- Email: [email protected]
Valeur de l'Elisa dans le diagnostic des infections a cytomegalovirus
TRAVAUX
O RIGI N A U X
Mddecine et Maladies Infectieuses
-- 1987 -- 3 - 1O0 ~ 105
VALEUR DE L'ELISA DANS LE DIAGNOSTIC DES INFECTIONS A CYTOMEGALOVIRUS* par A. DEWILDE**, A. MERCIECA**, D. MULLIER** et P. WATTRE** RESUME
La valeur de I'ELISA dans le diagnostic des infections ~ Cytom~galovirus est ~tudi~e comparativement ~ la r~action de fixation du compl~ment (RFC) dans 4 125 s~rums provenant de 3 763 patients dont 318 avec ~tude cin~tique, et aux m~thodes d'identification rapide et de culture virale pour 390 sujets. II existe 75,8 % de concordance des r~sultats entre les deux m~thodes s~roIogiques (p < 0,05). L'~tude cin~tique a objectiv~ 25 s~roconversions ou s~ro~l~vations significatives simultan~es avec les 2 m~thodes et 7 uniquement en E LISA, correspondant ~ 15 sujets transfuses ou recevant des ~/globulines et ~ 17 cas d'infections r~centes (16 avec IgM sp~cifiques, 11 avec isolement viral). 67 s~rums prQvenant de 46 patients comportaient des IgM anti-CMV apr~s (~limination des facteurs rhumato'ides : parmi eux on note 26 sujets ~ risques (16 transplant~s r~naux, 2 h~modialys~s, 5 leucoses, 1 SIDA, 2 homosexuels), 3 h~patites, 4 syndromes mononucl~osiques, 3 syndromes f~briles chez des femmes enceintes et 4 embryofoetopathies. Les taux moyens et la persistance des IgM varient selon qu'il s'agit d'une primoinfection ou d'une r~currence :leur presence est souvent associ~e ~ une s~roconversion ou une s~ro~l~vation significative ou ~ des taux ~lev~s d'anticorps IgG par les deux techniques. L'isolement viral a ~t~ obtenu chez 10 des 46 patients precedents et chez 11 sujets sans IgM dont 6 embryofoetopathies et 3 pneumopathies interstitielles. Ces r~sultats confirment la grande valeur de I'ELISA dans le diagnostic et la surveillance s~rologique des primo-infections et des r~currences ~ CMV, particuli~rement chez les nouveaun~s et les sujets greff~s ou transplant~s soumis ~ une th~rapeutique immunosuppressive. Son association au diagnostic rapide du virus ou de ses antig~nes dans les pr~l~vements (urines, sang, LBA, biopsies) par immunofluorescence indirecte avec anticorps monoclonal permet d'obtenir des r~sultats pr~coces et fiables. Mots-cl~s :CMV - Anticorps G/M - E LISA - I mmunod~prim~s - Facteurs rhumato'ides- Transplantation Depuis sa premiere description en 1956, le Cytom~gaIovirus (CMV) a ~t~ impliqu~ dans de nombreuses manifestations cliniques (16), particuli~rement dans la pathologie n~onatale et chez les immunod~prim~s. Comme tousles autres Herpes virus, apr~s la primo-infection, il peut persister & I'~tat latent dans I'organisme, malgr~ I'apparition et le maintien d'une r~ponse immunitaire antivirale sp~cifique. Sa grande fragilit~ implique une transmission interhumaine directe par voie orale ou sexuelle, ou encore iatrog~ne par les transfusions et les organes transplant~s. L'infection latente peut ~tre r~activ~e & chaque lois que s'installe une d~pression de I'immunit~ cellulaire, en particulier chez les receveurs de greffes et de transplants ou les sujets atteints d'h~mopathies malignes.
(10, 1 1) : outre leur bonne sensibilitY, elles permettent la d~tection des IgM sp~cifiques dont la presence chez le nouveau-n~ suffit ~ affirmer le diagnostic d'infection cong~nitale, et chez I'adulte correspond ~ une multiplication virale active, donc ~ une infection en cours (9). Dans ce travail, nous tentons ~ partir d'une experience de 2 ans (1984-t985), d'appr~cier la valeur de cette m~thode pour le diagnostic de I'infection ~ CMV, en la comparant aux techniques classiquement utilis~es : la fixation du ¢ompigment (RFC) et I'isolement du virus,
M A T E R I E L ET M E T H O D E S
Les manifestations cliniques sont des plus vari~es, incluant, & cSt~ du classique syndrome mononucl~osique, forme la plus fr~quente chez I'individu normal, lymphad~nopathie, purpura, h~patospl~nom~galie, p~ricardite ou rnyocardite, polyradiculon~vrite et pneumonie interstitielle. La gravit~ de certaines de ces manifestations notamment chez le nourrisson et I'immunod~prim~, impose un diagnostic rapide. Le diagnostic s~rologique a r~cemment b~n~fici~ de I'apport de techniques immunoenzymatiques (ELISA)
S(~rums - patients
L'~tude porte sur 4125 s~rums provenant de 3763 patients adultes et enfants, hospitalis~s au Centre Hospitalier Universitaire de Lille ou dans les hSpitaux r~gionaux. 318 * Requ le 5.9.1986. Acceptation definitive le 20.10.1986. **Service de Bact~riologie-Virologie B du C.H.U. et de I'lnstitut Pasteur de Lille, BP 245, F-59019 Lille c~dex 1O0
g~es. Le culot est alors aditionn~ de milieu de Hanks contenant des antibiotiques, puis inocul~ sur cellules sensibles.
malades o n t subi au moins 2 s~rodiagnostics. Le titrage des anticorps a ~t~ effectu~ par RFC et par E L I S A (IgG et IgM). Des pr~l~vements en vue de I'isolement du virus (urines, sang h~parin~ surtout, plus rarement liquide de lavage broncho-alv~olaire (LBA), liquide amniotique ou m~me biopsies) ont ~t~ obtenus pour 390 patients.
Le sang est recueilli par ponction veineuse sur hdparine (100 U pour 10 ml de sang). Apr~s agitation soigneuse, on laisse reposer ~ tempdrature ambiante pendant 2 heures puis on recueille les leucocytes et le plasma surnageant.
La r~action de fixation du compl(~ment
Les prdl~vements de LBA, liquide amniotique sont trait~s comme les urines. Les fragments d'organes sont broyds dans du milieu de Hanks avant inoculation.
Elle est r~alis~e selon une micromdthode standard d~rivde de celle de Kolmer, avec un antigone du commerce (Behring). Dans ces conditions t o u t titre supdrieur ou dgal 8 est retenu.
Les cultures sont rdalisdes sur cellules embryonnaires fibroblastiques humaines (MRC 5). Sur ces cellules, le CMV se ddveloppe le plus souvent lentement (1 & 4 semaines) en produisant un effet cytopathog(~ne caractdristique. Son identification peut ~tre compldt~e par immunofluorescence indirecte ~ I'aide d'un anticorps monoclonal (Biosoft). Un passage aveugle est r~alisd au bout de 15 jours si la culture est restde ndga-tive.
La technique E L I S A
Elie est effectu~e sur plaque de microtitration Enzygnost Cytomegalie (Behring). Chaque plaque comporte 6 barrettes de 2 rangdes de cupules r~actives, une rangde dtant recouverte d'antig~ne CMV (souche Davis), I'autre d'antig~ne de contrble (tdmoin cellulaire non infectd). - P o u r la recherche des IgG : un ddpistage est d'abord effectual sur une dilution au 1/20e du sdrum en tampon PBS, Tween 20 (0,5 %) et sdrum albumine bovine (1%). On d~pose 100 ~1 de cette d i l u t i o n dans 1 cupule antigone et 1 cupule contrble. Apr~s une heure d'incubation 37°C en chambre humide, suivie de 4 lavages avec le tampon PBS-Tween, 50~1 d'anti-lgG humaines de lapin marqudes par la phosphatase alcaline (Behring) sont distribuds. Apr~s une nouvelle incubation d'une heure ~ 37°C et 4 lavages, on ddpose 100 ~1 de paranitrophdnyl-phosphate 1 mg/ml dans le tampon didthanolamine de pH 9,8. La rdaction est bloqude par la soude 1 N quand le sdrum tdmoin positif inclus dans la sdrie atteint le titre indiqud. La lecture est effectude au spectrophotom~-tre ~ 405 nm. T o u t sdrum pour lequel la diffdrence des densitds optiques DO antigOneDO contrble est supdrieure ~ 0,2 est considdrd comme positif et doit ~tre titrd. Des dilutions de raison 4 en tampon PBS-Tween sont effectudes t] partir de la d i l u t i o n au 1/20e et chaque d i l u t i o n test~e comme prdcddemment. Le titre du sdrum est donnd par l'inVerse de la d i l u t i o n qui donne une diffdrence de DO supdrieure ou dgale ~ 0,2.
La reproductibilitd du test a dtd vdrifide gr~ice & 32 ddterminations sur un sdrum positif connu. Les variations de titre n'ont pas ddpass~ une unitd de log 2, ce qui est conforme aux hormes du~fabricant: - P o u r la recherche des I g M : du fait de I'interfdrence possible des facteurs rhumato'~'des (FR), la rdaction est effectude apres trai.temen{ dis dchantill0ns par I'absorbant RF (Behring) : le sdrum dilud au 1/20e est mdlangd ~ un m~me volume d'absorbant RF et le mdlange incubd 15 mn t] tempdrature ambiante ou 1 nuit & -t- 4°C. Le test est rdalisd sur'le mdlange; de la m~me fa(;on que pour la ddtermination des IgG'rnais =~ I'aide d'un sdrum anti-lgM humaines marqud par'la phosphatase alcaline (Behring).
R ESU L T A T S
D6tection des IgG anti-CMV par E L I S A : Comparaison b la
RFC Une concordance entre les 2 techniques est observde dans 3124 cas sur 4125 (75,8 %) (Tableau I), La courbe de r~gression, ~tablie d'apr~s les r~sultats obtenus pour 523 sdrums, montre qu'il existe une correlation significative : r = 0,81 ; p < 0,05. TABLEAU I Corn paraison entre ELISA/G et RFC pour la d6tection des anticorps anti-CMV
R(~sultats
RFC + ELISA +
RFC -ELISA -
RFC Jr ELISA-
RFC -ELtSA
Nombre de
1 434
1 690
18
983
s~ru ms
Les discordances concernent surtout les s~rums n~gatifs en RFC et positifs en ELISA : 983 s~rums soit 23,8 % ; elles t~moignent de la plus grande sensibilit~ de la technique • E L I S A : 59 % de s~rodiagnostics sont positifs par ELISA contre 35 % par RFC. 26 s~rums ndgatifs en RFC (0,6 %) pr~sentent des taux d'anticorps dlev~s en E LISA (>~ 10240). Dix-huit s~rums (0,4 %) n~gatifs en ELISA sont positifs taux faibles (8) en RFC. L'~tude des 318 s~quences s~riques a permis de mettre en ~vidence : 25 s~roconversions ou augmentations significatives du taux des anticorps ~ la fois par ELISA et par RFC ; 7 ~l~vations des taux uniquement en ELISA. ¢'
Les s~rums provenaient : dans 15 cas de patients porteurs de leucoses ou ayant b~n~fici(~ d'une greffe, transfuses ou recevant des injections de 3' globulines anti-CMV ~ titre prophylactique ; d~ns 17 cas de sujets atteints d'infection
L'isolement du virus
Les urines prdlevdes stdrilement et achemin(~es rapidement au laboratoire dans la glace fondante .sont centrifu101
19 patients n'ont eu q u ' u n seul s~rodiagnostic : 7 pr~sentalent des t a u x ~lev~s d'anticorps en RFC. Au total, la RFC a permis un diagnostic (au moins pr~somptif) d'infection ~ CMV dans 26 cas (soit 57 %). - L'isolement du virus tent~ chez 20 de ces malades s'est r~v~l~ positif dans 10 cas ; un pr~l~vement d'urines ~tait toxique pour les cellules, Ainsi dans 50 % des cas, le diagnostic d'infection ~ CMV a ~t~ pos~ par la seule d~tection d'lgM sp~cifiques. Chez les sujets viruriques ou vir~miques, ces IgM sont d~tect~es pr~cocement (Tableau IV) : en m~me temps que I'excr~tion virale ou la vir~mie (cas 2-6-8-10) et m~me ant~rieurement (cas 3-5-7). Elles peuvent aussi persister tr~s Iongtemps chez les transplant~s r~naux (4 ~ 6 mois apr~s le d(}but de I'infection : cas 1 et 2), et chez les nourrissons (5 mois apr~s : cas 3).
CMV, comme I'ont prouv~ la presence d'lgM sp~cifiques (16 cas) et/ou I'isolement du virus (1 1 cas). Chez 3 de c e s patients, I'ELISA a permis de d~tecter des anticorps tr~s pr~cocement, d~s le 5~me ou 6~me jour de I'infection, alors que la RFC demeurait n~gative. R e c h e r c h e des I g M sp~cifiques p a r E L I S A
La spdcificitd de la technique est vdrifide par I'absence de rdactions croisdes avec d'autres virus herpdtiques (Herpes virus varicellae) (HVV), Herpes simplex virus (HSV), Virus d'Epstein Barr (EBV) (Tableau II), d'interfdrence des FR (Tableau III), et de discordances avec un test d'immunocapture (Wellcome) effectual parall~lement pour 30 sdrums. T A B L E A U II Recherche des IgM anti-CMV par E L I S A : interf(}rence des IgM a n t i - H V V , anti H S V et anti-EBV
S(}rums HVV IgG +, IgM + HSV IgG Jr, IgM + EBV IgG +, IgM +
Nombre
IgM anti-CMV
13 5 13
---
T A B L E A U IV R(}ponse anticorps chez les patients dont I'infection est prouv6e par I'isolement (U -----urines ; S = sang h(}parin(})
Malade - Groupe
T A B L E A U III Recherche des IgM anti-CMV par E L I S A : interf(}rence du F.R. - Action de I'absorbant RF
Titre en FR WaalerRose Latex
1 2 3 4 5
6 7 8
128 512 32 32 1 024 ND* ND* ND*
80 320 40 40 2 560 640 160 160
Date
-
ELISA/M avant apr~s traitement traitement +
m
+
0
0
0
128 64
160 5120
1280 40
2.LJM
Transplant(} U -- 16/11 17/11 r~nal U+27/11 27/11 15/5
0 8 32
0 256O 20480
0 128O 40
3.ZM
Feetopathie U +23/6 U +11/7
21/6 28/6 3/12
64 64 64
20480 20480 20480
80 80 40
4.XJ
Foetopathie U +12/9 U + 26/9
26/9
256
20480
40
17/7
64
5120
320
6/5 13/5
0 0
20 160
160 1280
25/4 7/5
64 20480 64> 20480
320 40
5.CG 6.DS
+ m
+ --
7.FV
Transplant(} U + 2 8 / 5 r~nal
SlDA
S +21/7
Transplant(} S + 6 / 5 r(}nal L.A.L.
U +7/5
m
*Non d(}termin(} Des IgM spdcifiques ont dtd ddtectdes dans 67 sdrums provenant de 46 patients, aussi bien Iors de primo-infections que Iors de rdcurrences : - 26 de ces sujets appartenaient ~ des groupes ~ risques : 16 transplant~s r~naux (dont 5 s~ro-positifs avant la greffe), 2 h~modialys~s, 5 leuc~miques ou canc~reux, 1 patient atteint de S l D A et 2 homosexuels. On d~nombrait ~galement 3 h~patites, 4 syndromes mononucl~osiques, 3 syndromes f~briles en cours de grossesse et 4 foetopathies. Les titres d'lgM obtenus Iors des r~infections sont inf~rieurs (moyenne : 230 ; valeurs extremes : 40-640) & ceux trouv~s dans les primo-infections (moyenne : 400 ; valeurs extremes : 160-20480). - 27 de ces 46 patients ont b~n~fici~ d'au moins 2 s~rodiagnostics : une s~roconversion ou ascension significative des anticorps a ~t~ d~tect~e dans 12 cas par f i x a t i o n du compl~ment et dans 16 cas par E L I S A ; 7 fois les taux d'anticorps sont rest~s stables mais ~lev~s en RFC (>/64).
S(}rodiagnostic FC ELISA ELISA /G /M
28/5 18/6 18/10
1 .BN
S~rum
Isolement
8.DM
Foetopathie U +20/2
20/2
64
9.MF
Transplant(} U -- 10/7 r6nal S +10/7
10/7 16/7 23/7
0 0 16
10.DC
Transplant(} U + 5/8 r(}nal S - 5/8
5/8 27/8
64 64
20480
80
0 0 160 160 5120 20480 20480 20480
80 80
-- Parmi les 370 autres patients ayant ~galement b~n~fici~ d'une tentative d'isolement de virus, 11 ont eu au moins un pr~l~vement positif ; aucun n'a pr~sent~ d'lgM sp~cifiques. Parmi ces patients on retrouve : 6 nouveau-n~s ou nourrissons pr~sentant des embryopathies ; un b~b~ de 7 mois atteint d'un d~ficit immunitaire congenital, porteur d'une pneumopathie interstitielle ; et 2 greff~s de mo~tle pr~sentant une pneumopathie interstitielle. DISCUSSION D 6 t e c t i o n et t i t r a g e des I g G a n t i - C M V
par ELISA
La comparaison des titres d'anticorps IgG en ELISA et Ig totales en f i x a t i o n du compl~ment montre une bonne 102
ce. La concordance de nos r~sultats avec ceux obtenus par un test d'immunocapture insensible ~ I'action des FR (20) est un argument suppl~mentaire en faveur de I'efficacit~ de ce traitement.
correlation entre les deux m~thodes. La technique ELISA se r~v~le toutefois plus sensible : 59 % des s~rodiagnostics sent positifs par ELISA centre 35 % par fixation du compigment. Des r~sultats analogues (59 % centre 22 %) ont ~t~ obtenus par Ruiz et coll. (18) qui soulignent I'int~r~t de la m~thode pour la d~termination de I'~tat immunitaire des sujets avant transplantation.
La technique est tr6s sp~cifique ; nous n'avons pas observ~ de reactivit~ crois~e avec les autres Herpes virus contrairement aux constatations faites par d'autres auteurs (11).
Les discordances RFC + E LISA - ne representent que 0,4 % de I'ensemble et correspondent toujours ~ des taux faibles d'anticorps en RFC (~< 8). De tels r~sultats peuvent s'expliquer par la presence d'lgM anti-CMV d~tect~es par la RFC mais non par I'ELISA-IgG (1 cas). Pour les autres s~rums, la r~alisation d~licate de la RFC et te manque de specificit~ de I'antigOne utilis~ peuvent engendrer des r~sultats faussement positifs. L'ELISA peut aussi dans certains cas ~tre en d~faut.
Valeur de I'ELISA pour le diagnostic des infections & Cytom(~galovirus Outre sa rapidit~ d'ex~cution, la technique E LISA-IgG pr~sente, par rapport ~ la RFC, I'avantage de sa grande sensibilit~ : c'est sans doute la technique de choix pour la d~termination de I'~tat immunitaire des patients et I'identification des porteurs d'infections latentes ~ CMV parmi les donneurs de sang ou d'organes. Toutefois I'int~r~t essentiel de I'ELISA pour ce diagnostic est de permettre la d~tection des IgM sp~cifiques sans fractionnement pr~alable des s~rums. Cette recherche est un compl~ment indispensable au diagnostic direct d'une cytom~galie acquise car la raise en ~vidence du virus dans I'urine ou le pharynx ne suffit pas affirmer le diagnostic ~tant donn~ I'excr~tion virale prolong~e et la persistance du virus dans I'organisme apr~s une primo-infection.
En ce qui concerne les discordances RFC - ELISA 4-, il faut souligner la grande dispersion des titres obtenus en ELISA : faibles ou moyens (~< 5120,) dans la tr~s grande majorit~ des cas, parfois ~lev~s (/> 10240) pour 26 s~rums (soit 0,6 %). Les antig~nes ~tant diff~rents, il est possible que certains anticorps nesoient pas d~tect~s par fixation du compl~ment mais le soient en ELISA (10). Deux des 26 patients pr~sentant des taux d'anticorps Clevis en ELISA et nuls en RFC ~taient atteints de leuc~mie aigu~ lymphoblastique, ce qui pourrait expliquer l'aspect s~lectif observe.
Ces IgM peuvent ~tre d~cel~es aussi bien dans les primo infections que dans les r~infections, en particulier chez les immunod~prim~s (9) : leur d~tection permet d'affirmer qu'il y a multiplication active du virus, donc infection en cours. Plusieurs hypotheses ont ~t~ ~mises pour justifier la r~apparition de ces IgM : I'immunosuppression associ~e une stimulation antig~nique r~p~t~e pourrait induire de fa(~on r~it~r~e une r~ponse de type primaire avec production d'lgM ; une r~infection par un virus antig~niquement different pourrait dans certains cas 6tre envisag~e (18).
Les anticorps d~cel~s en ELISA sent synth~tis~s plus pr~cocement que ceux d~cel~s en fixation du compl~ment et les variations de leurs taux plus rapidement per~ues. De tels r~sultats pr~sentent un r~el int~r~t pour le diagnostic des infections ~ CMV ; il faut toutefois les interpreter avec prudence chez les sujets transfuses ou, & fortiori, soumis ,~ des injections preventives de "y globulines anti-CMV car les variations des taux r~sultent le plus souvent du transfert passif d'anticorps (17).
Les IgM sent parfois d~tect~es tr~s pr~cocement en meme temps que I'excr~tion virale ou la vir~mie, parfois m~me auparavant. Dans t o u s l e s cas, leur identification permet un diagnostic plus rapide que I'isolement du virus qui demande plusieurs jours voire plusieurs semaines. Enfin leur presence ~tablit & elle seule le diagnostic quand I'isolement n'est pas possible ou ~choue. Ces ~checs s'expliquent soit par I'extr~me fragilit~ du virus, soit par la raise en culture tardive, soit par la toxicit~ cellulaire ou la contamination bact~rienne de certains pr~l~vements.
Recherche des IgM sp(~cifiques De nombreux auteurs (13, 19) ont soulignd I'interfdrence possible des FR dans la recherche des IgM sp~cifiques par les techniques utilisant des anticorps marquds. Ceci peut conduire ~ de fau× rdsultats positifs. De m~me les phdnom~nes de compdtition IgG-IgM aboutissent au contraire de faux rdsultats n6gatifs Iorsque les sdrums renferment des IgG & des concentrations dlevdes tr~s supdrieures ~ celles des IgM (14). Darts le cas du CMV, Fattal German et coll. (3) montrent qu'en prdsence de taux ~levds d'lgG anti-CMV le titre apparent des IgM est sous-estimd dans 20 % des cas et m~me nul dans 6 % des infections confirmdes.
Des techniques rapides de diagnostic utilisant des anticorps monoclonaux ont ~t~ r~cemment propos~es (6, 7, 8, 12, 23) : elles permettent la d~tection des antig~nes viraux soit directement dans les cellules des pr~l~vements soit apr~s culture de 16 ou 36 heures sur cellules MRC5. Ces m~thodes ont ~t~ realis~es sur des biopsies d'organes (2, 7) mais aussi des pr~l~vements de LBA (12), d'urines ~6, 8) ou de sang (8). Outre leur rapiditY, elles ont I'avantage de mettre en ~vidence les virus ou leurs antig~nes, et de ne pas ~tre influenc~es par les contaminations bact~riennes. Elles sent sans aucun doute appel~es ~ un grand d~veloppement.
Le traitement pr~alable des s~rums par I'absorbant R F vise ~ ~liminer toutes ces interferences. Les r{}sultats obtenus semblent satisfaisants (Tableau III) et en accord avec ceux de Tardy et coll. (22) qui, comparant differentes techniques pour I'elimination des FR (adsorption par la prot~ine A, les IgG humaines agr~g~es par la chaleur et la glutarald~hyde, ou les latex sensibilis~s aux IgG) montrent que seul I'emploi de I'absorbant RF se r~v~le totalement effica103
Toutefois la recherche des IgM sp~cifiques restera toujours un compl~ment n~cessaire pour le diagnostic et ta surveillance de la matadie Son utilite a et~ parfaitement d~montr~e pour le diagnostic des infections ~ CMV des nourrissons (1, 5). Leur d~tection dans le sang du cordon serait particuli~rement importante, elle t~moignerait de f0rmes plus s~v~res d'infection congenitale avec d~ficits sensoriels, surtout auditifs. En r~gle g~n~rale, I'~volution des IgM est parall~le & I'excretion virale (1) et leur mise en evidence peut ~tre un bon moyen diagnostique quand I'isolement n'est pas possible. Toutefois, il peut exister un retard leur apparition (1) et il est n~cessaire de rep~ter les examens. En cas d'infection tr~s s~v~re entrainant un d~ficit immunitaire, ces IgM peuvent ne pas apparaitre (5) : dans ce cas, I'isolement du virus est en r~gle positif, ~tant donne la quantite de virus excr~t~.
Neanmoins, I'isolement du virus reste la technique la plus s0re, Iorsqu'existe une immunod~pression s~v6re, et que la synth~se des IgM s'en trouve perturb~e, comme c'est le cas chez certains transplant~s r~naux (15), greff~s de coeur (17) ou surtout de mo~lle (4) (2 cas dans notre ~tude). Chez ces patients, la recherche directe des antig~nes I'aide d'anticorps monoclonaux dans des biopsies (2, 7, 23) ou des pr~16vements de L B A (8, 12) peut se r~v~ler particuli~rement int~ressante : outre sa rapidite, elle permet la d~tection du virus in situ avant m6me I'apparition des premiers signes cliniques.
La recherche des IgM sp~cifiques est aussi un bon moyen de surveillance de I'infection cytom~galique chez les greffes et transplant~s. Chez ces sujets, un diagnostic rapide s'impose en raison de la gravit~ de certaines manifestations cliniques ; une d i m i n u t i o n pr~coce du traitement immunosuppresseur peut entrainer une r~gression des signes cliniques et ameliorer le pronostic (18). Rasmussen et coll. (17) ont d~montr~ I'int~r~t de la d~tection des IgM sp~cifiques chez les transplant~s cardiaques Chez les transplantes r~naux, I'identification des IgM permet un diagnostic plus rapide que la RFC et I'isolement du virus Iors des primoinfections (18, 21). Leur presence, dans les reinfections, semble ~tre un marqueur de gravit~ (15, 21).
En conclusion, I'ELISA apparait comme une technique simple, sensible et sp~cifique pour le diagnostic et la surveillance de I'infection & CMV, particuli~rement chez les nouveau-n~s et les sujets greffes ou transplantes. Son association au diagnostic rapide du virus par immunofluorescence I'aide d'anticorps monoclonaux permet d'obtenir des r~sultats pr~coces et fiables.
SUMMARY
CONCLUSION
REMERCIEMENTS Nous remercions Madame M.C. Bouchez pour son excellent travail de secretariat.
ELISA in the diagnosis of cywmegalic disease (CMV)
ELISA is investigated in the diagnosis of cytomegalic disease (CMV) and compared with complement fixation (CFT) in 4125 serum samples from 3763 patients and with virus research or rapid antigen screening in sampling of 390 subjects by indirect immunofluorescence using monoclonal antibody. There is a good relation between results of the two serological methods (75,8 %) (p < 0,05). EL ISA appears to be more sensitive and we have found low antibody titers in CFT alone in 18 sera (0,4 %). In 318 patients several serological determinations have been carried out and shown 25 seroconversions of significant increases of antibody titer by the two methods and 7 only by ELISA : these were obtained from 15 subjects who received blood transfusion or specific gamma globulin and from 17 patients with recent CMV infection (16 with IgM and I1 with virus isolation). 67 sere from 46 patients had specific IgM antibodies to CMV after RF absorption in which it has been found 16 renal transplant recipients, 2 patients on dialysis, 5 leukemia, I A.I.D.S., 2 homosexuals, 3 hepatitis, 4 mononucleosis, 3 infectious syndromes in pregnant woomen and 4 cases of embryofoetopathy. Middle-sized titers and IgM remaining differ between primary and recurrent CMV infections. The presence of IgM is often linked to seroconversion, significant increase or high titers of IgG antibody in the two methods. Virus isolation has been carried out in 10 from 46 of previous patients and also in 11 subjects without IgM antibodies : in which there are 7 newborn with embryofoetopathy or immune deficiency and 2 patients with bone marrow transplantation and pneumonitis. Our data substantiate the findings in others studies and suggest that ELISA is the best method to evaluate IgG and IgM antibodies in the diagnosis of primary and recurrent CMV infections especially in newborn and immunocompromised subjects. ELISA must be associated with virologic research by culture or indirect immunofluorescence in specimens (urine, blood, LBA, biopsy).
Key-words : Cytomegalovirus - IgG and IgM antibodies - ELISA - Immunocompromised patients Transplant - Rheumatoid factor
104
BIBLIOGRAPHIE
(limit6e aux principaux articles cites des 4 derni~res ann~es) 12.
M A R T I N W.J., SMITH T . F . - Rapid detection of CytomegaIovirus in broncho-alveolar lavage specimens by a monoclonal antibody method. J. Clin. Microbiol., 1988, 23, 6, 1006-1008
BENE M.C., FAURE G., BORDIGONI P., WITZ F. -- D(~tection rapide d'antig~nes' du Cytom~galovirus dans les tissus humains. Presse M~d., 1984, 13, 45, 2764
13.
M E U R M A N O.H., Z I O L A B.R. -- IgM class rheumatoid factor interference in the solid phase radioimmunoassay of rubella specific IgM antibodies. J. C/in. Patho/., 1978, I0, 628-632
F A T T A L GERMAN M., CHAMPSAUR H . - - Elimination des IgG pour la d~termination des IgM virales. Symposium Behring 1985
14.
N A O T Y., REMINGTON J.S. -- An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of IgM antibodies to Toxoplasma gondii : use for diagnosis of acute acquired toxoplasmosis. J. infect Dis., 1980, 142, 757-761
1.
A Y M A R D M., SALLE B., GIBERT R. - Infections & Cytom6galovirus des nourrissons - - A n n Pediat, 1983,30, 6,393-402
2.
3.
4.
5.
FLEURY H.J.A., BABIN M., BONNICI J.F., DU PASOUIER P., REIFFERS J . M A R I T G., DAVID B., BROUSTET A . - Surveillance du cytomL=galbvirus apr~s greffe de mo~lle osseuse. Comparaison des donn~es de l'isolement viral et de la recherche des anticorps sp~cificlues. M~d. Mal. Infect., 1985, 15, 1,35-38 GIBERT R., A Y M A R D M., LANGLOIS M. -- Diagnostic des infections ~ Cytom~galovirus chez les nouveau-n~s et les nourrissons : valeur de I'immunofluorescence indirecte compar~e avec la fixation du compl~ment et I'isolement du virus. 'Bull. O.M.S., 1982, 60, 3,357-366
6.
GLEAVES C.A., SMITH T.F., SHUSTER E,A., PEARSON G . R . - Rapid detection of Cytomegalovirus in MRC-5 cells inoculated with urine specimens by using low-speed centrifugation and monoclonal antibody to an early antigen. J. C/in. Microbiol., 1984, 19, 6, 917-919
7.
GOLDSTEIN L.C., Mc D O U G A L L J., H A C K M A N R., MEYERS J.D., THOMAS E.D., NOWINSKI R.C. - Monoclonal antibodies to Cytomegalovirus : rapid identification of clinical isolates and preliminary use in diagnosis of Cytomegalovirus pneumonia. Infect. Imrnun., 1982, 38, 1,273-281
8.
9.
10.
11.
15. PASS R.F., GRIFFITHS P.D., AUGUST A.M. -- A n ti b o d y response to Cytomegalovirus after renal transplantation : comparison of patients with primary and recurrent infections. J. infect. Dis., 1983, 147, 1,40-46 16. PEROL Y., FERCHAL F. - Les infections ~ Cytom(~galovirus. Encycl. Med. Chit., Paris, Maladies infectieuses, 8052 G10 4-1982 17.
RASMUSSEN L., K E L S A L L D., NELSON R., C A R N E Y W . , HIRSCH M., WINSTON D., PREIKSAITIS J., MERIGAN T.C. Virus specific IgG and IgM in normal and immunocompromised subjects infected with Cytomegalovirus. J. Infect. Dis., 1982, 145, 2, 191-199
18.
RUIZ G., M O U R A D G., PEREZ C., G A L E . , MION C., MANDIN J. - - Surveillance de I'infection cytom(3galique chez les greff~s r6naux par la technique ELISA. Ann. Virol. {Inst. Pasteur), 1983, 134E, 191-200
19. SALONEN E.M., V A H E R I A . , S U N I J. WAGER O . - - Rheumatoid factor in acute viral infections - interference with determination of IgM, IgG and IgA antibodies in an enzyme immunoassay. J. Infect. Dis, 1980, 142, 250-255
GRIFFITHS P.D., STIRK P.R., GANCZAKOWSKI M., PANJWANI D.D., B A L L M.G., B L A C K L O C K H.A., PRENTICE H.G. - Rapid diagnosis of Cytomegalovirus infection in immunocompromised patients by detection of early antigen fluorescent f o c i Lancet, 1984, ii, 1242-1245
20. S U T H E R L A N D S., BRIGGS J.D. -- The detection of antibo" dies to Cytomegalovirus in the sera of renal transplant patients by an IgM antibody capture assay. J. Meal. Virol., 1983, 11, 147-159
KANGRO H.O., GRIFFITHS P.D., HUBERT J.T., H E A L T H R.B. - Specific IgM class antibody production following infection with Cytomegalovirus. J. Med. Virol., 1982, 10, 203212
21.
KIEFER D.J. PHELPS D.A., H A L B E R T S.P. - Normalized enzyme linked immunosorbent assay for determining immunoglobulin G antibodies to Cytomegalovirus. J. C/in. Microbiol., 1983, 18, 1,33-39
T A R D Y J.C., BOSSHARD S., A Y M A R D M. - Marqueurs immunologiques du risque d'infection & Cytom~galovirus chez les immunod~prim~s. Rev. Epidem. et Sant~ Publ., 1985, 33, 297-3O3
22. T A R D Y J.C., BUSSEUIL C., A Y M A R D M. -- Facteurs rhumatoides et s~rodiagnostic des infections 8 Cytom~galoris. Symposium Behring 1985
KRISHNA R . V . , M E U R M A N O.H., ZIEGLER T., KRECH U. H. -- Solid phase enzyme immunoassay f o r determination of antibodies to Cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol., 1980, 12, 1,46-51
23.
VOLPI A., WHITEY J., CEBALLOS R., STAGNO S. - Rapid diagnosis of pneumoniae due to Cytomegalovirus. J. Infect. Dis., 1983, 147, 1119-1120
Pagination des pages hors textes : I-II-III-IV-V-Vl-VllEntre les pages 97 et 137, 7 pages sp~ciales incluses, num~rot~es de I & VII, concernant la publicitY. REPERTOIRE ASTRA .............. CLIN M I D Y . . . . . . . . . . . . GLAXO .............. LEDERLE ............. PFIZER .............. PHARMUKA ........... PRODUlTS ROCHE .......
DES ANNONCEURS
PENGLOBE . . . . . . . . . . . . FOSFOCINE ........... FORTUM ............. PIPERILLINE . . . . . . . . . . . VlBRAVEINEUSE ........ JOSACINE ............ ROCEPHINE ........... COBAS BACT . . . . . . . . . . . 105
II 3~me de Couverture I IV 4~me de Couverture V 2~me de couverture VI
O RIGI N A U X
Mddecine et Maladies Infectieuses
-- 1987 -- 3 - 1O0 ~ 105
VALEUR DE L'ELISA DANS LE DIAGNOSTIC DES INFECTIONS A CYTOMEGALOVIRUS* par A. DEWILDE**, A. MERCIECA**, D. MULLIER** et P. WATTRE** RESUME
La valeur de I'ELISA dans le diagnostic des infections ~ Cytom~galovirus est ~tudi~e comparativement ~ la r~action de fixation du compl~ment (RFC) dans 4 125 s~rums provenant de 3 763 patients dont 318 avec ~tude cin~tique, et aux m~thodes d'identification rapide et de culture virale pour 390 sujets. II existe 75,8 % de concordance des r~sultats entre les deux m~thodes s~roIogiques (p < 0,05). L'~tude cin~tique a objectiv~ 25 s~roconversions ou s~ro~l~vations significatives simultan~es avec les 2 m~thodes et 7 uniquement en E LISA, correspondant ~ 15 sujets transfuses ou recevant des ~/globulines et ~ 17 cas d'infections r~centes (16 avec IgM sp~cifiques, 11 avec isolement viral). 67 s~rums prQvenant de 46 patients comportaient des IgM anti-CMV apr~s (~limination des facteurs rhumato'ides : parmi eux on note 26 sujets ~ risques (16 transplant~s r~naux, 2 h~modialys~s, 5 leucoses, 1 SIDA, 2 homosexuels), 3 h~patites, 4 syndromes mononucl~osiques, 3 syndromes f~briles chez des femmes enceintes et 4 embryofoetopathies. Les taux moyens et la persistance des IgM varient selon qu'il s'agit d'une primoinfection ou d'une r~currence :leur presence est souvent associ~e ~ une s~roconversion ou une s~ro~l~vation significative ou ~ des taux ~lev~s d'anticorps IgG par les deux techniques. L'isolement viral a ~t~ obtenu chez 10 des 46 patients precedents et chez 11 sujets sans IgM dont 6 embryofoetopathies et 3 pneumopathies interstitielles. Ces r~sultats confirment la grande valeur de I'ELISA dans le diagnostic et la surveillance s~rologique des primo-infections et des r~currences ~ CMV, particuli~rement chez les nouveaun~s et les sujets greff~s ou transplant~s soumis ~ une th~rapeutique immunosuppressive. Son association au diagnostic rapide du virus ou de ses antig~nes dans les pr~l~vements (urines, sang, LBA, biopsies) par immunofluorescence indirecte avec anticorps monoclonal permet d'obtenir des r~sultats pr~coces et fiables. Mots-cl~s :CMV - Anticorps G/M - E LISA - I mmunod~prim~s - Facteurs rhumato'ides- Transplantation Depuis sa premiere description en 1956, le Cytom~gaIovirus (CMV) a ~t~ impliqu~ dans de nombreuses manifestations cliniques (16), particuli~rement dans la pathologie n~onatale et chez les immunod~prim~s. Comme tousles autres Herpes virus, apr~s la primo-infection, il peut persister & I'~tat latent dans I'organisme, malgr~ I'apparition et le maintien d'une r~ponse immunitaire antivirale sp~cifique. Sa grande fragilit~ implique une transmission interhumaine directe par voie orale ou sexuelle, ou encore iatrog~ne par les transfusions et les organes transplant~s. L'infection latente peut ~tre r~activ~e & chaque lois que s'installe une d~pression de I'immunit~ cellulaire, en particulier chez les receveurs de greffes et de transplants ou les sujets atteints d'h~mopathies malignes.
(10, 1 1) : outre leur bonne sensibilitY, elles permettent la d~tection des IgM sp~cifiques dont la presence chez le nouveau-n~ suffit ~ affirmer le diagnostic d'infection cong~nitale, et chez I'adulte correspond ~ une multiplication virale active, donc ~ une infection en cours (9). Dans ce travail, nous tentons ~ partir d'une experience de 2 ans (1984-t985), d'appr~cier la valeur de cette m~thode pour le diagnostic de I'infection ~ CMV, en la comparant aux techniques classiquement utilis~es : la fixation du ¢ompigment (RFC) et I'isolement du virus,
M A T E R I E L ET M E T H O D E S
Les manifestations cliniques sont des plus vari~es, incluant, & cSt~ du classique syndrome mononucl~osique, forme la plus fr~quente chez I'individu normal, lymphad~nopathie, purpura, h~patospl~nom~galie, p~ricardite ou rnyocardite, polyradiculon~vrite et pneumonie interstitielle. La gravit~ de certaines de ces manifestations notamment chez le nourrisson et I'immunod~prim~, impose un diagnostic rapide. Le diagnostic s~rologique a r~cemment b~n~fici~ de I'apport de techniques immunoenzymatiques (ELISA)
S(~rums - patients
L'~tude porte sur 4125 s~rums provenant de 3763 patients adultes et enfants, hospitalis~s au Centre Hospitalier Universitaire de Lille ou dans les hSpitaux r~gionaux. 318 * Requ le 5.9.1986. Acceptation definitive le 20.10.1986. **Service de Bact~riologie-Virologie B du C.H.U. et de I'lnstitut Pasteur de Lille, BP 245, F-59019 Lille c~dex 1O0
g~es. Le culot est alors aditionn~ de milieu de Hanks contenant des antibiotiques, puis inocul~ sur cellules sensibles.
malades o n t subi au moins 2 s~rodiagnostics. Le titrage des anticorps a ~t~ effectu~ par RFC et par E L I S A (IgG et IgM). Des pr~l~vements en vue de I'isolement du virus (urines, sang h~parin~ surtout, plus rarement liquide de lavage broncho-alv~olaire (LBA), liquide amniotique ou m~me biopsies) ont ~t~ obtenus pour 390 patients.
Le sang est recueilli par ponction veineuse sur hdparine (100 U pour 10 ml de sang). Apr~s agitation soigneuse, on laisse reposer ~ tempdrature ambiante pendant 2 heures puis on recueille les leucocytes et le plasma surnageant.
La r~action de fixation du compl(~ment
Les prdl~vements de LBA, liquide amniotique sont trait~s comme les urines. Les fragments d'organes sont broyds dans du milieu de Hanks avant inoculation.
Elle est r~alis~e selon une micromdthode standard d~rivde de celle de Kolmer, avec un antigone du commerce (Behring). Dans ces conditions t o u t titre supdrieur ou dgal 8 est retenu.
Les cultures sont rdalisdes sur cellules embryonnaires fibroblastiques humaines (MRC 5). Sur ces cellules, le CMV se ddveloppe le plus souvent lentement (1 & 4 semaines) en produisant un effet cytopathog(~ne caractdristique. Son identification peut ~tre compldt~e par immunofluorescence indirecte ~ I'aide d'un anticorps monoclonal (Biosoft). Un passage aveugle est r~alisd au bout de 15 jours si la culture est restde ndga-tive.
La technique E L I S A
Elie est effectu~e sur plaque de microtitration Enzygnost Cytomegalie (Behring). Chaque plaque comporte 6 barrettes de 2 rangdes de cupules r~actives, une rangde dtant recouverte d'antig~ne CMV (souche Davis), I'autre d'antig~ne de contrble (tdmoin cellulaire non infectd). - P o u r la recherche des IgG : un ddpistage est d'abord effectual sur une dilution au 1/20e du sdrum en tampon PBS, Tween 20 (0,5 %) et sdrum albumine bovine (1%). On d~pose 100 ~1 de cette d i l u t i o n dans 1 cupule antigone et 1 cupule contrble. Apr~s une heure d'incubation 37°C en chambre humide, suivie de 4 lavages avec le tampon PBS-Tween, 50~1 d'anti-lgG humaines de lapin marqudes par la phosphatase alcaline (Behring) sont distribuds. Apr~s une nouvelle incubation d'une heure ~ 37°C et 4 lavages, on ddpose 100 ~1 de paranitrophdnyl-phosphate 1 mg/ml dans le tampon didthanolamine de pH 9,8. La rdaction est bloqude par la soude 1 N quand le sdrum tdmoin positif inclus dans la sdrie atteint le titre indiqud. La lecture est effectude au spectrophotom~-tre ~ 405 nm. T o u t sdrum pour lequel la diffdrence des densitds optiques DO antigOneDO contrble est supdrieure ~ 0,2 est considdrd comme positif et doit ~tre titrd. Des dilutions de raison 4 en tampon PBS-Tween sont effectudes t] partir de la d i l u t i o n au 1/20e et chaque d i l u t i o n test~e comme prdcddemment. Le titre du sdrum est donnd par l'inVerse de la d i l u t i o n qui donne une diffdrence de DO supdrieure ou dgale ~ 0,2.
La reproductibilitd du test a dtd vdrifide gr~ice & 32 ddterminations sur un sdrum positif connu. Les variations de titre n'ont pas ddpass~ une unitd de log 2, ce qui est conforme aux hormes du~fabricant: - P o u r la recherche des I g M : du fait de I'interfdrence possible des facteurs rhumato'~'des (FR), la rdaction est effectude apres trai.temen{ dis dchantill0ns par I'absorbant RF (Behring) : le sdrum dilud au 1/20e est mdlangd ~ un m~me volume d'absorbant RF et le mdlange incubd 15 mn t] tempdrature ambiante ou 1 nuit & -t- 4°C. Le test est rdalisd sur'le mdlange; de la m~me fa(;on que pour la ddtermination des IgG'rnais =~ I'aide d'un sdrum anti-lgM humaines marqud par'la phosphatase alcaline (Behring).
R ESU L T A T S
D6tection des IgG anti-CMV par E L I S A : Comparaison b la
RFC Une concordance entre les 2 techniques est observde dans 3124 cas sur 4125 (75,8 %) (Tableau I), La courbe de r~gression, ~tablie d'apr~s les r~sultats obtenus pour 523 sdrums, montre qu'il existe une correlation significative : r = 0,81 ; p < 0,05. TABLEAU I Corn paraison entre ELISA/G et RFC pour la d6tection des anticorps anti-CMV
R(~sultats
RFC + ELISA +
RFC -ELISA -
RFC Jr ELISA-
RFC -ELtSA
Nombre de
1 434
1 690
18
983
s~ru ms
Les discordances concernent surtout les s~rums n~gatifs en RFC et positifs en ELISA : 983 s~rums soit 23,8 % ; elles t~moignent de la plus grande sensibilit~ de la technique • E L I S A : 59 % de s~rodiagnostics sont positifs par ELISA contre 35 % par RFC. 26 s~rums ndgatifs en RFC (0,6 %) pr~sentent des taux d'anticorps dlev~s en E LISA (>~ 10240). Dix-huit s~rums (0,4 %) n~gatifs en ELISA sont positifs taux faibles (8) en RFC. L'~tude des 318 s~quences s~riques a permis de mettre en ~vidence : 25 s~roconversions ou augmentations significatives du taux des anticorps ~ la fois par ELISA et par RFC ; 7 ~l~vations des taux uniquement en ELISA. ¢'
Les s~rums provenaient : dans 15 cas de patients porteurs de leucoses ou ayant b~n~fici(~ d'une greffe, transfuses ou recevant des injections de 3' globulines anti-CMV ~ titre prophylactique ; d~ns 17 cas de sujets atteints d'infection
L'isolement du virus
Les urines prdlevdes stdrilement et achemin(~es rapidement au laboratoire dans la glace fondante .sont centrifu101
19 patients n'ont eu q u ' u n seul s~rodiagnostic : 7 pr~sentalent des t a u x ~lev~s d'anticorps en RFC. Au total, la RFC a permis un diagnostic (au moins pr~somptif) d'infection ~ CMV dans 26 cas (soit 57 %). - L'isolement du virus tent~ chez 20 de ces malades s'est r~v~l~ positif dans 10 cas ; un pr~l~vement d'urines ~tait toxique pour les cellules, Ainsi dans 50 % des cas, le diagnostic d'infection ~ CMV a ~t~ pos~ par la seule d~tection d'lgM sp~cifiques. Chez les sujets viruriques ou vir~miques, ces IgM sont d~tect~es pr~cocement (Tableau IV) : en m~me temps que I'excr~tion virale ou la vir~mie (cas 2-6-8-10) et m~me ant~rieurement (cas 3-5-7). Elles peuvent aussi persister tr~s Iongtemps chez les transplant~s r~naux (4 ~ 6 mois apr~s le d(}but de I'infection : cas 1 et 2), et chez les nourrissons (5 mois apr~s : cas 3).
CMV, comme I'ont prouv~ la presence d'lgM sp~cifiques (16 cas) et/ou I'isolement du virus (1 1 cas). Chez 3 de c e s patients, I'ELISA a permis de d~tecter des anticorps tr~s pr~cocement, d~s le 5~me ou 6~me jour de I'infection, alors que la RFC demeurait n~gative. R e c h e r c h e des I g M sp~cifiques p a r E L I S A
La spdcificitd de la technique est vdrifide par I'absence de rdactions croisdes avec d'autres virus herpdtiques (Herpes virus varicellae) (HVV), Herpes simplex virus (HSV), Virus d'Epstein Barr (EBV) (Tableau II), d'interfdrence des FR (Tableau III), et de discordances avec un test d'immunocapture (Wellcome) effectual parall~lement pour 30 sdrums. T A B L E A U II Recherche des IgM anti-CMV par E L I S A : interf(}rence des IgM a n t i - H V V , anti H S V et anti-EBV
S(}rums HVV IgG +, IgM + HSV IgG Jr, IgM + EBV IgG +, IgM +
Nombre
IgM anti-CMV
13 5 13
---
T A B L E A U IV R(}ponse anticorps chez les patients dont I'infection est prouv6e par I'isolement (U -----urines ; S = sang h(}parin(})
Malade - Groupe
T A B L E A U III Recherche des IgM anti-CMV par E L I S A : interf(}rence du F.R. - Action de I'absorbant RF
Titre en FR WaalerRose Latex
1 2 3 4 5
6 7 8
128 512 32 32 1 024 ND* ND* ND*
80 320 40 40 2 560 640 160 160
Date
-
ELISA/M avant apr~s traitement traitement +
m
+
0
0
0
128 64
160 5120
1280 40
2.LJM
Transplant(} U -- 16/11 17/11 r~nal U+27/11 27/11 15/5
0 8 32
0 256O 20480
0 128O 40
3.ZM
Feetopathie U +23/6 U +11/7
21/6 28/6 3/12
64 64 64
20480 20480 20480
80 80 40
4.XJ
Foetopathie U +12/9 U + 26/9
26/9
256
20480
40
17/7
64
5120
320
6/5 13/5
0 0
20 160
160 1280
25/4 7/5
64 20480 64> 20480
320 40
5.CG 6.DS
+ m
+ --
7.FV
Transplant(} U + 2 8 / 5 r~nal
SlDA
S +21/7
Transplant(} S + 6 / 5 r(}nal L.A.L.
U +7/5
m
*Non d(}termin(} Des IgM spdcifiques ont dtd ddtectdes dans 67 sdrums provenant de 46 patients, aussi bien Iors de primo-infections que Iors de rdcurrences : - 26 de ces sujets appartenaient ~ des groupes ~ risques : 16 transplant~s r~naux (dont 5 s~ro-positifs avant la greffe), 2 h~modialys~s, 5 leuc~miques ou canc~reux, 1 patient atteint de S l D A et 2 homosexuels. On d~nombrait ~galement 3 h~patites, 4 syndromes mononucl~osiques, 3 syndromes f~briles en cours de grossesse et 4 foetopathies. Les titres d'lgM obtenus Iors des r~infections sont inf~rieurs (moyenne : 230 ; valeurs extremes : 40-640) & ceux trouv~s dans les primo-infections (moyenne : 400 ; valeurs extremes : 160-20480). - 27 de ces 46 patients ont b~n~fici~ d'au moins 2 s~rodiagnostics : une s~roconversion ou ascension significative des anticorps a ~t~ d~tect~e dans 12 cas par f i x a t i o n du compl~ment et dans 16 cas par E L I S A ; 7 fois les taux d'anticorps sont rest~s stables mais ~lev~s en RFC (>/64).
S(}rodiagnostic FC ELISA ELISA /G /M
28/5 18/6 18/10
1 .BN
S~rum
Isolement
8.DM
Foetopathie U +20/2
20/2
64
9.MF
Transplant(} U -- 10/7 r6nal S +10/7
10/7 16/7 23/7
0 0 16
10.DC
Transplant(} U + 5/8 r(}nal S - 5/8
5/8 27/8
64 64
20480
80
0 0 160 160 5120 20480 20480 20480
80 80
-- Parmi les 370 autres patients ayant ~galement b~n~fici~ d'une tentative d'isolement de virus, 11 ont eu au moins un pr~l~vement positif ; aucun n'a pr~sent~ d'lgM sp~cifiques. Parmi ces patients on retrouve : 6 nouveau-n~s ou nourrissons pr~sentant des embryopathies ; un b~b~ de 7 mois atteint d'un d~ficit immunitaire congenital, porteur d'une pneumopathie interstitielle ; et 2 greff~s de mo~tle pr~sentant une pneumopathie interstitielle. DISCUSSION D 6 t e c t i o n et t i t r a g e des I g G a n t i - C M V
par ELISA
La comparaison des titres d'anticorps IgG en ELISA et Ig totales en f i x a t i o n du compl~ment montre une bonne 102
ce. La concordance de nos r~sultats avec ceux obtenus par un test d'immunocapture insensible ~ I'action des FR (20) est un argument suppl~mentaire en faveur de I'efficacit~ de ce traitement.
correlation entre les deux m~thodes. La technique ELISA se r~v~le toutefois plus sensible : 59 % des s~rodiagnostics sent positifs par ELISA centre 35 % par fixation du compigment. Des r~sultats analogues (59 % centre 22 %) ont ~t~ obtenus par Ruiz et coll. (18) qui soulignent I'int~r~t de la m~thode pour la d~termination de I'~tat immunitaire des sujets avant transplantation.
La technique est tr6s sp~cifique ; nous n'avons pas observ~ de reactivit~ crois~e avec les autres Herpes virus contrairement aux constatations faites par d'autres auteurs (11).
Les discordances RFC + E LISA - ne representent que 0,4 % de I'ensemble et correspondent toujours ~ des taux faibles d'anticorps en RFC (~< 8). De tels r~sultats peuvent s'expliquer par la presence d'lgM anti-CMV d~tect~es par la RFC mais non par I'ELISA-IgG (1 cas). Pour les autres s~rums, la r~alisation d~licate de la RFC et te manque de specificit~ de I'antigOne utilis~ peuvent engendrer des r~sultats faussement positifs. L'ELISA peut aussi dans certains cas ~tre en d~faut.
Valeur de I'ELISA pour le diagnostic des infections & Cytom(~galovirus Outre sa rapidit~ d'ex~cution, la technique E LISA-IgG pr~sente, par rapport ~ la RFC, I'avantage de sa grande sensibilit~ : c'est sans doute la technique de choix pour la d~termination de I'~tat immunitaire des patients et I'identification des porteurs d'infections latentes ~ CMV parmi les donneurs de sang ou d'organes. Toutefois I'int~r~t essentiel de I'ELISA pour ce diagnostic est de permettre la d~tection des IgM sp~cifiques sans fractionnement pr~alable des s~rums. Cette recherche est un compl~ment indispensable au diagnostic direct d'une cytom~galie acquise car la raise en ~vidence du virus dans I'urine ou le pharynx ne suffit pas affirmer le diagnostic ~tant donn~ I'excr~tion virale prolong~e et la persistance du virus dans I'organisme apr~s une primo-infection.
En ce qui concerne les discordances RFC - ELISA 4-, il faut souligner la grande dispersion des titres obtenus en ELISA : faibles ou moyens (~< 5120,) dans la tr~s grande majorit~ des cas, parfois ~lev~s (/> 10240) pour 26 s~rums (soit 0,6 %). Les antig~nes ~tant diff~rents, il est possible que certains anticorps nesoient pas d~tect~s par fixation du compl~ment mais le soient en ELISA (10). Deux des 26 patients pr~sentant des taux d'anticorps Clevis en ELISA et nuls en RFC ~taient atteints de leuc~mie aigu~ lymphoblastique, ce qui pourrait expliquer l'aspect s~lectif observe.
Ces IgM peuvent ~tre d~cel~es aussi bien dans les primo infections que dans les r~infections, en particulier chez les immunod~prim~s (9) : leur d~tection permet d'affirmer qu'il y a multiplication active du virus, donc infection en cours. Plusieurs hypotheses ont ~t~ ~mises pour justifier la r~apparition de ces IgM : I'immunosuppression associ~e une stimulation antig~nique r~p~t~e pourrait induire de fa(~on r~it~r~e une r~ponse de type primaire avec production d'lgM ; une r~infection par un virus antig~niquement different pourrait dans certains cas 6tre envisag~e (18).
Les anticorps d~cel~s en ELISA sent synth~tis~s plus pr~cocement que ceux d~cel~s en fixation du compl~ment et les variations de leurs taux plus rapidement per~ues. De tels r~sultats pr~sentent un r~el int~r~t pour le diagnostic des infections ~ CMV ; il faut toutefois les interpreter avec prudence chez les sujets transfuses ou, & fortiori, soumis ,~ des injections preventives de "y globulines anti-CMV car les variations des taux r~sultent le plus souvent du transfert passif d'anticorps (17).
Les IgM sent parfois d~tect~es tr~s pr~cocement en meme temps que I'excr~tion virale ou la vir~mie, parfois m~me auparavant. Dans t o u s l e s cas, leur identification permet un diagnostic plus rapide que I'isolement du virus qui demande plusieurs jours voire plusieurs semaines. Enfin leur presence ~tablit & elle seule le diagnostic quand I'isolement n'est pas possible ou ~choue. Ces ~checs s'expliquent soit par I'extr~me fragilit~ du virus, soit par la raise en culture tardive, soit par la toxicit~ cellulaire ou la contamination bact~rienne de certains pr~l~vements.
Recherche des IgM sp(~cifiques De nombreux auteurs (13, 19) ont soulignd I'interfdrence possible des FR dans la recherche des IgM sp~cifiques par les techniques utilisant des anticorps marquds. Ceci peut conduire ~ de fau× rdsultats positifs. De m~me les phdnom~nes de compdtition IgG-IgM aboutissent au contraire de faux rdsultats n6gatifs Iorsque les sdrums renferment des IgG & des concentrations dlevdes tr~s supdrieures ~ celles des IgM (14). Darts le cas du CMV, Fattal German et coll. (3) montrent qu'en prdsence de taux ~levds d'lgG anti-CMV le titre apparent des IgM est sous-estimd dans 20 % des cas et m~me nul dans 6 % des infections confirmdes.
Des techniques rapides de diagnostic utilisant des anticorps monoclonaux ont ~t~ r~cemment propos~es (6, 7, 8, 12, 23) : elles permettent la d~tection des antig~nes viraux soit directement dans les cellules des pr~l~vements soit apr~s culture de 16 ou 36 heures sur cellules MRC5. Ces m~thodes ont ~t~ realis~es sur des biopsies d'organes (2, 7) mais aussi des pr~l~vements de LBA (12), d'urines ~6, 8) ou de sang (8). Outre leur rapiditY, elles ont I'avantage de mettre en ~vidence les virus ou leurs antig~nes, et de ne pas ~tre influenc~es par les contaminations bact~riennes. Elles sent sans aucun doute appel~es ~ un grand d~veloppement.
Le traitement pr~alable des s~rums par I'absorbant R F vise ~ ~liminer toutes ces interferences. Les r{}sultats obtenus semblent satisfaisants (Tableau III) et en accord avec ceux de Tardy et coll. (22) qui, comparant differentes techniques pour I'elimination des FR (adsorption par la prot~ine A, les IgG humaines agr~g~es par la chaleur et la glutarald~hyde, ou les latex sensibilis~s aux IgG) montrent que seul I'emploi de I'absorbant RF se r~v~le totalement effica103
Toutefois la recherche des IgM sp~cifiques restera toujours un compl~ment n~cessaire pour le diagnostic et ta surveillance de la matadie Son utilite a et~ parfaitement d~montr~e pour le diagnostic des infections ~ CMV des nourrissons (1, 5). Leur d~tection dans le sang du cordon serait particuli~rement importante, elle t~moignerait de f0rmes plus s~v~res d'infection congenitale avec d~ficits sensoriels, surtout auditifs. En r~gle g~n~rale, I'~volution des IgM est parall~le & I'excretion virale (1) et leur mise en evidence peut ~tre un bon moyen diagnostique quand I'isolement n'est pas possible. Toutefois, il peut exister un retard leur apparition (1) et il est n~cessaire de rep~ter les examens. En cas d'infection tr~s s~v~re entrainant un d~ficit immunitaire, ces IgM peuvent ne pas apparaitre (5) : dans ce cas, I'isolement du virus est en r~gle positif, ~tant donne la quantite de virus excr~t~.
Neanmoins, I'isolement du virus reste la technique la plus s0re, Iorsqu'existe une immunod~pression s~v6re, et que la synth~se des IgM s'en trouve perturb~e, comme c'est le cas chez certains transplant~s r~naux (15), greff~s de coeur (17) ou surtout de mo~lle (4) (2 cas dans notre ~tude). Chez ces patients, la recherche directe des antig~nes I'aide d'anticorps monoclonaux dans des biopsies (2, 7, 23) ou des pr~16vements de L B A (8, 12) peut se r~v~ler particuli~rement int~ressante : outre sa rapidite, elle permet la d~tection du virus in situ avant m6me I'apparition des premiers signes cliniques.
La recherche des IgM sp~cifiques est aussi un bon moyen de surveillance de I'infection cytom~galique chez les greffes et transplant~s. Chez ces sujets, un diagnostic rapide s'impose en raison de la gravit~ de certaines manifestations cliniques ; une d i m i n u t i o n pr~coce du traitement immunosuppresseur peut entrainer une r~gression des signes cliniques et ameliorer le pronostic (18). Rasmussen et coll. (17) ont d~montr~ I'int~r~t de la d~tection des IgM sp~cifiques chez les transplant~s cardiaques Chez les transplantes r~naux, I'identification des IgM permet un diagnostic plus rapide que la RFC et I'isolement du virus Iors des primoinfections (18, 21). Leur presence, dans les reinfections, semble ~tre un marqueur de gravit~ (15, 21).
En conclusion, I'ELISA apparait comme une technique simple, sensible et sp~cifique pour le diagnostic et la surveillance de I'infection & CMV, particuli~rement chez les nouveau-n~s et les sujets greffes ou transplantes. Son association au diagnostic rapide du virus par immunofluorescence I'aide d'anticorps monoclonaux permet d'obtenir des r~sultats pr~coces et fiables.
SUMMARY
CONCLUSION
REMERCIEMENTS Nous remercions Madame M.C. Bouchez pour son excellent travail de secretariat.
ELISA in the diagnosis of cywmegalic disease (CMV)
ELISA is investigated in the diagnosis of cytomegalic disease (CMV) and compared with complement fixation (CFT) in 4125 serum samples from 3763 patients and with virus research or rapid antigen screening in sampling of 390 subjects by indirect immunofluorescence using monoclonal antibody. There is a good relation between results of the two serological methods (75,8 %) (p < 0,05). EL ISA appears to be more sensitive and we have found low antibody titers in CFT alone in 18 sera (0,4 %). In 318 patients several serological determinations have been carried out and shown 25 seroconversions of significant increases of antibody titer by the two methods and 7 only by ELISA : these were obtained from 15 subjects who received blood transfusion or specific gamma globulin and from 17 patients with recent CMV infection (16 with IgM and I1 with virus isolation). 67 sere from 46 patients had specific IgM antibodies to CMV after RF absorption in which it has been found 16 renal transplant recipients, 2 patients on dialysis, 5 leukemia, I A.I.D.S., 2 homosexuals, 3 hepatitis, 4 mononucleosis, 3 infectious syndromes in pregnant woomen and 4 cases of embryofoetopathy. Middle-sized titers and IgM remaining differ between primary and recurrent CMV infections. The presence of IgM is often linked to seroconversion, significant increase or high titers of IgG antibody in the two methods. Virus isolation has been carried out in 10 from 46 of previous patients and also in 11 subjects without IgM antibodies : in which there are 7 newborn with embryofoetopathy or immune deficiency and 2 patients with bone marrow transplantation and pneumonitis. Our data substantiate the findings in others studies and suggest that ELISA is the best method to evaluate IgG and IgM antibodies in the diagnosis of primary and recurrent CMV infections especially in newborn and immunocompromised subjects. ELISA must be associated with virologic research by culture or indirect immunofluorescence in specimens (urine, blood, LBA, biopsy).
Key-words : Cytomegalovirus - IgG and IgM antibodies - ELISA - Immunocompromised patients Transplant - Rheumatoid factor
104
BIBLIOGRAPHIE
(limit6e aux principaux articles cites des 4 derni~res ann~es) 12.
M A R T I N W.J., SMITH T . F . - Rapid detection of CytomegaIovirus in broncho-alveolar lavage specimens by a monoclonal antibody method. J. Clin. Microbiol., 1988, 23, 6, 1006-1008
BENE M.C., FAURE G., BORDIGONI P., WITZ F. -- D(~tection rapide d'antig~nes' du Cytom~galovirus dans les tissus humains. Presse M~d., 1984, 13, 45, 2764
13.
M E U R M A N O.H., Z I O L A B.R. -- IgM class rheumatoid factor interference in the solid phase radioimmunoassay of rubella specific IgM antibodies. J. C/in. Patho/., 1978, I0, 628-632
F A T T A L GERMAN M., CHAMPSAUR H . - - Elimination des IgG pour la d~termination des IgM virales. Symposium Behring 1985
14.
N A O T Y., REMINGTON J.S. -- An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of IgM antibodies to Toxoplasma gondii : use for diagnosis of acute acquired toxoplasmosis. J. infect Dis., 1980, 142, 757-761
1.
A Y M A R D M., SALLE B., GIBERT R. - Infections & Cytom6galovirus des nourrissons - - A n n Pediat, 1983,30, 6,393-402
2.
3.
4.
5.
FLEURY H.J.A., BABIN M., BONNICI J.F., DU PASOUIER P., REIFFERS J . M A R I T G., DAVID B., BROUSTET A . - Surveillance du cytomL=galbvirus apr~s greffe de mo~lle osseuse. Comparaison des donn~es de l'isolement viral et de la recherche des anticorps sp~cificlues. M~d. Mal. Infect., 1985, 15, 1,35-38 GIBERT R., A Y M A R D M., LANGLOIS M. -- Diagnostic des infections ~ Cytom~galovirus chez les nouveau-n~s et les nourrissons : valeur de I'immunofluorescence indirecte compar~e avec la fixation du compl~ment et I'isolement du virus. 'Bull. O.M.S., 1982, 60, 3,357-366
6.
GLEAVES C.A., SMITH T.F., SHUSTER E,A., PEARSON G . R . - Rapid detection of Cytomegalovirus in MRC-5 cells inoculated with urine specimens by using low-speed centrifugation and monoclonal antibody to an early antigen. J. C/in. Microbiol., 1984, 19, 6, 917-919
7.
GOLDSTEIN L.C., Mc D O U G A L L J., H A C K M A N R., MEYERS J.D., THOMAS E.D., NOWINSKI R.C. - Monoclonal antibodies to Cytomegalovirus : rapid identification of clinical isolates and preliminary use in diagnosis of Cytomegalovirus pneumonia. Infect. Imrnun., 1982, 38, 1,273-281
8.
9.
10.
11.
15. PASS R.F., GRIFFITHS P.D., AUGUST A.M. -- A n ti b o d y response to Cytomegalovirus after renal transplantation : comparison of patients with primary and recurrent infections. J. infect. Dis., 1983, 147, 1,40-46 16. PEROL Y., FERCHAL F. - Les infections ~ Cytom(~galovirus. Encycl. Med. Chit., Paris, Maladies infectieuses, 8052 G10 4-1982 17.
RASMUSSEN L., K E L S A L L D., NELSON R., C A R N E Y W . , HIRSCH M., WINSTON D., PREIKSAITIS J., MERIGAN T.C. Virus specific IgG and IgM in normal and immunocompromised subjects infected with Cytomegalovirus. J. Infect. Dis., 1982, 145, 2, 191-199
18.
RUIZ G., M O U R A D G., PEREZ C., G A L E . , MION C., MANDIN J. - - Surveillance de I'infection cytom(3galique chez les greff~s r6naux par la technique ELISA. Ann. Virol. {Inst. Pasteur), 1983, 134E, 191-200
19. SALONEN E.M., V A H E R I A . , S U N I J. WAGER O . - - Rheumatoid factor in acute viral infections - interference with determination of IgM, IgG and IgA antibodies in an enzyme immunoassay. J. Infect. Dis, 1980, 142, 250-255
GRIFFITHS P.D., STIRK P.R., GANCZAKOWSKI M., PANJWANI D.D., B A L L M.G., B L A C K L O C K H.A., PRENTICE H.G. - Rapid diagnosis of Cytomegalovirus infection in immunocompromised patients by detection of early antigen fluorescent f o c i Lancet, 1984, ii, 1242-1245
20. S U T H E R L A N D S., BRIGGS J.D. -- The detection of antibo" dies to Cytomegalovirus in the sera of renal transplant patients by an IgM antibody capture assay. J. Meal. Virol., 1983, 11, 147-159
KANGRO H.O., GRIFFITHS P.D., HUBERT J.T., H E A L T H R.B. - Specific IgM class antibody production following infection with Cytomegalovirus. J. Med. Virol., 1982, 10, 203212
21.
KIEFER D.J. PHELPS D.A., H A L B E R T S.P. - Normalized enzyme linked immunosorbent assay for determining immunoglobulin G antibodies to Cytomegalovirus. J. C/in. Microbiol., 1983, 18, 1,33-39
T A R D Y J.C., BOSSHARD S., A Y M A R D M. - Marqueurs immunologiques du risque d'infection & Cytom~galovirus chez les immunod~prim~s. Rev. Epidem. et Sant~ Publ., 1985, 33, 297-3O3
22. T A R D Y J.C., BUSSEUIL C., A Y M A R D M. -- Facteurs rhumatoides et s~rodiagnostic des infections 8 Cytom~galoris. Symposium Behring 1985
KRISHNA R . V . , M E U R M A N O.H., ZIEGLER T., KRECH U. H. -- Solid phase enzyme immunoassay f o r determination of antibodies to Cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol., 1980, 12, 1,46-51
23.
VOLPI A., WHITEY J., CEBALLOS R., STAGNO S. - Rapid diagnosis of pneumoniae due to Cytomegalovirus. J. Infect. Dis., 1983, 147, 1119-1120
Pagination des pages hors textes : I-II-III-IV-V-Vl-VllEntre les pages 97 et 137, 7 pages sp~ciales incluses, num~rot~es de I & VII, concernant la publicitY. REPERTOIRE ASTRA .............. CLIN M I D Y . . . . . . . . . . . . GLAXO .............. LEDERLE ............. PFIZER .............. PHARMUKA ........... PRODUlTS ROCHE .......
DES ANNONCEURS
PENGLOBE . . . . . . . . . . . . FOSFOCINE ........... FORTUM ............. PIPERILLINE . . . . . . . . . . . VlBRAVEINEUSE ........ JOSACINE ............ ROCEPHINE ........... COBAS BACT . . . . . . . . . . . 105
II 3~me de Couverture I IV 4~me de Couverture V 2~me de couverture VI