- Email: [email protected]
Influence de la température sur quelques activités enzymatiques chez Palaemon serratus
BiochemicalSysrematicsand Ecology, Vol. 8, pp. 171 to 179. © Pergamon Press Ltd. 1980. Printed in England.
0305-1978/80/0601-0171 $02.00/0
Influence de la Temp( rature sur quelques Activit s Enzymatiques chez Palaemon serratus JOi~L TRELLU et HUBERT J. CECCALDI Ecole Pratique des Hautes Etudes, Laboratoire de Biochimie et Ecologie des I nvertebr(}s marins, Station marine d'Endoume, 13007 Marseille, France
Key Word Index-Palaemon serratus; Crustacea; Decapoda; zymograms; temperature; hepatopancreas; abdominal muscle; ecology. Abstract-Variation in Esterase 2 C activities, involving the hydrolysis of 2-carbon carboxylic esters, c~-glucosidase acetylglucosaminidase and alkaline and acid phosphatases, in the hepatopancreas and the abdominal muscle of Palaemon serratus was examined by polyacrylamide gradient gel electrophoresis. Soluble proteins were measured in the hepatopancreas and the abdominal muscle, and trypsin and chymotrypsin activities in the hepatopancreas. The activities and the isoenzymatic variations in shrimps accllmatea at 5 different temperatures ~between 14 and 30 °) were compared and the molecular weight of each isozyme evaluated. It was found that: (a) the concentrations of soluble proteins decrease in the hepatopancreas between 18 and 30°, but remain unchanged in the abdominal muscle; (b) esterase and phosphatase activities increase with temperature but in a more or less random manner, according to the isozyme under consideration; (c) glycosidase activities increase with temperature; and (d) trypsin activity varies in an inverse relation to chymotrypsin activity.
Introduction La,temperature agit directement sur la vitesse de developpement et la duree de vie des animaux marins. C'est pourquoi de nombreuses agences d'amenagement et de protection de I'environnement etudient ses effets; I'utilisation de ceux-ci pourrait presenter un grand interet, notamment en aquiculture. Les plus recents travaux, par exemple chez la truite Salmo gairdneri, mettent au point des modeles de rendement et proposent de veritables traitemerits thermiques de contrele de la biomasse [1]. Chez les Crustaces, elle influence tout d'abord la croissance. Chez Penaeus aztecus, le taux de croissance augmente regulierement jusqu'~ 32,5 ° et chute brutalement apres 34 °. Cependant la survie decroft ~ ces temperatures et la production optimale en laboratoire se situe entre 22,5 et 30 ° [2]. L'elevation de temperature accelere la vitesse de deroulement de tousles stades d'intermue, en particulier le stade C4 chez le crabe Pachygrapsus marmoratus [3]. U n effet similaire a ete mis en evidence chez Penaeus kerathurus [4] et chez Balanus balanoides [5]. Chez Palaemon serratus au laboratoire, le nombre de mues en 210 j passe de 25 chez des individus acclimates & 22 ° , ~ 15 chez des individus acclimates & 10 °. La duree moyenne du
temps d'intermue augmente d'autant [6]. Mais la temperature n'influe pas sur les durees relatives des differents stades d'intermue chez cette espece [7]. Les constituants biochimiques primordiaux montrent d'intereSsantes variations. Chez le crabe Hemigrapsus nudus, les specimens acclimates au froid possedent moins de proteines dans leur hemolymphe que ceux habitues ~ la chaleur [8]. L'effet de la temperature montre une specificite dependant de chacun des acides amines libres consideres dans le muscle chez Palaemon serratus et Palaemon squilla [9]. Une augmentation de la temperature entre 9 et 25 °, provoque une diminution de la concentration en acides amines libres. Chez Palaemon serratus, une diminution de la temperature d'acclimatation provoque une augmentation de la quantite de lipides du muscle par rapport au poids frais et une diminution de la teneur en acides gras [10]. La temperature agit non seulement sur la cinetique d'activite d'une enzyme in vitro, mais aussi sur sa synthese et son comportement biochimique in vivo. Les activit(~s specifiques de la lactate deshydrogenase et de I'~glycerophosphate deshydrogenase chez I'¢crevisse Cambarus bartoni diminuent dans le
(Received 10 September 1978; received for publication 24 May 1979) 171
172
muscle et augmentent dans I'hepatopancreas Iorsque la temperature d'acclimatation varie de 9 250 [11]. In vitro, I'activite de la lactate deshydrogenase du muscle chez le homard Homarus vulgaris montre une inhibition par exces de substrat qui depend de la temperature; elle est maximale ~ 12 °, temperature moyenne du homard dans son milieu naturel [12]. Tout recemment, des variations non genetiques des activites enzymatiques de cinq isozymes de la LDH ont ete mises en evidence, ~ differentes saisons, chez un Mollusque Gasteropode Cepaea nemoralis [13]. Les resultats exposes ici rendent compte d'une etude electrophoretique des variations de quelques activites enzymatiques de I'hepatopancr6as et du muscle abdominal chez Pa/aemon serratus adulte acclimates ~ differentes temperatures. R6suItats Les variations des concentrations en proteines solubles de I'hepatopancreas sont portees sur la Fig. 1. Les dosages biochimiques des activites trypsine et chymotrypsine de I'h6patopancreas sont portes aussi sur la Fig. 1. Les zymogrammes et leurs integrations, de diverses hydrolases de I'hepatopancreas sont reproduits sur les Figs. 1 et 2. Les variations des concentrations en proteines solubles du muscle, les zymogrammes et leurs integrations, de quelques hydrolases du muscle sont reprocluits sur les Figs. 3 et 4.
Prot#ines Solubles Les concentrations, trois fois sup6rieures dans I'hepatopancreas que dans le muscle, restent stables dans le muscle, mais diminuent r6guli¢rement apr¢s 18°dans I'hepatopancreas, pour arriver ~ 30 ° ~ une valeur deux fois plus faible (Figs. 1 et3). Trypsine et Chymotrypsine Ces activities n'ont pu etre dosees que dans I'hepatopancreas. L'activite de la trypsine est maximale ~ 26 ° alors que celle de la chymotrypsine augmente brusquement apr6s 26 ° (Fig. 1). Activit# Est#rase Plusieurs des 10 isozymes, de poids moleculaires compris entre 690000 et 50 000, existent dans les deux types d'extraits: hepatopancreas et muscle. D'autres m[grent I~gCrement differemment. U ne isozyme de poids mol6culaire 430000 semble specifique du muscle. Une premiere s~rie d'actwit~s ramen~es au mg de prot~ines solubles, isozymes de poids
JOEL TRELLU ET HUBERT J. CECCALDI
moleculaire de 690000 dans le muscle et de poids moleculaire de 350000 dans I'hepatopancreas diminuent regulierement de 14 ~ 30 ° (Figs. 1 et3). Alors que dans I'h6patopancr6as, les autres activit6s commencent par diminuer de 14 ~fi 26 ° et remontent nettement de 26 ~fi30 °, I'augmentation d'activite est plus reguliere dans le muscle, de 14 ~ 30 °. De plus, dans le muscle, un groupe de proteines de poids moleculaires compris entre 75 000 et 55 000 presente une veritable explosion d'activite, quarante fois superieure ~ 30 ° qu'aux temperatures plus basses. La valeur globale correspondant ~ leurs activit6s n'a pas ete portee sur les courbes mais ce phenomCne est tr~s visible sur les photographies.
Activit# Phosphatase A/caline Deux i~rozymes extraites du muscle, de poids moleculaires de 220 000 et de 190 000, diminuent d'activit6 entre 14 et 30 °. Les autres isozymes, que ce soit dans le muscle ou dans I'h6patopancreas, augmentent d'activite entre 14et 30 ° (Figs. 2et 4). Activit~ Phosphatase Acide Les activit6s des trois isozymes du muscle, de poids mol~culaires de 160000, 130000 et 100000, et des quatre isozymes de I'h6patopancr6as, de poids moleculaires 110000, 90000, 75000 et 50000, augmentent toutes plus ou moins r6gulierement de 14 ~ 30 °. (Figs. 2et4). Activit# A c#tylglucosaminidase Deux activites sur quatre, dans le muscle, isozymes de poids moleculaires compris entre 370000 et 170000, sont nettement maximales 30 °. Trois activit6s sur quatre, dans I'hepatopancr6as, de poids moleculaires 335000, 170000 et 110 000 atteignent leurs maximums ~ 22 ° (Figs. 2 et4). A ct/vit# c~Glucosidase L'activite n'a pu 6tre r6vel6e que dans I'hepatopancreas; elle correspond ~ une prot6ine de poids moleculaire de 65000 et pr6sente un palier entre 22 et 30 °. L'activit~ maximale se situe 22 °" Discussion Techniques La technique des zymogrammes, malgr6 son caractere approche, permet neanmoins de quantifier tr~s nettement I'influence des facteurs
14"
I
18 °
I
22"
I
26 °
14"
o 18"
30 °
I
w
p-
'=
E
E ~-
22"
0.4
0.8
14."
26 o
i
i 22 °
~
Hepotopancreas
18 °
30"
ii
b
a ~
l 26 °
14"
_f
55 50
9O 6O
150
350 330
640 520
1 30 °
J= 0
0 E
~0.2
E 0.4
E
I 22 °
I 18 e
I
14 °
26 °
J
18"
30 °
22"
65
26 e
FIG. 1. VARIATIONS DES ZYMOGRAMMES, DES PROTEtNES SOLUBLES ET DES ACTIVITES ENZYMATIQUES DE L'HEPATOPANCREAS CHEZ PALAEMON SERRATUS &DULTE ACCLIMATIZE A DIFFI~RENTES TEMPERATURES. Indication des poids mok~culairesx 10-3.
~ ,o
"~ J5
~.o~
n
0
OJ
~
22°
I
26°
1
30 o
I
~_
i
e~
4
14°
t,~
--
22 °
I
b
[ ~)6o
Hepetopancreas
18 o
I
J
15
30 °
I
50
90
FIG. 2. VARIATIONS DES Z Y M O G R A M M E S DE L ' H E P A T O P A N C R E A S CHEZ PALAEMON SERRATUS A D U L T E DIFFERENTES TEMPERATURES. I N D I C A T I O N DES POIDS M O L E C U L A I R E S x 10 3
18•
t~
14°
I
o
.l::
Io
50
75
i20 tOO
t4 o
ACCLIMATEE
-~'F.
A
I 18 o
i
~
I 22 °
¢
a
26 °
I
....
30 o
,,o II0
250
3 3 5
--
m--I
~m Cr.~
mr~
-.-I~ m
NN~ m.N~ mmg
mNg
m, C0 ::0 C~ O mr-m zm(,o --t C'} N r'rl m -<
O O --~Z
m
~>"
c) r.~ - -
tJ
Prot~ines solubles,
8
mg/mL
•
e~ 0
I
I
o
8
Est~rases
2C G
|
---I
o
O0
2C
so|ubles
Esl~rases
Prot~ines
O0
#s
i
20
25
14°
22 °
26 °
30 o
40
rl
o
2o
~, 3o
"o '~
r4 o
18 °
22 °
Muscle
26 °
30 °
~
5
~§,o ~u
el ae=~
14 °
+
t~
18°
+~ ....
22"
+
:IG. 4.VARIATIONS DES ENZYMES DU MUSCLE CHEZ PALAEMON SERRATUS ADULTE ACCLIMATEE ~, DIFFERENTES TEMPERATURES.
18°
c
130
~oo
b~
m
100
~
,+o
e e e e . e
220 190 150 130
+/~/:: ;,
a~ ....
26 °
. . . .. . . .
30"
200
285
STO
INFLUENCE DE LA TEMPI~RATURE SUR QUELQUES ACTIVITF:SENZYMATIQUESCHEZ PALAEMON SERRATUS
du milieu sur la biologie des Crustaces. Les resultats ont ete renforces par des dosages biochimiques. Ceux-ci ont permis de detecter, entre autres, I'activite de la trypsine chez Palaemon serratus adulte, alors que les isozymes n'avaient pu ~tre revelees sur gel [14]. Ce succes est sans doute dQ ~ la specificite de la trypsine de cette espece, vis-a-vis du substrat employe, qui est ici le benzoylarginine-p-nitranilide; ce produit a ete utilise pour demontrer I'existence de I'activite trypsine chez I'ecrevisse Astacus leptodacty/us [15], ou la polychete, Nereis brandti [16].
Prot#ines Solubles La concentration en proteines solubles de I'hepatopancreas diminue avec I'augmentation de la temperature d'acclimatation, rejoignant en cela les variations des proteines de I'hemolymphe du crabe Hemigrapsus nudus avec la temperature [17]. Ces variations dependent du tissu consider& Dans le muscle, une augmentation de temperature de 16 ° ne semble pas faire varier la concentration en proteines solubles. Activit# Est6rase L'activite augmente dans le muscle et I'hepatopancreas Iorsque la temperature augmente, ceci d'une fa(;on plus ou moins marquee suivant I'isozyme consideree. Les esterases du muscle, entre les poids mol6culaires: 75000 et 55000 semblent particulierement sensibles aux effets de la temperature ~ partir de 25 °. Leurs activit6s augmentent nettement et plus fortement que les autres. Avec I'augmentation de la temperature, la quantite de lipides dans le muscle, par rapport au poids frais, diminue sensiblement [10]. Dans la mesure oQ la concentration en proteines solubles du muscle reste constante, on peut supposer qu'il n'y a pas eu d'absorption d'eau entre 14 et 30 °. L'augmentation de I'activite esterase est parallele ~ une diminution de la concentration en lipides totaux. II est remarquable que, surtout pour les activites esterase du muscle, la temperature agisse d'une maniere differente suivant I'isozyme consideree. L'activit6 de I'isozyme de poids mol6culaire de 690000 diminue avec la temperature alors que celle des isozymes de poids moleculaires de 540000, 75000 et 55000 augmente nettement. Les optimums d'activite enzymatique different suivant les isozymes considerees, pour un facteur du milieu donne, comme cela a ete montre chez certains poissons [18]. Les zymo-
177
grammes d'esterase constituent en cela de precieux indicateurs de la manifestation phenotypique des effets de I'environnement.
Activit6s Prot~ases Les activites trypsine et chymotrypsine, soumises ~ differentes temp6ratures d'acclimatation, varient d'une maniere exactement inverse. L'augmentation de I'activite de la trypsine de 18 ~ 26 ° est contrebalancee par une diminution d'activite de la chymotrypsine. Inversement, I'intervalle 2630 ° fait apparaitre une nette diminution de I'activite trypsine en meme temps qu'une tres forte augmentation de I'activite chymotrypsine. Le metabolisme des aminoacides libres ne semble pas etre lie directement ~ ces activites endopeptidasiques puisque la concentration en aminoacides du muscle diminue regulierement de 9 ~fi25 ° [9]. Activit#s Glycosidases L' ~ glucosidase et I'acetylglucosaminidase varient de maniere inverse, en fonction de la temperature. Comme au cours du cycle d'intermue [19], le metabolisme de la chitine semble se faire au depens du reste du metabolisme glucidique, tout au moins celui mettant en jeu I'c~glucosidase. Acdvit6s Phosphatases Les activites phosphatases alcaline et acide de I'hepatopancreas augmentent avec la temperature, quel que soit I'isozyme consideree. Dans le muscle, de m~me que pour les esterases, les isozymes ~ activite phosphatase alcaline ne montrent pas toutes les m~,mes variations. Les optimums d'activites enzymatiques different suivant les isozymes considerees, pour un facteur du milieu bien precis. Conclusion La mise en 6vidence de I'influence de facteurs du milieu sur les activites enzymatiques des isozymes chez les Crustac6s, pose des problemes th6oriques importants et debouche sur plusieurs applications. II faut en effet diff6rencier de fa¢on nette les variabilites des activites enzymatiques telles qu'elles ont ete rev61ees au cou rs de cette 6tude. Tout d'abord, suivant les conditions du milieu dans lesquelles les animaux ont ete eleves, les zymogrammes montrent des diff6rences importantes, sur le meme gel d'electrophor6se; certaines bandes peuvent ~,tre tr~s faibles, parfois invisibles, ce qui peut conduire
178 certaines erreurs d ' i n t e r p r e t a t i o n dans des etudes de genetique. Ensuite, il faut souligner le fait que dans un z y m o g r a m m e , c h a q u e isozyme m o n t r e une valeur m a x i m a l e caracteristique des c o n d i t i o n s de I ' e n v i r o n n e m e n t consider(~ et de I'acclimatation ~ long terme des animaux ~ ce milieu. Ainsi, I'adaptation b i o c h i m i q u e d ' u n organisme dans le milieu oQ il vit est-il la c o m p o s a n t e globale, integree, des variations individuelles de c h a c u n e des isozymes considerees isol¢ment. La regulation de la synthese de chacune d'elle et le c o n t r e l e h o r m o n a l de cette syntheses pose des problemes o r i g i n a u x qui d e v r o n t etre abordes par la suite. Enfin, I'activite p r o p r e m e n t dite de chaque isozyme en f o n c t i o n des c o n d i t i o n s du milieu, temperature, p h o t o p h a s e , intensite lumineuse, salinite par exempte, vient, au m o m e n t o3 se produisent les reactions e n z y m a t i q u e s , m o d u l e r les caracteristiques b i o c h i m i q u e s des isozymes considerees. Les applications p e u v e n t etre envisagees sous deux angles: I ' a m e n a g e m e n t du littoral et I ' a q u i c u l t u r e . L ' a m ¢ n a g e m e n t du littoral, le developpement des activites industrielles ceti¢res creent des c o n d i t i o n s particuli¢res I'interieur des equilibres biologiques. Les animaux marins reagissent, s'adaptent parfois et les manifestations de ce c h a n g e m e n t d'equilibre p e u v e n t se detecter par I'etude electrophoretique des activites enzymatiques. L ' a m e n a g e m e n t du littoral peut etre cfi I'origine de c o n d i t i o n s de temperature de I'eau de mer exceptionnelles, n o t a m m e n t aux alentours des centrales thermiques ou nucleaires. L'etablissement des z y m o g r a m m e s est, non seulement c o m p l e m e n t a i r e cfi I'etude des variations des activites e n z y m a t i q u e s , mais necessaire par plusieurs aspects de certains problemes d'ecologie. L'heterogeneite microg e o g r a p h i q u e de certaines esp¢ces influence d i r e c t e m e n t les z y m o g r a m m e s . II existe, c o m m e nous I'avons constate, une variabilite de la manifestation de certains alleles a quelques c o n d i t i o n s du milieu, ici la temperature. Les especes reagissent en m e t t a n t en oeuvre des processus d ' a d a p t a t i o n . Les z y m o g r a m m e s p e r m e t t e n t de mettre en evidence I'influence de ces facteurs sur I'expression p h e n o t y p i q u e de certains alleles et pourraient ¢tre utilises facilement comme indicateurs tres sensibles de pollution. Cette ~tude s'applique b I'elevage c o n t r e l e des Crustaces marins: le travail preliminaire ~fi t o u t e experience d ' a q u i c u l t u r e consiste ~ determiner les c o n d i t i o n s externes
JOEL TRELLUET HUBERTJ. CECCALDI necessaires ~ une croissance optimale, aussi bien pour les fonctions physiologiques digestives que pour les f o n c t i o n s metaboliques.
Mat6riel et M 6thode Animaux ~tudi~s. Les Crustaces Decapodes Palaemon serratus adultes, ont 6t6 p~ches sur la cete mediter
raneenne, aux environs de Port-Saint-Louis-du-Rhene, fin Octobre 1976. L'acclimatation de six semaines s'effectue en laboratoire, dans un circuit semi-ouvert d'eau de mer, ayant un renouvellement de 4 ~ 5 fois par jour, et comportant un syst~me de refrig(,~rationamenant la temperature de I'eau 12° . Celle-ci est ensuite rechauffee dans chaque bac jusqu'aux temperatures de 14, 18, 22, 26, 30° suivant le bac, au moyen de resistances electriques sous verre; la regulation se fait grace ~ des retais 61ectroniques commandes par des thermometres & contact ou des sondes ~ thermistance [7]. L'eclairement est assure par des tubes fluorescents ITT Claude, de type Lumiere de jour de luxe, U 40 RS, 40W, 6500K, places ~ 70 cm au dessus des bacs, ~ raison de deux tubes de 40 W pour deux bacs d'experience. Une horloge commune commande la photoperiode L-D: 17-7. Pendant toute la duree de I'experience, les animaux sont nourris I'aide de moules fraiches, toujours fournies en exces les restes de nourritu re 6tant enleves chaque matin. Extraction des prot#ines solubles. Afin d'eviter les variations individuelles dQes aux modifications physiologiques au cours des differentes etapes du cycle d'intermue [19] et pour tenir compte des fluctuations circadiennes des activites enzymatiques [20], les animaux sont sacrifies par lots de 10 individus, ,~09.00 h apres refroidissement sur glace pilee. Pour une temperature donnee, 10 hepatopancreas sont broyes, ~ 0 °, dans un broyeur de type Potter, en verre, raison de 0,1 g de poids frais dans 1.5 ml de milieu d'extraction; 10 muscles sont broyes, a 0 °, a I'aide d'un homogeneiseur Sorvall type Omnimixer 17220, 1 min une vitesse de 10000 tr/min, a raison de 1 g de poids frais dans 4 ml de milieu d'extraction. Celui-ci est constitue par du tampon d'electrophorese: Tris, 0,09 M; borate, 0,08 M; Na2 EDTA, 0,003 M; complete par du glycerol, 0,5 M; du mercaptoethanol, 10 mM; pH=8,35. Les broyats sont ensuite centrifuges, ~ 4 °, 15 min ~ 10 000 g, et le surnageant obtenu, 30 min ~ 35000 g [14]. Le surnageant final sert ,~ I'electrophorese Les proteines solubles sont dosees, pour chaque lot et pour chaque temperature, par la methode de Lowry [21], et les concentrations exprimees en mg/ml d'extrait. Electrophor#ses. Les extraits de proteines solubles sont soumis a I'electrophorese sur gel ~ gradient de potyacrylamide, Pharmacia Fine Chemicals, PAA 4-30, 15 h 125 V stabilises, dans du tampon d'electrophorese decrit plushaut. R#ve/ations sur g e / s - dosages enzymatiques. Les activites enzymatiques sont revelees, directement sur les gels apres electrophorese suivant des procedures dej~ decrites [22, 23]. Les colorations obtenues sont integrees au photocolorimetre enregistreur Vernon, type PH I 3 UV, ramenees au mg de proteines solubles, et exprimees en unites arbitraires d'integration. Le poids moleculaire des differentes isozymes est 6valu# ~ +10000 d pres, par comparaison avec une electrophorese de serum humain et
INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR QUELQUES ACTIVlTES ENZYMATIQUES CHEZ PALAEMONSERRATUS un standard de r~f~rence fourni par le fabricant. La trypsine et la chymotrypsine sont dosbes par les Test Boehringer Mannheim n ° 125.024 et n ° 125.865, respectivement avec les substrats benzoylarginine-p-nitranilide et carboxypropionyl-phenylalanine-p-nitranilide. Les activites sont exprim6es en IU par mg de prot6ines solubles.
Remerciements-Nous tenons & remercier Monsieur P. Richard qui a permis I'acclimatation des animaux, Messieurs B. J. Martin et R. Galois pour leur aide ~ la capture des animaux. Ce travail a (~te r~alis~ dans le cadre du contrat CN.E.X.O. 77/1598. Bibliographie 1. Hokanson, K. E. F., Kleiner, C. F. et Thorslung, T. W. (1977) J. Fish. Res. Board Can. 34, 639. 2. Zein-Eldin, Z. P. et Griffith, G. W. (1966) Biol. Bull. 131, 186". 3. Rouquette, M. (1965) Bull. Soc. Zoo/. Fr. 90,437. 4. Cuzon, G., Cognie, D. et Ceccaldi, H. J. (1970) C.R, Soc. Biol. 164, 1275. 5. Barnes, H. et Stone, R. L. (1974) J. Exp. Mar. Biol. Ecol. l & 275. 6. Campillo, A. (1975) Rev. Trav. Inst. P~ches Marit. 39, 381.
179
7. Richard, P (1978) Aquaculture 14, 13 8. Peters, R. (. et Long, G. E. (1973) Comp. Biochem. PhysioL A 46, 207. 9. Richard, P. (1977) Biochem. Syst. Ecol. $,297. 10. Martin, B. J. et Ceccaldi, H. J. (1977) Biochem. Syst. EcoL 5, 151. 11. Popham, J. D. et Dandy, J. W. T. (1976) Comp. Biochem. Physiol. B,&3, 97. 12. Trausch, G. (1976)Biochem. Syst. EcoL 4,65. 13. Gill, P. D. (1978) Comp. Biochem. Physiol. B5&271. 14. Tre(lu, J. et Ceccaldi, H. J. (1976) C.R. Soc. Biol. 178, 634. 15. Zwilling, R., Pfleiderer, G., Sonneborn, H. N., Kraft, V. et Stucky, I. (1969) Comp. Biochem. Physiol. 28,1275. 16. De Villez, E. J. et Reid, R. M. (1971) Comp. Biochem. Physiol. 38, 235. 17. Peters, R. I. et Long, G. E. (1973) Comp. Biochem. Physiol. A 46, 207. 18. Koehn, R. K. (1969)Science 153,943. 19. Trellu, J. et Cecca(di, H. J. (1977) C.R. Soc. Biol. 171, 115. 20. Tre)lu, J. et Ceccaldi, H. J. (1977) J. Interdiscipl. Cycle Res. $,357. 21. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. et Randall, R. J. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265. 22. Brewer, G. J. (1970) An Introduction to Isozyme Techniques, p. 70. Academic Press, London. 23. Shaw, C. R. et Prasad, R. (1970) Biochem. Genet. 4, 297.
0305-1978/80/0601-0171 $02.00/0
Influence de la Temp( rature sur quelques Activit s Enzymatiques chez Palaemon serratus JOi~L TRELLU et HUBERT J. CECCALDI Ecole Pratique des Hautes Etudes, Laboratoire de Biochimie et Ecologie des I nvertebr(}s marins, Station marine d'Endoume, 13007 Marseille, France
Key Word Index-Palaemon serratus; Crustacea; Decapoda; zymograms; temperature; hepatopancreas; abdominal muscle; ecology. Abstract-Variation in Esterase 2 C activities, involving the hydrolysis of 2-carbon carboxylic esters, c~-glucosidase acetylglucosaminidase and alkaline and acid phosphatases, in the hepatopancreas and the abdominal muscle of Palaemon serratus was examined by polyacrylamide gradient gel electrophoresis. Soluble proteins were measured in the hepatopancreas and the abdominal muscle, and trypsin and chymotrypsin activities in the hepatopancreas. The activities and the isoenzymatic variations in shrimps accllmatea at 5 different temperatures ~between 14 and 30 °) were compared and the molecular weight of each isozyme evaluated. It was found that: (a) the concentrations of soluble proteins decrease in the hepatopancreas between 18 and 30°, but remain unchanged in the abdominal muscle; (b) esterase and phosphatase activities increase with temperature but in a more or less random manner, according to the isozyme under consideration; (c) glycosidase activities increase with temperature; and (d) trypsin activity varies in an inverse relation to chymotrypsin activity.
Introduction La,temperature agit directement sur la vitesse de developpement et la duree de vie des animaux marins. C'est pourquoi de nombreuses agences d'amenagement et de protection de I'environnement etudient ses effets; I'utilisation de ceux-ci pourrait presenter un grand interet, notamment en aquiculture. Les plus recents travaux, par exemple chez la truite Salmo gairdneri, mettent au point des modeles de rendement et proposent de veritables traitemerits thermiques de contrele de la biomasse [1]. Chez les Crustaces, elle influence tout d'abord la croissance. Chez Penaeus aztecus, le taux de croissance augmente regulierement jusqu'~ 32,5 ° et chute brutalement apres 34 °. Cependant la survie decroft ~ ces temperatures et la production optimale en laboratoire se situe entre 22,5 et 30 ° [2]. L'elevation de temperature accelere la vitesse de deroulement de tousles stades d'intermue, en particulier le stade C4 chez le crabe Pachygrapsus marmoratus [3]. U n effet similaire a ete mis en evidence chez Penaeus kerathurus [4] et chez Balanus balanoides [5]. Chez Palaemon serratus au laboratoire, le nombre de mues en 210 j passe de 25 chez des individus acclimates & 22 ° , ~ 15 chez des individus acclimates & 10 °. La duree moyenne du
temps d'intermue augmente d'autant [6]. Mais la temperature n'influe pas sur les durees relatives des differents stades d'intermue chez cette espece [7]. Les constituants biochimiques primordiaux montrent d'intereSsantes variations. Chez le crabe Hemigrapsus nudus, les specimens acclimates au froid possedent moins de proteines dans leur hemolymphe que ceux habitues ~ la chaleur [8]. L'effet de la temperature montre une specificite dependant de chacun des acides amines libres consideres dans le muscle chez Palaemon serratus et Palaemon squilla [9]. Une augmentation de la temperature entre 9 et 25 °, provoque une diminution de la concentration en acides amines libres. Chez Palaemon serratus, une diminution de la temperature d'acclimatation provoque une augmentation de la quantite de lipides du muscle par rapport au poids frais et une diminution de la teneur en acides gras [10]. La temperature agit non seulement sur la cinetique d'activite d'une enzyme in vitro, mais aussi sur sa synthese et son comportement biochimique in vivo. Les activit(~s specifiques de la lactate deshydrogenase et de I'~glycerophosphate deshydrogenase chez I'¢crevisse Cambarus bartoni diminuent dans le
(Received 10 September 1978; received for publication 24 May 1979) 171
172
muscle et augmentent dans I'hepatopancreas Iorsque la temperature d'acclimatation varie de 9 250 [11]. In vitro, I'activite de la lactate deshydrogenase du muscle chez le homard Homarus vulgaris montre une inhibition par exces de substrat qui depend de la temperature; elle est maximale ~ 12 °, temperature moyenne du homard dans son milieu naturel [12]. Tout recemment, des variations non genetiques des activites enzymatiques de cinq isozymes de la LDH ont ete mises en evidence, ~ differentes saisons, chez un Mollusque Gasteropode Cepaea nemoralis [13]. Les resultats exposes ici rendent compte d'une etude electrophoretique des variations de quelques activites enzymatiques de I'hepatopancr6as et du muscle abdominal chez Pa/aemon serratus adulte acclimates ~ differentes temperatures. R6suItats Les variations des concentrations en proteines solubles de I'hepatopancreas sont portees sur la Fig. 1. Les dosages biochimiques des activites trypsine et chymotrypsine de I'h6patopancreas sont portes aussi sur la Fig. 1. Les zymogrammes et leurs integrations, de diverses hydrolases de I'hepatopancreas sont reproduits sur les Figs. 1 et 2. Les variations des concentrations en proteines solubles du muscle, les zymogrammes et leurs integrations, de quelques hydrolases du muscle sont reprocluits sur les Figs. 3 et 4.
Prot#ines Solubles Les concentrations, trois fois sup6rieures dans I'hepatopancreas que dans le muscle, restent stables dans le muscle, mais diminuent r6guli¢rement apr¢s 18°dans I'hepatopancreas, pour arriver ~ 30 ° ~ une valeur deux fois plus faible (Figs. 1 et3). Trypsine et Chymotrypsine Ces activities n'ont pu etre dosees que dans I'hepatopancreas. L'activite de la trypsine est maximale ~ 26 ° alors que celle de la chymotrypsine augmente brusquement apr6s 26 ° (Fig. 1). Activit# Est#rase Plusieurs des 10 isozymes, de poids moleculaires compris entre 690000 et 50 000, existent dans les deux types d'extraits: hepatopancreas et muscle. D'autres m[grent I~gCrement differemment. U ne isozyme de poids mol6culaire 430000 semble specifique du muscle. Une premiere s~rie d'actwit~s ramen~es au mg de prot~ines solubles, isozymes de poids
JOEL TRELLU ET HUBERT J. CECCALDI
moleculaire de 690000 dans le muscle et de poids moleculaire de 350000 dans I'hepatopancreas diminuent regulierement de 14 ~ 30 ° (Figs. 1 et3). Alors que dans I'h6patopancr6as, les autres activit6s commencent par diminuer de 14 ~fi 26 ° et remontent nettement de 26 ~fi30 °, I'augmentation d'activite est plus reguliere dans le muscle, de 14 ~ 30 °. De plus, dans le muscle, un groupe de proteines de poids moleculaires compris entre 75 000 et 55 000 presente une veritable explosion d'activite, quarante fois superieure ~ 30 ° qu'aux temperatures plus basses. La valeur globale correspondant ~ leurs activit6s n'a pas ete portee sur les courbes mais ce phenomCne est tr~s visible sur les photographies.
Activit# Phosphatase A/caline Deux i~rozymes extraites du muscle, de poids moleculaires de 220 000 et de 190 000, diminuent d'activit6 entre 14 et 30 °. Les autres isozymes, que ce soit dans le muscle ou dans I'h6patopancreas, augmentent d'activite entre 14et 30 ° (Figs. 2et 4). Activit~ Phosphatase Acide Les activit6s des trois isozymes du muscle, de poids mol~culaires de 160000, 130000 et 100000, et des quatre isozymes de I'h6patopancr6as, de poids moleculaires 110000, 90000, 75000 et 50000, augmentent toutes plus ou moins r6gulierement de 14 ~ 30 °. (Figs. 2et4). Activit# A c#tylglucosaminidase Deux activites sur quatre, dans le muscle, isozymes de poids moleculaires compris entre 370000 et 170000, sont nettement maximales 30 °. Trois activit6s sur quatre, dans I'hepatopancr6as, de poids moleculaires 335000, 170000 et 110 000 atteignent leurs maximums ~ 22 ° (Figs. 2 et4). A ct/vit# c~Glucosidase L'activite n'a pu 6tre r6vel6e que dans I'hepatopancreas; elle correspond ~ une prot6ine de poids moleculaire de 65000 et pr6sente un palier entre 22 et 30 °. L'activit~ maximale se situe 22 °" Discussion Techniques La technique des zymogrammes, malgr6 son caractere approche, permet neanmoins de quantifier tr~s nettement I'influence des facteurs
14"
I
18 °
I
22"
I
26 °
14"
o 18"
30 °
I
w
p-
'=
E
E ~-
22"
0.4
0.8
14."
26 o
i
i 22 °
~
Hepotopancreas
18 °
30"
ii
b
a ~
l 26 °
14"
_f
55 50
9O 6O
150
350 330
640 520
1 30 °
J= 0
0 E
~0.2
E 0.4
E
I 22 °
I 18 e
I
14 °
26 °
J
18"
30 °
22"
65
26 e
FIG. 1. VARIATIONS DES ZYMOGRAMMES, DES PROTEtNES SOLUBLES ET DES ACTIVITES ENZYMATIQUES DE L'HEPATOPANCREAS CHEZ PALAEMON SERRATUS &DULTE ACCLIMATIZE A DIFFI~RENTES TEMPERATURES. Indication des poids mok~culairesx 10-3.
~ ,o
"~ J5
~.o~
n
0
OJ
~
22°
I
26°
1
30 o
I
~_
i
e~
4
14°
t,~
--
22 °
I
b
[ ~)6o
Hepetopancreas
18 o
I
J
15
30 °
I
50
90
FIG. 2. VARIATIONS DES Z Y M O G R A M M E S DE L ' H E P A T O P A N C R E A S CHEZ PALAEMON SERRATUS A D U L T E DIFFERENTES TEMPERATURES. I N D I C A T I O N DES POIDS M O L E C U L A I R E S x 10 3
18•
t~
14°
I
o
.l::
Io
50
75
i20 tOO
t4 o
ACCLIMATEE
-~'F.
A
I 18 o
i
~
I 22 °
¢
a
26 °
I
....
30 o
,,o II0
250
3 3 5
--
m--I
~m Cr.~
mr~
-.-I~ m
NN~ m.N~ mmg
mNg
m, C0 ::0 C~ O mr-m zm(,o --t C'} N r'rl m -<
O O --~Z
m
~>"
c) r.~ - -
tJ
Prot~ines solubles,
8
mg/mL
•
e~ 0
I
I
o
8
Est~rases
2C G
|
---I
o
O0
2C
so|ubles
Esl~rases
Prot~ines
O0
#s
i
20
25
14°
22 °
26 °
30 o
40
rl
o
2o
~, 3o
"o '~
r4 o
18 °
22 °
Muscle
26 °
30 °
~
5
~§,o ~u
el ae=~
14 °
+
t~
18°
+~ ....
22"
+
:IG. 4.VARIATIONS DES ENZYMES DU MUSCLE CHEZ PALAEMON SERRATUS ADULTE ACCLIMATEE ~, DIFFERENTES TEMPERATURES.
18°
c
130
~oo
b~
m
100
~
,+o
e e e e . e
220 190 150 130
+/~/:: ;,
a~ ....
26 °
. . . .. . . .
30"
200
285
STO
INFLUENCE DE LA TEMPI~RATURE SUR QUELQUES ACTIVITF:SENZYMATIQUESCHEZ PALAEMON SERRATUS
du milieu sur la biologie des Crustaces. Les resultats ont ete renforces par des dosages biochimiques. Ceux-ci ont permis de detecter, entre autres, I'activite de la trypsine chez Palaemon serratus adulte, alors que les isozymes n'avaient pu ~tre revelees sur gel [14]. Ce succes est sans doute dQ ~ la specificite de la trypsine de cette espece, vis-a-vis du substrat employe, qui est ici le benzoylarginine-p-nitranilide; ce produit a ete utilise pour demontrer I'existence de I'activite trypsine chez I'ecrevisse Astacus leptodacty/us [15], ou la polychete, Nereis brandti [16].
Prot#ines Solubles La concentration en proteines solubles de I'hepatopancreas diminue avec I'augmentation de la temperature d'acclimatation, rejoignant en cela les variations des proteines de I'hemolymphe du crabe Hemigrapsus nudus avec la temperature [17]. Ces variations dependent du tissu consider& Dans le muscle, une augmentation de temperature de 16 ° ne semble pas faire varier la concentration en proteines solubles. Activit# Est6rase L'activite augmente dans le muscle et I'hepatopancreas Iorsque la temperature augmente, ceci d'une fa(;on plus ou moins marquee suivant I'isozyme consideree. Les esterases du muscle, entre les poids mol6culaires: 75000 et 55000 semblent particulierement sensibles aux effets de la temperature ~ partir de 25 °. Leurs activit6s augmentent nettement et plus fortement que les autres. Avec I'augmentation de la temperature, la quantite de lipides dans le muscle, par rapport au poids frais, diminue sensiblement [10]. Dans la mesure oQ la concentration en proteines solubles du muscle reste constante, on peut supposer qu'il n'y a pas eu d'absorption d'eau entre 14 et 30 °. L'augmentation de I'activite esterase est parallele ~ une diminution de la concentration en lipides totaux. II est remarquable que, surtout pour les activites esterase du muscle, la temperature agisse d'une maniere differente suivant I'isozyme consideree. L'activit6 de I'isozyme de poids mol6culaire de 690000 diminue avec la temperature alors que celle des isozymes de poids moleculaires de 540000, 75000 et 55000 augmente nettement. Les optimums d'activite enzymatique different suivant les isozymes considerees, pour un facteur du milieu donne, comme cela a ete montre chez certains poissons [18]. Les zymo-
177
grammes d'esterase constituent en cela de precieux indicateurs de la manifestation phenotypique des effets de I'environnement.
Activit6s Prot~ases Les activites trypsine et chymotrypsine, soumises ~ differentes temp6ratures d'acclimatation, varient d'une maniere exactement inverse. L'augmentation de I'activite de la trypsine de 18 ~ 26 ° est contrebalancee par une diminution d'activite de la chymotrypsine. Inversement, I'intervalle 2630 ° fait apparaitre une nette diminution de I'activite trypsine en meme temps qu'une tres forte augmentation de I'activite chymotrypsine. Le metabolisme des aminoacides libres ne semble pas etre lie directement ~ ces activites endopeptidasiques puisque la concentration en aminoacides du muscle diminue regulierement de 9 ~fi25 ° [9]. Activit#s Glycosidases L' ~ glucosidase et I'acetylglucosaminidase varient de maniere inverse, en fonction de la temperature. Comme au cours du cycle d'intermue [19], le metabolisme de la chitine semble se faire au depens du reste du metabolisme glucidique, tout au moins celui mettant en jeu I'c~glucosidase. Acdvit6s Phosphatases Les activites phosphatases alcaline et acide de I'hepatopancreas augmentent avec la temperature, quel que soit I'isozyme consideree. Dans le muscle, de m~me que pour les esterases, les isozymes ~ activite phosphatase alcaline ne montrent pas toutes les m~,mes variations. Les optimums d'activites enzymatiques different suivant les isozymes considerees, pour un facteur du milieu bien precis. Conclusion La mise en 6vidence de I'influence de facteurs du milieu sur les activites enzymatiques des isozymes chez les Crustac6s, pose des problemes th6oriques importants et debouche sur plusieurs applications. II faut en effet diff6rencier de fa¢on nette les variabilites des activites enzymatiques telles qu'elles ont ete rev61ees au cou rs de cette 6tude. Tout d'abord, suivant les conditions du milieu dans lesquelles les animaux ont ete eleves, les zymogrammes montrent des diff6rences importantes, sur le meme gel d'electrophor6se; certaines bandes peuvent ~,tre tr~s faibles, parfois invisibles, ce qui peut conduire
178 certaines erreurs d ' i n t e r p r e t a t i o n dans des etudes de genetique. Ensuite, il faut souligner le fait que dans un z y m o g r a m m e , c h a q u e isozyme m o n t r e une valeur m a x i m a l e caracteristique des c o n d i t i o n s de I ' e n v i r o n n e m e n t consider(~ et de I'acclimatation ~ long terme des animaux ~ ce milieu. Ainsi, I'adaptation b i o c h i m i q u e d ' u n organisme dans le milieu oQ il vit est-il la c o m p o s a n t e globale, integree, des variations individuelles de c h a c u n e des isozymes considerees isol¢ment. La regulation de la synthese de chacune d'elle et le c o n t r e l e h o r m o n a l de cette syntheses pose des problemes o r i g i n a u x qui d e v r o n t etre abordes par la suite. Enfin, I'activite p r o p r e m e n t dite de chaque isozyme en f o n c t i o n des c o n d i t i o n s du milieu, temperature, p h o t o p h a s e , intensite lumineuse, salinite par exempte, vient, au m o m e n t o3 se produisent les reactions e n z y m a t i q u e s , m o d u l e r les caracteristiques b i o c h i m i q u e s des isozymes considerees. Les applications p e u v e n t etre envisagees sous deux angles: I ' a m e n a g e m e n t du littoral et I ' a q u i c u l t u r e . L ' a m ¢ n a g e m e n t du littoral, le developpement des activites industrielles ceti¢res creent des c o n d i t i o n s particuli¢res I'interieur des equilibres biologiques. Les animaux marins reagissent, s'adaptent parfois et les manifestations de ce c h a n g e m e n t d'equilibre p e u v e n t se detecter par I'etude electrophoretique des activites enzymatiques. L ' a m e n a g e m e n t du littoral peut etre cfi I'origine de c o n d i t i o n s de temperature de I'eau de mer exceptionnelles, n o t a m m e n t aux alentours des centrales thermiques ou nucleaires. L'etablissement des z y m o g r a m m e s est, non seulement c o m p l e m e n t a i r e cfi I'etude des variations des activites e n z y m a t i q u e s , mais necessaire par plusieurs aspects de certains problemes d'ecologie. L'heterogeneite microg e o g r a p h i q u e de certaines esp¢ces influence d i r e c t e m e n t les z y m o g r a m m e s . II existe, c o m m e nous I'avons constate, une variabilite de la manifestation de certains alleles a quelques c o n d i t i o n s du milieu, ici la temperature. Les especes reagissent en m e t t a n t en oeuvre des processus d ' a d a p t a t i o n . Les z y m o g r a m m e s p e r m e t t e n t de mettre en evidence I'influence de ces facteurs sur I'expression p h e n o t y p i q u e de certains alleles et pourraient ¢tre utilises facilement comme indicateurs tres sensibles de pollution. Cette ~tude s'applique b I'elevage c o n t r e l e des Crustaces marins: le travail preliminaire ~fi t o u t e experience d ' a q u i c u l t u r e consiste ~ determiner les c o n d i t i o n s externes
JOEL TRELLUET HUBERTJ. CECCALDI necessaires ~ une croissance optimale, aussi bien pour les fonctions physiologiques digestives que pour les f o n c t i o n s metaboliques.
Mat6riel et M 6thode Animaux ~tudi~s. Les Crustaces Decapodes Palaemon serratus adultes, ont 6t6 p~ches sur la cete mediter
raneenne, aux environs de Port-Saint-Louis-du-Rhene, fin Octobre 1976. L'acclimatation de six semaines s'effectue en laboratoire, dans un circuit semi-ouvert d'eau de mer, ayant un renouvellement de 4 ~ 5 fois par jour, et comportant un syst~me de refrig(,~rationamenant la temperature de I'eau 12° . Celle-ci est ensuite rechauffee dans chaque bac jusqu'aux temperatures de 14, 18, 22, 26, 30° suivant le bac, au moyen de resistances electriques sous verre; la regulation se fait grace ~ des retais 61ectroniques commandes par des thermometres & contact ou des sondes ~ thermistance [7]. L'eclairement est assure par des tubes fluorescents ITT Claude, de type Lumiere de jour de luxe, U 40 RS, 40W, 6500K, places ~ 70 cm au dessus des bacs, ~ raison de deux tubes de 40 W pour deux bacs d'experience. Une horloge commune commande la photoperiode L-D: 17-7. Pendant toute la duree de I'experience, les animaux sont nourris I'aide de moules fraiches, toujours fournies en exces les restes de nourritu re 6tant enleves chaque matin. Extraction des prot#ines solubles. Afin d'eviter les variations individuelles dQes aux modifications physiologiques au cours des differentes etapes du cycle d'intermue [19] et pour tenir compte des fluctuations circadiennes des activites enzymatiques [20], les animaux sont sacrifies par lots de 10 individus, ,~09.00 h apres refroidissement sur glace pilee. Pour une temperature donnee, 10 hepatopancreas sont broyes, ~ 0 °, dans un broyeur de type Potter, en verre, raison de 0,1 g de poids frais dans 1.5 ml de milieu d'extraction; 10 muscles sont broyes, a 0 °, a I'aide d'un homogeneiseur Sorvall type Omnimixer 17220, 1 min une vitesse de 10000 tr/min, a raison de 1 g de poids frais dans 4 ml de milieu d'extraction. Celui-ci est constitue par du tampon d'electrophorese: Tris, 0,09 M; borate, 0,08 M; Na2 EDTA, 0,003 M; complete par du glycerol, 0,5 M; du mercaptoethanol, 10 mM; pH=8,35. Les broyats sont ensuite centrifuges, ~ 4 °, 15 min ~ 10 000 g, et le surnageant obtenu, 30 min ~ 35000 g [14]. Le surnageant final sert ,~ I'electrophorese Les proteines solubles sont dosees, pour chaque lot et pour chaque temperature, par la methode de Lowry [21], et les concentrations exprimees en mg/ml d'extrait. Electrophor#ses. Les extraits de proteines solubles sont soumis a I'electrophorese sur gel ~ gradient de potyacrylamide, Pharmacia Fine Chemicals, PAA 4-30, 15 h 125 V stabilises, dans du tampon d'electrophorese decrit plushaut. R#ve/ations sur g e / s - dosages enzymatiques. Les activites enzymatiques sont revelees, directement sur les gels apres electrophorese suivant des procedures dej~ decrites [22, 23]. Les colorations obtenues sont integrees au photocolorimetre enregistreur Vernon, type PH I 3 UV, ramenees au mg de proteines solubles, et exprimees en unites arbitraires d'integration. Le poids moleculaire des differentes isozymes est 6valu# ~ +10000 d pres, par comparaison avec une electrophorese de serum humain et
INFLUENCE DE LA TEMPERATURE SUR QUELQUES ACTIVlTES ENZYMATIQUES CHEZ PALAEMONSERRATUS un standard de r~f~rence fourni par le fabricant. La trypsine et la chymotrypsine sont dosbes par les Test Boehringer Mannheim n ° 125.024 et n ° 125.865, respectivement avec les substrats benzoylarginine-p-nitranilide et carboxypropionyl-phenylalanine-p-nitranilide. Les activites sont exprim6es en IU par mg de prot6ines solubles.
Remerciements-Nous tenons & remercier Monsieur P. Richard qui a permis I'acclimatation des animaux, Messieurs B. J. Martin et R. Galois pour leur aide ~ la capture des animaux. Ce travail a (~te r~alis~ dans le cadre du contrat CN.E.X.O. 77/1598. Bibliographie 1. Hokanson, K. E. F., Kleiner, C. F. et Thorslung, T. W. (1977) J. Fish. Res. Board Can. 34, 639. 2. Zein-Eldin, Z. P. et Griffith, G. W. (1966) Biol. Bull. 131, 186". 3. Rouquette, M. (1965) Bull. Soc. Zoo/. Fr. 90,437. 4. Cuzon, G., Cognie, D. et Ceccaldi, H. J. (1970) C.R, Soc. Biol. 164, 1275. 5. Barnes, H. et Stone, R. L. (1974) J. Exp. Mar. Biol. Ecol. l & 275. 6. Campillo, A. (1975) Rev. Trav. Inst. P~ches Marit. 39, 381.
179
7. Richard, P (1978) Aquaculture 14, 13 8. Peters, R. (. et Long, G. E. (1973) Comp. Biochem. PhysioL A 46, 207. 9. Richard, P. (1977) Biochem. Syst. Ecol. $,297. 10. Martin, B. J. et Ceccaldi, H. J. (1977) Biochem. Syst. EcoL 5, 151. 11. Popham, J. D. et Dandy, J. W. T. (1976) Comp. Biochem. Physiol. B,&3, 97. 12. Trausch, G. (1976)Biochem. Syst. EcoL 4,65. 13. Gill, P. D. (1978) Comp. Biochem. Physiol. B5&271. 14. Tre(lu, J. et Ceccaldi, H. J. (1976) C.R. Soc. Biol. 178, 634. 15. Zwilling, R., Pfleiderer, G., Sonneborn, H. N., Kraft, V. et Stucky, I. (1969) Comp. Biochem. Physiol. 28,1275. 16. De Villez, E. J. et Reid, R. M. (1971) Comp. Biochem. Physiol. 38, 235. 17. Peters, R. I. et Long, G. E. (1973) Comp. Biochem. Physiol. A 46, 207. 18. Koehn, R. K. (1969)Science 153,943. 19. Trellu, J. et Cecca(di, H. J. (1977) C.R. Soc. Biol. 171, 115. 20. Tre)lu, J. et Ceccaldi, H. J. (1977) J. Interdiscipl. Cycle Res. $,357. 21. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. et Randall, R. J. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265. 22. Brewer, G. J. (1970) An Introduction to Isozyme Techniques, p. 70. Academic Press, London. 23. Shaw, C. R. et Prasad, R. (1970) Biochem. Genet. 4, 297.