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Une méthode de LC-MS entièrement automatisée pour la recherche et le dosage des stupéfiants
Toxicologie Analytique & Clinique (2018) 30, S53—S80
Disponible en ligne sur
ScienceDirect www.sciencedirect.com
CONGRÈS SFTA 2018
Posters夽 P1
Une méthode de LC-MS entièrement automatisée pour la recherche et le dosage des stupéfiants T. Robin 1 , S. Dulaurent 1 , S. El Balkhi 1 , F. Saint-Marcoux 1,2,∗ Service de pharmacologie, toxicologie et pharmacovigilance, CHU de Limoges, Limoges, France 2 Laboratoire de toxicologie, faculté de pharmacie, Limoges, France ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (F. Saint-Marcoux)
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Objectif Les méthodes de LC-MS pour la recherche et le dosage de xénobiotiques dans les matrices biologiques font usuellement appel à des préparations par extraction liquide—liquide, par extraction en phase solide (« off-line » ou « on-line ») ou par précipitation protéique (notamment avec des sels QuEChERS [1]). Quelle que soit l’approche, des étapes manuelles demeurent nécessaires. Dans cette étude, nous rapportons une méthode d’extraction entièrement automatisée et directement couplée à un système de LC-MS, pour le dosage d’amphétamines, de cocaïniques et d’opiacés dans le sang. Méthodes Quarante-deux molécules (et 20 étalons internes deutérés ; EI) parmi lesquelles des dérivés amphétaminiques, cocaïniques et opiacés sont incluses dans la méthode. L’extraction est ® réalisée par un automate (CLAM 2000 ; Shimadzu ) directement couplé à une chaîne LC-MS (pompes LC-30 AD/Nexera X2, passeur automatique SIL-30 AC-MP, triple quadripôle LC-MS-8060 ; ® Shimadzu ). La séparation chromatographique est effectuée par ® une colonne Raptor biphenyl (100 × 2,1 mm ; Restek ). L’acquisition spectrale se fait en mode électrospray (ionisation positive) avec jusqu’à 15 transitions suivies par molécule, à des énergies de collision optimisées (option MRM spectrum). Résultats Après avoir déposé le tube primaire dans l’automate, 50 L de sang ou plasma sont pipetés et délivrés dans un tube
夽 Note du rédacteur en chef : l’ensemble de ces résumés a été validé par le conseil scientifique de la SFTA. Chaque auteur est responsable de ses écrits. Ils ne constituent pas un endossement de la SFTA ni du comité éditorial du journal.
2352-0078/
contenant un filtre (PTFE ; pores de 0,45 m) qui est au préalable conditionné avec 20 L de méthanol, puis 10 L d’une solution contenant les EI, et 100 L d’acétonitrile sont ajoutés. Après agitation, le mélange est aspiré à travers le filtre et 3 L sont injectés. Au total, extraction (9 min) et temps chromatographique (séparation en 9 min + 9 min d’équilibration) étant réalisées en parallèle, 18 minutes sont nécessaires pour obtenir les premiers résultats d’une série. La méthode a été validée selon les exigences de la norme ISO 15189 (répétabilité, reproductibilité, effets matrices, rendements d’extraction, accord entre matrices). En fonction des molécules, les limites de détection et de quantification sont de 1, 2,5 ou 5 g/L. L’acquisition en mode MRM spectrum (dwell time compris entre 3 et 10 ms et pause time de 1 ms permettant un temps de cycle inférieur à 1 s) ne montre aucune perte de sensibilité par rapport à une acquisition MRM traditionnelle (3 transitions par molécule). Une étude de stabilité a montré que les courbes de calibration pouvaient assurer une précision supérieure à 80 % pendant au moins 1 mois. Les performances de cette méthode ont été comparées à celles d’une méthode LC-MS utilisant des sels QuEChERS [1] pour un échantillon de 43 prélèvements issus de patients : 76 molécules ont été détectées, chacune par les 2 méthodes, et une analyse de régression a rapporté un r2 de 0,98 entre les 2 méthodes. Conclusion Nous rapportons une méthode de LC-MS avec une extraction entièrement automatisée permettant le dosage de stupéfiants dans le sang ou le plasma. Elle permet de diminuer le temps opérateur et d’accélérer très significativement les délais de rendu de résultats. Déclaration de liens d’intérêt T. Robin perc ¸oit une bourse de thèse financée par Shimadzu France. Référence [1] Dulaurent S, et al. QuEChERS sample preparation prior to LC-MS/MS determination of opiates, amphetamines, and cocaine metabolites in whole blood. Anal Bioanal Chem 2016;408:1467—74. https://doi.org/10.1016/j.toxac.2018.04.067
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CONGRÈS SFTA 2018
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Une méthode de LC-MS entièrement automatisée pour la recherche et le dosage des stupéfiants T. Robin 1 , S. Dulaurent 1 , S. El Balkhi 1 , F. Saint-Marcoux 1,2,∗ Service de pharmacologie, toxicologie et pharmacovigilance, CHU de Limoges, Limoges, France 2 Laboratoire de toxicologie, faculté de pharmacie, Limoges, France ∗ Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (F. Saint-Marcoux)
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Objectif Les méthodes de LC-MS pour la recherche et le dosage de xénobiotiques dans les matrices biologiques font usuellement appel à des préparations par extraction liquide—liquide, par extraction en phase solide (« off-line » ou « on-line ») ou par précipitation protéique (notamment avec des sels QuEChERS [1]). Quelle que soit l’approche, des étapes manuelles demeurent nécessaires. Dans cette étude, nous rapportons une méthode d’extraction entièrement automatisée et directement couplée à un système de LC-MS, pour le dosage d’amphétamines, de cocaïniques et d’opiacés dans le sang. Méthodes Quarante-deux molécules (et 20 étalons internes deutérés ; EI) parmi lesquelles des dérivés amphétaminiques, cocaïniques et opiacés sont incluses dans la méthode. L’extraction est ® réalisée par un automate (CLAM 2000 ; Shimadzu ) directement couplé à une chaîne LC-MS (pompes LC-30 AD/Nexera X2, passeur automatique SIL-30 AC-MP, triple quadripôle LC-MS-8060 ; ® Shimadzu ). La séparation chromatographique est effectuée par ® une colonne Raptor biphenyl (100 × 2,1 mm ; Restek ). L’acquisition spectrale se fait en mode électrospray (ionisation positive) avec jusqu’à 15 transitions suivies par molécule, à des énergies de collision optimisées (option MRM spectrum). Résultats Après avoir déposé le tube primaire dans l’automate, 50 L de sang ou plasma sont pipetés et délivrés dans un tube
夽 Note du rédacteur en chef : l’ensemble de ces résumés a été validé par le conseil scientifique de la SFTA. Chaque auteur est responsable de ses écrits. Ils ne constituent pas un endossement de la SFTA ni du comité éditorial du journal.
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contenant un filtre (PTFE ; pores de 0,45 m) qui est au préalable conditionné avec 20 L de méthanol, puis 10 L d’une solution contenant les EI, et 100 L d’acétonitrile sont ajoutés. Après agitation, le mélange est aspiré à travers le filtre et 3 L sont injectés. Au total, extraction (9 min) et temps chromatographique (séparation en 9 min + 9 min d’équilibration) étant réalisées en parallèle, 18 minutes sont nécessaires pour obtenir les premiers résultats d’une série. La méthode a été validée selon les exigences de la norme ISO 15189 (répétabilité, reproductibilité, effets matrices, rendements d’extraction, accord entre matrices). En fonction des molécules, les limites de détection et de quantification sont de 1, 2,5 ou 5 g/L. L’acquisition en mode MRM spectrum (dwell time compris entre 3 et 10 ms et pause time de 1 ms permettant un temps de cycle inférieur à 1 s) ne montre aucune perte de sensibilité par rapport à une acquisition MRM traditionnelle (3 transitions par molécule). Une étude de stabilité a montré que les courbes de calibration pouvaient assurer une précision supérieure à 80 % pendant au moins 1 mois. Les performances de cette méthode ont été comparées à celles d’une méthode LC-MS utilisant des sels QuEChERS [1] pour un échantillon de 43 prélèvements issus de patients : 76 molécules ont été détectées, chacune par les 2 méthodes, et une analyse de régression a rapporté un r2 de 0,98 entre les 2 méthodes. Conclusion Nous rapportons une méthode de LC-MS avec une extraction entièrement automatisée permettant le dosage de stupéfiants dans le sang ou le plasma. Elle permet de diminuer le temps opérateur et d’accélérer très significativement les délais de rendu de résultats. Déclaration de liens d’intérêt T. Robin perc ¸oit une bourse de thèse financée par Shimadzu France. Référence [1] Dulaurent S, et al. QuEChERS sample preparation prior to LC-MS/MS determination of opiates, amphetamines, and cocaine metabolites in whole blood. Anal Bioanal Chem 2016;408:1467—74. https://doi.org/10.1016/j.toxac.2018.04.067