Ultra-microdosage automatique du calcium serique

VOL.

CLINICA CHIMICA ACTA

4 (1959)

ULTRA-MICRODOSAGE P.

AUTOMATIQUE CARTIEK

357

DU

CALCIUM

SERIQUE

ET J. CL&klENT-Ml?~R.X

fitablir avec rapidite et precision un ionogramme complet sur un faible volume de serum (en particulier chez le jeune enfant), est un probleme qui se pose frequemment. Or, si le sodium et le potassium sont dosables rapidement et sur de faibles volumes de serum, par photometric de flamme, le calcium et le magnesium necessitent habituellement dcs prelevements plus importants et des techniques delicates et longues, qui excluent de l’ionogramme, souvent demand6 d’urgence, le dosage de ces deux elCments. ITn autre probleme faisant intervenir les memes considerations s’est pose a nous dans le domaine de la recherche: la mesure de l’activite de preparations parathyroidiennes, par la determination des variations de la calcemie du rat thyro-parathyroidectomise. Le dosage du calcium serique par precipitation sous forme d’oxalate apres calcination, et dosage manganimetrique du precipite, constitue toujours la methode de reference’? %.Mais cette technique est laborieuse et necessite un volume important de serum (2 a 4 ml). La photometric de flamme n’est pas habituellemcnt employee, cn raison surtout de son manque de sensibilite et de specificite, qui entraine des corrections de mesure difficiles. Recemment, l’application a la micro-determination du calcium sanguin dcs proprietes complexantes de 1’EDTX (acide ethylene-diaminetetraacetique), ont represent6 un reel progres de simplicite et de rapidite. Les nombreuses techniques propo&es3-5 reposent sur la propriete de 1’EDTA de complexer tout le calcium present dans le serum (sous quelque for-me qu’il soit), dans un rapport equimoleculaire. La fin de la titration est apprecide par le virage d’un indicateur convenablement choisi qui change de teinte en presence ou en l’absence d’ions Caf2 libres. Les plus frequemment employ& de ces indicateurs sont : a. le Noir d’Eriochrome T, qui est stable, possede un virage franc, mais dose & la fois calcium et magnesium: de ce fait, le dosage &pare du magnesium devient obligatoire et rend la methode inutilisable pour le dosage direct de la calcemie6~ ‘; b. lakfzrrexi~e, qui, dans des conditions de pH determinees, est specifique du calcium (PH 12 environ). Mais cet indicateur presente de multiples inconvenients. Les maxima d’absorption des deux formes (libre et complexee) sont suffisamment d&ales, mais le virage d’une forme a l’autre est progressif et tres difficile a apprecier a l’teil. Cette imprecision du virage est am&liorCe par l’adjonction d’un colorant de contrastes et surtout par la mesure photometrique du virage. Nous avons propose un microdosage automatique derive de ce principe 9, dans lequel nous enregistrons la courbe de virage a une longueur d’onde 06 la diffCrence de densitk optique des deux formes est la plus marquee, au pH utilise. Cependant, nous avons abandonne cette technique en raison de l’instabilite de la murexide en solution. En effet, selon differents auteurs1°-13, et d’apres notre experience personnelle, la couleur n’est pas stable plus de 15 min et la solution de l’indicateur commence a se d&composer en 2 B 3 h. Cette coloration est egalement sensible aux variations de pH et l’emploi de la murexide a l’etat solide Bzbliographie p. 363

I’. C.\RTIER, J. CLgMENT-MkTRAL

358

voL. 4 (1959)

(habituellement diluee dans du chlorure de sodium pulverise), propose par BUCKI,EY~~-‘~ ne permet pas d’ajoutcr une quantite constante d’indicateur, a moins de s’astreindre a pcser le melange avant chaque dosage. c. Recemment, I)IEHL ET ~r.r.INc;HoE17 ont decrit un nouvel indicateur, produit de condensation de la fluorescdine et de l’acide imino-diacetiquc, qu’ils ont appele “Calce’ine”, sp&ifique du calcium. Cct indicatcur, d’unc rcmarquablc stabilite, vire du jaune-vert au brun a pH superieur a 12 quand tout le calcium de la solution est complex& En realitd, lc virage de la calceine cst egalement difhcile a apprecier visuellcment. ‘~IJCIXR~* et BARON’” ont preconise l’addition d’un colorant (thymolphtaleine) pour accuser le contrastc du virage, mais soulignent que des traces d’hemolyse modifient les colorations. Toutefois, il semble que la preparation de calceine de DIEHL ET ELLINGROE constitue un melange et I(GRHL ET \~YI~HAzOont rdalise la condensation de la fluorescdine et de l’acide imino-diacetique selon une autre methode : la calceme ainsiprepareene presenterait plus de virage dans les conditions du dosage compleximdtrique, mais une intense fluorescence qui dlsparait en l’absence d’ions Ca++; ce phenomene avait deja Cte signalezly 22. C’est cettc propriete dc la calceine que nous avons appliquee au microdosage du calcium serique, quc nous presentons dans ce travail, et qui nous permet d’effectuer avec une excellente precision le dosage direct du calcium sur un echantillon de serum inferieur a 0.1 ml.

TECHNIQUE I. Re’actifs

Toutcs les solutions sont prepaGes & l’eau bi-distillee et conservees dans des flacons en polyethylene. Les precautions requises dans les microdosages sont kvidemment respect&es et la verrerie, lavde au melange sulfo-chromique, est rincee a l’eau bi-distill&e. FaOH 0.25 S (&rck purissime) Solution &talon de cat&m ?I Ioopglml. (Dissoudre 0.2497 g de CaCO,)R.P.), s&h& 24 h a IOO’, dans un peu d’HC1 (R.P.) redistill& Chasser I’acide et le CO, a l’ebullition. Apres refroidissement, amener a un litre avec de l’eau bi-distill&e). Le titre est v&if% par la methode de CLARK ET COLLIP. Solution-m&e d’EDTd 0.1 &?: Dissoudre 37.21 g de Complexon 111 (se1 disodique de l’acide ethylenediamine-tetra-acetique) dans environ 600 ml d’eau. La solution est amenee & pH 10.5-11 avec NaOH N et completee a IOOOml avec de l’eau bidistillee. Solution d’EDT_4 0.01 Jf: Dilution au I/IO~ de la solution-mere Cal&&e* : Solution-mere p&par&e selon ANDERSCH~“. Dissoudre z g de CalcCine dans 25 ml de KaOH N et completer a 250 ml avec de l’eau bi-distillee. Nous utilisons une dilution dans I’eau bi-distillee au r/100, que nous prefhons preparer chaque jour (bien qu’elle soit stable pendant plusieurs jours). _+lnti-moussant: une solution d’octanol secondaire a 20:; dans l’alcool ethylique a 95”“. * G. Frederick l~iblio~rnphir

t). ,363

Smith

Chemical

Co., Colombus,

Ohio,

LJ.S.A.

VOL.

2.

4

(1959)

ULTRA-MICRODOSAGE

DU CALCIUM

SkRIQUE

359

Mate’riel Micropipettes

de

IO B

40 ,MIou micropipettes

automatiques

du type LASG-LEVY

(20 a IOO ~1). Tubes de polyethylene de 4 mm de diamlttre exterieur, baguettes de verre de m&me diametrc (utilises en cas de micro-prelevements chez le Rat). Fluorescimetre Photovolt Corporation (New York City), equipe d’un &ran primaire (Pr L- Hg 1-z-3) et d’un &ran secondaire interferentiel (Set = 520 m,u). Suiveur de Spot GraphiSpot Sefram relic au fluorescimetre. Pompe a aquarium, qui assure l’agitation dans la cuve par l’intermediaire

dune

aiguille

metallique.

Seringue

micrometrique

AGLA

(Burroughs \Vellcome and Co., Londres) dont le piston, entrain& par un micromoteur*, cst solidaire d’un contact qui inscrit les tours du palmer et par consequent les volumes d’EDTA verses (Fig. I). La seringue est reliee par un fin tube en polyethylene (diametrc I mm), it un tube capillaire qui plonge dans la cuve de mesure (cuvc de verre a 4 faces transparentes

r cm %:I cm). Le capillaire est solidaire de l’a’guille d’agitation

(Fig.

I).

IGg. T. blicroburette automatique et cuve de mcsure: (I) microseringue, (1) micromtitre AGLA, (3) contact, (4) moteur, (5) capillaire, (6) aircomprimC, (7) cuve verre I i I cm.

1. PrdlPvement du sang (Rat)

6

Le sang est preleve par section de la queue et immediatement

introduit

dans une

portion de tube de polyethylene dont l’extremitk a CtC &a&e. On recueille environ 0.5 ml et on ferme avec un petit morceau de baguette de verre l’extremite infhieurc. On centrifuge

immkdiatement.

On aspire ensuite avec une pipette

PASTEUR

un volume

de plasma que l’on depose sur une plaque a godets vaselinee. Tres rapidement, pour eviter l’evaporation, on prClPve avec une micropipette la quantite desiree et on effectue le dosage. 4. Dosage La courbe 0.25

N

de titrage

en prksence

du calcium

de Calceine

0.01 M (prealablement

titree

(introduit

trCs diluee),

par une solution

dans un grand

par une solution etalon

volume d’EDTA

de CaCl, a

IOO

&ml

de NaOH di-sodique dans les

m&mes conditions), est enregistree continuement a l’aide du suiveur de spot “GraphiSpot” relic au fluorescimetre (vitesse : 60 mm/min). L’aiguille amenant l’air cornprime plonge au fond de la cuve et le biseau est tour& vers le capillaire de la burette. Le debit est regle de man&e a obtenir une agitation vigoureuse pour melanger instantanement 1’EDTA verse : les bulles d’air ne g&rent habituellement pas l’enregistrement. * Sapmi, Iliblwgraphie

un tour/minute,

p. 363

sens in\-ersC.

P.CARTIER,

360

J. CL~~~ENT-~~~TR‘~L

VOL. 4

(I959)

En raison de la presence dans la soude, meme purissime, de traces de calcium que la sensihilite de la methode rend ddcelables, on determine la quantite d’EDTA necessaire pour faire virer la calceine en presence de soude (soit 3 ml NaOH 0.25 JV et 50 ~1 de solution diluee de calceine). L’etalonnage de I’EDTA est effect& en introduisant de 20 k IOO ~1 de la solution &talon de calcium. Le dosage du calcium serique est reali& dans Ies m&mcs conditions sur une prise d’essai de 20 A IOO ,~l (selon le volume disponible) en presence de quelques gout& d’anti-moussant. Les dosages sont effectues en double.

On ohtient ainsi les trois courbes de titrage correspondant a: temoin, etalon et serum a doser. Le debut du titrage est donne par l’inscription du signal qui est declanche en m&me tcmps que la rotation du moteur de la microhurctte; la fin par l’intersection entre la p‘artie ascendante et le plateau de la courbe. Le volume d’EDTA utilise pour complexer le calcium est donnk par l’abscisse de la courbe que l’on peut mesurer avec prckision. Soient 7‘ (temoin), E (Ca etalon), S (serum), les volumes d’EDTA verses (ou la valeur des absicsses en mm), la teneur en Ca dans la prise d’essai (exprimee en ,~g) est donnGe par l’expression : S T E _._ 7‘ x pg Ca dans E

La pente galvanometre,

de la courbe peut Ctre modifiee en agissant soit sur la sensibilitk du soit sur l’intensite de la IumiPre d’excitation de fluorescence. La Fig. z

A0.o

Fig. 2. Enregistrements des titrages croissantes d’une solution Btalon de calcium (IOO @g/ml) par l’EDT.4 CJ.OI M.

de =j concentrations 0

50

100

150

200 m 1

represente les enregistrements de 5 concentrations differentes de calcium Ctalon. La Fig. 3 montre la proportionnalite parfaite entre les volumes d’EDTA verses et les concentrations en calcium (rapport I/I du complexe EDTA-calcium). Nous l’avons v&i%% sur vingt courbes d’etalonnage. Sur la courbe superieure chaque mesure est figuree avec sa deviation standard. La courbe inferieure est deduite de la precedente en soustrayant la valeur du temoin. Bibliographic

Q. 363

VOL. 4 (1959) Le Tableau

ULTRA-MICRODOSAGE

I, qui rassemble

proposee et comparkes

Fig.

3.

DU CALCIUM

les valeurs

a celles obtenues

361

ShIQUE

des calcemies

do&es

par la methode de CLARK

par la technique

ET COLLIP

(moyenne

Courbesd'&&mnage.

de deux dosages), montre que les valeurs trouvees par fluorimetrie ne diff &rent pas de plus de zqb de celles fournies par la mdthode classique de CLARK ET COLLIP.

DISSCALCfMIES

COMPARAISON TECHNIQUE

FLUORIMhTRIQUE

I

100.0

L 3

97.4 106.0

(EXPRIdES ET PAR

EN LA

Xlg/l)

M6THODE

DIhERMIN~ES DE

CLARK

99.9 96.7 106.4

0.1 0.7 0.4

+ 0.1 +-r - 0.4

0.0

+(:

96.0

96.0

;

104.0 96.0

102.0 95.0

2.0 I.0

+2

;

ro0.q

100.0

0.4 1.0

-2

9

97.0 105.0

99.0 104.0

96.0

95.5

4

10

IT I.2

'3

I IS.0

III.0

94.0 85.5

94.0 86.0

PAR

LA

ET COLLIP

-t 0.4

I.0

iI

0.S

+ 0.5

2.0

--L

0.0 0.5

+ 0.5

0

InoJwlne =

1_ o.Yy'o

DISCUSSION

Sur IO echantillons

de 2 concentrations

avons effect&z le microdosage formule :

de la solution

et calcule la deviation

U=

&talon de calcium,

standard

dcs resultats

nous

scion la

~~. ~ /Z(x - my 11- I 1

(oti x est la valeur du dosage, m la moyenne de ces valeurs et n leur nombre), et les erreurs standard sur la moyenne et la difference des moyennes par les formules: Bihliographie

p. 36.3

I’. CARTIER,

362

J. CLkMENT-h&TRAL

II

T.-\BLI
(les rfkdtats

1)U

sent exprimks

VOL. 4 (19.59)

DOSAGE

en ~61d’EDTA

0.01 111)

~Woyenne

cr

S.Ii.111.

nz 1 2 S.6.

a s.1:. ‘16

50 ,ul sol. calcium TCmoin DiffCrence

16.39 3.2’

0.20 0.18

0.07 0.06 0.09

10.39 * 0.13 3.22 * 0.12 ‘3.17 1 o.r8

1.4

I 00 ~1

r9.70

0.60

0.10

~9.76 $ 0.4”

3.53 16.13

0.17

0.05 O.LI

3.53 zk 0.12 r&r3 & 0.42

‘3.17

sol. calcium

T6moin DiffCreIVX

I.6

Ces resultats nous montrtnt que, compte-tenu du faible volume du prelevement, la precision de la technique est excellente. Nous avons v&if% que les autre metaux du serum (plus specialement le fer) n’interferaient pas. L’addition de cyanure, recommandee par BUCI
III

INFLUENCE DU MAGNkSIUbl (les rksultats

sont exprimks

en mm)

0 0 40

24.5 121.5 0

0 0 60

60 80 80

30.4 0 30.4

IL0

91.5

40 60

30.4 0

59 90

100 IO0

0 30.4

‘50 I50

ILI

Enfin, l’hemolyse n’influence pratiquement pas le dosage, comme le montrent les resultats du Tableau IV, obtenus en ajoutant a un serum des volumes croissants d’un hemolysat centrifuge, prepare a partir de sang total.

lNFLUENCE

DE

L’HhlOLYSE

(LE

DOSAGE

(les r&ultats

2

0.00

2

0.05

2

0.10

2 ____._~ ISihliographie

p. 363

0.20 ~~~__

A kT,i

EFFECTUd

sent exprimbs

~_~

0.50 0.45 0.40 0.30

~

SUR

80

en mm)

~_~.

130 ‘31.7 129 I30

,d)

DU

MkLANGE

VOL.

4

(Igjg)

ULTRA-MICRODOSAGE

DU CALCIUM

SERIQUE

363

REMERCIEMENTS

Ce travail a pu &tre realise grace a une bourse d’Attache de Recherche attribuee al’un de nous (J. C.-M.) par 1’Institut National d’Hy@ne, que nous tenons a remercier.

La calceine constitue un excellent indicateur dans le dosage compleximetrique du calcium serique: indicateur specifique et stable. Par ailleurs, la disparition de sa fluorescence en l’absence d’ions Ca +* libres est infiniment plus sensible que la modification de sa coloration. Nous proposons un microdosage de la calcemie fond6 sur l’enregistrement automatique des variations de fluorescence de la calceinc, permettant d’apprecier la concentration en calcium sur un echantillon de serum inferieur a 0.1 ml (de 0.02 a 0.1 ml) avec une precision de - r.j”,,.

ULTRAMICRO

DETERMINATION

01; SERURI

CALCIUM

Calcein is an excellent indicator for the complexometric determination of serum calcium, since it is specific and stable. The disappearance of its fluorescence in the absence of calcium ions is, however, much more sensitive than the colour change. A micromethod for determining calcium in cases of calcaemia is proposed, in which the variation of the fluorescence of calcein is automatically recorded. M’ith this method it is possible to determine the calcium content in a sample of serum less than 0.1 ml (0.02-0.1 ml) with an accuracy of + 1.5:;~. BIBLIOGRAPHIE B. KRAMER ET F. F. TISDALL, J. Blot. Chem., 47 (1921) 475. E. P. CLARK ET J. B. COLLIP, Biol. Chem., 63 (1923) 461. F. W. FaLES, .I.Biol. Chem.. ~04 (‘953) 577. A.D. KENNY ET S.U.TOVERUD,.~~U~. Chem., ~6(1954) 1059. R. H. WILKINSON, J. Clin. Pathol., IO (1957) 126. A. E. SOBEL ET A. HANOK, Proc. Sot. Evptl. Biol. Med., 77 (1951) 737. 7 H. C. LEIFHEIT, J. Lab. Clin. Med., 47 (1956) 623. B G. MATTIOLI, A. PIERANGELI ET C. DE RUBERTIS, Boll. sot. ital. biol. sper., 33 (1957) 947. @ J. CLEMENT-METRAL ET P. CARTIER, Proc. 4th I?ltern. Congr Biochemistry, Vienna, 1958, 17-15, p. zoo. I11F. \V. DIGGINS, Amzlyst, 80 (1955) 401. I1 T. T. GORSUCH ET A. M. POSNER, Nature, 176 (1955) 268. I2 D. MENDELSOHN, S. .4frican J. Med. Sci., 21 (1956) 57. I3 hl. B. WILLIAM ET J. H. hlosER, .4naZ. Chem., 25 (1953) 1414. 14E.S.BUCKLEY,JR., J.G.GIBSON Andes T. R. BORTOLOTTI, J. Lab. Clin. Med., 38 (1951) 75~. I8 A. C. KIBRICK, M. Ross ET H. E. ROGERS, Proc. Sot. Exptl. Viol. Med., 81 (1952) 353. I6 I.J.GREENBLATT ET ~.HARTMAN, Anal. Chem., 23 (1951) 1708. I7 H.DIEHL ET J.L. ELLIXGBOE, Anal. Chem., 28 (Igjh) 882. I* B. RI. TUCKER. Analyst, 82 (1957) 284. I0 D. N. BARON ET J. i. BELL, Clin.Ch;m. Acta, 2 (1957) 327 z" 1. KGRBL ET F. HYDRA. Chem. tisty, 51 (1957) 14.57. 21 k.0. ASHBYET M. ROBERTS, J. Lab: C&z.-tied., 49 (1957)958. 22 I.M. BETT ET G. P. FRASER, Biochem. J., 68 (1958) 13 P. 23 iVI. C. SANZ, Cliw. Chem., 3 (1957) 406. 24M. A. ANDERSCH, J. l_ab. Clis. Med., 49 (1957) 486. 1 2 3 4 5 6

Reqr le 5 novembre

1958