Variations des zymogrammes estérasiques chez les larves de Palaemon serratus soumises à différentes durées de choc thermique

8iochemical$yltematics.al)dEcOlogy,Vol;8. pp,341 to 348 © PergamonPressLtd. 1978.Printedin England.

0305-1978/78/1201-0341$02.00/0

Variations des Zymogrammes Est6rasiques chez les Larves de Palaemon serratus Soumises & Diff6rentes Dur(~esde Choc Thermique JOEL TRELLU. HUBERT J. CECCALDI Ecole Pratique des Hautes Etudes. Laboratoire de Biochimie et Ecologie des Invert6brds marins. Station marine d'Endoume 13007 Marseille, France

et PIERRE MAGGI et PATRICK LASSUS Institut Scientifique et Technique des P~ches Maritimes, B,P. 1049, 44037 Nantes Cedex. France Key W o r d Index--Palaernon serratus; Crustacea; Decapoda; thermal shock; electrophoresis; enzymatic activities, isozymes; esterases.

Abstract--Palaemon serratusat larval stage 2, acclimatized at 16 °, were subjected to a temperature increase of 15° for periods of 5, 20 or 40 min with or without return to the initial temperature for 12 h. The soluble protein concentration of larvae subjected to a thermal shock of 20 rain duration is lower than in control larvae. Total esterase-2C activity per mg of soluble protein after a thermal shock of 20 rain duration is lessthan in control larvae but, in contrast with larvae subjected to a shock of 40 min duration, the initial activity is restored after 12 hours. Esterase-2Cactivity zymograms, after polyacrylamide gradient gel electrophoresis, show twelve isozymes.The activity of each isozyme examined varies according to the duration of the thermal shock.

Introduction Les variations physi01og!ques provoqu~es par des modifications de temp6rature, lentes ou brutales, ont suscit6 des travaux de plus en plus nombreux au cours de ces derni~res ann~es. En effet, 1'6tude plus fine des modifications et adaptations physiologiques au cours des variations saisonni~res ou circadiennes d'une part, I'impact des rejets d'eaux de mer r6chauff(~es par des centrales ~lectriques ou des industries d'autre part, ont dt6 rendus ndcessaire afin de mieux comprendre les processus de I'adaptation des esp~,ces consid(~r6es ~ un milieu dont la temperature varie. Les fonctions physiologiques sont la cons6quence des variations biochimiques qui les sous-tendent; en part!culler les activit6s enzymatiques digestives ou mdtaboliques sont sous la d~pendance des facteurs du milieu. Parmi ces activitds, les estdrases jouent un r01e primordial, principalement dans le m~tabolisme des lipides, o~ il est relativement ais~ de les mettre en ~vidence [1]. C'est pourquoi elles s'emploient pour diff6rencier les races d'animaux matins, facilitant grandement les dtudes biochimiques de populations [2-4]. Les activit(~s des isozymes estdrasiques subissent des variations en fonction des facteurs internes, de la biologie de I'animal. Elles ont

permis de mettre en ~vidence des diff6rences (dectrophor~tiques does au sexe chez le Cop~pode Anomalocera patersoni [5]. Elles varient en fonction des facteurs du milieu, subissent des fluctuations saisonni~res chez Gammarus [6]. 11 existe une corr61ation entre la fr(~quence des alleles est~rasiques et les variations saisonni~,res de la temperature de I'eau chez Anoplarchus purpurescens [7] et Balanus balanoides [8]. A I'influence des facteurs naturels se superpose I'action des polluants. IIs agissent au niveau mol~culaire sur les est~rases de mammif~,res [9]. Le prdsent travail rend compte de I'action de diff(~rentes dur~es d'un choc thermique sur I'activit~ de ces isozymes est~rasiques des larves au stade 2 de Palaemon serratus

R~ultat$ Prot~ines Solubles Les moyennes des concentrations sont exprim(~es en ~./ml et compar~es & I'aide d'un test de t (Fig. l a ) . Les lots ayant subi les pallets: 20 rain puis retour (pointill(~s), 40 min et 40 rain puis retour, sont significativement infdrieures: (p <0,05) aux concentrations des t6moins T~ II existe de plus une diminution de concentration entre le palier 5 rain puis retour (pointill~s)

(Received 15 January 1978; received for publication 8 May 1978) 341

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JOEL TRELLU, HUBERT J. CECCALDI, PIERRE MAGGI ET PATRICK LASSUS

Prot&lnes

solubles

2000~

Actlvlt6 est&rasklUe totale pa r mg de p~t6ines s e l t ~ N .

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FIG. 1. VARIATIONS DES CONCENTRATIONS EN PROTEINES SOLUBLES ET DE L'ACTIVITE ESTERASE 2C TOTALE PAR RAPPORT AUX TEMOINS, (T), APRES 5 MIN, 20 MIN, 40 MIN DE CHOC THERMIQUE DE 15% SANS, (BLANCS)o OU APRE$ RETOUR A LA TEMPERATURE INIT1ALE DE 16 °. (pointill6s). Indications des 6carts types et des rdisultet$ statistiques de comparalsons de moyennu, (test de t).

et les paliers 20 min puis retour et 40 min. (p <0,01 ). Le choc thermique seul, ~ partir de 40 rain et le retour ~ la temp6rature initiale, partir de 20 min, semblent provoquer une diminution de la concentration en prot~ines solubles des larves. Le m~me ph~nom~,ne existe entre le lot 5 rain puis retour, qui montre une valeur revenant ~ la concentration tdmoin, ainsi que les lots 20 rain puis retour et 40 min.

Activit6 Est6rase 2C Totale L'activit~ est exprim~e en unit6s arbitraires d'int(~gration ramen~es au mg de, prot6ines solubles (Fig. lb). Par rapport au t~moin (T), le palier 20 min. provoque la diminution de I'activit6, mais celle-ci reprend sa valeur initiale pendant le retour ~ la temp6rature de d6part (Ti). Apr&s le palier 40 min, I'activit6 ne montre pas de variations, mais d~croit nettement pendant le retour ~ Ti. Ni le palier 5 min, ni son retour Ti, n'influent sur I'activit6. Les variations des concentrations en prot6ines solubles, d0es sans doute ~ une

absorption d'eau par la larve expliqueraient dans une certaine mesure les changements d'activit6s est6rase 2C, ramen~es au mg de protdines solubles. Mais, les variations does au retour ~ Ti 6tant plus nettes pour les activitds enzymatiques que pour les concentrations protdiques, (paliers 20 min et 40 min) il semble que les larvee perdent une notable partie de leur activit6 est6rase 2C aprils un palier de 20 min et r6ussissent ~ recouvrer 1'6tat initial, pendant le retour en 12 h, alors qu'un palier de 40 min est la cause d'une perte d'activit6 apr~s 12 h.

Isozymes Grace i~ la pr6sence d'un gradient de polyacrylamide, de 4 i~ 30% sur 80 mm, dans les gels employ6s, les isozymes se s6parent plus cause des diff6rences dans les poids mol~culaires et encombmments dans I'espace qu'en fonction des charges 61ectriques (Figs.

2-4).

La migration ne varie que faiblement Iorsqu'un amino-acide poss~de une charge diff6rente de celui qu'il remplace [10]. C'est

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170 140

600 520 380 350 290

VARIATIONS DES ZYMOGRAMMES ESTERASIQUES

140

Est6mses ,

isozyme

345

Est6rsses, I s o z y m •

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FIGS. 3 ET 4. VARIATIONS DES ACTIVITES DES ISOZYMES c, d, e, f, PAR RAPPORT AUX ACTIVITES TEMIONS RESPECTIVES, EN UNITES ARBITRAIRES D'INTEGRATION AU PHOTOCOLORIMETRE. Indications des ecarts types.

I'activit6 enzymatique elle-mOme, d~pendant de la structure de la prot6ine et du contrSle de la synth~,se, qui rend compte, ici, des variations (dectrophor~tiques. La r~v(dation de I'activit~ est6rase 2C montre douze isozymes de poids mol(~culaires compris entre 600 000 et 50 000. Elles se r(~partissent plus particuli~,rement en deux groupes, le premier comprenant les prot~ines de PM compris entre 600 000 et 290 000 et le second, les prot~ines de PM compris entre 170 000 et 50 000. Les m~mes substrats, = et ~ napthyl acetate, permettent de r~v~ler dans I'h~patopancreas, chez Palaemon serratus adulte, vingt bandes se r(~partissant de m~me en deux groupes distincts, le premier comprenant les PM >300 000 et le second les PM <170 000. Certaines isozymes apparaissent, pour un m~me palier, seulement dans un lot sur 3, (palier 20 mn). Bien que les extraits enzymatiques sont effectuL=s ~ partir de lots de 30

individus, 1'61ectrophor~se fait apparaitre un polymorphisme biochimique notable, qui d(~montre le caract~,re hautement h(~t6rozygote de I'esp~ce [11]. Les variations d'activit(~ entre le palier et son retour suivent, Iorsque les diff6rences sont significatives, le sch6ma d~crit pour I'activit~ est(~rase 2C totale. Cependant, les variations entre I'activit~ du t~moin et celle des paliers, et entre les activit6s des diff~rents paliers, s'~cartent de ce sch6ma g~n~ral, et cela, d'une mani~re plus ou moins nette d'une isozyme ~ I'autre. L'activit~ de I'isozyme b augmente Iors du choc thermique de 5 min et reste stable pendant les autres paliers, contrairement ,~ I'isozyme e dont I'activit(3 croTt Iors du choc thermique de 40 min et plus encore Iors du retour ~ Ti. Certains paliers sont la cause de I'augmentation de I'activit~ pour la plupart des isozymes par rapport au t(~moin. C'est le cas des isozymes a, b, c, d et e, alors que toutes les valeurs ont

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JOEL TRELLU ,HUBERTJ. CECGALDI .PIERREMAGGI ET PATRICKLASSUS

une activit6 inf6rieure ~ celle du t 6 m o i n pour I'isozyme f. La dur~e du c h o c thermique, avec ou sans retour ~ la temperature initiale, agit d ' u n e mani~re diffdrente sur I'activitd e n z y m a t i q u e , s u i v a n t I'isozyme considdr~e. Ce rdsultat pr~liminaire d e m a n d e ~ ~,tre compl~t~ par I'~tude d'autres activit~s enzymatiques, digestives et m6taboliques, que nous avons ~tudi~ par ailleurs.

L'activit6 est6rase 2 C est raise en 6vidence directement sur le gel suivant une proc6dure d6j~ ddcrite [13], employ6e chez I'adulte [14, 15]. La coloration est intdgrde au photocolorim~tre enregistreur Vernon, type PH 13 UV et I'intdgration est ramende au mg de proteines solubles. Celles-ci sont dos6es suivant la m~thode de Lowry [16]. Les poids mol~culaires des isozymes sont apprdcids par comparaison avec une 61ectrophor~se de s~rum humain et un graphe fourni pour chaque lot par le fabricant.

Bibliographie Mat6riel et m 6 t h o d e Animaux etudi~s. Les femelles grain6es de Palaemon serratus proviennent de I'Atlantique, r6gion du Croisic Une chambre thermostat6e permet d'isoler chaque femelle dens de I'eau de mer maintenue ~ 16 ° . A 1'6closion des oeufs, les larves sont s6pardes de la femelle et re~oivent des nauplius d'Artemia. Choc thermique. Le choc thermique s'effectue sur un lot de 100 larves au stade 2, ~ I'aide de I'appareillage pr6cddemment d6crit [12]. Chaque lot passe de 16 ° 31 o, soit un LIT de 15 °, en 8 s. Les dur6es du choc, ou paliers, sont de 5 min, 20 min, 40 min. Les larves sont ensuite immerg6es dens de la glace pil6e et congeldes, pour une moiti6 des lots, juste apr~s le palier, pour I'autre moiti6, apr~s le palier et retour ~ la tempdrature initiale en 12 h. Un lot t6moin est pr61ev6 directement de la chambre thermostat6e. Electrophor~ses. Pour le t(~moin et pour chaque palier avec et sans retour ~ Is tempdrature initiale, trois lots de 30 larves sont pes6s et broy6s ~ 0 °, ~ I'homogdn~iseur type Potter ~ raison de 15 mg/ml en poids frais. Le tampon d'extraction pH = 8,35, contient du Tris: 0,09 M; borate: 0,08 M; Na2 EDTA: 0,003 M; glycdrol: 0,5 M: mercaptoethanol: 0,01 M. L'extraction des prot6ines solubles est rdalisde par centrifugation du broyat, 10 min ~ 35000 g, ~ 4 °. L'61ectrophor~se des surnageants s'effectue sur gels ~ gradient de polyacrylamide, technique Pharmacia PAA 4-30, dans le tampon Tris, borate, Na= EDTA, pH = 8,35, sous une tension de 125 v, stabilis~e, pendant 15 h.

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