Une nouvelle méthode de détection de la galactosémie congénitale

CLINICACHIMICAACTA

UNE

NOUVELLE

437

MfiTHODE DE DBTECTION

DE LA GALACTOSl?MIE CONGENITALE E. EGGERMONT*

ET

H. G.

HERS

Laboratoire de Chimie Physiologique, Univevsitd de Louvain (Belgique)

Louvain,

(Re$u le 31 aoat, 1961)

La galactoskmie congenitale est une affection hereditaire consistant en une intolerance tres grave vis-a-vis du galactose et due a une absence de galactose-phosphate-uridylyle-transferase dans les tissus I. Le diagnostic precoce de l’affection rev&t une importance particuliere du fait que les sujets atteints ne peuvent se developper normalement que si le galactose est supprime de leur alimentation diis le plus jeune age. Ce diagnostic est generalement base sur l’existence d’une galactosurie. La certitude n’est cependant obtenue que par le dosage de l’activite de l’uridylyle-transferase dans les globules rouges2 ou encore en mesurant l’accumulation de galactose-Iphosphate dans les Crythrocytes incubes in vitro en presence de galactose3. La complexite technique de ces methodes associee a la raretd de l’affection rendent souhaitable que ces analyses soient centraliskes par quelques laboratoires specialises. La methode que nous decrivons ici est basee sur le dosage du 14C0, forme par les erythrocytes a partir de galactose-I-14C et releve done d’un laboratoire CquipC pour la mesure de la radioactivite. Elle est cependant a la portee de tous les pediatres grace au fait que le materiel a analyser peut &tre expedie, m&me a grande distance, sans precautions particulieres. Ce travail a fait l’objet d’une publication prCliminaire4. Une methode analogue a la n8tre a Cte developpee independamment par WEINBERG et ak5 qui en ont recemment fait un bref compte-rendu. PRINCIPE Contrairement aux globules rouges normaux, les globules rouges provenant de sujets galactodmiques ne forment pas ou forment extremement peu de 14C0, aux depens du galactose-r-14C en presence de bleu de methylene. On sait que tout le CO, forme aux depens du glucose dans ces conditions provient t&s preferentiellement du carbone I de l’hexoses, et est done dQ a l’activite du cycle des pentoses-phosphates. 11 en va de m&me de l’oxydation du galactose qui est prealablement transforme en glucose-6-phosphate par une suite de reactions faisant intervenir l’uridylyle-transferase et qui n’a done pas lieu chez les galactosemiques. L’ensemble de ces transformations est represente a la Fig. I. Nous avons utilid notre methode de facon quantitative, ayant en vue la detection des heterozygotes porteurs de 1’hCrCditCgalactosemique. Nous en avons aussi utilise une variante semi-quantitative pour usage clinique et dont la precision suffit largement a la detection de la galactosemie congenitale. * Aspirant

du FNRS. Clic Chim. Acta, f (1962) 437-442

438

E. EGGERMONT, H. G, HERS DESCRIPTION

DE LA MkTHODE ET RlkWLTATS

Le sang est recueilli sur heparine; les globules rouges sont isol& par centrifugation et laves B 3 reprises dans 5 fois leut volume de NaCl o.rg M puis resuspendus dans I fois leur volume de la mCme solution saline. 0.2 ml de cette suspension (globules 112) est ajoute A un mklange comprenant 5 pmoles de tampon phosphate PH 7.4, 0.1 pmole de bleu de mCthyl&ne et 0.1 PC de galactose-r-W (o.12 pmole) ou 0~07 PC de gfucose-I:-14Cf2.z pmoles), k volume total &ant de 0.6 ml et le milieu &ant maintenu isotonique par la presence de NaCl. Dans certains cas nous ajoutons I pmole de glucose non radioactif au melange contenant le galactose-r-*X. Ces diffkrents mB GALACTOSE

GL!JCOSE

GALACTOSE

-!-

PHOSPHATE

ATP

ADP GLUCOSE

GLVCOSE

RlBUiOSE

- 6-

- I-

PHOSPWATE

PHOSPHATE

%

02

- 5 - PZ-ICYWHATE

I

=02

Fig. r. RBactions intervenant dans I’oxydation du glucose et du galactose par les globules rouges en pr&ence de bleu de m&hyl&ne, Nous utilisons les abr&iations suivantes :ATP pour adCnosinetriphosphate; ADP pour ad&no&e-&phosphate, UTP pour uridine-triphosphate. UDPG pour uridinediphosphoglucose; UDPGal pour uridinediphosphogalactose; TPN” et TPNH pour les formes oxy&e et r6duite du triphosphopyridinenucldotide; MB et MBK, pour les formes oxydke et rkduite du bleu de mCthyl&ne.

fanges sont incub& A 37” avec agitation pendant I h dans des iides coniques &-m&s par une membrane perforable et munles d’un compartiment s&par&contenant I mTde NaOH I IV, NaHCO, 0.1 N. La reaction est arretee par injection de I ml de H,SO, I IV. Une heure plus tard, on recueille la soude carbonatee dans un exces de BaCl, et on la neutral&e par HCl jusqu’a dkoloration de la ph&rolphtal&ne. Qn isole le pritcipitk de BaCO, par centrifugation, on le lave 3 fois dans de l’eau distillee. puis on en determine la radioactivite spkifique. Nous avons rassemblk au Tableau 6 les resultats que nous avons obtenus par cette mkthode chez un certain nombre de sujets normaux et dans quelques familles de galactosemiques. Les sujets se &parent en deux groupes tres distincts selon la vitesse zi IaqueUe ils oxydent le galactose. Nous classons comme galactoskniques ceux dont les globules rouges ne forment qu’une petite quantitk de %O, aux d&pens du galactose-1 J4C. L’oxydation du galactose par les erythrocytes des parents de galactosdmiques est plus lente que normalement fP < ox); la dispersion des r&AC&n, Chk.

d&z, 7 (1~62)

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TABLEAU I OXYDKrloN DU GLUCOSE ET DU GALACTOSE FAR %&THODH

I. Sujets mm suspects de galuctasth~e E.E. 30 ans-le 25.x0.60 -1e 3 .x1.60 -1e x0.11.60 -1er6.rx.60 E.G. 20 ans-le ro.rr.6a -1e 22.11.60 Moyenne de 36 adultes ( j, &art-type)

If.

.%j&

ne, sang cordon ne, sang cordon jours mois

~~~~~~~

?&RYTHROCVTES

Activitd sptfcifique du &CO, ~~~s~~~~~~~~ &tea aux d&en-s ds Gakzctose-x-lC ____~.______ Ghxse-x-W -I-Glucose --Glucose

sujets

Nouveau Nouveau Enfant 8 Enfant 8

LES

QUANTITATNE

r7o -

250

28”

238 137 166 XQ.3& 40

-

-

-

89 1.50 145

138 220 190

Diagmxtk

210 1.58

130 156 92 98 128 zk 37 58 102

120

80

rr6 128 440

III

78 128 I12 120

108 111 -

94 92 224

Galactos6mique

-

rgr 196 vi.5

124 154 243

Galactos6mique

-

202

213 4 2

1.54 172 190 348

Galactos&mique Galacto&mique

-

232 223 259 338 25

=9* 206 246

Galacto&mique

-

158 144 -

120 236 -

GZllaCtOSb.miqUCf

62

rt des fl%?r&CS4%~a~~s~~~~s

Famille Ley. P&e 44 ans Mere 42 ans Enfant IO ans Enfant 8 ana Enfant 6 ans Enfant 4 ans Enfant I jour Famille Dri. P&-e 38 ans Mere 37 aus Enfant 6 mois * Famille Leg. P&e Mere Enfant * Famille Sme. P&e 49 ans Mere 42 ans Enfant 5 ans* Enfant I aus* Famiile Van Ro. P&e 37 an++ Mere 38 ans Enfant 7 ans Enfant 6ans Enfant 2 ana* Famille Fra. P&e 35 ans Mere 35 ans Enfant 9 mois Famille V. d. M. P&e Mere Enfant 9 ans Enfant 6 ans Enfant z ans Enfant 6 rnois Familfe Em. P&e Mere Enfant 3 mois Moyenue des 16 parents (+ &cart-type) Moyenne de 6 enfants galact~~miqu~~ (i &art-type)

7r 82 82 0 0 0

370 66 64 0.8

242 210

-

165 129 r96 189 2.5 240

:;Tp” 157 146 218 188

-

228

184

-

200 I%5 uo(;t 46)

8.66 * 9.7

G~acto~~m~qne Galacto&mique GalactosAmique

(voir tableau

II

Galactoskmique

180 Galactosemique 368 152 (-I:SO) 269 (4~ 72)

* Absence d’uridyfyfe-transf~rrase dknentree par la methode d'ANDERSmi etaka. L’etude clinique a et6 faite par le Professeur P. DENYS (Louvain) pour les familles Ley., Dri. et Em.; par le Professeur M. LELONG (Paris) pour la famille Leg.; par le Dr. W. TEGELAERS (Eindhoven) pour les familtes Sme. et Van Ro,; par le Dr. L. PHIL~PPART (Verviers) pour la famille Fra.; par ie Dr. H. A. C. SCHAAF (Rotterdam) pour la famille V, d. M. Cl&r. Chira. A&, 7 jxg6zf 437-442

W. EGGERMONT, H. G. HERS

440

tats est cependant trop grande que pour permettre la dCtection des hCtQozygotes par cette mbthode. Une assez grande variabilitk est Cgalement observCe dans la vitesse d’oxydation du galactose et m&me du glucose par les sujets normaux et aussi chez un m6me sujet d’un jour 2. l’autre. La prCsence de glucose a un effet favorable sur l’oxydation du galactose et il existe un certain degr& de corrClation entre les vitesses d’oxydation des deux hexoses (Y = 0.6 pour les &-ythrocytes normaux, l’oxydation du galactose &ant rCalisCeen prCsence de glucose). L’oxydation du glucose par les &ythrocytes de galacto&miques est nettement accC1CrCe.La m&me tendance s’observe chez les parents, mais ici la diffCrence n’est pas statistiquement significative. fiour usage clinique

MWhode semi-quantitative

Nous avons plusieurs fois mis notre mCthode B la disposition de pCdiatres belges et &rangers en procCdant de la faqon suivante : nous leur envoyons trois petits tlacons fermCs par une membrane en caoutchouc perforable (bouteilles & pknicilline); le premier contient le mClange de galactose-I-14C, de bleu de mCthyl&ne et de tampon phosphate ainsi que IO ,ug de chloramph&nicol, de kanamycine, de colimycine et de nystatine dans un volume total de 0.05 ml; le deuxibme contient un m6lange analogue mais oti le galactose-I-14C est remplack par le glucose-I-14C, tandis que le troisi&me conGent de la soude caustique I N. Le pitdiatre lave les globules rouges de son malade et injecte I ml? de globules tassks (I/I) dans chacun des deux premiers flacons. Apres une courte agitation, il laisse les deux flacons reposer ?t tempbrature de la chambre pendant I h, puis il injecte I ml de soude caustique dans chacun d’eux et nous les renvoie. Nous rCgitnCronsle CO, radioactif par addition de H2S04, le recueillons dans la soude carbonaGe comme dkcrit plus haut et l’isolons sous forme de BaCO, dont nous dkterminons la radioactivith spkcifique. Les rksultats obtenus par cette mitthode sont rassemblCs au Tableau II. TABLEAU OXYDATION DU Sujets

II

GALACTOSE ET DU GLUCOSE PAR LES ~RYTHROCYTES MkTHODE SEMI QUANTITATIVE ~_____~_._ .___ Radioactivite' spe’cifique * du B&O3 Diagnostic

(en coups/min/mg) obtenu aux d&ens de Galactose-I-14C Glucose-z-14C V. de M., T.,** I mois V. de M., G.,** I jour Hyp. M. T.,*** I mois Fra. M., sang du cordon** Tre. P.,**** 5 mois

Galactoskmique Normal GalactosBmique GalactosCmique Galactoskmique

-

0.8

530 354 430 430

670 8.5 2.3 82

* Tous les essais ont 6t6 r6alis6s avec I ml de globules rouges. ** M&me sujet qu’au Tableau I. *** Malade du Dr. E. FRIEDRICH (Strasbourg). **** Malade du Prof. R. FRANFOIS (Lyon). A re$u 225 ml de sang &ranger au tours des 3 semaines prkkdant l’analyse. La radioactivite mesurke est done compatible avec le diagnostic de galactosCmie. DISCUSSION

La mkthode tale dans

que nous

la mesure

oh sont

t Nous avons rkemment 0.1 ml de sang complet.

proposons

permet

vCrifiCs les trois ramen

un diagnostic postulats

de galactoskmie

conghni-

suivants:

cette quantitb & 0.5 ml et avons parfois

Clin. Chim. A&,

procBd6 avec

7

(xg62)437-442

DETECTIONDE LA GALACTOSEMIE CONGENITALE

441

(I) L’absence d’uridylyle-transferase est la seule lesion enzymatique qui puisse empecher l’oxydation du galactose dans les globules rouges. Notons que la seule autre deficience connue est l’insuffisance de glucose-6-phosphate-deshydrogenase qui caract&rise certaines anemies hemolytiques medicamenteuses’. Cette deficience n’est cependant que partielle et serait reconnue par une diminution parallele de l’oxydation du glucose et du galactose. Rappelons aussi qu’une absence de galactokinase a Cte observee par KURAHASHI~chez certains mutants d’Escherichia coli. (2) En l’absence d’uridylyle-transferase, les globules rouges ne disposent pas dune autre voie metabolique qui, suite par exemple a un phenomene adaptatif, pourrait compenser l’insuffisance de la voie principale. On sait notamment qU’1SSELBACHERf~ a decrit une UDP-galactose-pyrophosphorylase qui forme directement de l’UDPgalactose a partir de galactose-x-phosphate et d’UTP. La lente oxydation du galactose par les erythrocytes des sujets galactosemiques peut &tre due soit Q l’intervention de cet enzyme, soit au fait que l’absence d’uridylyle-transferase n’est pas compl&e2. (3) Une absence d’uridylyle-transferase est necessairement generalisee a tous les tissus et un diagnostic pose sur l’examen des erythrocytes est toujours valable pour les autres tissus. Le fait que dans les glycogenoses la deficience en amylo-1, 6-glucosidase est parfois &endue au foie et au muscle et parfois localisee au premier de ces deux tissusl”, indique que ce troisieme postulat n’est pas necessairement vrai. Rappelons aussi que dans l’interpretation des resultats obtenus, il y a toujours lieu de tenir compte de la presence Cventuelle de globules rouges &rangers que le sujet pourrait avoir recu par transfusion et que, en depit de la presence d’antibiotiques, une contamination microbienne du milieu d’incubation est susceptible de fausser les resultats. Notre methode n’est pas utilisable pour la detection des heterozygotes.

REMERCIEMENTS Ce travail a CtC subsidie par le Fonds de la Recherche Scientifique Medicale et par la Division de Pathologie de 1’U.S. Public Health Service (Research Grant A-4053). Le materiel biologique a pu &tre rassemble grace a la collaboration du Prof. P. DENYS (Louvain), du Prof. M. LELONG (Paris), du Dr. W. TEGELAERS (Eindhoven), du Dr. L. PHILIPPART (Verviers) et du Dr. H. A. C. SCHAAF(Rotterdam). RJ?SUMe Les auteurs decrivent une nouvelle methode de detection de la galactosemie congenitale, basee sur la mesure du r*CO, form6 par les globules rouges a partir de galactose-I-r4C. Cette methode a CtC adaptee pour pouvoir etre mise a la disposition des personnes non specialisees dans l’emploi des radioisotopes. SUMMARY A NEW

METHOD

TO DETECT

CONGENITAL

GALACTOSEMIA

The authors describe a new method for the detection of congenital galactosemia. This method is based on the measurement of r”CO, formed from I-14C-galactose by the erythrocytes. It has been adapted to be used by clinicians who are not specialized in the use of radioisotopes. Clin. Chim.

Acta, 7 (x962)

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