- Email: [email protected]
Une vue protéomique des tumeurs endocrines
Disponible en ligne sur www.sciencedirect.com
Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
Une vue protéomique des tumeurs endocrines A proteomic approach of the endocrine tumors J.-J. Diaz a,∗ , C. Couderc b , Y. Couté c , G. Poncet b , S. Pourpe a , S. Hacot a , F. Borson-Chazot d , K. Aguerra a , J.-Y. Scoazec b , J.-C. Sanchez c , C. Roche b a
Université de Lyon, Université Lyon 1, CNRS, UMR 5534, Centre de Génétique Moléculaire et Cellulaire, Villeurbanne, France b Inserm, U865, IFR Lyon-Est, Université de Lyon, Université Lyon 1, Lyon, France c Département de biologie structurale et bioinformatique, Biomedical Proteomics Research Group, centre médical universitaire, Genève, Suisse d Inserm, U865, IFR Lyon-Est, Université de Lyon, Lyon 1, Lyon, France Disponible sur Internet le 18 avril 2008
1. Objectif Les tumeurs endocrines digestives (TED) sont des tumeurs qui restent encore mal connues et pour lesquelles le pronostic et le traitement demeurent problématiques. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents à la progression de ces tumeurs est un prérequis à l’amélioration de leur prise en charge. C’est pourquoi ces dernières années nous avons mis en place un groupe de recherche constitué de plusieurs laboratoires pour développer un programme de recherche dédié à cette thématique. L’objectif de ce programme est d’identifier de nouveaux marqueurs moléculaires d’intérêt pronostique et/ou thérapeutique. La démarche expérimentale consiste à effectuer une analyse protéomique de plus en plus ciblée [1,2] des différents stades d’évolution des TED à partir de modèles animaux représentatifs de la pathologie humaine que nous avons développés récemment [3,4] et que nous optimisons au fur et à mesure de l’avancée du programme. 2. Situation du sujet Les TED constituent le groupe de tumeurs endocrines le plus important après le groupe des tumeurs endocrines de la thyroïde. Elles sont définies comme des lésions néoplasiques résultant de la prolifération de cellules épithéliales à différenciation endocrine dont elles conservent les caractères morphologiques et la capacité à exprimer un ensemble de marqueurs caractéristiques, incluant des marqueurs endocrines proprement dits (comme la chromogranine A) et de nombreux marqueurs dits ∗
Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (J.-J. Diaz).
0003-4266/$ – see front matter © 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.ando.2008.02.012
neuroendocrines, communs aux cellules endocrines et aux neurones (comme la synaptophysine). Ces tumeurs synthétisent certains peptides digestifs ou des amines biogènes qui, s’ils sont sécrétés, sont alors responsables d’un syndrome fonctionnel caractérisé par des symptômes résultant d’un excès d’hormone circulante ; dans ce cas, les tumeurs sont dites fonctionnelles [5]. L’histoire naturelle des TED va suivre trois étapes successives : le stade d’initiation de la tumorigenèse, le stade de croissance locale et le stade de dissémination métastatique. La première phase reste très mal connue, puisque les altérations portant sur les gènes classiquement mutés dans la majorité des autres cancers (p53, Rb, β-caténine, ras etc...) ne sont qu’exceptionnellement retrouvées dans les TED. Seules les mutations du gène suppresseur de tumeur MEN 1 rendent compte de l’apparition des tumeurs associées au syndrome de néoplasie endocrine multiple de type 1. Les phases de croissance locale et de dissémination métastatique sont mieux décrites, car les tumeurs sont généralement identifiées et diagnostiquées à ce stade, mais les mécanismes mis en jeu restent en grande partie inconnus. La classification OMS de ces tumeurs les répartit en deux grandes catégories : les formes bien différenciées et les formes peu différenciées. Les formes peu différenciées ne représentent que 5 % des TED, elles constituent un groupe assez homogène de tumeurs de haut grade de malignité, agressives et rapidement évolutives. Les formes bien différenciées constituent à l’inverse un groupe très hétérogène, incluant des tumeurs authentiquement bénignes, des tumeurs de faible grade de malignité, lentement évolutives mais susceptibles néanmoins de donner naissance à des métastases ou de récidiver après traitement, et des tumeurs plus agressives, à vitesse d’évolution rapide [6]. Face à cette grande diversité, le clinicien ne dispose que de peu d’indices pour prédire l’évolution de la tumeur. La présence des métastases permet d’affirmer le caractère malin, or 50 % des
J.-J. Diaz et al. / Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
tumeurs sont déjà métastatiques au moment du diagnostic. Dans ce cas, le pronostic vital est engagé, mais des vitesses de progression très variables peuvent être observées. Pour les tumeurs non métastatiques au moment du diagnostic, comment affirmer le caractère bénin ou malin d’une tumeur, comment évaluer sa vitesse de progression, quel traitement choisir et comment en évaluer la réponse ? Pour tenter de répondre à ces questions, il est indispensable d’identifier des marqueurs qui permettent de prédire l’évolution de la tumeur. Le caractère malin d’une TED est acquis lorsque la tumeur progresse au sein du tissu où elle est apparue pour devenir localement invasive puis métastatique. Ce sont les mécanismes moléculaires qui sont mis en jeu lors de cette transformation maligne qu’il faut mettre en évidence. Une approche possible consiste à comparer le protéome (protéines synthétisées par un génome à un instant donné) de tumeurs à différents stades de leur progression afin d’identifier des protéines dont les quantités varient en fonction du stade de la tumeur. Ces protéines seront ensuite validées comme outils pronostiques ou comme cibles thérapeutiques. Le traitement des TED demeure en effet problématique, exception faite de la chirurgie qui vise la résection complète de la tumeur et de ses métastases. Les TED sont, la plupart du temps, résistantes aux chimiothérapies conventionnelles.
139
L’essentiel des traitements médicaux repose actuellement sur les biothérapies, qui consistent à réduire la sécrétion hormonale et la croissance tumorale grâce à l’administration de deux molécules : analogues de la somatostatine et interféron alpha. Ces traitements améliorent l’état clinique du malade en diminuant les effets indésirables de la surproduction hormonale, mais leur effet antiprolifératif reste assez marginal [7]. Une meilleure connaissance des mécanismes de la progression tumorale permettra donc aussi d’améliorer le traitement de ces tumeurs. Pour progresser dans la connaissance de ces tumeurs il est nécessaire de disposer de matériel en quantité suffisante. Or ces tumeurs sont rares et extrêmement hétérogènes. Il est donc difficile d’établir des séries de grande taille pour en tirer des informations fiables. Les données de la littérature portent actuellement sur des séries restreintes ou sur un seul type de tumeur [8–10]. C’est pourquoi, pour contourner un certain nombre de ces difficultés et pour combler le déficit en modèles expérimentaux, nous avons choisi de développer des modèles animaux de tumeurs endocrines, sur lesquelles nous pourrons réaliser des analyses protéomiques mais aussi transcriptomiques, qui seront ensuite validées sur des échantillons de tumeurs humaines et confrontées aux annotations cliniques.
Fig. 1. Synopsis de la stratégie expérimentale. (1) Injection sous-cutanée de lignées cellulaires endocrines tumorales dans des souris nude qui entraîne la formation d’une première tumeur. (2) Prélèvement d’un fragment de la tumeur sous-cutanée puis greffe orthotopique dans la paroi cæcale. (3) Développement de la tumeur primitive suivie d’une dissémination ganglionnaire et hépatique. (4) Analyse protéomique. (5) Validations biologiques et cliniques.
140
J.-J. Diaz et al. / Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
Fig. 2. Séparation par 2-DE de protéines de tumeur primitive (A) et d’une métastase hépatique (B). Les gels ont été obtenus à partir des prélèvements de tumeurs primitives et de nodules hépatiques développés chez la souris huit semaines après la greffe dans la paroi cæcale d’une tumeur provenant de la lignée cellulaire STC-1.
3. Stratégie expérimentale La stratégie expérimentale que nous avons développée comporte les différentes étapes qui sont schématisées sur la Fig. 1. 4. Méthodologie 4.1. Définition du modèle animal expérimental Au cours des années précédentes, nous avons développé des modèles animaux de tumorigenèse endocrine, fondés sur l’utilisation de lignées cellulaires endocrines tumorales implantées chez la souris nude [3,4]. Le modèle sur lequel nous focalisons actuellement nos recherches est représenté par une greffe orthotopique d’une TED chez la souris. Ce modèle consiste à implanter dans la paroi du cæcum d’une souris Swiss nude (Charles River France) un fragment de tumeur préalablement obtenue par injection sous-cutanée des cellules d’intérêt. Une tumeur primaire se développe dans la paroi cæcale et selon les cellules utilisées, une dissémination métastatique, ganglionnaire puis hépatique, est observée dans un délai de deux à huit semaines après la greffe. L’étude cinétique du développement de la tumeur primaire permet d’observer les différentes
phases de l’invasion locale : invasion des couches musculaires, puis de la muqueuse elle-même. Ce modèle offre donc la possibilité d’étudier les mécanismes impliqués lorsque les cellules tumorales envahissent le tissu environnant, stade nécessaire à la dissémination des cellules pour former des métastases à distance de la tumeur primaire. Deux lignées cellulaires endocrines d’origine murine sont particulièrement adaptées à ce modèle : STC-1 et INS-1, respectivement intestinale et pancréatique, qui sont à l’origine de tumeurs plus ou moins invasives et plus ou moins métastatiques. La lignée STC-1 génère des tumeurs moins différenciées et très invasives : les signes d’invasion locale sont observés quatre à cinq semaines après la greffe, avec la présence de métastases ganglionnaires, les métastases hépatiques se développant audelà de cinq semaines de greffe. À l’inverse, la lignée INS-1 développe des tumeurs de type bien différencié, non invasives huit semaines après la greffe. Ces deux lignées permettent donc de reproduire chez l’animal les deux types principaux de tumeurs endocrines humaines : les formes bien différenciées peu agressives avec INS-1 et les formes peu différenciées très agressives avec STC-1. La lignée STC-1 présente l’intérêt supplémentaire de pouvoir accéder aux étapes précoces de l’invasion locale, stade qu’il est assez rarement possible d’observer en clinique humaine, les tumeurs étant le plus souvent détectées à des stades plus avancés.
Fig. 3. Analyse histologique de la paroi intestinale (cæcum) (A) et du foie (B) d’une souris huit semaines après la greffe de tumeur provenant de cellules STC-1. (A) : la tumeur primitive a franchi la musculeuse, a envahi la sous-muqueuse et commence à franchir la musculaire muqueuse. (B) : le foie est envahi avec le développement de nombreuses métastases. (MQ) : muqueuse ; MM : musculaire muqueuse ; Tm : tumeur primitive ; M : musculeuse ; Méta : métastase.
J.-J. Diaz et al. / Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
141
Fig. 4. Mise en évidence des protéines présentant des niveaux d’accumulation différents entre la tumeur primitive et la métastase hépatique. L’analyse d’image effectuée à partir des différents gels obtenus à partir des tumeurs primitives et de métastases hépatiques a permis de mettre en évidence : • vingt protéines dont la quantité est supérieure dans la métastase hépatique par rapport à la tumeur primitive ; • dix-huit protéines dont la quantité est inférieure dans la métastase hépatique par rapport à la tumeur primitive.
4.2. Analyse protéomique Les tumeurs et leurs métastases sont alors prélevées à différents stades de progression sous loupe binoculaire et analysées. À chaque étape, les échantillons prélevés sont analysés par histologie conventionnelle pour vérifier le stade de progression et les caractéristiques de la tumeur. Les protéines sont ensuite extraites dans un tampon contenant de fortes proportions d’urée et un détergent de type zwitterion. Après extraction les protéines sont séparées par électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide. Cette technique comprend deux étapes successives : une première séparation par focalisation isoélectrique (IEF), suivie d’une deuxième séparation par éléctrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS. Entre les deux étapes, les protéines sont réduites et alkylées. L’IEF consiste à séparer les protéines en fonction de leur charge globale représentée par leur point isoélectrique en utilisant des gradients de pH immobilisés. L’électrophorèse de la seconde dimension consiste à séparer les protéines en fonction de leur masse apparente. Après la 2-DE, les protéines sont détectées dans le gel par différentes techniques pour être analysables, en utilisant des substances qui colorent ou qui marquent les protéines. À ce stade de l’étude, nous avons utilisé principalement la coloration au nitrate d’argent et au bleu de Coomassie. Dans un premier temps, plusieurs gels par échantillons sont effectués avec de faibles quantités de protéines pour effectuer la partie analytique. Cette analyse est effectuée à l’aide du logiciel Image-
Master 2D associée à des tests statistiques. Cela permet de mettre en évidence et de valider un certain nombre de protéines dont la quantité varie significativement entre les différents échantillons. Dans un deuxième temps, des gels préparatifs contenant de plus grandes quantités de protéines sont effectués. Les protéines d’intérêt sont extraites du gel, digérées par de la trypsine et identifiées par différentes méthodes de spectrométrie de masse : détermination de l’empreinte peptidique et fragmentation de peptides. 5. État d’avancement des travaux L’étape initiale du projet a consisté à évaluer la faisabilité de l’approche protéomique sur le matériel biologique prélevé à partir des modèles animaux. En particulier, étant donné la très petite taille des métastases hépatiques (de l’ordre du millimètre cube), il était nécessaire de s’assurer de la possibilité d’analyser chaque métastase de fac¸on indépendante. De l’ensemble de ces expériences, il ressort, d’une part, qu’il est possible d’analyser l’ensemble des échantillons biologiques quel que soit leur origine (tumeur primitive, ganglion ou encore métastase hépatique unique), et d’autre part, que les cellules implantées chez l’animal expriment au moins certains des marqueurs caractéristiques des TED (Fig. 2). À ce stade, une comparaison approfondie des tumeurs primitives et des métastases hépatiques obtenues avec la lignée STC-1 a été effectuée. Cette étude résumée ci-dessous sera présentée en détail.
142
J.-J. Diaz et al. / Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
5.1. Comparaison du protéome des tumeurs primitives et des métastases hépatiques obtenues avec la lignée tumorale STC-1 La stratégie expérimentale décrite dans la Fig. 1 a été mise en place. Les tumeurs cæcales ainsi que les métastases hépatiques ont été prélevées huit semaines après la greffe orthotopique. La morphologie de la tumeur primitive et des métastases hépatiques est présentée sur la Fig. 3. Les extraits protéiques ont été ensuite soumis à l’analyse protéomique décrite précédemment. Cette analyse a permis de mettre en évidence une quarantaine de protéines dont les niveaux d’accumulation varient significativement entre la tumeur primitive et les métastases hépatiques (Fig. 4). L’identité de certaines de ces protéines et leur implication potentielle dans le processus métastatique sera discutée. 6. Travaux en cours Les autres études visant à analyser les modifications du protéome de la tumeur STC-1 au cours de l’acquisition du caractère invasif sont en cours et les résultats préliminaires seront présentés. De même, les analyses visant à comparer les protéomes d’une lignée invasive (STC-1) à ceux d’une lignée peu invasive (INS-1) pour un même stade de développement sont également en cours. Les résultats préliminaires seront présentés. 7. Validations biologiques et cliniques Les protéines qui auront été détectées et identifiées par l’analyse protéomique devront être recherchées sur du matériel tumoral humain afin de valider leur pertinence. Dans le cadre de la tumorothèque des hospices civils de Lyon, nous avons accès à une banque de 350 cas de TED (tissus fixés) associées au dossier clinique et à une collection de 105 TED cryopréservées. Grâce à cette banque, une puce tissulaire comportant 117 échantillons différents de TED a été préparée et validée. Une seconde puce tissulaire comportant une centaine de
cas de tumeurs primaires et de la ou des métastases correspondantes est en préparation. Des analyses immunohistologiques seront donc effectuées sur ces puces tissulaires pour confirmer et valider les molécules repérées par l’analyse protéomique. L’approche protéomique permettra d’identifier des molécules dont l’expression varie selon le stade d’évolution de la tumeur et dont l’intérêt comme marqueurs pronostiques ou comme cibles thérapeutiques potentielles devra alors être envisagé. Références [1] Couté Y, Kindbeiter K, Belin S, Dieckmann R, Duret L, Bezin L, et al. ISG20L2, a novel vertebrate nucleolar exoribonuclease involved in Ribosome biogenesis. Mol Biol Cell 2002;13:4100–9. [2] Scherl A, Couté Y, Déon C, Callé A, Kindbeiter K, Sanchez JC, et al. Functional proteomic analysis of human nucleolus. Mol Cell Proteomics 2008;13(11):4100–9. [3] Poncet G, Hervieu V, Theillaumas A, Blanc M, Cordier-Bussat M, Chayvialle JA, et al. Mise au point d’un modèle animal d’implantation et de dissémination métastatique de tumeur endocrine digestive. Ann Endocrinol 2006;67(5):399. [4] Pourreyron C, Poncet G, Roche C, Gouysse G, Nejjari M, Walter T, et al. The role of angiogenesis in endocrine liver metastases: an experimental study. J Surg Res 2008;144:64–73. [5] Scoazec JY. Endocrine tumors: Biology and physiopathology. Ann Pathol 2005;25:447–61. [6] Solcia E, Klöppel G, Sobin LH. Histological typing of endocrine tumors. In: WHO International Histological Classification of tumors. 2nd ed. Berlin: Springer Verlag; 2000. p. 56–68. [7] Kulke MH. Gastrointestinal neuroendocrine tumors: a role for targeted therapies ? Endocr Relat Cancer 2007;14:207–19. [8] Bloomston M, Durkin A, Yang I, Rojiani M, Rosemurgy AS, Enkmann S, et al. Identification of molecular markers specific for pancreatic neuroendocrine tumors by genetic profiling of core biopsies. Ann Surg Oncol 2004;4:413–9. [9] Maitra A, Hansel DE, Argani P, Ashfaq R, Rahman A, Naji A, et al. Global expression analysis of well-differentiated pancreatic endocrine neoplasms using oligonucleotide microarrays. Clin Cancer Res 2003;9: 5988–95. [10] Couvelard A, Hu J, Steers G, O’Toole D, Sauvanet A, Belghiti J, et al. Identification of potential therapeutic targets by gene-expression profiling in pancreatic endocrine tumors. Gastroenterology 2006;131:1597–610. WHO International Histological Classification of Tumours Berlin.
Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
Une vue protéomique des tumeurs endocrines A proteomic approach of the endocrine tumors J.-J. Diaz a,∗ , C. Couderc b , Y. Couté c , G. Poncet b , S. Pourpe a , S. Hacot a , F. Borson-Chazot d , K. Aguerra a , J.-Y. Scoazec b , J.-C. Sanchez c , C. Roche b a
Université de Lyon, Université Lyon 1, CNRS, UMR 5534, Centre de Génétique Moléculaire et Cellulaire, Villeurbanne, France b Inserm, U865, IFR Lyon-Est, Université de Lyon, Université Lyon 1, Lyon, France c Département de biologie structurale et bioinformatique, Biomedical Proteomics Research Group, centre médical universitaire, Genève, Suisse d Inserm, U865, IFR Lyon-Est, Université de Lyon, Lyon 1, Lyon, France Disponible sur Internet le 18 avril 2008
1. Objectif Les tumeurs endocrines digestives (TED) sont des tumeurs qui restent encore mal connues et pour lesquelles le pronostic et le traitement demeurent problématiques. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents à la progression de ces tumeurs est un prérequis à l’amélioration de leur prise en charge. C’est pourquoi ces dernières années nous avons mis en place un groupe de recherche constitué de plusieurs laboratoires pour développer un programme de recherche dédié à cette thématique. L’objectif de ce programme est d’identifier de nouveaux marqueurs moléculaires d’intérêt pronostique et/ou thérapeutique. La démarche expérimentale consiste à effectuer une analyse protéomique de plus en plus ciblée [1,2] des différents stades d’évolution des TED à partir de modèles animaux représentatifs de la pathologie humaine que nous avons développés récemment [3,4] et que nous optimisons au fur et à mesure de l’avancée du programme. 2. Situation du sujet Les TED constituent le groupe de tumeurs endocrines le plus important après le groupe des tumeurs endocrines de la thyroïde. Elles sont définies comme des lésions néoplasiques résultant de la prolifération de cellules épithéliales à différenciation endocrine dont elles conservent les caractères morphologiques et la capacité à exprimer un ensemble de marqueurs caractéristiques, incluant des marqueurs endocrines proprement dits (comme la chromogranine A) et de nombreux marqueurs dits ∗
Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (J.-J. Diaz).
0003-4266/$ – see front matter © 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.ando.2008.02.012
neuroendocrines, communs aux cellules endocrines et aux neurones (comme la synaptophysine). Ces tumeurs synthétisent certains peptides digestifs ou des amines biogènes qui, s’ils sont sécrétés, sont alors responsables d’un syndrome fonctionnel caractérisé par des symptômes résultant d’un excès d’hormone circulante ; dans ce cas, les tumeurs sont dites fonctionnelles [5]. L’histoire naturelle des TED va suivre trois étapes successives : le stade d’initiation de la tumorigenèse, le stade de croissance locale et le stade de dissémination métastatique. La première phase reste très mal connue, puisque les altérations portant sur les gènes classiquement mutés dans la majorité des autres cancers (p53, Rb, β-caténine, ras etc...) ne sont qu’exceptionnellement retrouvées dans les TED. Seules les mutations du gène suppresseur de tumeur MEN 1 rendent compte de l’apparition des tumeurs associées au syndrome de néoplasie endocrine multiple de type 1. Les phases de croissance locale et de dissémination métastatique sont mieux décrites, car les tumeurs sont généralement identifiées et diagnostiquées à ce stade, mais les mécanismes mis en jeu restent en grande partie inconnus. La classification OMS de ces tumeurs les répartit en deux grandes catégories : les formes bien différenciées et les formes peu différenciées. Les formes peu différenciées ne représentent que 5 % des TED, elles constituent un groupe assez homogène de tumeurs de haut grade de malignité, agressives et rapidement évolutives. Les formes bien différenciées constituent à l’inverse un groupe très hétérogène, incluant des tumeurs authentiquement bénignes, des tumeurs de faible grade de malignité, lentement évolutives mais susceptibles néanmoins de donner naissance à des métastases ou de récidiver après traitement, et des tumeurs plus agressives, à vitesse d’évolution rapide [6]. Face à cette grande diversité, le clinicien ne dispose que de peu d’indices pour prédire l’évolution de la tumeur. La présence des métastases permet d’affirmer le caractère malin, or 50 % des
J.-J. Diaz et al. / Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
tumeurs sont déjà métastatiques au moment du diagnostic. Dans ce cas, le pronostic vital est engagé, mais des vitesses de progression très variables peuvent être observées. Pour les tumeurs non métastatiques au moment du diagnostic, comment affirmer le caractère bénin ou malin d’une tumeur, comment évaluer sa vitesse de progression, quel traitement choisir et comment en évaluer la réponse ? Pour tenter de répondre à ces questions, il est indispensable d’identifier des marqueurs qui permettent de prédire l’évolution de la tumeur. Le caractère malin d’une TED est acquis lorsque la tumeur progresse au sein du tissu où elle est apparue pour devenir localement invasive puis métastatique. Ce sont les mécanismes moléculaires qui sont mis en jeu lors de cette transformation maligne qu’il faut mettre en évidence. Une approche possible consiste à comparer le protéome (protéines synthétisées par un génome à un instant donné) de tumeurs à différents stades de leur progression afin d’identifier des protéines dont les quantités varient en fonction du stade de la tumeur. Ces protéines seront ensuite validées comme outils pronostiques ou comme cibles thérapeutiques. Le traitement des TED demeure en effet problématique, exception faite de la chirurgie qui vise la résection complète de la tumeur et de ses métastases. Les TED sont, la plupart du temps, résistantes aux chimiothérapies conventionnelles.
139
L’essentiel des traitements médicaux repose actuellement sur les biothérapies, qui consistent à réduire la sécrétion hormonale et la croissance tumorale grâce à l’administration de deux molécules : analogues de la somatostatine et interféron alpha. Ces traitements améliorent l’état clinique du malade en diminuant les effets indésirables de la surproduction hormonale, mais leur effet antiprolifératif reste assez marginal [7]. Une meilleure connaissance des mécanismes de la progression tumorale permettra donc aussi d’améliorer le traitement de ces tumeurs. Pour progresser dans la connaissance de ces tumeurs il est nécessaire de disposer de matériel en quantité suffisante. Or ces tumeurs sont rares et extrêmement hétérogènes. Il est donc difficile d’établir des séries de grande taille pour en tirer des informations fiables. Les données de la littérature portent actuellement sur des séries restreintes ou sur un seul type de tumeur [8–10]. C’est pourquoi, pour contourner un certain nombre de ces difficultés et pour combler le déficit en modèles expérimentaux, nous avons choisi de développer des modèles animaux de tumeurs endocrines, sur lesquelles nous pourrons réaliser des analyses protéomiques mais aussi transcriptomiques, qui seront ensuite validées sur des échantillons de tumeurs humaines et confrontées aux annotations cliniques.
Fig. 1. Synopsis de la stratégie expérimentale. (1) Injection sous-cutanée de lignées cellulaires endocrines tumorales dans des souris nude qui entraîne la formation d’une première tumeur. (2) Prélèvement d’un fragment de la tumeur sous-cutanée puis greffe orthotopique dans la paroi cæcale. (3) Développement de la tumeur primitive suivie d’une dissémination ganglionnaire et hépatique. (4) Analyse protéomique. (5) Validations biologiques et cliniques.
140
J.-J. Diaz et al. / Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
Fig. 2. Séparation par 2-DE de protéines de tumeur primitive (A) et d’une métastase hépatique (B). Les gels ont été obtenus à partir des prélèvements de tumeurs primitives et de nodules hépatiques développés chez la souris huit semaines après la greffe dans la paroi cæcale d’une tumeur provenant de la lignée cellulaire STC-1.
3. Stratégie expérimentale La stratégie expérimentale que nous avons développée comporte les différentes étapes qui sont schématisées sur la Fig. 1. 4. Méthodologie 4.1. Définition du modèle animal expérimental Au cours des années précédentes, nous avons développé des modèles animaux de tumorigenèse endocrine, fondés sur l’utilisation de lignées cellulaires endocrines tumorales implantées chez la souris nude [3,4]. Le modèle sur lequel nous focalisons actuellement nos recherches est représenté par une greffe orthotopique d’une TED chez la souris. Ce modèle consiste à implanter dans la paroi du cæcum d’une souris Swiss nude (Charles River France) un fragment de tumeur préalablement obtenue par injection sous-cutanée des cellules d’intérêt. Une tumeur primaire se développe dans la paroi cæcale et selon les cellules utilisées, une dissémination métastatique, ganglionnaire puis hépatique, est observée dans un délai de deux à huit semaines après la greffe. L’étude cinétique du développement de la tumeur primaire permet d’observer les différentes
phases de l’invasion locale : invasion des couches musculaires, puis de la muqueuse elle-même. Ce modèle offre donc la possibilité d’étudier les mécanismes impliqués lorsque les cellules tumorales envahissent le tissu environnant, stade nécessaire à la dissémination des cellules pour former des métastases à distance de la tumeur primaire. Deux lignées cellulaires endocrines d’origine murine sont particulièrement adaptées à ce modèle : STC-1 et INS-1, respectivement intestinale et pancréatique, qui sont à l’origine de tumeurs plus ou moins invasives et plus ou moins métastatiques. La lignée STC-1 génère des tumeurs moins différenciées et très invasives : les signes d’invasion locale sont observés quatre à cinq semaines après la greffe, avec la présence de métastases ganglionnaires, les métastases hépatiques se développant audelà de cinq semaines de greffe. À l’inverse, la lignée INS-1 développe des tumeurs de type bien différencié, non invasives huit semaines après la greffe. Ces deux lignées permettent donc de reproduire chez l’animal les deux types principaux de tumeurs endocrines humaines : les formes bien différenciées peu agressives avec INS-1 et les formes peu différenciées très agressives avec STC-1. La lignée STC-1 présente l’intérêt supplémentaire de pouvoir accéder aux étapes précoces de l’invasion locale, stade qu’il est assez rarement possible d’observer en clinique humaine, les tumeurs étant le plus souvent détectées à des stades plus avancés.
Fig. 3. Analyse histologique de la paroi intestinale (cæcum) (A) et du foie (B) d’une souris huit semaines après la greffe de tumeur provenant de cellules STC-1. (A) : la tumeur primitive a franchi la musculeuse, a envahi la sous-muqueuse et commence à franchir la musculaire muqueuse. (B) : le foie est envahi avec le développement de nombreuses métastases. (MQ) : muqueuse ; MM : musculaire muqueuse ; Tm : tumeur primitive ; M : musculeuse ; Méta : métastase.
J.-J. Diaz et al. / Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
141
Fig. 4. Mise en évidence des protéines présentant des niveaux d’accumulation différents entre la tumeur primitive et la métastase hépatique. L’analyse d’image effectuée à partir des différents gels obtenus à partir des tumeurs primitives et de métastases hépatiques a permis de mettre en évidence : • vingt protéines dont la quantité est supérieure dans la métastase hépatique par rapport à la tumeur primitive ; • dix-huit protéines dont la quantité est inférieure dans la métastase hépatique par rapport à la tumeur primitive.
4.2. Analyse protéomique Les tumeurs et leurs métastases sont alors prélevées à différents stades de progression sous loupe binoculaire et analysées. À chaque étape, les échantillons prélevés sont analysés par histologie conventionnelle pour vérifier le stade de progression et les caractéristiques de la tumeur. Les protéines sont ensuite extraites dans un tampon contenant de fortes proportions d’urée et un détergent de type zwitterion. Après extraction les protéines sont séparées par électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide. Cette technique comprend deux étapes successives : une première séparation par focalisation isoélectrique (IEF), suivie d’une deuxième séparation par éléctrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS. Entre les deux étapes, les protéines sont réduites et alkylées. L’IEF consiste à séparer les protéines en fonction de leur charge globale représentée par leur point isoélectrique en utilisant des gradients de pH immobilisés. L’électrophorèse de la seconde dimension consiste à séparer les protéines en fonction de leur masse apparente. Après la 2-DE, les protéines sont détectées dans le gel par différentes techniques pour être analysables, en utilisant des substances qui colorent ou qui marquent les protéines. À ce stade de l’étude, nous avons utilisé principalement la coloration au nitrate d’argent et au bleu de Coomassie. Dans un premier temps, plusieurs gels par échantillons sont effectués avec de faibles quantités de protéines pour effectuer la partie analytique. Cette analyse est effectuée à l’aide du logiciel Image-
Master 2D associée à des tests statistiques. Cela permet de mettre en évidence et de valider un certain nombre de protéines dont la quantité varie significativement entre les différents échantillons. Dans un deuxième temps, des gels préparatifs contenant de plus grandes quantités de protéines sont effectués. Les protéines d’intérêt sont extraites du gel, digérées par de la trypsine et identifiées par différentes méthodes de spectrométrie de masse : détermination de l’empreinte peptidique et fragmentation de peptides. 5. État d’avancement des travaux L’étape initiale du projet a consisté à évaluer la faisabilité de l’approche protéomique sur le matériel biologique prélevé à partir des modèles animaux. En particulier, étant donné la très petite taille des métastases hépatiques (de l’ordre du millimètre cube), il était nécessaire de s’assurer de la possibilité d’analyser chaque métastase de fac¸on indépendante. De l’ensemble de ces expériences, il ressort, d’une part, qu’il est possible d’analyser l’ensemble des échantillons biologiques quel que soit leur origine (tumeur primitive, ganglion ou encore métastase hépatique unique), et d’autre part, que les cellules implantées chez l’animal expriment au moins certains des marqueurs caractéristiques des TED (Fig. 2). À ce stade, une comparaison approfondie des tumeurs primitives et des métastases hépatiques obtenues avec la lignée STC-1 a été effectuée. Cette étude résumée ci-dessous sera présentée en détail.
142
J.-J. Diaz et al. / Annales d’Endocrinologie 69 (2008) 138–142
5.1. Comparaison du protéome des tumeurs primitives et des métastases hépatiques obtenues avec la lignée tumorale STC-1 La stratégie expérimentale décrite dans la Fig. 1 a été mise en place. Les tumeurs cæcales ainsi que les métastases hépatiques ont été prélevées huit semaines après la greffe orthotopique. La morphologie de la tumeur primitive et des métastases hépatiques est présentée sur la Fig. 3. Les extraits protéiques ont été ensuite soumis à l’analyse protéomique décrite précédemment. Cette analyse a permis de mettre en évidence une quarantaine de protéines dont les niveaux d’accumulation varient significativement entre la tumeur primitive et les métastases hépatiques (Fig. 4). L’identité de certaines de ces protéines et leur implication potentielle dans le processus métastatique sera discutée. 6. Travaux en cours Les autres études visant à analyser les modifications du protéome de la tumeur STC-1 au cours de l’acquisition du caractère invasif sont en cours et les résultats préliminaires seront présentés. De même, les analyses visant à comparer les protéomes d’une lignée invasive (STC-1) à ceux d’une lignée peu invasive (INS-1) pour un même stade de développement sont également en cours. Les résultats préliminaires seront présentés. 7. Validations biologiques et cliniques Les protéines qui auront été détectées et identifiées par l’analyse protéomique devront être recherchées sur du matériel tumoral humain afin de valider leur pertinence. Dans le cadre de la tumorothèque des hospices civils de Lyon, nous avons accès à une banque de 350 cas de TED (tissus fixés) associées au dossier clinique et à une collection de 105 TED cryopréservées. Grâce à cette banque, une puce tissulaire comportant 117 échantillons différents de TED a été préparée et validée. Une seconde puce tissulaire comportant une centaine de
cas de tumeurs primaires et de la ou des métastases correspondantes est en préparation. Des analyses immunohistologiques seront donc effectuées sur ces puces tissulaires pour confirmer et valider les molécules repérées par l’analyse protéomique. L’approche protéomique permettra d’identifier des molécules dont l’expression varie selon le stade d’évolution de la tumeur et dont l’intérêt comme marqueurs pronostiques ou comme cibles thérapeutiques potentielles devra alors être envisagé. Références [1] Couté Y, Kindbeiter K, Belin S, Dieckmann R, Duret L, Bezin L, et al. ISG20L2, a novel vertebrate nucleolar exoribonuclease involved in Ribosome biogenesis. Mol Biol Cell 2002;13:4100–9. [2] Scherl A, Couté Y, Déon C, Callé A, Kindbeiter K, Sanchez JC, et al. Functional proteomic analysis of human nucleolus. Mol Cell Proteomics 2008;13(11):4100–9. [3] Poncet G, Hervieu V, Theillaumas A, Blanc M, Cordier-Bussat M, Chayvialle JA, et al. Mise au point d’un modèle animal d’implantation et de dissémination métastatique de tumeur endocrine digestive. Ann Endocrinol 2006;67(5):399. [4] Pourreyron C, Poncet G, Roche C, Gouysse G, Nejjari M, Walter T, et al. The role of angiogenesis in endocrine liver metastases: an experimental study. J Surg Res 2008;144:64–73. [5] Scoazec JY. Endocrine tumors: Biology and physiopathology. Ann Pathol 2005;25:447–61. [6] Solcia E, Klöppel G, Sobin LH. Histological typing of endocrine tumors. In: WHO International Histological Classification of tumors. 2nd ed. Berlin: Springer Verlag; 2000. p. 56–68. [7] Kulke MH. Gastrointestinal neuroendocrine tumors: a role for targeted therapies ? Endocr Relat Cancer 2007;14:207–19. [8] Bloomston M, Durkin A, Yang I, Rojiani M, Rosemurgy AS, Enkmann S, et al. Identification of molecular markers specific for pancreatic neuroendocrine tumors by genetic profiling of core biopsies. Ann Surg Oncol 2004;4:413–9. [9] Maitra A, Hansel DE, Argani P, Ashfaq R, Rahman A, Naji A, et al. Global expression analysis of well-differentiated pancreatic endocrine neoplasms using oligonucleotide microarrays. Clin Cancer Res 2003;9: 5988–95. [10] Couvelard A, Hu J, Steers G, O’Toole D, Sauvanet A, Belghiti J, et al. Identification of potential therapeutic targets by gene-expression profiling in pancreatic endocrine tumors. Gastroenterology 2006;131:1597–610. WHO International Histological Classification of Tumours Berlin.