.3d

-32.6

P = 0.025

20

54.8 f

5.3

80.4 f

4.0d

-32

P = 0.014

a Les Ig sont remenkes au prkalable B la m&me concentration que dans le s&urn. b Sur comparaison des moyennes. c Milieu 199 seul. d Dans le milieu 199 avec des Ig tbmoins aux m&mes concentrations que les Ig immunes.

chromatographie d’affinitk, les autres immunoglobulines &ant ensuite fractionnkes sur SCphadex G-200. Nous obtenons alors un pit Ig M (avec des traces d’Ig G) et deux autres pits (au lieu d’un habituellement) qui se sont avQks, en immunoBlectrophorke, ne correspondre tous les deux qu’& des Ig G; il s’agit la saris doute d’un artkfact de manipulation (non retrouvk par la suite) et qui n’a d’ailleurs pas d’incidence notoire sur les kultats (Fig. 1). Ces kultats sont consign& dans la partie inf&ieure du Tableau VI: ils confirment Paction prkpond&ante des Ig M (-19.8% ) par rapport aux Ig G ( -12.6% et -16.2% ) et montrent le r81e nkgligeable joub par les Ig A skriques sur les productions des feL 2~encore, seule la fracmelles ( -3.7%). tion Ig M provoque une inhibition statistiquement significative: P = 0.035. Par ailleurs nous avons effect&, par immunodiffusion radiale, un dosage cinktique des Ig A kriques de souris primoinfestkes qui confirme quantitativement le fait que ces Ig A ne semblent jouer qu’un rBle n&

gligeable dans la trichinose. En effet cellesci n’augmentent que faiblement vers le 13kme jour aprks I’infestation par rapport aux tkmoins non infest& (0.53 mg/ml) : J 5: 0.51 mg/ml; J 11: 0.49 mg/ml; J 13: 0.59 mg/ml; J 19: 0.51 mg/ml. V. Action des S&r&ions lntestinales (Totales et Fractionne’es) de Souris et de Rats, lnfestb ou Zmmutish (Tableau VII) Quatre rksultats peuvent &tre extraits de ce tableau. (A) L’action des s&r&ions globales des souris et des rats tbmoins est nkgligeable: respectivement -1.8% et -6.7%, chiffres qui ne sont pas statistiquement significatifs. (B) Les &r&ions globales de souris et ,de rats infest& respectivement depuis 11 jours et 7 jours sont nettement plus actives (-11.3% et -25%); ces pourcentages sont statistiquement significatifs. (C) La presence des vers T. spirahs adultes dans l’intestin gr&le n’est pas indis-

50

JACQUELINE

pensable pour dCclencher l’apparition des s&r&ions actives puisque des souris, seulement immunisCes per 0s par l’antig&ne “total,” ont des &r&ions inhibitrices de la production de larves ( -11% ) de faGon significative. (D) Les Ig A s&r&oires semblent (quantitativement et qualitativement) constituer la majeure partie des globulines sCcr&es. En effet aprb leur extraction par chromatographie d’affinitk nous n’avons pas r&ssi g dktecter d’autres immunoglobulines sur Skphadex G-200. Qualitativement ces Ig A s6crCtoires se sont avkrkes actives vis a vis de la production de larves des T. s@raZis femelles a de faibles concentrations (de I5 ?t 24 pg/ml) aussi bien chez le rat ( - 13.170 ) que chez Ja souris ( -16.570 ) de faGon statistique-

ET

ment significative. Quant aux autres prot&nes (r&colt&es sur des rats B J 7), c’est B dire les s&&ions globales moins les Ig A sCcr&oires, leur faible activitB ( -6.7%) n’est pas significative. DISCUSSION

En ce qui concerne les deux antig&nes que nous avons ultilisks nous savons (Vernes et al. 1975; Vernes 1976) que l’antigkne “m6tabolique” administrC per OS induit, en l’absence apparente d’anticorps s&iques, une augmentation notable de I’HSR (hypersensibiliti: de type retard&e) qui conf&re aux souris et aux ports ainsi immunis& une protection (apprCcike en nombre de larves enkystCes) d&passant 99%. Malgrk cette absence d’anticorps SC-

TABLEAU Actions

Animaux

AL.

VI

Comparkes in v&o (sur la Production de Larves de Trichine!kz spirulis) des Ig A, Ig M, et Ig G Skriques de Miniporc et de Rats Infest& depuis Respectivement 30 et S joursa infest&

Fractions ut.iliskes (10% dans milieu 199)

Nombre moyen delarves pitr femelle en 24 hr de culture (90 femelles par sdrie) Milieu 199 contenant des SI ou des Igb

Miniporc infest4 depuis 1 mois

Rats infest& depuis 13 jours

S&um total

72.5 f

Ig M + k A

64.9 * 5.1

Ig G + Ig A

72.8 & 6.6

Ig A

61.5 f

Ig M

51.2 zk 2.6

Milieu 199 (t6moins)

0.5

REduetion de la ponte (%I par rapport aux tkmoins

-13 83.3 f

7.8

7.5

-22.2

Probabiiitis

P = 0.08 NS P = 0.050

- 12.7

P = 0.14 NS

-3.7

P = 0.13 NY P = 0.035

- 19.8 63.9 zt 8.6

IgGd

55.8 f

3.0

- 12.6

Ig Ge

53.5 f

1.2

- 16.2

P = 0.10 NS P = 0.055 NS

Q Les rats sont infest& par 2000 larves, les miniporcs par 5000. Les femelles sont prblevbes sur rats & J 5. b SI, s&urn immun. = Sur comparaison des moyennes. NS, non significatif. * Ler pie SW Skphadex G-200. * 2&e pit sur S6phadex G-200.

Trichindu

SpidiS:

INHJBITEURS

DE

TABLEAU

LA

PRODUCTION

DE LARVES.

51

II

VII

Action in Vitro (SW la Production de Larves) des Secretions Intestinales (Totales ou Fractionnees) de Souris et de Rats Infest&s ou Immunises par Trichinella spirulis depuis Respectivement 11 et 7 jours Animaux

utilises

Secretions ou fractions secretoires

Nombre moyen de larves par femelle en 24 hr de culture (75 femelles par serie) Milieu 199 contenant 10% des secretions ou d’Ig A secrktoires

Souris temoins

Secretions

globales

72.4 f

globales

65.4 f

1.4

Souris immunisees per 0s par Ag total

Secretions

globales

70.8 f

4.8

Rats temoins

Secretions

globales

74.4 f

9.4

Rats a J 7

S&r&ions

globales

Rats b J 7

Ig A sh (I50 rdbte) Autres secrCtionsc

59.5 f

2

75.3 f

0.2

2.2

79.6 f

2.3

79.4 f

7.1

P = 0.23 NS

-11.3

P = 0.020

-11

P = 0.050

-6.7

86.7 f 80.9 f

(%I par rapport aux temoins

-1.8 73.7 f

Secretions

Probabilites

Milieu 199 (temoins)

1.0

Souris a J 11

Reduction de la ponte

P = 0.24 NS

-25

P = 0.050

-13.1

P = 0.048

11.1

24.6

-6.7

P = 0.11 NS

Souris a J 7

Ig A S de souris (240 wzlbte)

0 Sur comparaison des moyennes. b Ig As : Ig A secretoires. c Globales sauf Ig A.

63.5 f

1.2

76.1 f

5.7

- 16.5

P = 0.044

NS, non significatif.

riques nous avons montre (experience “+nceps”) que in viva I’antigbne metabolique induit une reduction de production de larves statistiquement significative, peut-Btre consecutive a l’action des mecanismes cellulaires sur les femelles au niveau de la muqueuse intestinale. L’efficacitd de la “vaccination” par l’antigene” metabolique” pourrait resulter, dune part, dune inhibition partielle de la production de larves de Trichindla spiralis et d’autre part dun blocage, a un certain niveau, des larves Ll produites. Dennis & aI. (1970), Despommier ( 1971), et James et Denham

(1975) ont montre que les larves Ll ne sont ni immunogenes, ni sensibles aux reactions immunitaires de l’hote, du moins lorsqu’elles sont inject&es par voie intraveineuse. Elles sont alors retrouvees enkystkes dans les muscles pour une grande partie d’entre elles quel que soit le degrk d’immunite de l’hbte. 11 est done logique de penser que le blocage eventuel des larves Ll chez les souris vaccin&es devrait s’effectuer au niveau de la muqueuse intestinale avant que ces larves ne gagnent les espaces lymphatiques ou les veinules mesenthiques. 11 ne s’agit la encore que

52

JACQUELINE

ET

AL.

A % de

a

transmission 50. 1 A = 256

nm

60 -

A

b

X de transmission 5a ;i

h=256nm

60 .

70 -

100

3 Nombre de tubes

FIG. 1. (a) Ig totales de miniporc prima-infest8 depuis 30 jours par 5000 larves de Trichindu spiralis. (b) Ig (moins les Ig A) de rats primo-infest& depuis 8 jours par 2000 T. spiralis larves. (a et b) Fractionnement sur Skphadex G-200 aprks precipitations au sulfate d’ammonium.

dune hypothese que nous nous attachons actuellement A verifier. L’antigene somatique “total” inject6 par voie intraperitonkale (ou per OS) induit une montee des anticorps tres proche de celle provoquee par une primo-infestation (Crandall et Crandall 1972), ce qui explique vraisemblablement qu’il induise in viva une inhibition de production de larves nettement superieure A celle que dkclenche I’antigene “metabolique” (Tableau I). Nous avons retrouve in vitro (Tableau II) l’ac-

tion significative des serums anti-antigbne “somatique,” alors que les serums antiantigene “metabolique” sont inactifs; un m&me resultat est atteint avec des immunserums de port primo-infest& (Tableau III), les immuns&ums de ports “vaccines” par I’antigene ‘cmetabolique” s’averant inefficaces. La cinetique d:action, sur la production de larves des immunserums de rats primoinfest&, nous montre (Tableau IV) que l’efficacite est maximale a J 8; il est interes-

%&id?42

.S@dS:

INHIBITEURS DE LA PRODUCTION DE LARVES. II

sant de noter que c’est justement de J 6 a J 8 que les femelles produisent le plus; peut-ktre s’agit-il dune adaptation de la reponse immunitaire au cycle de la trichinose. Dans nos conditions exp&imentales les immunoglobulines immunes se sont a&&es plus actives que les serums totaux correspondants, notamment a la concentration de 20% dans le milieu de culture (Tableau V ) . Ce fait suggbre que les proteines et les elements organiques du serum jouent un role trophique efficace dans les metabolismes des femelles en culture, et .que cette action positive masque, en partie, l’activitk inhibitrice des immunskrums. Laude de l’action des diffkrentes classes d’immunoglobulines seriques (ou plus exactement des fractions t&s enrichies en ces diverses classes) (Tableau VI) m&e a la conclusion que seules les Ig M induisent une inhibition de production de larves statistiquement significative; les Ig G n’ont qu’une action mod&&e qui s’est aver&e, dans le cadre de nos experiences, non significative. Quant aux Ig A leur role semble negligeable. Ces r&hats confirment ceux de Kwan (1971) : des larves infestantes de T. spiralis incubees avec des Ig M antitrichines avant l’infestation, induisent une parasitose (appreciee par le nombre d’adultes et de larves musculaires) moindre ,que lorsqu’elles sont incubees avec des Ig G. Perrudet-Badoux et al. ( 1965), de son c&e, a obtenu des infestations du m&me ,ordre de grandeur chez deux lots de souris &nnCtiquement skctionnees; les unes pour leur forte production en anticorps sauf pour les Ig M, et les autres pour leur faible production en anticorps sauf egalement pour les Ig M. Ceci demontre indirectement le faible role joue par les immunoglobulines autres que Ies Ig M. 11 est enfin interessant de constater qu’au niveau des secrktions intestinales seule la fraction Ig A s’est aver&e active vis a vis de la production de larves Trichinella spiralis (Tableau VII) dans nos conditions ex-

53

perimentales. Nous apportons ainsi un argument nouveau aux travaux qui attribuent ,aux Ig A secrbtoires un role primordial dans l’immunite au tours de la trichinose (Crandall et Crandall (1972) ainsi qu’aux conclusions de Bazin et al. (1973) sur les reponses immunologiques induites par voie orale. 11n’est peut-&tre pas sans inter&t de noter que les deux anticorps les plus actifs ont une structure polymkrique: jusqu’a 15 S de constante de sedimentation pour les Ig A secrktoires et 19 S (pentamere) pour les Ig M skriques. Nous essaierons done, dans un proche avenir, de determiner si l’efficacite de ces anticorps depend effectivement de cette structure particuliere. L’action p&pond&-ante des Ig M au ,niveau du s&-urn, et des Ig A secr&oires au niveau de l’intestin g&e, nous incite a poursuivre nos recherches dans ces deux directions pour essayer d’elucider leur mecanisme d’action. REMERCIEMENTS Nous remercions Mme A. Wattez et Mr. D. Deslee pour leur prkcieuse collaboration technique. Ce travail a et& effect& dans la cadre du contrat INSERM CRL 75 5099. dr. A. Capron est directeur du Service d’Immunologie et de Biologie parasitaire, de PInstitut Pasteur de Lille.

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54

JACQUELINE

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