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Untersuchung und reinigung von kieselsäurehaltigen kohlenhydraten
Jorrrnai of Cfwomarogrc&y, 118 (1976) 250-253 Q Ekvk Scientific Publishing Company, Amsterdam CHROM.
Printed ia The Netherlands
8859
Note
Untersuchung ULRICH
und
Reinigung
von
kieseEiurehaItigen
Kohlenhydraten
SCHWARZMAIER
Insritur fir Organische Chemie’, Neue Uni~ersikit, D-23 Kiel {B.R.D.) (Eingegangen am 22. Oktoher 1575)
Bekanntlich eignet sich Kieselgel in Verbindung mit wasserhaltigen La&mitteln vorziiglich fur die chromatographische Auftrennung von Zuckem, GIycosiden und andersartigen Naturstoffen. Leider wird jedoch die Qualitat der eluierten Komponenten durch einen gewissen Gehalt an kolloidaler Kieselsaure bisweilen merklich gemindert. Zu den mannigfaltigen St6rungen, mit denen man unserer Erfahrung nach rechnen muss, z5hlen Verhinderung der Kristailisation durch Schutzkohoidwirkung, Substanzverluste durch wiederhohes Filtrieren und Umkristallisieren, uncharakteristische physikalische Konstanten fur Schmelzpunkt und Drehuntypische Kristallformen sowie Elementaranalysenwerte, wert, unbefriedigende Koagulationserscheinungen bei der Applikation an Testorganismen. Besonders betroffen sind naturgemsss Substanzen, die sich nicht zur Kristailisation bringen fassen. Wir waren im Rahmen unserer Naturstoffarbeiter? gezwungen, eine L6sung fur das angesprochene Problem zu fmden und miichten im folgenden dariiber kurz berichten. METHODEN,
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
Als Laufmittel f-r Kohienhydrate bei der Dtinnschicht-, praparativen Schichtund SSiulenchromatographie (DC, PSC, SC) auf Kieselgel verwenden wir gewiihnlich wasserges5ttigte Chloroform-Methanol-Gemische (Tabelle I)_ Je nach Zusammensetrung des Elutionsmittels, Provenienz des TrSigers und Aiter der S&denfiilhrng bei Mehrfachverwendung enthdlt das Eluat l-6 mg Kieselsdure pro 100 ml LCisung. Am einfachsten ergibt sich der Gehalt aus dem Eindampfriickstand von Blindelutionen. Identifikation und halbquantitative Bestimmung der Kieselsiure erlaubt such die Wassertropfenprobe=, bei der der Rfickstand mit CalciumSuorid/Schwefels%rre aufgeschlossen und vcrfhichtigt und das auf feuchtem Filterpapier niedergeschlagene Hydrolyseprodukt nach dem Trocknen fiber Kaliumhydroxid ausgewogen wird. Die in chromatographisch gereinigten Kohlenhydraten enthaltene Kieselsbure lfsst sich auf die gleiche Weise bestimmen. Eine zweite Moglichkeit besteht in der Acetylierung des Kohlenhydrats mit Acetanhydrid/Pyridin, Vakuumverdampfung des ReagenTes und gravimetrischer Bestimmung des in Chloroform unlbsiichen Siliciumdioxids. Welche Anomalien die mitgelijste Kieselsdure bedingt, zeigt an einigen Rei* Dire&or:
Prof. Dr. A. Mondon.
251
NOTES
spielen Tabelle I, in der die Schmelzpunkte und Drehwerte einiger kieselsWrehaltiger und von Kieselsiiure befreiter Kohlenhydrate nach einmdiger Kristallisation gegeniibergestellt sind. Im Falle von Saccharose, Amygdalin und Rutin ist die Kristallisation nicht merklich beeintr&htigt, der Schmelzpunkt jedoch deutlich emiedrigt. Der Drehwert l%st auf einen Gehalt an eingeschlossecer Kieselsdure von ca. 1% schliessen. Isoamygdalin (racemisiertes Amygdalin3*3, das als Diastereomerengemisch nicht kristallisierbar ist, weist dagegen eine betichtliche Drehwertemiedrigung auf, die von einem KieselsZuregehalt von CQ. 5% herriihrt. Im Falle von Sambunigrin (L-MandelsHurenitril-#?-D-glucosid5) tritt die Kristallisation ohne Animpfen nicht ein, bedingt durch einen als Schutzkolloid wirkenden KieselsWregehalt von ca. 2.5%. Uber ein schonendes Abtrennverfahren fi,ir Kiesel&iurcspuren, bei dem keine
andersartigen St6rsubstanzen eingeschleppt werden, liegt bisher kein Bericht var. Filtration und Zentrifugation erweisen sich als v6llig nutzlos. Ultrafiltration und Ultrazentrifugation konnten nicht ausprobiert werden. Das einzige brauchbare und einfache Verfahren, auf das wir stiessen, ist Verteilungschromatographie auf Cellulosepulver. Zur El&on verwendet man am besten dasselbe Laufmittel wie bei der vorherigen Trennung auf Kieselgel. Wir verwenden fiir die Entkieselung Cellulosepulver Nr. 123 A (Schleicher & Schiill, Dassel, B.R.D.). Eine griindliche Vorreinigung ist unumglnglich und gelingt folgendermassen: Das Trsgermaterial wird fiinfmal jeweils 5 min mit reichlich Wasser ausgekocht und abgenutscht. Nach der letzten Filtration wird der Riickstand auf dem Filter mit Methanol und Chloroform nachgewaschen, sodann im Vakuum getrocknet oder als methanolische Suspension aufbewahrt. In der SZule wird der TrHger
unmittelbar vor dem Gebrauch nochmals mit dem jeweils vorgesehenen Laufmittel gewaschen, und zwar solange, bis das Eluat viillig kohlenhydratfrei und UV-inaktiv abtropft (beniitigte LGsungsmittelmenge ca. OS-l.0 1). Das kieselsiurehaltige Kohlenhydrat gibt man in Form eines trocknen Adsorbats an hochreinem Ceilulosepulver auf die S5uie. Bei der Elution eilt das Kohlenhydrat der Kieselsaure voraus. 1st eine En’firbung des Prgparats erforderlich, kann man dem TrZger 1% Aktivkohle zumischen. Nach der Reinigung weisen die Kohlenhydrate ein wesentlich verbessertes Kristallisationsverm6gen auf, woraus merkliche Ausbeutesteigerung resultiert. Betiglich der S&denkapazitZt gelten folgende Daten: Die optimale Schichtdicke betr5gt cu. 20 cm. Fiir 1 g Kohlenhydrat sollte eine QuerschnittsflBche von ca. 5 cm2 zur Verfcguung stehen. Das beschriebene Entkieselungsverfahren ist von uns bisher zur Reinigung von Monosen, Biosen und Triosen sowie deren Glycosidderivaten herangzogen worden. Es l&St sich erwarten; dass die Methode bei heheren Oligomeren versagt, wenn deren
Polaritit gr6ssenordnungsmSssig der von ko!loidaler Kiesels5ure entspricht. Als Stiirfaktor ist Kieselsgure kfirzlich such bei Biotests mit Steroiden in Erscheinung
getreten’.
Das vorgeschlagene
Die Abtnnnung
erfolgte
mit Hilfe von
DC-Celluloseplatten.
Verfahren ist fiir unsere Zwecke jedoch viillig unbrauchbar.
Es
fiihrt zur Verunreinigung der Probe mit den in der Schicht vorhandenen l&lichen Kohlenhydraten und UV-aktiven Stoffen und erlaubt nicht die Aufarbeitung prgparativer Ansitze.
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A 2 Amygdalin A 3 Isonmygdniin A 4 ’ Snmbunigrin B 5 C Rulin ‘_L__--..__.___--eI_L_
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0.20 174-177 0.49 208-212 0.49 0.34 -. 0.33 185-187 -__.. _.-.-ll-_---l-_-.
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184186 222-224 156-157 190-193
Reitl D D E F ---
-I-65.7 - 39.5 -485 -75.2 -360
-t-66.4 -40,o -51.1 -77.1 -365
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VERGLEICH KIESELShiUREHALTlGERUND KIESELSjlUREFRElER KOHLENHYDRATE NACH EINMALIGER KRISTALLISATLQN Trnger: 1~iesclgcl0.05-0.2 mm (E, Merck,Dnrmstndt,B.R.D.), Lnufmitlcl: A - Chloroform-Melhnuol(2:1, wnsscrgcslltt.);B = Chloroform-Melhnnol (4:1, wussergcsUl1.); C = Chloroform-MethanoI-Eisscssig (80:40:3,wassergcsilll.).Losungsmiltel:D = Wasser-.bithnnol(1:9);E = Essigoster;F = MC. ’ thanol-Wasser (1:2); G = Wasscr;H = 0.1% EssigsUurc;I = Athnnol-Wasser(1:I). ..__..-__..._P “---__--I_c__----______c__ -- _.-.-____,^__ ---l_-,!i’i/bstm NO. Lurr/initrcl Rfi-Werr Schelzprrrrkr(“C) Spez. D~cimr~[a# Kicscls~m-
TABELLE I
EITEESTUR 1 u. schw arrmaier,Disserftatin, KieI_ 1970. 2 G. Jan&r und -E. Biasius, Lehrbuch &r Ardyffschen ruuiPriiporarivenAtwrgar&che Cfmnie, Him& Stuttgakt~9. Ad., 1970, S. 208. 3 4 5 6
J. W. Wdker, J. C&m. Sac., tondon, (1903) 472. K. D. Dakin, J. C~IZ. Sac., London, (1904) 1512. U.Szh tvarmakr, I_ Ckmmrogr., IL1 (197.5) 430. E. scirnurr, fi Chonmrogr., 84 (1973) 165.
Printed ia The Netherlands
8859
Note
Untersuchung ULRICH
und
Reinigung
von
kieseEiurehaItigen
Kohlenhydraten
SCHWARZMAIER
Insritur fir Organische Chemie’, Neue Uni~ersikit, D-23 Kiel {B.R.D.) (Eingegangen am 22. Oktoher 1575)
Bekanntlich eignet sich Kieselgel in Verbindung mit wasserhaltigen La&mitteln vorziiglich fur die chromatographische Auftrennung von Zuckem, GIycosiden und andersartigen Naturstoffen. Leider wird jedoch die Qualitat der eluierten Komponenten durch einen gewissen Gehalt an kolloidaler Kieselsaure bisweilen merklich gemindert. Zu den mannigfaltigen St6rungen, mit denen man unserer Erfahrung nach rechnen muss, z5hlen Verhinderung der Kristailisation durch Schutzkohoidwirkung, Substanzverluste durch wiederhohes Filtrieren und Umkristallisieren, uncharakteristische physikalische Konstanten fur Schmelzpunkt und Drehuntypische Kristallformen sowie Elementaranalysenwerte, wert, unbefriedigende Koagulationserscheinungen bei der Applikation an Testorganismen. Besonders betroffen sind naturgemsss Substanzen, die sich nicht zur Kristailisation bringen fassen. Wir waren im Rahmen unserer Naturstoffarbeiter? gezwungen, eine L6sung fur das angesprochene Problem zu fmden und miichten im folgenden dariiber kurz berichten. METHODEN,
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
Als Laufmittel f-r Kohienhydrate bei der Dtinnschicht-, praparativen Schichtund SSiulenchromatographie (DC, PSC, SC) auf Kieselgel verwenden wir gewiihnlich wasserges5ttigte Chloroform-Methanol-Gemische (Tabelle I)_ Je nach Zusammensetrung des Elutionsmittels, Provenienz des TrSigers und Aiter der S&denfiilhrng bei Mehrfachverwendung enthdlt das Eluat l-6 mg Kieselsdure pro 100 ml LCisung. Am einfachsten ergibt sich der Gehalt aus dem Eindampfriickstand von Blindelutionen. Identifikation und halbquantitative Bestimmung der Kieselsiure erlaubt such die Wassertropfenprobe=, bei der der Rfickstand mit CalciumSuorid/Schwefels%rre aufgeschlossen und vcrfhichtigt und das auf feuchtem Filterpapier niedergeschlagene Hydrolyseprodukt nach dem Trocknen fiber Kaliumhydroxid ausgewogen wird. Die in chromatographisch gereinigten Kohlenhydraten enthaltene Kieselsbure lfsst sich auf die gleiche Weise bestimmen. Eine zweite Moglichkeit besteht in der Acetylierung des Kohlenhydrats mit Acetanhydrid/Pyridin, Vakuumverdampfung des ReagenTes und gravimetrischer Bestimmung des in Chloroform unlbsiichen Siliciumdioxids. Welche Anomalien die mitgelijste Kieselsdure bedingt, zeigt an einigen Rei* Dire&or:
Prof. Dr. A. Mondon.
251
NOTES
spielen Tabelle I, in der die Schmelzpunkte und Drehwerte einiger kieselsWrehaltiger und von Kieselsiiure befreiter Kohlenhydrate nach einmdiger Kristallisation gegeniibergestellt sind. Im Falle von Saccharose, Amygdalin und Rutin ist die Kristallisation nicht merklich beeintr&htigt, der Schmelzpunkt jedoch deutlich emiedrigt. Der Drehwert l%st auf einen Gehalt an eingeschlossecer Kieselsdure von ca. 1% schliessen. Isoamygdalin (racemisiertes Amygdalin3*3, das als Diastereomerengemisch nicht kristallisierbar ist, weist dagegen eine betichtliche Drehwertemiedrigung auf, die von einem KieselsZuregehalt von CQ. 5% herriihrt. Im Falle von Sambunigrin (L-MandelsHurenitril-#?-D-glucosid5) tritt die Kristallisation ohne Animpfen nicht ein, bedingt durch einen als Schutzkolloid wirkenden KieselsWregehalt von ca. 2.5%. Uber ein schonendes Abtrennverfahren fi,ir Kiesel&iurcspuren, bei dem keine
andersartigen St6rsubstanzen eingeschleppt werden, liegt bisher kein Bericht var. Filtration und Zentrifugation erweisen sich als v6llig nutzlos. Ultrafiltration und Ultrazentrifugation konnten nicht ausprobiert werden. Das einzige brauchbare und einfache Verfahren, auf das wir stiessen, ist Verteilungschromatographie auf Cellulosepulver. Zur El&on verwendet man am besten dasselbe Laufmittel wie bei der vorherigen Trennung auf Kieselgel. Wir verwenden fiir die Entkieselung Cellulosepulver Nr. 123 A (Schleicher & Schiill, Dassel, B.R.D.). Eine griindliche Vorreinigung ist unumglnglich und gelingt folgendermassen: Das Trsgermaterial wird fiinfmal jeweils 5 min mit reichlich Wasser ausgekocht und abgenutscht. Nach der letzten Filtration wird der Riickstand auf dem Filter mit Methanol und Chloroform nachgewaschen, sodann im Vakuum getrocknet oder als methanolische Suspension aufbewahrt. In der SZule wird der TrHger
unmittelbar vor dem Gebrauch nochmals mit dem jeweils vorgesehenen Laufmittel gewaschen, und zwar solange, bis das Eluat viillig kohlenhydratfrei und UV-inaktiv abtropft (beniitigte LGsungsmittelmenge ca. OS-l.0 1). Das kieselsiurehaltige Kohlenhydrat gibt man in Form eines trocknen Adsorbats an hochreinem Ceilulosepulver auf die S5uie. Bei der Elution eilt das Kohlenhydrat der Kieselsaure voraus. 1st eine En’firbung des Prgparats erforderlich, kann man dem TrZger 1% Aktivkohle zumischen. Nach der Reinigung weisen die Kohlenhydrate ein wesentlich verbessertes Kristallisationsverm6gen auf, woraus merkliche Ausbeutesteigerung resultiert. Betiglich der S&denkapazitZt gelten folgende Daten: Die optimale Schichtdicke betr5gt cu. 20 cm. Fiir 1 g Kohlenhydrat sollte eine QuerschnittsflBche von ca. 5 cm2 zur Verfcguung stehen. Das beschriebene Entkieselungsverfahren ist von uns bisher zur Reinigung von Monosen, Biosen und Triosen sowie deren Glycosidderivaten herangzogen worden. Es l&St sich erwarten; dass die Methode bei heheren Oligomeren versagt, wenn deren
Polaritit gr6ssenordnungsmSssig der von ko!loidaler Kiesels5ure entspricht. Als Stiirfaktor ist Kieselsgure kfirzlich such bei Biotests mit Steroiden in Erscheinung
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Das vorgeschlagene
Die Abtnnnung
erfolgte
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VERGLEICH KIESELShiUREHALTlGERUND KIESELSjlUREFRElER KOHLENHYDRATE NACH EINMALIGER KRISTALLISATLQN Trnger: 1~iesclgcl0.05-0.2 mm (E, Merck,Dnrmstndt,B.R.D.), Lnufmitlcl: A - Chloroform-Melhnuol(2:1, wnsscrgcslltt.);B = Chloroform-Melhnnol (4:1, wussergcsUl1.); C = Chloroform-MethanoI-Eisscssig (80:40:3,wassergcsilll.).Losungsmiltel:D = Wasser-.bithnnol(1:9);E = Essigoster;F = MC. ’ thanol-Wasser (1:2); G = Wasscr;H = 0.1% EssigsUurc;I = Athnnol-Wasser(1:I). ..__..-__..._P “---__--I_c__----______c__ -- _.-.-____,^__ ---l_-,!i’i/bstm NO. Lurr/initrcl Rfi-Werr Schelzprrrrkr(“C) Spez. D~cimr~[a# Kicscls~m-
TABELLE I
EITEESTUR 1 u. schw arrmaier,Disserftatin, KieI_ 1970. 2 G. Jan&r und -E. Biasius, Lehrbuch &r Ardyffschen ruuiPriiporarivenAtwrgar&che Cfmnie, Him& Stuttgakt~9. Ad., 1970, S. 208. 3 4 5 6
J. W. Wdker, J. C&m. Sac., tondon, (1903) 472. K. D. Dakin, J. C~IZ. Sac., London, (1904) 1512. U.Szh tvarmakr, I_ Ckmmrogr., IL1 (197.5) 430. E. scirnurr, fi Chonmrogr., 84 (1973) 165.