Untersuchungen über den Verlust von R-Plasmiden bei E. coli und Klebsiella pneumoniae im Verlauf von Bouillonpassagen

Zbl. Bakt. Hyg., I.Abt. Orig. A 246,318-328 (1980)

Aus dem Institut fiir Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der Fakultat fiir Klinische Medizin Mannheim der Karl-Ruprecht-Universitat Heidelberg (Direktor: Prof. Dr. med. W. Wundt)

Untersuchungen iiber den Verlust von R-Plasmiden bei E. coli und Klebsiella pneumoniae im Verlauf von Bouillonpassagen Examinations About the Segregation of R-Plasmids in E. coli and Klebsiella pneumoniae During Nutrient Broth Passages N. DICKGIESSER

Eingegangen am 28. Mai 1979

Abstract Plasmid RP1 (= CarbrNeorKanarTetrarAmpr) or Plasmid R100 (= TetrarStreptrSu]fr) were transferred on 5 different strains of E. coli and on 3 strains of KI. pneumoniae. Plasmid RK1 (= CarbrTetrStrept rAmpr) was transferred on 3 strains of KI. pneumoniae also. The resulting strains were cultured in 7 passages of Standard-I-Nutrient-Broth

(Merck) and Mueller-Hinton-Broth (Becton-Dickinson); 48 colonies were examined for resistanc{. to antibiotics of the different R-Plasmids. In E. coli and in KI. pneumoniae with R-Plasmids RP1 and RK1 no more than 2 colonies without one of several antibiotic resistances after 7 nutrient broth passages were seen. Striking loss of R-plasmids was seen in Kl. pneumoniae with R-Plasmid R100 after the third passage. The behaviour of strains in Standard-I-Nutrient-Broth and Mueller-HintonBroth was not different. In conclusion for sensitivity test colonies should be taken only from primary cultures. Furthermore it is recommended to pick up several colonies from one isolated strain for sensitivity test.

Zusammenfassung Auf 5 plasmidfreie Starn me von E. coli und 3 von Klebsiella pneumoniae wurden durch Konjugation das Plasmid RP1 (= CarbrNeorKanarTetrarAmpr) oder das Plasmid R100 (= TetrarStreptrSulf r) iibertragen. Ferner wurden Transkonjuganten aus den Kl. pneumoniae und dem Plasmid RK 1 (= CarbrTetrStrept rAmpr) hergestellt. Mit jedem dieser Sramme wurden 7 Bouillonpassagen in Standard-I-Bouillon und Mueller-Hinton-Bouillon vorgenommen, wobei nach jeder einzelnen Passage gepriift wurde, ob hierbei ein Verlust von einzelnen Antibiotikaresistenzen auftrat. Hierbei wurden jeweils 48 Einzelkolonien untersucht.

Verlust von R-Plasmiden bei E. coli

319

Bei E.. coli fanden sich nach 7 Bouillonpassagen unter 48 Kolonien bei den Plasmiden RP 1 und R 100 maximal 2 Kolonien mit dem Verlust einer Resistenzdeterminante. Deutlichere R-Plasmid-Veriuste zeigten sich bei dem Plasmid R 100 teilweise schon nach 3 Bouillonpassagen in den KI. pneumoniae. Stabil verhielten sich dagegen die Plasmide RP 1 und RK 1 in den KI. pneumoniae; hier war nur selten der Veriust einer Resistenzdeterminante zu beobachten. Ein unterschiedliches Verhalten der Keime in Standard-I-Bouillon oder MueIIer-Hinton-BouilIon zeigte sich nicht. Flir die Routinediagnostik wird empfohlen, moglichst nur vom Primarausstrich ein Antibiogramm anzufertigen sowie stets mehrere Kolonien derselben Keimart in die Testung einzubeziehen.

Der hohe Anteil R-Plasmide-tragender Erreger erfordert haufige Kontrollen des Antibiogramms von Enterobacteriaceae und Pseudomonaden, da durch Konjugation bei gleichzeitiger Antibiotikatherapie die Resistenzverhaltnisse rasch wechseln konnen (3, 10, 11). Bohus (1) empfiehlt aus diesem Grunde, jeweils auch die Sensibilitat der vermutlich nicht den KrankheitsprozeG verursachenden gramnegativen Stabchenbakterien zu bestimmen. Diese Anregung durfte vor allem fur bakterielle Untersuchungen des Magen-Darm- und Respirationstraktes gelten. Die Dberlegungen erscheinen aber fur das Routinelabor als zu weitgehend. Es gilt jedoch sicherzustellen, daG bei Untersuchungsverfahren evtl. vorhandene Plasmide nicht verloren gehen und dem anschlieGenden Antibiogramm keine klinische Bedeutung mehr zukommt. Auf diese Fragestellung ging Lebek (7, 8) naher ein, als er an S. heidelberg und S. typhi-murium im Laufe mehrerer Bouillonpassagen einen Verlust von Resistenzeigenschaften in bis zu 100% der faIle nachwies; seine Untersuchungen an je einer Spezies von E. coli und Klebsiella-Aerobacter ergaben dagegen auch nach 70 Bouillonpassagen keine Anderung des Resistenzspektrums. Diese Aussage ist seither nicht weiter untersucht worden und gab daher AniaG zu der vorliegenden Arbeit. Es sollte damit geklart werden, ob nicht auch an Stammen von E. coli und Klebsiella pneumoniae, evtl. in Abhangigkeit vom bouillonhaltigen Medium, im Verlaufe mehrerer Bouillonpassagen ein Verlust von Resistenzeigenschaften nachweis bar ist.

Methodik Als Akzeptoren standen plasmidfreie E. coli-Stamme 1 vom Typ W 3110 (Grinstedt, 4) mit den Nummern 2007a, 2007b, 2007c und 2007e, sowie ein Stamm E. coli Nr. 2008 vom Typ EC 1005 zur Verfligung. Die Kl. pneumoniae wurden aus klinischem Material isoliert. Hier waren wir bestrebt, moglichst plasmidfreie Stamme zu erhalten. In denjenigen Fallen, in weichen dies nach dem Antibiogramm zu erwarten war, erfolgte eine Isolierung der DNA mit anschliefSender Gelelektrophorese nach Meyers und Falkow (9) 2. Dabei erwiesen sich folgende Stamme als geeignet: Nr. 8049: plasmidfrei; Nr. 18557: Plasmid von 2,1 MDalton; Nr. 8076: Plasmid von 1,9 MDalton. Die chromosomalen Eigenschaften der Akzeptoren waren folgende: 1 Freundlicherweise stellte uns Herr Prof. B. Wiedemann, Inst. f. Med. Mikrobiologie und Immunologie der Universitat Bonn die Stamme zur Verfligung. 2 Flir die Unterstlitzung bei der Durchflihrung dieser Untersuchung danke ich Herrn Dipl.-Biol. van Treeck, Inst. f. Med. Mikrobiologie und Immunologie der Universitat Bonn.

320

N. Dickgiesser

E. coli 2007a 2007b 2006c 2007e 2008

chromos. Eigenschaften Rifrlac+Sulfr Nxrlac+Sulfr RifrlacSulfr NxrlacSulf' Nx'lac+Sulf'

Kl. pneumoniae 8049 18557 8076

RifrCarbrlac+Sul£r RifrCarbrlac+Sulfr RifrCarbrlac+Sulfr

Als Donatoren dienten folgende Keime:
chromos. Eigenschaften lac+ Nxrlac lac+

Plasmide CarbrNeorKanarTetra'Amp' TetrStrept'Sulf r CarbrTetrStrept'Ampr

Durch Konjugation mit einem der o. a. Donatoren (oder mit einer resultierenden Transkonjuganten) wurden auf E. coli 2007a, 2007b, 2007c, 2007e, 2008 und auf die Kl. pneumoniae 8049, 18557, 8076 die Plasmide RPI oder RI00 iibertragen ; das Plasmid RKI wurde nur mit den Klebsiella-Stammen in Verbindung gebracht. Damit ergaben sich fiir die weiteren Untersuchungen folgende Exkonjuganten: Stamm-Nr. chromos. Eigenschaften Plasm ide 2007aRPI Rifrlac+Sulfr CarbrNeorKanarTetrarAmpr 2007aRIOO Rifrlac+Sul£r TetrStreptrSulf r 2007b RPl Nxrlac+Sulfr CarbrNeorKanarTetra rAmpr 2007b RI00 Nxrlac+Sulfr TetrStreptrSulf r 2007c RPI Rifrlac Sulfr CarbrNeorKanarTetra rAmpr 2007cR100 Rifrlac SuI£r TetrStreptrSulf r 2007eRPl Nxrlac Sulfr CarbrNeorKanarTetrarAmpr 2007eRI00 NxrJacSulfr TetrStreptrSu!fr 2008 RPl Nxrlac+Sulfr CarbrNeorKanarTetrarAmpr 2008 R100 Nxrlac+Sulfr TetrStreptrSulf r RifrCarbrlac+Sul£r CarbrNeorKanarTetra rAmpr 8049 RP1 RifrCarbrlac+Sulfr TetrStreptrSulf r 8049 RI00 8049RKI RifrCarbrlac+Sulfr CarbrTetrStreptrAmpr 8076 RPI RifrCarbrJac+Sulfr CarbrNeorKanarTetra rAmpr 8076 R100 RifrCarbrJac+Sulfr TetrStreptrSulf r 8076RKl RifrCarb rJac+Sulfr CarbrTetrStreptrAmpr 18557RPl RifrCarbrlac+Sulfr CarbrNeorKanarTetrarAmpr 18557RI00 RifrCarbrJac+Sul£r TetrStreptrSulf r 18557RK1 RifrCarbrlac+Sulfr CarbrTetrStreptrAmpr Rif = Rifampicin, Nx = Nalidixinsaure, Tet = Tetracycline, Strept = Streptomycin, Amp = Ampicillin, Sulf = Sulfonamide, Kana = Kanamycin, Neo = Neomycin, Carb = Carbenicillin.

Die Ubertragung des gesamten Plasmids wurde durch MHK-Bestimmungen gegen entsprechende Antibiotika bestatigt.

Verlust von R-Plasmiden bei E. coli

321

Untersuchungsgang

Es wurden je 7 Kulturpassagen in 5 ml Standard-I-Bouillon (Merck) und 5 ml MiillerHinton-Bouillon (Becton-Dickinson) vorgenommen; in jedem Faile betrug die Bebriitungszeit 16 Std., die Temperatur 37°C. Die RP1-haltigen Stamme wurden auf Chinablau-Lactose-Agar (Merck) mit 20 Ilg/ml Kanamycin ausgestrichen, 10 Ilg/ml Streptomycin wurden dem Agar zugegeben, wenn Stiimme mit dem Plasmid RI00 oder RKI angeziichtet wurden. Nach Bebriitung wurde ein Teil der Kolonie in Standard-I-Bouillon, der andere Teil in Miiller-Hinton-Bouillon gegeben; die bebriitete Bouillon wurde am darauffolgenden Tag jeweils iiberimpft. Bei jeder der 7 Bouillonpassagen wurde der Anteil der R-Plasmid-haltigen Keime folgendermaBen bestimmt: 100 III der Bouillon wurden so verdiinnt, daB eine Keimzahl von 3000-7000 Keimen/ml resultierte; 100 III dieser Keimsuspension wurden auf antibiotikafreiem Chinablau-Lactose-Agar ausgestrichen. N ach Bebriitung wurden mittels sterilisierter Holzstabchen 48 der Kolonien auf Mikrotiterplatten (U-Form) iiberimpft, wobei jede der Vertiefungen 100 III Standard-I-Bouillon oder Miiller-Hinton-Bouillon enthielt. Nach Anziichtung wurden mittels Stempel die 48 Keimsuspensionen auf antibiotikahaltige Chinablau-Lactose-Agarplatten iibertragen. Dabei wurden im Faile der RPl-haltigen Stamme 20 Ilg/ml Kanamycin oder 50 Ilg/ml Carbenicillin, 10 Ilg/ml Neomycin oder 10 fig/ml Tetracyclin-HCL zugegeben; bei den RI00- und RKl-haltigen Stammen erfolgte ein Streptomycin- oder Tetracyclinzusatz in der oben angegebenen Menge. Bei den Transkonjuganten 8049RPl, 8076RPl und 18557RPl entfiel die Priifung auf Carbenicillinresistenz aufgrund der chromosomalen Eigenschaften; aus dem gleichen Grund entfiel bei den Transkonjuganten mit dem Plasmid RI00 die Priifung auf Sulfonamidresistenz. Ais Beimpfungskontrolle wurde anschlieBend ein Blutagar bestempelt, als Wachstumskontroll en wurde auf jedem Agar je ein Impfstrich mit dem plasmidhaltigen und dem plasmidfreien Stamm vorgenommen. Nach Bebriitung konnte die Anzahl der iiberimpften Keime bestimmt werden, welche auf dem antibiotikahaltigen Agar zu wachsen in der Lage waren. Die statistische Auswertung 3 sollte erbringen, in welchem Umfang von den gepriiften 48 Kolonien Riickschliisse auf den Anteil plasmidhaltiger Keime in der Nahrbouillon moglich sind; dafiir war ein SchluB von der Stichprobe auf die Grundgesamtheit erforderlich. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit (=
=

Xl

X, + (49-x,)F"'/2%(Nl,N2) wobei Nl = 98 - 2X, und N2 = 2x, . Der fiir (Nl, N2) entsprechende Wert fiir F wurde einer Tabelle zur Berechnung von Binominal-Konfidenzintervallen entnommen, die auf die Zahl der 48 gepriiften Kolonien ausgelegt worden war. Ais Sonderfalle waren zu beriicksichtigen: x, = 0: pu = 0 und x, = 48: pu = 0,9394. po =

X,

+1

X, + 1 + (48-x , ) F _"'/2%(Nl,N2) Hier war N1 = 96 - 2XI' und N2 = 2XI X, = 48: po = 1.

+ 2.

Sonderfalle waren:

X,

= 0: po = 0,06 und

Ergebnisse Die Ergebnisse iiber die Untersuchungen an RP1-haltigen Stammen finden sich in Tab. 1 (Standard-I-Bouillon) und Tab. 2 (Mueller-Hinton-Bouillon); in Tab. 3 3 Fiir die Unterstiitzung bei der statistischen Auswertung danke ich Herrn Dipl.-Math. H.-P. Altenburg, Med. Statistik, Biomathematik an der Fakultat fiir klinische Medizin Mannheim der Universitat Heidelberg.

322

N. Dickgiesser

(Standard-I-Bouillon) and Tab. 4 (Mueller-Hinton-Bouillon) sind die Ergebnisse der RIOO-haltigen Stiimme angefiihrt. Die Untersuchungen an Kl. pneumoniae, welche das Plasmid RKI enthalten, finden sich in Tab. 5 a (Standard-I-Bouillon) und Tab. 5b (Mueller-Hinton-Bouillon). Um einen RiickschluR von den 48 getesteten Kolonien auf den Anteil plasmidhaltiger Keime in der Bouillon zu ermoglichen, wurden in Tab. 6 die unteren und oberen Intervallgrenzen errechnet.

Tabelle 1. Untersuchungen tiber den Verlust des Plasmids RP1 durch mehrfache Passagen in Standard-I-Bouillon; angegeben ist die Zanl der gegen die selektierenden Antibiotika resistenten Kolonien (48 Kolonien = 100%) Table 1. Examinations about the segregation of Plasmid RP1 in several passages in Standard-I-Nutrient Broth; number of colonies resistant against selecting antibiotics (48 colonies = 100%) Passagen

1

2

3

4

5

6

7

E. coli 2007aRPl

Kana earb Neo Tetra

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

46 48 48 48

47 48 48 48

2007bRP1

Kana earb Neo Tetra

48 48 47 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

2007cRPl

Kana earb Neo Tetra

48 48 47 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

2007eRP1

Kana earb Neo Tetra

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 47 48

48 48 48 48

47 48 48 48

48 48 48 48

2008RPl

Kana earh Neo Tetra

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

47 48 48 48

48 48 48 48

47 48 48 48

KI. pneumoniae 8049RP1

Kana Neo Tetra

48 48 48

48 48 48

47 48 48

48 48 48

48 47 48

48 48 48

48 48 48

8076RP1

Kana Neo Tetra

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

18557RPl

Kana Neo Tetra

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

Verlust vo n R-Plasmiden bei E. coli

323

Bei E. coli zeigten sich nur wenige Kolonien mit Verlust von einzelnen Resistenzdeterminanten: im ausgepragtest en Fall war dies bei 2 von 48 Kolonien, was einer unteren Intervallgrenze von 85,7% entspricht. Ein Unterschied beziiglich der beiden Nahrmedien zeigte sich nicht. Einzelne Resistenzeigenschaften gingen jedoch verloren, ohne daIS ein Verlust in den anderen plasmidbedingten Antibiotikaresistenzen auftrat (Tab. 1: 2007aRP1, 2007cRP1; Tab. 2: 2007eRP1). Die gleiche Beobach-

T abelle 2. Untersuchungen iiber den VerIust des Plasmids RP1 durch mehrfache Passagen in Mueller-Hinton-Bouillon; angegeben ist die Zahl der gegen die selektierenden Antibiotika resistenten Kolonien (48 Kolonien = 100%) Table 2. Examinations about the segregation of Plasmid RP1 in several passages in Mueller Hinton Broth; number of colonies resistant against selecting antibiotics (48 colonies = 100%) Passagen

1

2

3

4

5

6

7

E. coli 2007aRPl

Kana Carb Neo Tetra

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

2007bRP1

Kana Carb Neo Tetra

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 47 48 48

2007cRP1

Kana Carb Neo Tetra

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 47 48

2007eRPl

Kana Carb Neo Tetra

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 46 48

48 48 48 48

48 48 48 48

2008RPl

Kana Carb Neo Tetra

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

48 48 48 48

KI. pneumoniae 8049 RPl

Kana Neo Tetra

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

47 48 48

46 47 48

8065RP l

Kana Neo Tetra

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

47 48 48

48 48 48

18557RPl

Kana Neo Tetra

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

48 48 48

324

N.Dickgiesser

tung ergab sich bei den RP1-haltigen Kl. pneumoniae, wobei ein Unterschied zwischen Mueller-Hinton-Bouillon und Standard-I-Bouillon nicht nachzuweisen war. Bei den Kl. pneumoniae mit dem Plasmid R100 traten dagegen ab der dritten Bouillonpassage auffallige Verminderungen des Anteils der resistenten Kolonien auf. Besonders labile Integration lag bei 8076R100 vor, wo sich bereits nach der 3.Passage eine untere Intervallgrenze von 74,8% bzw. 72,3%, eine obere Grenze von 95,2% bzw. 93,9% ergab; nach 7 Passagen betrug im Fall des ausgepragtesten Resistenzverlustes der Anteil der resistenztragenden Population 0,5-14,2%. Auch hier fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Verhalten der Keime in Standard-I-Bouillon und Mueller-Hinton-Bouillon. Die Kl. pneumoniae mit dem Plasmid RK1 zeigten eine sehr stabile Integration. Der Anteil der resistenztragenden Kolonien veranderte sich im Verlauf der Bouillonpassagen iiberhaupt nicht oder ergab in einigen Fallen Intervallgrenzen von 87,2 bis 99,9% der resistenten Keime an der Gesamtpopulation. Der Verlust bezog sich stets nur auf eine der beiden Resistenzeigenschaften und war unabhangig vom Kulturmedium.

Tabelle 3. Untersuchungen tiber den Verlust des Plasmids RI00 durch mehrfache Passagen in Standard-I-Bouillon; angegeben ist die Zahl der gegen die selektierenden Antibiotika resistenten Kolonien (48 Kolonien = 100%) Table 3. Examinations about the segregation of Plasmid RI00 in several passages in Standard-I-Nutrient Broth; number of colonies resistant against selecting antibiotics (48 colonies = 100%) Passagen

1

2

3

4

5

6

7

2007aRI00

Strept Tetra

48 48

48 48

47 48

48 48

48 48

48 48

48 48

2007bRI00

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 47

48 48

47 48

48 48

2007cRI00

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 47

2007eRI00

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

2008RI00

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

E. coli

Kl. pneumoniae 8049RI00

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

8076RI00

Strept Tetra

48 48

46 47

42 47

34 36

30 35

27 34

6 15

18557RI00

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

47 47

48 48

44 43

14 18

Verlust von R-Plasmiden bei E. coli

325

Tabelle 4. Untersuchungen tiber den Verlust des Plasmids R100 durch mehrfache Passagen in Mueller-Hinton-Bouillon; angegeben ist die Zahl der gegen die selektierenden Antibiotika resistenten Kolonien (48 Kolonien = 100%) Table 4. Examinations about the segregation of Plasmid R100 in several passages in Mueller-Hinton-Broth; number of colonies resistant against selecting antibiotics (48 colonies = 100%) Passagen

1

2

3

4

5

6

7

E. coli 2007aRlOO

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 47

2007bR100

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 47

48 48

48 47

48 46

2007cR100

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 46

2007eR100

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

2008R100

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

Kl. pneumoniae 8049R100

Strept Tetra

47 47

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

45 45

8076R100

Strept Tetra

48 48

47 48

41 43

39 42

22 24

12 16

2 3

18557R100

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 47

48 45

47 35

Diskussion

Die Ergebnisse zeigen, daB bei den gepruften E. coli-Stammen nur in Ausnahmefallen mit einem Verlust der durch die Plasmide RP1 oder R100 bedingten Resistenzen gegen Kanamycin, Carbenicillin, Neomycin, Tetracyclin oder Streptomycin gerechnet werden muB; bei KI. pneumoniae mit dem Plasmid R100 war teilweise schon ab der dritten Bouillonpassage ein betrachtlicher Teil der Kolonien gegen die jeweiligen Antibiotika empfindlich. Gleichzeitig fiei bei E. coli und KI. pneumoniae auf, daB sich teilweise unter 48 Kolonien eine nur gegen ein Antibiotikum empfindliche Variante fand, wobei die ubrigen plasmidbedingten Antibiotikaresistenzen unverandert bestanden. Auch in den RK1- tragenden KI. pneumoniae zeigte sich der nur ein Antibiotikum betreffende Resistenzverlust in geringem Umfang. 1m Routinelabor hatte hier die Gefahr bestanden, einen fur das entsprechende Antibiotikum empfindlichen Sensibilitatstest zu erhalten, falls nur von einer Kolonie ausgegangen worden ware. Unsere Keime zeigten damit ein anderes Verhalten als die von Lebek (8) gepruften Spezies, der bei seinen Stammen von E. coli und Klebsiella-Aerobacter bis zur

326

N. Dickgiesser

Tabelle 5. Untersuchungen tiber den Verlust des Plasmids RK1 durch mehrfache Passagen in Standard-I-Bouillon und Mueller-Hinton-Bouillon; angegeben ist die Zahl der gegen die selektierenden Antibiotika resistenten Kolonien (48 Kolonien = 100%) Table 5. Examinations about the segregation of Plasmid RK1 in several passages in Standard-I-Nutrient Broth and Mueller-Hinton Broth; number of colonies resistant against selecting antibiotics (48 colonies = 100%) a) Standard-I-Bouillon Passagen

1

2

3

4

5

6

7

Kl. pneumoniae 8049RK1

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

8076RKl

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 47

48 47

48 48

48 48

18557RKl

Strept Tetra

48 48

48 47

48 47

48 47

48 48

48 48

48 48

b) Mueller-Hinton-Bouillon Passagen 1

2

3

4

5

6

7

Kl. pneumoniae 8049RK1

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

8076RK1

Strept Tetra

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

48 48

18557RKl

Strept Tetra

48 48

48 48

48 47

48 48

48 47

48 48

48 47

70. Bouillonpassage keinen Verlust der Kanamycin- oder Streptomycinresistenzen finden konnte. Deutliche R-Plasmid-Verluste ermittelte Lebek (7, 8) jedoch bei S. heidelberg und S. typhi-murium. Die unterschiedlichen Ergebnisse sind u. a. dadurch bedingt, daB Plasmide nicht in allen Genera gleichbleibend stabil sind oder gleichbleibend stabil integriert werden. Auch die vorliegende Arbeit zeigt diese unterschiedliche Stabilitat der Integration: so verhielt sich das Plasmid R100, welches urspriinglich von E. coli isoliert wurde, in den Kl. pneumoniae wesentlich instabiler als in E. coli; dagegen zeigte das aus Kl. pneumoniae isolierte Plasmid RKl in den Bouillonpassagen kaum einen Verlust seiner Resistenzeigenschaften in den Kl. pneumoniae-Stammen. Ein Beispiel dafiir, daB auch Plasmide anderer Tribus sehr stabil integriert werden konnen, gab das Plasmid RP1, welches urspriinglich aus Pseudomonas isoliert wurde: dieses Plasmid verhielt sich sowohl in E. coli als auch in Kl. pneumoniae sehr stabil. Wie Wiedemann (11) zeigen konnte, finden auch im menschlichen Darm Dbertragungen von Plasmiden statt. Auch hierbei muB mit instabilen Integrationen von Plasmiden gerechnet werden. Deshalb muB man aus diesen Untersuchungen fur Resistenztestungen folgende SchluBfolgerungen ziehen:

Verlust von R-Plasmiden bei E. coli

327

Tabelle 6. Untere (pu) und obere (po) Intervallgrenzen bei 48 untersuchten Kolonien Table 6. Inferior limit of interval (pu) and superior limit of interval (po) in 48 colonies tested Anzahl der Kolonien mit Antibiotikaresistenz

pu

po

Anzahl der Kolonien mit Antibiotika resistenz

pu

po

48 47 46 45 44 43 42 41 40 39 36 35 34

0,9395 0,8729 0,8578 0,8284 0,8007 0,7742 0,7481 0,7233 0,6983 0,6747 0,6047 0,5827 0,5601

1,0000 0,9996 0,9950 0,9872 0,9770 0,9654 0,9529 0,9394 0,9252 0,9106 0,8637 0,8473 0,8306

30 27 24 22 18 16 15 14 12 6 3 2

0,4743 0,4122 0,3529 0,3140 0,2398 0,2041 0,1868 0,1702 0,1365 0,0473 0,0130 0,0050

0,7606 0,7053 0,6479 0,6085 0,5272 0,4842 0,4626 0,4407 0,3961 0,2526 0,1720 0,1426

a) es soUten keine Bouillonpassagen derjenigen Keime vorgenommen werden, von welchen spater auch ein Antibiogramm angelegt wird; als empfehlenswert erweist sich vielmehr ein Antibiogramm direkt vom Primarausstrich. b) zur Resistenztestung soUten stets mehrere Kolonien derselben Keimart einbezogen werden, so daB in jedem FaU auch die R-Plasmid-tragenden Stamme miterfaBt werden. Aus denselben Oberlegungen geben auch Lebek (7, 8) und Bohus (1, 2) diese Empfehlungen. Von Vorteil ist dieses Vorgehen sicher auch unter dem Gesichtspunkt, daB sich schon vor Beginn einer Antibiotikatherapie unter einer Population einige wenige plasmidtragende Erreger £lnden konnen; diese gilt es zu erfassen, damit man durch die Auswahl des Antibiotikums von vornherein eine Selektion der R-Faktor-Trager vermeiden kann. Literatur 1. Bohus, ].: Transmissible resistance in routine laboratory practice. In: Bacterial plasmids and antibiotic resistance. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1972) 2. Bohus, ].: Study of transmissible polyresistance in routine laboratory practice. J. Hyg. Epidem. (Praha) 15 (1971) 339-346 3. Datta, N.: Properties of an R Factor from Pseudomonas aeruginosa. In: Bacterial plasmids and antibiotic resistance. Springer-Verlag, Berlin - Heidelberg - New York (1972)

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N.Dickgiesser

4. Grinsted, I.: Properties of an R Factor which originated in P. aeruginosa 1822. J. Bact. 110 (1972) 529-537 5. Hedges, R. W.: R124, an fi+ R Factor of a new compatibility class. J. gen. Microbiol. 71 (1972) 403-405 6. Lebek, G.: Epidemiological investigations of R-Factors in man and animals in Switzerland. In: Bacterial plasmids and antibiotic resistance. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1972) 7. Lebek, G.: Die infekti6se bakterielle Antibiotikaresistenz. Hans Huber-Verlag, Bern (1969) 8. Lebek, G.: Der spontane Verlust episomal tibertragener Mehrfachresistenz gegen Antibiotika bei Populationen gramnegativer Darmkeime in Kulturen mit und ohne Antibiotika. Z. Hyg. 149 (1963) 255-266 9. Meyers, I.A.: Simple agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid. J. Bact. 127 (1976) 1529-1537 10. Nakahara, H.: Mercury resistance and R Plasmids in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Zbl. Bakt. Hyg., I.Abt. Orig. A 238 (1977) 51-58 11. Wiedemann, B.: Untersuchungen tiber die Verb rei tung von R-Faktoren. Zbl. Bakt. I.Abt. Orig. 212 (1970) 97-103 Dr. med. Norbert Dickgief5er, lnst. f. Hyg. u. Med. Mikrobiologie, Stadtische Krankenanstalten, D-6800 Mannheim