Untersuchungen zur Physiologie der Chinolinalkaloide bei Echinops spec.

Biochem. Physiol. Pflanzen 169, S. 461-470 (1976)

Untersuchungen zur Physiologie der Chinolinalkaloide bei Echinops spec. Pham THANH K y und PETER SCHRODER Sektion Pharmazie der Martin-Luther- Universitat Halle-Wittenberg, Halle/S.

Studies on the Physiology of the Quinoline Alkaloids in Globe Thistles (Echinops spec.) Key T e r mIn d ex: quinoline alkaloids, echinorine, echinoramine I, alkaloid artefacts, tissue cultures; Echinops spec.

Summary The content of echinorine, the main alkaloid of the globe thistles, was determined at different developmental stages of Echinops ritro. The highest alkaloid amount was found in the fruits of this and other species (1.8 - 2.2 %). One remarkable phase of echinorine biosynthesis proceeds during seedling development. Echinorine was proved to be accompanied by small amounts of other Dragendorff-positive substances in six Echinops species. From these echoniramine I was always available and therefore investigated in detail. Echinorine as well as echinoramine I seem to be specific constituents of the genus Echinops. However, both easily form artefacts. Conditions for growth of tissue cultures of Echinops sphaerocephalus are described.

Einleitung

Echinorin (Abb. 1: I) wurde von uns bisher als einziges genuines Alkaloid in den Friichten und in anderen Organen von Echinaps ritra sowie E. aphaeracephalus isoliert und als 1-Methyl-4-methoxy-chinolinium-Verbindung identifiziert (SCHRODER und LUCKNER 1968a). In friiheren Arbeiten konnten 2 andere Alkaloide isoliert und strukturell aufgekHirt werden: Echinopsin (II) und Echinopsidin (III) (GRESHOFF 1900; KLEIN und SCHUSTA 1930; SUCHOMUTH 1957; FROLOWA et al. 1957; BANKOWSKI et aL 1963; AWRAMOWA 1964). Die artefizielle Bildung dieser beiden Alkaloide konnte mit chromatografischen Methoden wahrscheinlich gemacht (BANKOWSKI et al. 1963) und apater mit Hilfe isotop markierter Untersuchungen bewiesen werden (SCHRODER und LUCKNER 1968b). Echinopsin® hat als Herztonikum Eingang in die Therapie der Sowjetunion und Bulgariens gefunden. 1969 wurde iiber das Vorkommen von Echinin (1-Methyl-3-methoxy-4-hydroxy-1,2-dihydrochinolin) mitgeteilt (DOPKE und FRITSCH 1969). Kiirzlich ist es uns gelungen, ein weiteres Alkaloid aus Echinops-Friichten zu siolieren und weitestgehend strukturell aufzuklaren (SCHRODER et al. unveroffentlicht). Durch Variation der friiher angewandten chromatografischen Technik war es moglich, dieses bisher unbekannte Alkaloid von Echinorin zu unterscheiden. Es war auf Grund

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PHAM THANH

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P. SCHRODER

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(ECHINORAMIN I) II[

Abb.1. Strukturell bekannte geniune und artefizieUe Echinops-Alkaloide.

seiner physikochemischen Eigenschaften (z. B. keine Salzbildung) bei der Isolation von Echinorin stets abgetrennt worden. Das neue Alkaloid konnte als eine Verbindung identifiziert werden, die zu der Gruppe der Echinoramine zu rechnen ist. Es handelt sich um ein Reaktionsprodukt aus Echinorin und Asparagin, das synthetisch leicht zuganglich ist. Flir dieses Alkaloid wurde der Name Echinoramin I (Abb. 1: IV) vorgeschlagen (SCHRODER 1974). Es stellt chemisch wahrscheinlich ein (1-Methyl-4-methoxy-1,4dihydrochinolyl-4)-1-carboxy-2-carbamoyl-athyl-1-amin dar; nicht gesichert ist bisher das Vorhandensein der Methoxygruppe in Position 4 des Chinolinringes bei dem Naturstoff (SCHRODER et al., unverOffentlicht). Bei der Artefaktbildung, als deren stabile Endstufe Echinopsin anzusehen ist, stellt Echinorin das hauptsachliche Ausgangsmaterial flir die Alkaloidumwandlung im alkalischen Milieu dar. Aber auch Echinoramin Ila.!3t sich alkalisch quantitativ zu Echinopsin sowie Asparaginsaure spalten, und im sauren Milieu entstehen in ihrer Struktur bisher nicht aufgekiarte Artefakte (PHAM THAN K Y 1974). Das Auftreten einer Verbindung yom Typ der Echinoramine in der Reihe der natlirlich vorkommenden Chinolinalkaloide berechtigt zu der Frage, ob es sich um eine genuin gebildete oder eine bei der Lagerung und Aufarbeitung der Frlichte entstehende Substanz handelt. Da die in vitroSynthese der Verbindung unter sehr schwach alkalischen Bedingungen und bei Raumtemperatur glatt vonstatten geht (SCHRODER 1974), mu.!3 die Frage nach einer eventuellen nichtenzymatischen Biosynthesereaktion gestellt werden. Jedenfalls la.!3t sich eine

1111

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II

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solche nichtenzymatische Bildung von Echinoramin I aus der Chinoliniumverbindung Echinorin und dem Asparagin in Kompartimentierungen der Zelle mit entspreehendem pH durchaus denken. Die hier mitgeteilten Untersuchungen sollten zur Beantwortung folgender Fragen beitragen: . 1st das aus den Frtichten isolierte Echinoramin I auch in anderen Pflanzenteilen von Echinopsarten wiihrend der ontogenetischen Entwicklung nachweisbar und lassen die Extraktionsmethoden, auf Frtichte und Pflanzenteile anderer Entwicklungsstadien von Echinopsarten angewandt, Aussagen dartiber zu, ob Echinoramin I ein genuin gebildetes Alkaloid ist oder erst wahrend der Lagerung undjoder Aufarbeitung des Pflanzenmaterials entsteht? In welcher Konzentration kommt Echinoramin I im VerMltnis zu Echinorin in Frtichten und Keimlingen verschiedener Echinopsarten vor? Lassen die jetzt angewandten Untersuchungsmethoden tiber die frtiher erhaltenen Ergebnisse hinaus weitere Aussagen zur Artefaktbildung bei den Echinopsalkaloiden zu? Material und Methoden Untersuchungsmaterial und Herklinfte. - Echinops ritro L. Herkunft: Firma Deutscher Saatgutvertrieb Quedlinburg (1)1); Botanischer Garten der Technischen Universitat Dresden (DDR); Botanischer Garten der Landwirtschaftlichen Fakultat der Universitat Sofia (Bulgarien); Institut de Botanique de Strasbourg (Frankreich). Echinops sphaerocephalus L. Herkunft: Wildvorkommen am Rollsdorfer See bei Halle (DDR);

Gradina Botanica I.M.F. Tirgumures (Rumanien)1 Echinops commutatus JUR. Herkunft: Gradnia Botanica Cluj (Rumanien); Jardin Botanique de

Dijon (Frankreich); Botanischer Garten der Universitat Riga (UdSSR)1 Echinops exaltatus SCHRAD. Herkunft: Botanischer Garten der Padagogischen Hochschule Potsdam (DDR) (!); Botanischer Garten der UniversiattRiga (UdSSR): Botanischer Garten der Uni-

versitat Rostock (DDR). Echinops erevanensis MULK. Herkunft: Botanischer Garten der Universitat Riga (UdSSR) (I); Botanischer Garten der Universitat Rostock (DDR). Echinops macrophyllus BOISS. et HAUSSK. Herkunft: Botanischer Garten Aschchabad (UdSSR) (I); Botanischer Garten der Akademie der Wissenschaften Erevan (UdSSR). Echinops microcepha.lus SIBTH. et SM. Herkunft: Botanischer Garten der Akademie der Wissenschaften Vlicni.t6t (Ungarn)1 Kultivierung. - Anbau im Freiland: Die Friichte ausgewahlter Proben wurden zunachst im Gewachshaus in Pikierkasten zur Keimung gebracht und nach einer gewissen Ubergangsperiode im Friihbeet im FreiIand auf dem Gelande des Instituts fiir Biochemie der Pflanzen der AdW der DDR, Halle, Weinbergweg, auf maBig kalkhaltigem Boden kultiviert. Anzucht von Keimlingen: Die zu Alkaloiduntersuchungen benotigten Keimlinge wurden in der fruher beschriebenen Weise angezogen (SOHRODER und LUCKNER 1968c). Dazu wurden Friichte in einer Petrischale auf mit White-Nithrliisung angefeuchtetem Zellstoff ausgelegt und bei 22 °0 und einem Hell-Dunkel-Rhythmus von 14 zu 10 h kultiviert. 1) Das durch Ausrufezeichen gekennzeichnete Pflanzenmaterial wurde zur quantitativen Alkaloidanalytik verwendet.

·,1

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PRAM THANH Ky und P. SClIRODER

Analytische Methoden 1. Qualitativer Alkaloidnachweis. - Die zerkleinerten und unzerkleinerten Friichte aller unter Echinops spec. aufgefiihrten 1968 angebauten Provenienzen sowie aus den geernteten Friichten angezogene 8 Tage alte Keimlinge wurden gepriift. 2 g des Pflanzenmaterials wurden jeweils mit ca. 50 ml Methanol bzw. Methanol-Eisessig-Gemisch (9: 1) etwa 20 h lang im Soxhlet-Apparat extrahiert. Die erhaltenen Extrakte wurden erstens sofort auf mit Kieselegl G "Merck" beschichteten Platten (0,5 mm Schichtdicke) aufgetragen und entwickelt und zweitens nach dem Einengen im Wasserbad diinnschichtchromatografisch untersucht. Ais Laufmittel diente Wasser/Eisessig/Methanol/Chloroform (1: 1: 3: 5), und als Detektionsmittel wurde MUNIERS Reagens (1953) auf die getrockneten Platten aufgespriiht. Zum Vergleich mit der heiBen Extraktion wurden in Parallelansiitzen zerkleinerte und unzerkleinerte Friichte mit den gleichen Losungsmitteln bei Zimmertemperatur bzw. bei 0 °C durch 20 h Schiitteln extrahiert und wie beschrieben chromatografisch untersucht. 2. Bestimmung des Gesamtalkaloidgehaltes in Echinops-Friichten. - 2,00g zerkle inerte Friichte wurden mit 100 ml Petroliither durch Soxhletextraktion entfettet, dann mit 100 ml Methanol 20 h extrahiert. Yom Extrakt wurde das Losungsmittel im Vakuum abdestilliert. Der Riickstand wurde mit 50 mIl N NaOH versetzt und in einem 100-ml-Rundkolben 2 hunter RiickfluBkiihlung gekocht, wobei die vorhandenen Alkaloide vollstandig in Echinopsin iibergefiihrt wurden. Nach dem Erkalten wurde die Losung durch Watte in einen 250-ml-Scheidetrichter filtriert, der Rundkolben 2mal mit 5 ml 1 N NaOH nachgewaschen und die Losung gleichfalls in den Tropftrichterfiltriert. Das Filtrat wurde 8mal mit je 15 ml Chloroform ausgeschiittelt. Das iiber Natriumsulfat siccum getrocknete Chloroform wurde im Vakuum auf etwa 10 ml abdestilliert und iiber eine Saule (innerer Durchmesser 10 mm, Schichthohe 80 mm) von Aluminiumoxid VEB Chemiewerk Greiz-Dolau (neutral, standardisiert nach BROCKMANN) gegeben. Das Echinopsin wurde mit 200 ml Chloroform von der Saule eluiert und das Eluat im Vakuum zur Trockne abdestilliert. Der Riickstand wurde mit wenig Methanol aufgenommen, die Echinopsin]osung durch Watte in einen 50-mlMeBkolben filtriert und unter Nachwaschen mit Methanol auf 50,00 ml aufgefiillt. - Das Echinopsin wurde wie unter 4. beschrieben bestimmt. Die Fehlergrenze bei der Bestimmung des Gesamtalkaloidgehaltes betrug ± 5 %. 3. Bestimmung des Echinorin- und Echoniramin I-Gehaltes. - Eine bestimmte Menge des Pflanzenmaterials wurde wie unter 2. beschrieben mit Methanol extrahiert. Der eingeengte Extrakt wurde auf mit 11 g Kieselgel PF 254 "Merck" pro Platte beschichteten Chromatographieplatten aufgetragen und in dem oben beschriebenen Laufmittel entwickelt. Die Kieselgelzonen mit Echinorin und Echinoramin I wurden abgeschabt, mit je 150 ml Methanol eluiert und das Methanol abdestilliert. AnschlieBend wurden die Alkaloide durch zweistiindiges Erhitzen mit 30 mIl N NaOH in Echinopsin iibergefiihrt, dieses durch sechsmaliges Ausschiitteln mit Chloroform aus der waBrigen Losung extrahiert und die auf etwa 10 ml eingeengte Ch]oroformlosung we iter wie unter 2. beschrieben, iiber Aluminiumoxid gereinigt und das Echinopsin photometrisch bestimmt (4). 4. Photometrische Bestimmung von Echinopsin. - 1,50 ml der methanolischen AlkaloidlOsung wurden mit 0,05 ml methanolischer 1 N Natronlauge (Herstellung s. DAB 7 - DDR) und 0,50 ml Eisen-Ill-chioridiosung (10,00 g FeCl 3 • 6 H 2 0/100,0 ml Methanol) versetzt. Die Extinktion der Losung wurde nach 2 min im Spekol bei 525 nm und 10 mm Schichtdicke gegen eine Mischung aus 1,50 ml Methanol, 0,05 ml methanolischer 1 N NaOH und 0,5 ml der Eisen-III-chloridlOsung gemessen. Herstellung der Ausziige fiir den Aminosaurenachweis. - Etwa 10 g zerkleinerte Friichte von E. ritro wurden mit 100 ml 80%igem Athanol etwa 20 h im Soxhletapparat extrahiert. Yom Extrakt wurde das Athanol im Vakuum abdestilliert. Die eingeengte Losung wurde zunachst dreimal mit je 30 ml Chloroform ausgeschiittelt und dann weiter zur Trockne eingeengt. Der Riickstad wurde in Wasser gelost, zentrifugiert, filtriert und das Filtrat iiber eine Dowex 50-WX-2-Saule (mesh 50-100, H+-Form) gegeben. Die Saule wurde mit Wasser nachgewaschen und die Aminosauren anschlieBend mit 4%iger AmmoniaklOsung eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum vom Losungsmittel

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Physiologic von Echinops-Alkaloiden

befreit, der Riickstand in 10 ml Wasser aufgenommen und die Liisung im Aminosaureanalysator gepriift.

Ergebnisse

1968 wurden 114 Echinaps-Proben aus Botanischen Garten, einer Eigensammlung aus Wildvorkommen und von einem Saatgutvertrieb ausgesat. Die als E. persicus Ster. zugesandte Art ist unter unseren Bedingungen nicht ausgekeimt und E. macraphyllus im Freiland nicht zur Fruchtreife gelangt. 1m Ergebnis del' taxonomischen Bestimmungen standen uns sechs Arten zur phytochemischen Untersuchung zur Verfugung. Echinoramin I laBt sich auch unter schonendsten Bedingungen aus dem biologischen Material extrahieren und identifizieren, d. h. es ist moglich, bei Verwendung von Methanol und auch Methanol-Eisessig-Gemisch als Extraktionsmittel Echinoramin I aus unzerkleinerten Fruchten sowohl bei Zimmertemperatur als auch aus zerkleinerten Fruchten und Keimlingen z. B. von E. ritra und E. sphaeracephalus bei °C zu extrahieren und dunnschichtchromatografisch nachzuweisen, ohne daB neben Echinorin andere dragendorffpositive Flecke sichtbar wurden. Somit kann dieses Alkaloid nach dem heutigen Stand einer Definition den naturlich gebildeten Pflanzenstoffen zugeordnet werden. Bei allen im neutral en oder sauren Milieu durchgefUhrten Extraktionsverfahren bildet das Echinorin die Hauptmenge der nachweisbaren Alkaloide und Dragendorffpositiven Substanzen. Dessen Bezeichnung als genuines Hauptalkaloid kann damit bestatigt werden (SCHRODER und LUCKNER 1968c). Als einziges immer neben Echinorin vorhandenes Alkaloid wurde bei allen von uns erprobten Extraktionsmittels und -bedingungen in den Fruchten und Keimlingen jeder der sechs Echinopsarten Echinoramin I nachgewiesen sowie die von uns mit Y bezeichnete Verbindung (s. unten). Echinorin, Echinoramin I und die weiteren Dragendorff -positiven Verbindungen hatten unter den angegebenen chromatografischen Bedingungen folgende R F - Werte: Echinopsin - 0,89; Y - 0,78; Z2 - 0,71; Zl - 0,69; Echinopsidin - 0,57; Echinorin - 0,52; Echinoramin I - 0,40; X 2 - 0,29; X3 - 0,15; X 4 - 0,12. Echinopsidin ist bei unserCl1 qualitativen Untersuchungen von Fruchten der 6 Arten nur in den Soxhlet-Extraktionen mit Methanol, nicht aber mit MethanoljEisessig (9: 1) dunnschichtchromatografisch nachweisbar gewesen. Nach einer halbquantitativen Bewertung der Chromatogramme kann die aufgetretene Echinopsidinmenge jeweils unter der von Echinoramin I angegeben werden. Echinopsin ist nicht oder nur in Spuren auch bei unter Erwarmung hergestellten Extrakten ganzer und zerkleinerter Fruchte sowie Keimlinge dieser Spezies aufgetreten, wenn die Rohextrakte sofort dunnschichtchromatografisch untersucht wurden. Das Alkaloid ist aber immer bis etwa zur 2fachen Menge von Echinoramin I halbquantitativ nachgewiesen worden, wenn die Probenextrakte weiter verarbeitet worden waren oder uber langere Zeit standen, wie das zur quantitativen Bestimmung del' Alkaloide z. B. del' Fall war. Das bedeutet, daB die Hauptmenge dieses Artefaktes nach del' Extraktion aus dem Pflanzenmaterial durch Bearbeitung del' Losungen aus den nativen Alkaloiden entstehen muB und nicht bereits in den Fruchten vorliegt.

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PHAM Tn.\NH

Ky und

P. SCHRODER

Die Flecke, die mit X 2 , X3 und X.j, bezeichnet wurden, sind Dragendorff-positive Substanzen, die sich nach Isolierung mittels praparativer Schichtchromatographie und nachfolgender natronalkalischer Behandlung alle in Echinopsin iiberfiihren lieBen (PHAM ~HAN Ky 1974). Da diese Flecke nur in Methanolextrakten und zudem unregelmaBig beobachtet wurden, sind diese Verbindungen nicht einer naheren Charakterisierung zugefUhrt worden. Der mit Y bezeichnete, mit Muniers Reagens gelborange anfarbbare Fleck erwies sich als einzige nach Anreicherung und alkalischer Hydrolyse nicht in Echinopsin iiberfUhrbare Verbindung. Damit lag die Vermutung nahe, daB Y mit dem von DOPKE und FRITSCH (1969) als Echinin bezeichneten Alkaloid identisch ist, fUr das die Autoren auch ahnliche Polaritat und ebenfalls keine Spaltung in 1-Methyl-chinolon-(4) beschrieben hatten. Der diinnschichtchromatografische Vergleich beider Substanzen schloB jedoch eine solche Ubereinstimmung aus: auf Kieselgel G "Merck" unter Verwendung des Laufmittels Benzol/Essigester/Methanol (2: 2: 1) und einer Schichtdicke von 0,5 mm wurde fUr Y - RF 0,48 und Echinin = 0,61 ermittelt (DOPKE, pers. Mitt.). Eine dem Echinin entsprechende Dragendorff-positive Verbindung wurde bei unseren bisherigen Untersuchungen an 6 Echinapsarten nicht beobachtet. Die Flecke Zl und Z2 konnten eindeutig als aus Echinoramin I entstandene Artefakte identifiziert werden. Die gleichen Verbindungen werden auch nach salzsaurer Hydrolyse gebildet. TIber die Struktur von Zl und Z2 konnen z. Z. noch keine definitiven Aussagen gemacht werden. Beide Verbindungen sind durch alkalische Behandlung in Echinopsin und einen bisher nicht identifizierten Rest spaltbar. Als Ergebnis der qualitativen Untersuchungen an den von uns ausgewahlten sechs Echinapsarten kann festgestellt werden, daB nur das Hauptalkaloid Echinorin und das Echinoramin I nativ gebildet zu werden scheinen. Sie sind als gattungsspezifische Alkaloide in der Familie der Asteraceae anzusehen. Die Untersuchung des Spektrums freier Aminosauren in Extrakten von Echinaps ritra-Friichten in einem nach MOOR und STEIN (1948, 1949) modifizierten Aminosaureanalysator ergab einen im Verhaltnis zu anderen Aminosauren, wie Glutaminsaure, Lysin, Asparaginsaure u. a., iiberraschend geringen Anteil an Asparagin (PHAM THAN Ky 1974). Moglicherweise ist die Entstehung von Echinoramin I an spezifische Kompartimentierungen gebunden. AuBerdem scheint das Auffinden weiterer Alkaloide vom Typ der Echinoramine in der Gattung Echinaps - auch in Abhangigkeit von der Provenienz - nicht ausgeschlossen zu sein. In friiheren Untersuchungen wurden drei ausgepragte Phasen einer starken Alkaloidbiosynthese und -akkumulation bei E. ritra nachgewiesen: Wahrend der Keimlingsentwicklung sowie zur Zeit der Stengelentwicklung und Fruchtreife ab der 2. Vegetationsperiode. Die quantitativen Alkaloiduntersuchungen bei den von uns geziichteten 6 Arten beschrankten sich auf die Friichte und die aus ihnen angezogenen Keimlinge der oben gekennzeichneten Provenienzen. Bei Keimlingen von E. ritra und E. sphaerocephalus gibt es etwa zwischen dem Ergriinen der Kotyledonen (ca. 6. Tag nach der Aussaat) bis zur Entwicklung des ersten Laubblattes (etwa 12. Tag) ein Stadium absoluter Alkaloidbildung und -akkumulation (SCHRODER 1972; SCHRODER und LUCKNER 1968 c). Als Untersuchungstermin wurde der 8. Tag nach der Aussaat festgelegt, da auch

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Abb. 2. Alkaloidgehalt in Fruehten und 8 Tage alten Keimlingen von Eehinops spec.

Untersuchungen zur Biosynthese des Echinorins, an zerschnittenen Keimlingen zu diesem Zeitpunkt gute Einbauraten der eingesetzten Precursoren bei wesentlich verktirzten Ftitterungszeiten erzielt werden konnten (SCHRODER 1975). Die Gehaltsbestimmung von Echinorin und Echinoramin I erfolgte in jedem Fall nach schichtchromatischer Trennung der Alkaloide aus den Pflanzenextrakten und alkalischer Uberftihrung in Echinopsin. Das quantitative Vorhiiltnis der beiden Alkaloide zueinander ist bei allen untersuchten Arten durchschnittlich 10: 1. Die Differenz der Summe beider Alkaloide zum Gesamtalkaloidgehalt der Frtichte ergibt sich aus dem 16-26%igem Verlust bei Anwendung der Schichtchromatografie sowie Uberftihrung der genuin und artefiziell in den Extrakten vorhandenen Chinolinverbindungen in Echinopsin. Der Gesamtalkaloidgehalt von tiber 2 % in den Frtichten der untersuchten Arton kann im Vergleich zu anderen Organen sowie Pflanzenteilen anderer alkaloidfiihrender Species als tiberdurchschnittlich hoch bezeichnet werden (MOTHES und SCHUTTE 1969). Beim Vergleich des Gehaltes an Echinorin und Echinoramin I bezogen auf die Einzelfrucht und den 8 Tage alten Keimling ist ersichtlich, daB beide Alkaloide in allen 6 untersuchten Arten einer de novo-Shnthese unterliegen (Abb. 2). Besonders augenfii.llig ist der hohe Alkaloidgehalt in den Species E. exaltatus und E. commutatus (Frii.chte und

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PHAM THANH

Ky und

P. SCHRODER

Keimlinge). Offensichtlich korreliert der Gehalt in den Fruchten mit deren relativer GroBe im Vergleich zum Frischgewicht der Fruchte der ubrigen Arten. Der hohe GesamtalkaloidgehaIt in den Frtichten (bezogen auf die Trockenmasse) und der viel hohere Q-ehalt an Echinorin in den 8 d aIten Keimlingen von E. commutatus im Vergleich zu den ubrigen Arten liU3t sich nur mit einer - moglicherweise artspezifischen - sehr starken Alkaloidbildungsrate und Alkaloidakkumulation erklaren. Eine so hohe Differenz im VerhiiItnis des Alkaloidgehalts von Fruchten und acht Tage aIten Keimlingen wurde auch nicht bei E. ritrio und E. sphaerocephalus in fruheren Untersuchungen beobachtet (SCHRODER 1972). Diskussion

Unter Berucksichtigung von Ergebnissen fruher durchgefUhrter Experimente (SCHRODER und LUCKNER 1966; SCHRODER 1972) kann ein Biosyntheseweg fUr Echinoramin I postuliert werden, der von Anthranilsaure und Azetat ausgeht, unter 2facher Methylierung zum Echinorin fUhrt, das dann als Hauptzwischenprodukt mit Asparagin zum Echinoramin I reagiert. Beim Studium des Einflusses verschiedener Aminosauren auf die Alkaloidsynthese bei Echinops (ohne Altersangaben der Pflanzen) wurde von BEREZNEGOVSKAYA et al. (1970) beobachtet, daB nach Applikation von Tryptophan in mineralischem Nahrboden unter sterilen Bedingungen eine ErhOhung auf 410% (angegeben als Echinopsin) erfolgte; die Applikation von Phenylalanin fUhrte zu einer Steigerung von 261 % und z. B. von Methionin zu 207 %. Die hohe Tryptophanabhiingigkeit steht in gewissem Gegensatz zu unseren Ergebnissen mit Anthranilsaure-14COOH, die ohne Verlust der Carboxylgruppe in das Chinolinmolektil des Echinorins eingebaut wurde (SCHRODER und LULKNER 1966). Entsprechende Futterungsversuche mit markiertem Tryptophan sollten AufschluB daruber geben, ob moglicherweise beide Synthesewege, del' direkte Einbau von Anthranilsaure und Tryptophan als Precursor zum Aufbau des Echinorins realisiert sind. Hinsichtlich Alkaloidspektrum und -analytik stellt Echinops ein relativ einfaches und leicht zu handhabendes System dar. Das und die zur Physiologie der Alkaloidbildung erhaltenen ResuItate lassen diese Gattung als ein gunstiges Modell erscheinen, die Zellspezialisierungsprozesse der Alkaloidbiogenese an Gewebekulturen zu untersuchen. Hierbei durfte die experimentelle Untersuchung der auslOsenden Faktoren der beobachteten Phasen absoluter Alkaloidsynthese von grundlegender Bedeutung sein. Die Anzucht von Gewebekulturen von E. sphaerocephalus ist bereits gelungen (KOBLITZ, pers. Mitt.). Zur Callusbildung wurde aus Samen (Embryo) und Keimwurzel prapariert und als Medium eine Zusammensetzung des Grundmediums nach MURASHIGE und SKOOG (1962) plus 6 ppm 2,4-D, plus 0,2 ppm Kinetin plus 0,1 ppm GAs plus 50 ppm L-Apfelsaure plus 8 gil Agar verwendet. Samtliche Subkulturen wurden unter verminderter 2,4-D-Gabe kuItiviert und letztlich nur 1-2 ppm 2,4-D zugesetzt. Die KuIturen wurden wie fur vergleichbare andere Species ublich (ROMEIKE und KOBLITZ 1970) mit 12 hid im Licht unter Verwendung von Rumiflor-Lampen (ca. 1200 Lux) bei einer

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Passagenfrequenz von 3-4 Wochen angezogen und hatten ein gelblich bis hellbraunes Aussehen. Es ist geplant, zunachst den Verlauf von Alkaloidsynthese und -akkumulation mehrercr aufeinanderfolgender Passagen zu untersuchen. Von SH,MYKOVA und BERESNEGOVSKAYA (1975) wurde unlangst tiber den Verlauf der Alkaloidbildung in Gewebekulturen von E. sphaerocephalus (aus Samen prapariert) berichtet. Dabei wurde in der ersten Woche bei gering em Wachstum eine Zunahme des Alkaloidgehaltes von ca. 0,03 auf 0,1 %, in den folgenden W ochen ein stufenweises Absinken gemessen. Die Autoren diskutieren einen Zusammenhang zwischen Alkaloidbiosynthese und Kernteilungsaktivitat. Herrn Dr. J. KRusE, Zentralinstitut fUr Genetik und Kulturpflanzenforschung der AdW der DDR, Gatersleben, danken wir sehr herzlich fiir die sehr umfangreiche taxonomische Bestimmung des Pflanzenmaterials. Herrn Dr. W. MULLER, Sektion Pharmazie der ML U, danken wir fiir die Anfertigung der Fraktogramme im automatischen Aminosiiureanalysator.

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PRAM THANH Kf und P. SCHRODER, Physiologie von Echinops-Alkaloiden

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