Untersuchungen zur Variabilität der Phaseolotoxinbildung bei Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

Zbl. Mikrobiol. 139 (1984), 109-118 [Friedrich-Schiller-Universitat Jena, Sektion Biologie, Arbeitsgruppe Technische Mikrobiologie]

Untersuchungen zur Variabilitat der Phaseolotoxinbildung bei Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Investigations on the Variability of the Phaseolotoxin Production by Pseudomonas syringae pv. phaseolicola B. VOLKSCH, F. I,APLACE und W. FRITSCHE Mit 4 Abbildungen

Summary Isolation of bacteria from a field of bean plants (Phaseolus vulgaris L.) with conspicuous symptoms of halo blight disease resulted in 123 bacterial strains from which 57 were identified as Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. At 18 °0 the phaseolot.oxin production of the isolated strains differs widely in submerse culture. Only few strains produce high amounts of phaseolotoxin being comparable with those of the reference strain 1321, while most of the strains show a low capability of phaseolotoxin production. Furthermore, we proved the stability of phaseolotoxin production of 29 strains. After one year about 50 % of the strains were extremely reduced in their capability of phaseolotoxin production. We found that the reason for this reduction of toxin production is the appearance of Tox : segregants within a 'I'ox r clone. At 24 °0 all strains (with one exception) show considerable lower amounts of toxin production or none at all: maximally 30 % of the toxin amounts synthesized at 18 °0 were produced. At 28 °0 none of the isolated strains produce phaseolotoxin. The present data allow the conclusion to be drawn that in natural environments there exists a wide spread regarding the amount and stability of the phaseolotoxin production.

Zusammenfassung Von einer 200 ha groBen Bohuenanbauflache (Sorte Esto), die sehr stark ausgepragte Symptome der Fettfleckenkrankheit zeigte, wurden 123 Bakterienisolate gewonnen. Davon konnten auf Grund morphologischer und serologischer Untersuchungen sowie Pathogenitiitspriifungen 57 Starnme eindeutig als Pseudomonas syringae pv. phaseolicola identifiziert werden. Das Phaseolotoxinbildungsvcrmogon ist bei den verschiedenen P. phaeeolicola-Wildstammen sehr unterschiedIich , Nur einzelne Isolate bilden in bezug auf den Vergleichsstamm 1321 (Rasse 2) viel Toxin, die Mehrzahl dagegen wenig oder kein Toxin. Von 29 ausgewahlten Stammen wurde nach Ablauf eines J ahres die St.abilitat der Toxinproduktion iiberpriift. Etwa 50 % der Isolate wiesen einen starken Riickgang in der Toxinproduktion auf. Zwei Stamme hatten ihr Toxinbildungsvermogen vollstandig verloren. Ursache fur den Riickgang der Phaseolotoxinproduktion ist die Aufspaltung dieser Stamme in Tox t-; und Tox r-Linien. Bei 24 °0 war die Toxinbildung der einzelnen Isolate wesentlich geringer bzw. nicht mehr nachweisbar. Es wurden maximal 30 % der bei 18 °0 gebildeten Toxinmenge produziert. Bei 28 °0 wies keiner der untersuchten Stamme eine nachweisbare Phaseolotoxinproduktion auf. Die vorliegenden Ergebnisse lassen die SchluBfolgerung zu, daB in der Natur eine breite Streuung hinsichtlich Hohe und Stabilitat des Phaseolotoxinbildungsver. mogens besteht.

Das phytopathogene Bakterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (BURK. HOLDER 1926) Young, Dye und Wilkie 1978 (YOUNG et al. 1978) syn. Pseudomonas phaseolicola (BURKHOLDER 1926) Dowson 1932 ist der Erreger der Fettfleckenkrankheit der Buschbohne (Phaseolus vulgaris L.). Charakteristische Kennzeichen dieser

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Krankheit sind chlorotische Hofe um die Infektionsstelle auf den Bliittern und wasserdurchtrankte "Fettflecken" auf den Hiilsen (STAPP 1958). Die chlorotischen Flecken werden durch die Wirkung eines vom Bakterium gebildeten Phytotoxins, des Phaseolotoxins (N-Phosphosulphamyl-ornithyl-alanyl-homoarginin), hervorgerufen (MITCHELL 1976). Die Fahigkeit zur Sekundarmetabolitbildung unterliegt im Gegensatz zu Merkmalen des Grundstoffwechsels einer groBen Variabilitat. Das trifft zum Beispiel fur die Antibiotikabildung zu. Die Funktion der Antibiotikabildung im natiirlichen Okosystem ist umstritten (ATLAS und BARTHA 1981). Beim Phaseolotoxin, einem Vertreter der Phytotoxine, handelt es sich dagegen um einen Sekundarmetaboliten, dem eine 6kologische Funktion fiir den produzierenden Organismus zuzuschreiben ist. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir am Beispiel des Phaseolotoxins, in welchem MaBe die Bildung eines Sekundarmetaboliten mit 6kologischer Funktion in einer natiirlichen Population von P. phaseolicola variiert. Dazu wurden Bakterienstamme neu isoliert und die Variabilitat und Stabilitiit der Phaseolotoxinbildung ermittelt.

Material und Methoden Bakterienisolierung Von verschiedenen Stellen einer 200 ha groBen Anbauf'lache von Buschbohnen der Sorte "Esto" bei Ermsleben (Bezirk Halle) wurde 1980 erkranktes Pflanzenmaterial gesammelt. Der gesamte Bestand zeigte typische, sehr ausgepragte Symptome der Fettfleckenkrankheit. Von diesem Material wurden kleine Pflanzenteile aus den Randzonen erkrankter Blatter und Hiilsen en tnommen. Nach auBerlicher Desinfektion mit 70%igem Athanol wurden diese in sterilem Aqua dest. mazeriert und sofort auf selektivem Kristallviolett-Agar (CROSSE 1959) ausgestrichen. N ach der Gewinnung von Reinkulturen erfolgte die Abimpfung der Stamme. Fur Vergleichszwecke verwendeten wir zwei P. syringac pv. phascolicola-Stamme aus der Stammsammlung des Instituts fur Phytopathologie der AdL in Aschersleben: Stamm 1321 (Rasse 2) und Stamm Hb-Ib (Rasse I). Zur Vereinfachung der grafischen Darstellungen wurden die isolierten P. phascolicola-Stamme fortlaufend numeriert.

Stammhaltung und Submerskultur Die Stammhaltung erfolgte auf Bouillon-Glycerin-Agar (3 g Fleischextrakt, 5 g Pepton, I g Hefeextrakt, 20 g Glycerin, 20 g Agar, 1000 ml Aqua dest.; pH 7,0). Fur die Submerskultur wurde zunachst eine Vorkultur, danach eine Hauptkultur durchgefiihrt. Sie erfolgte in 500-ml-Rundstandkolben mit 100 ml Na.hrlosung nach WATANABE (1963) mit verstarkter Pufferkapazitnt [0,55 % (NH4)2HP04' 0,26 % KH 2P0 4] auf Rundsehut.tlern. Je 10 ml einer 24-h-Vorkultur wurden in die Hauptkultur uberimpft und bei den im Ergebnisteil genannten Temperaturen 48 h kultiviert.

Pathogenitatstest Zur Erfassung der wirtsspezifischen Symptome wurden Bohnenhulsen von empfindlichen Sorten (Red Mexican VI 34 und Red Kidney 35) im Stadium der Marktreife die von uns isolierten Bohnenstamme injiziert. Von jedem Isolat wurde eine Bakteriensuspension von 24.h·Kulturen mit einer Dichte von 10 7 Zellenjml hergestellt. Mittels Injektionsspritze wurden zwei Bohnenhiilsen verschiedener Pflanzen durch 3-5 Einspritzungen inokuliert (Temperaturbereich 20-25 "C, relat. Luftfeuchte 60-80 %). Die Hypersensitivitatsreaktion wurde parallel dazu an Tabak getestet (KLEMENT et al. 1964).

Morphologische Charakterisierung Zur morphologischen Identifizierung der Bakterienisolate erfolgte die Bestimmung der Zellgr6Be und -form, der Beweglichkeit im hangenden Tropfen und des Gram-Verhaltens nach GREGERSEN (1978). Zur Charakterisierung der Kolonieausbildung wurden die Isolate auf Kristall-

Pha seol otoxinbildung b ei P seu dom o-nas sy rillgae pv. phaseoli cola

III

v iole tt- Agar geim p ft , b ei 28 °C be b ru tet und na ch 48 h d ie K onsist enz, Farbe, F orm, Profil und R anda usb ildung festgestellt. Die Pru fung del' I sol ate a u f Fluoreszenz e rfolg te a u f Kings-B-Medium (KING e t a l. 19 54).

Serologische Chara kterisieru ng Zur serologis chen Identifizier ung d el' B akt erienisola t e d ient e d e l' Dop pe ldiffus ions test n a ch OUCHTERLONY (OD D ) in P etrisch al en (0 90 m m ) mit 15 m l 0,8 %igem B a cto-Spezial a gar " Nob le" in 0,01 ml K al iumphosph a tpuffer (pH 7,2) und Zu sa tz vo n 0,0 2 % N a trium a zid . D a s Anti se rum w ur de n a ch dem bei LEISTNER ( 1978) besc hriebe ne n Verfahren mit P . p haseolico la Stam m 1 321 a.ls An ti gen ge wo n ne n. Fur den ODD-Test w ur de n ve rdu n nte A ntiseren (I : 4 m it phy si ol ogi sch e r N a CI-L osung) und hitzebeh andelte B akteri en (ca. 10 9 Zell enjrnl, a utoklav iert b ei 121 "C, 20 min) eingeset zt.. Di e Kontroll e d el' Ausbildung v on Praz.ipitat ionsl in ien w u rd e n a ch 48 h Inkubat ion be i R aum t em p era tur vo rgenom m en .

Euglena-A gardiffusionstest zur Prtifung auf phytoeffektive Wirksamkeit Di e zu prufenden Bakterienisol ate wurden auf 2%igem Agarm edium nach WATANABE (196 3) mit v erstiirkter Pufferkapazitiit aus p la t t ier t . Die Kultivierungszeit betrug funf Tage bei 18 -c. D ana ch wurden Agarblocke (Mikrokulturen 0 8 mm) ausgestanzt. und mit Euglena gracilis Z (Alg en sammlung des Pflanzenphy si ol ogi sch en Instituts Gott.ingen Nr. 1 224- 5/25) als Lndikat.or o rganism us a u f phytoeffektiv e Wirksarnk eit ge p ru ft , Die T estplatten (0 130 mm) bestanden a US e in er Gr u n dsc hic ht (40 ml) aus 2 %igem Bact o -Ag a rrne d iu rn (0,1 g N a CI, 0,4 g MgS0 4 ' 7 H 20, 0, 4 g KH2P0 4 , 0,05g CaC I2, 1,0 g (N H 4)2S0 4' 10 g Glukose , 2,0 g Glu tarni nsau re, 10 mg F e-(III) E DTA, 10- 2 m g V it am in B 1, 5 · 10 - 4 mg Vit amin B 12, 1 ml Spurenelementl osung a u f 11 A qua d est .) und ei ner D eck sch icht, di e sic h a us 3 ml a u f 45 "C a bgek u h ltem 2%igen B a cto-Wassera gar und 3 ml Euglenct-Suspensio n zu sammenset zt . A is E u glen a- Suspension d ie nte ei n e 14 Tage a lte E u glena Sohragagark u ltu r , di e mit 10 ml Aqu a d est . abgesc h we m m t wu rde . A u f d ie so vorhereiteten T estpl a t ten w urde n d ie Agarzylinder aufgesetzt-, be i 28 °C und Ku nstlicht (14 h h ell , 10 h d un k el ) 4 T age in k ub ie rt und anschlicfsend ausgewertet.

Escherichia coli-Agardiffusionstest zur quantitativen Bestimmung der Phaseolotoxin bildung Di e B est irnmung des T oxin gehal t s in del' Kulturlosung d el' ei nzeln en B akt erien st iimm e erfolg te m it tels L ochpl a t tendiffusionst es t mit Escherichia coli N 100 a ls Indi ka t oror g an ismus , rn odit'iziert n a ch STASKAWICZ und PAKOPOULOS (1 979) . Di e H erstellung d el' T est p latten er fo lgte in a n aloger W e ise w ie b eim E ug lena- Agard iffus ions test. D a s Grundmed ium hes tan d a u s 1,0 g KH 2P 0 4, 1,0 g K 2HP04, 1,0 g N a CI, 0,5 g N a -cit.rat., 4 ,0 g (NH4h S04' 2,0 g Glu kos e, 0,7 g l\Ig S0 4 . 7 H 20 a u f I I Aqua dest. (RUDOLPH , p ers onl ich e Mitteilung). D ie D eck s chi cht se t zte sic h a us 5 ml 2 %igem Bacto -W a sser a gar und 5 ml E. coli- Sus p ens ion (E 5 78 = 0,3 ) zu sa mmen. In die Pl a tten werde n L och er (0 8 mm) gestanzt und in d iese 50,ul del' zu priifenden Kulturlosung einpipettiert. D el' si ch aus b ild en d e Hemmhofdurchm esser ist ein MaO fur d ie 'l' ox inkon zentration. Auf je der 'l' estpla tte wurde ein Bezugsstand ard micgefuhrt, Da keine Pha scol ot oxin-Reinsubst.anz zur Verfii gung stand , wurde Kulturlosung v orn Stamm 1321 (48 h, 18 °C, N iihrliisung nach' WATANABE [1963] mit ve rs t a rk t er Pufferkapazitiit) v erwendet., Del' Bezugsstanda rd di ente auch zur Aufstel lung del' Eichkurve und zur Erreclmnn g de l' Toxinkonzentrationen in re la tiven Einheiten. Diese W erte wurden auf die Zelldich t e (Op ti sch e Di chte E 578 ) d el' ge teste t en Bakt erienisol ate bez ogen und als T oxineinheiten pro Zell di chte (TE/OD) aus ge dr u e kt ,

Ergebnisse Cha ra k te r is i e r u n g d er I s ol at e Mit der beschrieb en en Methode gewanne n wir 123 Bakteri en isolate, die zuniichst auf ihre ph ytoeffektive Wirksa mk eit im Eugl ena-Bi ot est ub erpruft wurden. 62 Isolate verursachten eine n H emmhof. Das bedeutet, daB un gefahr die H alfte del' I solate eine n ode r rnehrere Metabolite bildet, d ie das Wa ch stum von Euglena hemmen. Die ver-

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wendeten Identifizierungsmethoden ergaben, daB 57 Isolate Merkmale von Pseudomonas syringae pv. phaseolicola aufweisen. Es handelt sich um bewegliche, Gramnegative Stabchen in der GroBe der fur diese Art angegebenen Grenzen (KIRALY et al. 1970). Die Kolonien sind gaIlertartig bis schleimig, fluoreszieren auf Kings-B. Medium und geben teilweise die fluoreszierenden Verbindungen in den Agar abo Die Kolonien sind hellgrau glanzend, rund, konvex bis kalbkugelig und ihr Rand ist glatt. Ftinf der im Euglena-Biotest wirksamen Isolate zeigen teilweise abweichende Eigenschaften, drei davon fielen schon durch eine abweichende Kolonienmorphologie auf. Die oben genannten Merkmale sind aber noch nicht gentigend aussagekraftig fur eine Identifizierung von Bakterienstammen. Die serologische Bestimmungsmethode stellt daher eine wesentliche Erganzung fur die Bakteriendiagnose dar. So konnte TAYLOR (1971) nachweisen, daB serologische Methoden fur die spezifische Identifizierung von P. syringae pv. phaseolicola eingesetzt werden konnen. Rassenunterschiede sind aIlerdings serologisch nicht nachweisbar (GUTHRIE 1968, TAYLOR 1971). Die Spezifitat des verwendeten Antiserums wurde durch Kreuzreaktion gegen 18 verschiedene Pseudomonas-Arten bzw. -Stamme tiberprtift (TabeIle 1). Von diesen 18 Stammen reagierten 16 eindeutig negativ. Bei P. mors-prunorum, Stammo C.9RU und PM 57, bildeten sich schwache und unscharfe Prazipitationslinien. Daraus wird ersichtlich, daB das verwendete Antiserum spezifisch wirkt, d. h. Kreuzreaktionen des Antiserums mit anderen Pseudomonas-Arten sind nahezu auszuschlieBen. Von den 62 Stammen reagierten funf eindeutig negativ. Es handelt sich dabei um die bereits obengenannten, sich abweichend verhaltenden Stamme. AIle anderen Stamme zeigten eine positive Reaktion. Beispiele dafur sind in Abb. 1 dargestellt. Die aufgrund der morphologiTabelle 1. Serologische Reaktion des Antiserums von Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1321 mit verschiedenen Pseudomonas-Arten (Spezif'it.atsprufung) Art

Stamm

P. aeruqinosa P. [luorescens P. syringae: pv. syringae pv. syringae pv. syringae pv. tabaci pv. lachrymans pv. lachrymans pv. mors-prunorum pv. mors-prunorum pv. mors-prunorum pv. mors-prunorum pv. mors-prunorum

Jena IMET 10403 .Jena IMET 10406

pv. taqetis pv. pisi pv. tomato pv. tomato pv. tomato pv. phaseolicola (Rasse 1) pv. phaseolicola (Rasse 2)

Aschersleben 524 Aschersleben W50 Aschersleben J59 Aschersleben pp 112 Aschersleben PI/01 Aschersleben 61/15 Aschersleben PM 57 Aschersleben 330 Aschersleben D.359 Aschersleben C.9RU Aschersleben D.5 Aschersleben 99 Aschersleben 436 Aschersleben 33 Aschersleben 34 Aschersleben 55 Aschersleben Hb-Lb Aschersleben 1321

Serologische Reaktion

(+)

(+)

+ +

Zeiehenerklarung - keine Reaktion, (+) schwachepositive Reaktion, + positive Reaktion.

Phaseolotoxinbildung bei P seudom on as 8yringae p v. p haee olico la

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Abb. 1. O uchterlony-Doppeld iffu sionstest zur se rologische n I d entifizierung der B ak te ri en isola t e. (I ) P.lachryman8 61 /1 5, (2) P . m or8-prunorum P1\1 57, (3) P . mor8-pru norum C.9 RU, (4) P. p ha seolicola-Isol at Nr. 4, (5) P. phaseoli cola 1321, (6) P. phaseoli cola Hb-Ib, (AS ) Ant iserum.

schen Merkmale getroffen e Einteilung der Isolate wird durch di e sero logische Unte r suc hung bestiiti gt und erlau b t eine einde ut ige Zu ordnung d er 57 Stii m me zur Art P . syringa e pv. phaseolicola . Di ese 57 P . pha seolicola-St amme zeigt en aue h di e typisehe hypersensit ive R eaktion au f Tabak und im P athogeni t iit stest a n Bohnenhiilsen F et t fl ecken mit Fxsudatbildung. V ariabil it iit d er Ph a s e olot oxin b ildung in e i ne r natiirli ch en Popul a ti on v on P . phaseolicola Es wurde die Phaseolotoxinbildung d er isolierten Stii mme in Su bm er skultur bei 18 °C ermittelt. 18 °C ist das Temperaturoptimum fur di e Phaseolotoxinbildung (MITCHELL 1978). Wi e au s Abb. 2 zu er sehen ist , bestehen zwi sch en den einzelnen Isolaten hinsicht lich ihrer Phaseolotoxinbildung gro Be Unterschi ed e . Etwa drei Viertel der Stiimme (42 I solat e) zeigen schwac he (unter 20 TE/OD) , ein Sechstel (9 Isolate) nur m iiJlige T oxinbildung (zwisch en 20-50 TE/OD) . Sowohl d ie Zahl der St iim me mit hoh er (tiber 50 TE/OD ) al s a uc h fehl ender T oxinbildung ist gering. Daraus ist zu schliefsen, daB in der unt er su ch t en n aturlich en P opulation Stamrne mit schwachem Phaseolotoxinb ild ung sver mogen v orherrsch en, St ab ili t iit d er Ph a s e ol ot oxinbildung Urn di e Stabilitat des Merkmals Pha seolotoxinbildung zu prufen, wurde bei 29 ausgewahlt en Stammen nach einem Jahr die Toxinbildung bei 18 °C erneut untersucht . Die Stammhaltung wiihrend di eser Zeit erfolgte auf Bouillon-Glycerin-Agar 8

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Abb, 2. Phuseolotoxinproduktion der v er schi edenen P seudomonas syringae pv. phaseoli eola.Isolat e aus eine r n atiirli chen Population b ei 18 °e (1980) .

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Stammnummer "Ab b . 3. Stabilitat der Phaseolotoxinproduktdon de r verschied enen P seud omon as syri ngae pv. pha8eoUeola· I sol at e bei 18 -c, 1980 0 und 198 1 • .

Pha seolot oxinbildung b ei Ps eudomonas syri ngae pv. phaseoli cola

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bei 18 DC (Uberimpfung et wa zwei mo nat. lich ). Das in Abb. 3 d argestellte Ergebnis zeigt , daf fa st di e H alfte d el' Starnrne in ihrem 'I'oxinbildungsvermogen sta bil ist. Eine m ehr od er weni ger st ark a usge pragt e Abnahme d es T oxinbildungsverrnogen s zeigten 12 St am rne und eine n v olligen Verlust 2 St arnme . Eine Beziehung zwi sch en d el' Hohe des Toxinbildungsverrn ogen s und del' Sta b ilitiit besteh t ni cht. Aufspaltung e i n ig e r Starn m e in to x i n p os it ive und t oxinne gative Lini en D el' bei eine r R eih e v on Sta mmen beob achtete Riick gang bzw. Verl us t des Toxinbildungsvermogen s konnt e a u f einer Aufspaltung diesel' Sta mme in produzierende (Tox t ) und ni chtproduzierend e Linien (Tox zuriickzufiihren sein . Zur Kliirung di eser F rage wurden ausg ewahlt e Sta rnme a u f Watanabe-Medium (s. Mater ial und Method en) ausplat t iert und nach Au sbildung v on Einzelkolonien mit Agar, d er den Indikatorst am m E . coli N 100 en thielt , tib er schi chtet. Das in Tabelle 2 dargestellte Ergebnis zeigt , d af die einzelnen Starnm e in verschiedenem MaBe aufsp a.lten. Stabile Starn me und d er eben falls stabile Ver gleieh sstamm 13 21 zeig en k eine oder nul' sehr geringe Aufspaltung, bei inst a bilen Stamme n dagegen sind Aufspaltungen in groBem Umfang nachweisbar. Bei Stamm Nr . 6 zeigen bis zu 68 % del' Kol onien nicht mehrdas Merkm al Toxinbildung. r

)

Ta b elle 2. Aufspaltung v ersc h iede ne r St a m m e von P seudomonas syringa e pv. p haseolicola in T ox +u nd T ox r -Linien S tam m

T ox inprod.

Gesamtzahl del' unter sueh t en E inzelkolonien

da von T ox -

0 0 0 2 26 13 64

1321

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240

N l'.l

st a b il

213

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N r . ll Nl'.2

stah il instabil

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N l'. 4

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125

Nr. 6

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93

98

Anteil del' T ox "K olonien in % 0 0 0 1,5 33,7 10,4 68,4

Urn d ie Ursache del' starken Aufspaltung zu klaren , wurde untersucht, ob ein mo glich er Zu sammenhang zwi sch en dem Verlust des Merkm al s T oxinbildung und spont anen Plasmid-Verlusten besteht. Di ese an Stammen anderer H erkunft d urchgefiihrt en Unter suchungen ergaben , d af P . phaseolicola-Stamme bis zu drei Plasmidspecies en t halt en, die Aufspaltung in 'I'ox t -L inien jedoch ni cht m it eine m Plasmidverlust gekop pelt ist. Ph ase o l o to x in bild un g s v e r m o g e n b ei ver se h i e d e nc n T ern p era tur en Vergleich ende U ntersuc hung en zum T emper atureinfluB a uf die Phaseol otoxinbildung in Submerskultur wurden bei 18, 24 und 28 DC durchgefiihrt . Di e in Abb . 4 d argestellten Ergebnisse zeigen , d af b ei 24 DC di e Ph aseolot oxinbildung wesentli ch gcr inger ist als bei 18 DC ode r ni cht mehr naohweisb ar ist. Ein Stam m (Nr . 11) v er hi elt sich abweiche n d : er zeigt e bei 18 und 24 DC etwa d ie gleic he T oxinbildung. B ei 28 °C bildete keiner d el' unt er su ch t en Stiimme n ach weisbare Men gen Phaseolotox in.

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Stammnummer Abb. 4. Einflul3 d er T emp er a tur auf d ie P haseolo t ox inpr oduk t ion der v er schiedenen Pseu domonas sy ri ngae pv. p has eoli cola .I solat e bei 18 °C 0 u n d 24 °C Illl .

Diskussion In ein er nat.ur lichen Populat ion von P . -phaeeolicola , wie sie auf einem mit der F ett· fleckenkrankheit befallen en Buschbohnenfeld vorliegt , besitzen u ber 90 % der Stamme di e Fiihigkeit zur Phaseolotoxinbildung. Bei dem iib erwiegenden Teil dieser St amme (et wa 85 %) ist das Merkmal schwac h bis maBig a usgepragt , Diese Befunde zeigen , daB es sich beim Phaseolot oxin um eine n Sek und iirm et aboliten handelt, der gemaf seine r okologisehen Funkt ion bei naturlich vorkommenden St ammen in der R egel vo rhanden ist. Offen bar ist bereit s eine schwa ehe bis miiBige P ot en z zur Phaseolot oxinbildung fur die E xistenz des B ak t eriums bei den unt ersu cht en F eld bedingungen aus reiche nd , wie die qu antitative ~Ierkm alsvert eilung zeigt (Abb. 2). Bei Kultivierung auf synt het ische m Med ium zeigt en nur etwa 30 % der St iimme eine st abile Toxinprodukti on. Insta bile Stii mme spalten in 'I'ox t - und 'I'ox r -Li nien auf. Die Ursache der Aufspalt ung ist un geklart. E ine Punktmutation ist wegen der hohen Frequenz der Aufsp altung au szu schlielren. Dagegen spricht auch die Tatsa che, daB bish er keine 'I'ox r -R evert a nten aus 'I'ox v-Linicn erhalten wurde n (JAMIE SON et al. 1981). Da der Verlust des Phaseolotoxinbildu ngsvermogen s ni cht mit einem Plasmid verlust verbunde n ist, k ann a uch die spontane Eliminierung vo n Plasm id en nicht zur Erk liirung der Aufspaltung herangezogen werde n . Mdglicherweise liegen di esem Phanamen site-spez ifische Inver sionen zugrunde, wie sie vo n ZIEG et al. (1978) d iskut ier t werden . Fur fast aIle St iimme wurde nachgewiesen , daB d ie T oxinbildung bei 18 °0 hoher als bei 24 °0 ist . Das zeigt , daB da s niedrige Temperaturop t imum eng mit der Phaseolotoxinbiosynthese gek oppelt ist . Das Wach stumsop t imum liegt bei 25 °0 . Das Temperaturoptimum des W achstums und der P rodukt bildung st imme n also nicht iiber ein. Es ist bekannt , daB boi hohen Temperaturen eine Infektion an Bohnenpflanz en mit P . phaseolicola in wesetlich ger ingerem MaBe als bei niedrigen Temper aturen

Phaseolotoxinbildung bei Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

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zur Auspragung der typischen Chlorose-Symptome fiihrt. Hieraus laBt sich auf einen Zusammenhang zwischen der Ausbildung der Krankheitssymptome und der Phaseolotoxinbildung schlie13en (MITCHELL und BIELESKI 1977). Die im Labor erzielten Ergebnisse zur Instabilit.at der Stamme lassen sich nur bedingt auf das Bakterien Pflanzen-Interaktionsgefiige iibertragen, da dort andere Bedingungen vorliegen, welche diese Prozesse selektiv beeinflussen konnten. Der hohe Prozentsatz der vom Feld isolierten toxinpositiven St.amme weist darauf hin. Die Phaseolotoxinbildung ist eines der die Pathogenitat des Bakteriums bedingenden Merkmale. Dieser Faktor ist im Verlaufe der Coevolution von Bakterien und Wirtspflanzen optimiert worden. Das nachgewiesene Verhalten der Bakterienstamme ist als ein Ausdruck dieser Optimierung anzusehen. Schliisse auf die Pathogenitat der Stamme lassen sich aus dem Merkmal Phaseolotoxinbildung allein nicht ziehen, da hierfur ein Komplex von Merkmalen verantwortlich ist. Die serologischen Untersuchungen fuhrte Frl. 1. ROTTER (Friedrich-Schiller-Universitat, Sektion Biologie) in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. NAUMANN von der Abteilung "Pflanzliche Bakteriosenforschung" des Instituts ftir Phytopathologie Aschersleben der AdL durch, Von dieser Einrichtung wurden uns freundlicherweise auch das Antiserum und eine Reihe phytopathogener Pseudomonas·Stamme zur VerfUgung gestellt. Die Pathogenitatsteste wurden von Frau E. HENNING im VEG Pflanzenproduktion Aschersleben durchgefiihrt. Wir danken diesen Kollegen fur ihre freundliche Unterstiitzung. Weiterhin danken wir Herrn Dr. RUDOLPH, U niversitat Gott.ingen, fur den E. coli N -100 Stamm und Herrn Dr. OHMANN, Universit.at Halle, fur die Uberlassung des Stammes Euglena gmcilis Z.

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