Vereinfachte mikromethode zur bestimmung der leucinaminopeptidase im serum

CLINICA CHIMICAACTA

VEREINFACHTE

MIKROMETHODE

LEUCINAMINOPEPTIDASE

ZUR BESTIMMUNG

521

DER

IM SERUM

H. WEBER* Medizinische

Klinik

des Kantonsspitals

St. Gallen (Schweiz)**

(Eingegangen den 5. MBrz 1964)

SUMMARY A SIMPLE MICRO METHOD FOR THE DETERMINATION OF LEUCINE AMINOPEPTIDASE IN SERUM An ultra-micro method is described for the determination of leucine aminopeptidase in serum; it has the advantage of great simplicity. 0.02 ml serum is incubated with 2.0 ml tris buffer-L-leucin-/?-naphthylamide for 60 or 30 min at pH 7.2 and 37’, and the /%naphthylamide released is directly determined by adding I ml of fast red B solution. Fast red B has definite advantages over fast red 3 GL which has been almost exclusively employed previously.

Seit RUTENBURG u. Mitarb.1 1958 auf die Bedeutung der Leucinaminopeptidase (LAP)-Aktivitat im Serum fur die Diagnose von Pancreas-Erkrankungen hingewiesen haben ist der Messung dieses Enzyms zunehmende Beachtung geschenkt worden. Man Weiss zwar heute, dass die Friiherfassung des Pancreas-Carzinoms nach wie vor schwierig ist und dass die Bestimmung der LAP entsprechende diagnostische Fragen haufig nicht beantwortet. Nach den Ergebnissen spater erschienener Arbeiten von HARKNESS* und BRESSLER~ ist die Bestimmung der LAP such fur die Differentialdiagnose hepatobiliarer Erkrankung nur von beschrankter Bedeutung. Die Ursache fur dieses Ergebnis diirfte aber darin zu suchen sein, dass man lange Zeit immer noch hoffte, durch Bestimmung eines einzigen Enzyms definierte Krankheitsbilder oder Krankheitsgruppen mehr oder weniger eindeutig zu erfassen. Inzwischen haben verschiedene Autoren nachgewiesen, dass die Bestimmung der LAP sehr wertvolle diagnostische Resultate liefern kann, wenn sie in Beziehung zu andern Parametern - vor allem alkalischer Phosphatase (A.Ph.) und Transaminasen - gebracht wird 4, 5, rl. Parallele Erhiihungen der LAP und der A.Ph. weisen mit grosser Sicherheit auf hepatobiliare Erkrankungen hin. Isolierte Erhiihungen der LAP bei normaler A.Ph. wecken haufig Verdacht auf ein Pancreas-Carzinomb oder kdnnen such auf ein Carzinom anderen Ursprunges hinweisen ll. Andererseits: Isolierte Erhijhungen der A.Ph. bei normaler LAP sind meist Ausdruck einer Osteopathie. Wir haben selber mehrere Falle eines Paget mit dieser Konstellation beobachtet. Auch die Auftrennung der * Anschrift: Enzym-Labor. Hantonsspital, ** Chefarzt: Dr. T. WEGMAN.

St. Gallen (Schweiz).

LAP in ihre Isoenzyme erscheint diagnostiscl~ je lgnger je wcrtvoller, wie dies XYXatlem durch die Arbeiten van SCHOHEL UND WE'IVALK.~~ sowi~ Drot;u,zs~r II. Xitarb.’ zum Ausdruck kommt. Leider ist die Bestimmung der LAP sowohl nach den in der Literatur zu findenden Vorschriftm, als such mit den im Handel befindlichen Test-Packungen fiir das klinische Routine-Labor immer noch relativ kompliziert, was vor allem such der (;rund dafiir sein mag, dass die LAP die Popularit~t der A.Ph. niemals erreicht hat, obwohl sie dieser nach Ansicht vieler Autoren iiberlegen ist. Das Bediirfnis nach einer wesentlich Auch

vereinfachten Methode ist deshalb weit verbreitet. die hier zu beschreibende Methode beruht auf der Aufspaltung

von I.-

Leucyl-,!-Naphthylamin in I_-Leucin und P-Naphthylamin. Das so freigesetzte @Naphthylamin kann diazotiert und zu einem Azofarbstoff gekuppelt werden (BRATTON-M..~RSHALLReaktion “). Einfacher ist die Reaktion nach BRAUN-FALCO@, bei der das B-Naphthylamin mit Echtrot 3 GL direkt zu einem roten Farbstoff gekuppelt wird. Auch bei dieser Methode und den sich daraus ableitenden Modifikationen muss aber enteiweisst, zentrifugiert und der Azofarbstoff mit Essigs2ureBthylester ausgeschiittelt werden bevor man schliesslich die Extinktion messen kann. Diese verschirdenen Handlungen machen die Methode trotz ihrer prinzipiellen Einfachheit fiir den klinischen Routinebetrieb immer noch zu kompliziert. Einem Vorschlag von SAXORAJSKI’~ folgend haben wir versucht, das j%Naphthylamin direkt mit Echtrot B zu kuppeln und damit eine Methode entwickeln phatase-Bestimmung nach Bessey entspricht. Kupplung van @-Naphthylamin an Echtrot

kiinnen, die an Einfachheit der PhosWegen der prinzipiellen Bedeutung der B sind die dafiir notwendigen Bedin-

gungen etwas breiter besprochen worden. Es sollte miiglich sein, nach dem gleichtan Prinzip such die Oxytocinase (L-Cystin-di-~-Naphthylamid), Trypsin (N-Benzoylnr_-Arginin-P-Naphthylamid-HCl) u.a. nachzuweisen. Es diirfte vor allem such dann interessant sein, eine einfache LAP-Bestimmung zur Verftigung zu haben, wenn im Laufe der ngchsten Jahre die $-Nitroanilide als Substrate zur Verfiigung stehen werden. Nach allen vorliegenden Berichten sollen sich die verschiedenen LAP-Isoenzyme vor allem such hinsichtlich ihrer Substrat-Spezifit~t unterscheiden, so dass gcrade aus dem Vergleich der AktivitBten zwischen diesen beiden Substratgruppen unter Umstgnden

interessante

Ergebnisse

zu erwarten

sind.

BESCHREIBUNG DER METHODE

Die LAP katalysiert

folgende

Reaktion:

L-Leucin-B-Naphthylamid t----f

L-Leucin f p-Naphthylamin

Das so freigesetzte p-Naphthylamin wird mit Echtrot B (diazotiertes 4-Nitro-canisidin) direkt zu einem roten Farbstoff gekuppelt und die Extinktion der L6sung bei 546 nm gemessen (Fig. I). A#xzrate,

Glaswaren, ChemiknlieB

Photometer (z.B. Eppendorf) Filter Mikropipette 20 ~1 (z.B. Beckman) Stabpipetten IO ml, 2 ml, I ml

546 nm

LEUCINAMINOPEPTIDASE

BESTIMMUNG

oder automatische Pipette 2 ml “Ultra-Asept” Nicht zu dickwandige, 4-6 ml Reagensglaser

523

IM SERUM

(Braun-Melsungen)

Thermokonstantes Wasserbad 37’ Tris-Puffer puriss. p.a. MG 121, 14 (z.B. Fluka) Cobalt-Chlorid p.a. MG 237.95 (z.B. Merck) L-Leucin-p-Naphthylamid-Hydrochlorid puriss. p.a. MG 2928 Echtrot B, MG 180.15 + 287.3 (Fluka) P-Naphtylamin puriss. p.a. MG 143,19 (z.B. Fluka) Salzsaure I N, p.a. (z.B. Merck) Schwefelsaure 5 yO

(z.B. Fluka)

P- Naphthylamin

Echtrot B

’

co rotw

Fig. I. Bildung

eines roten Azofarbstoffes

\

‘/

-NH3+

Azofarbstoff

aus p-Naphthylamin

und Echtrot

B.

Herstellung der Reagentien Tris-Pufler 0.05 M mit CoCl, (I * IO-~ M), PH 7.2: 6.05 g Tris in ca. 800 ml Aq.bidest l&en, pH mit I N Salzsaure auf ca. 7.5 einstellen; 238 mg CobaltChlorid in etwas Aq.bidest liisen und so in den Trispuffer geben. PH dann genau auf 7.2 einstellen und mit Aq.bidest auf genau IOOO ml aufftillen. Dieser Puffer ist mehrere Monate haltbar und wird am besten bei 4’ aufbewahrt. P@er-Sub&at Gebrauc/&sung. IOO mg I-Leucin-p-Naphthylamid-HCl ad 200 ml Aq.bidest l&en und nachher 200 ml Tris-Puffer zugeben. Diese Losung halt sich in dunkler Flasche bei 4O wenigstens einen Monat, wahrscheinlich such Ianger. Das Substrat (Trockensubstanz) sollte ebenfalls ktihl und gut verschlossen aufbewahrt werden. Echtrot B-Liisung.

Echtrotsalz

B: 250 mg in

IOO

ml eiskaltem

Aq.bidest.

lijsen

und nachher I ml 5% Schwefeldure zugeben. Am besten stellt man IOO ml Aq.bidest. in einem Becherglas in ein Gefrierfach und giesst es nach begonnener Eisbildung in ein zweites Becherglas, in welchem man inzwischen das Echtrot abgewogen hat. Das Echtrot sol1 vor Licht geschtitzt und deshalb erst kurz vor der Zubereitung der Losung abgewogen werden. Diese Liisung halt sich in dunkler Flasche bei 4” gut 5-7 Tage. Wir stellen sie wijchentlich einmal her. Sie wird in dieser Zeit etwas dunkler, wodurch Leerwert und Analysenwert etwas ansteigen. Das Gesamtresultat wird aber dadurch nicht beeinflusst. Trockensubstanz ktihl und vor Licht absolut geschtitzt aufbewahren. Naphthylamin-Standard: 3.49 mM (500 ,ug/ml). j%Naphthylamin: 50 mg in 50 ml Aethanol 96”/0 p.a. l&en und mit Aq. bidest. auf genau IOO ml aufftillen. Diese Liisung halt sich bei 4’ in dunkler Flasche und gut verschlossen wenigstens 1-2 Monate. Clin. Chim. Acta, IO (1964)

521-529

PI. WEBER

524

Das Serum wird mit einer Mikropipette fur Analysen und zugehiirigc Lcerwertc am besten gleichzeitig in kurze (5-O cm lange) Riihrchen einpipettiert. Serum Puffer-Substrat

AIzalyse:

0.02 ml 2.0 ml

Gemisch

gut schtitteln und bei 37’ wahrend 60 (evt. 30) min inkubieren. Echtrot-Losung

I.0

ml

gut schiitteln, ca. IO min stehen lassen und bei 546 nm gegen Wasser ablesen (EA). Leerwert. Am besten z Teile Puffer-Substrat und I Teil Echtrot-LSsung einige ~inuten vor beendeter Inkubation der Analysen in der erforderlichen Menge mischen (PS~-Gemisch) Serum 0.02 ml PSE-Gemisch 3.0 ml gut schtitteln, ca. IO min stehen lassen und bei 546 nm gegen Wasser ablesen (EL). (Da die Leerwerte nur sehr geringe Extinktionen aufweisen (o.oro.-o.o50), wirken sich die tiblichen Pipettenfehler tiberhaupt nicht aus, so dass ohne weiteres das Gesamtgemisch pipettiert werden darf.) Standard-Leerwert

Standard

0.02 ml

Standard-Liisung --

2.0 1.0

Ail. desi. Echtrot-T~~sung

2.02 ml 1.0 ml

ml ml

nicht inkubieren, gut mischen und nach ca. IO min bei 546 nm gegen Wasser ablesen. Bavechnung der Aktivih%t Einheiten (I.U.) ausgedrtickt werden: ,umol/min/~ooo

Diesesollin Internationalen ml Serum, bei 37’. Aktivitgt

(I.U.)

EA - EL : -____&t

-

EstLw

. 58.2

Ableitung des Faktors jO.000 x 3.49 58.2 = :--;7y+ 50.000 : ~mrech~ungsfaktor 3_49. 50

van 20 ,ul Serum auf die BezugsgrCisse van 1000 ml

I ml des Standards enthllt

3.49 pmol ,!?-Naphthylamin.

* 60 : Reduktion der Inkubationszeit

0.02 ml enthalten 50 ma1 weniger.

auf eine Minute.

Bei einem absolut messenden Photometer kann die Aktivitat such absolut gemessen werden, wenn man an Stelle eines Standards den molaren Extinktionskoeffizienten verwendet. Da die Extinktion des Standards unter den angeftihrten Bedingungen 0.270 betragt, ergibt sich als einfachste und schnellste Berechnungsart : AktivitZt

(1.u.) = (J??A-

EL) X 21 j

58.2 (0.270

=

215)

Ausserdem besteht natiirlich such die Moglichkeit, sich eine Standardkurve anzulegen und die jeweilige Aktivitat daran abzulesen.

LEUCINAMINOPEPTIDASE

BESTIMMUNG IM SERUM

BESTIMM~NG DER ~OR~ALWERTE

525

IM SERUM

Es wurden die Seren von 93 erwachsenen Blutspendern des Schweizerischen Roten Kreuzes in St. Gallen untersucht. Es lie@ eine Normalverteilung vor (Fig. z), so dass der Normalbereich aus X f z s berechnet werden darf. ff = 59.2 I.U. s = 11.0 I.U. = 37 - 81 I.U.

Mittelwert Standardabweichung Normalbereich

Pathologische Werte kiinnen bis ca. 600 I.U. reichen.

Fig. 2. Normalwertverteilung

von 93 gesunden, erwachsenen

Blutspendern.

llO0 -

9ao -

700 G 5 so0 s 300

Abhingrgkert

“on drr

S”b.rratk~nre”lrat,o” too 1

L

I

6.5

A0

I

L

I

I

I

I

7.5

a.0

a.5

9.0

PH

10

I too

1 200

I 300

, 100 SuBsTRar

Fig. 3. Abhgngigkeit der LAP-Aktivit&t vom PK. Tris 0.025 M. L-LeucinB-Naphthylamid 0.83 m&f. Inkubation I h bei 37”. Serum 0.02 ml, Endvol. 2.02 ml.

I

I

600 pg /ml

a00

I 1000

I 12OO

EV

Fig. 4. AbhPngigkeit der LAP-Aktivitst von der Substratkonzentration. Tris0.025 M, pi 7.2, Serum 0.02 mI Endvol. 2.02 ml. Inkubation x h bei 37”.

OPTIMALE REAKTIONSBEDINGUNGEN

Da die Reaktion zwischen @-Naphthylamin und Echtrot B pH abhangig ist, m&en nach erfolgter Inkubation die einzelnen Ansatze zuerst auf ein einheitliches PH von 7.2 eingestellt werden. Vorher wurden die Reaktionen durch Einstellen der Glaschen in Eiswasser gestoppt. Fig. 3 vermittelt das Ergebnis. Zwischen 6.75 und 7.5 liegt ein relativ breites Optimum, das auf beide Seiten hin nur langsam absinkt. In Ubereinstimmung mit den meisten Autoren wurde fur die weitern Untersuchungen ein pH von 7.2 gewahlt.

Det- oytimale Wert lie@ bei ca. ZOO pg L-Leucin-~-~aphth~~lamin pro ml Endvolumen (0.68 * IO-~ Mj (Fig. 4). Bei hoheren Konzentrationen tritt eine leichte Uberschusshemmung ein. Bei den von BERGMEYER angegebenen Verfahrenl” wird mit Substratkonzentrationen von zoo-z86 pg/rnl gearbeitet. Bei der hier beschriebcnen Methode besteht eine Substratkonzentration von 250 ,ug/ml. SAMOR.\JSKI” lie@ mit einer Konzentration van nur 80 ,ug/ml sicher deutlich unterhalb des Optimums. Eine Begriindung dafiir ist in seiner Arbeit nicht zu finden.

800 700 $

60‘-

t SW% =a alo300 ao100 I 0

I 10-s

I 10-e

I lo-

I IO.1

I 10“

M Co/PUFFER

Fig. 5, _%bh&ngigkeit der LAP-Aktivit$t van der Cobaltkonzentration. Tris O.oZj .V, p” Substrat 0.85 mM. Serum o.oz ml, Endvol. 2.02 ml.

7.1,

.’

1300 EXI:

2.2oO 2.m

JIOO

.

-

/

! 900

1.800 .

1.600 -

/

:G G! i:

1.100 1.200 -

.

J.000 -

i

700

.

500 -

.dOO *erum

.dOO .200 -

Abhingrgkat

/

.6W-

“0” der

/* 1,

300 -

. Konzmtratm”

-

l,. I.

loo-

..,’ 10 20

t

45

/

:

/

I

60

I

90

I.

I*

/ ~1 SERUM

Fig. 6. AbhPngigkeit der LAP-Aktivit% son der Serumkonzentration. Reaktionsbedingungen wie oben.

20

60

/*

/

Abha’ngfgkwt

WI

#or

Inkubatmnszetl

60

I I‘?5

,

JR0

5

210

MINUTEN

Fig. 7. Abhgngigkeit der LAP-AktiviUit von der Inkubationszeit. Reaktionsbedingungen wie oben.

Co~~ltko~zzent~ut~on

Die LAP wird u.a. durch Cobalt aktiviert. Die AbhGrgigkeit der Aktivitgt von der Konzentration wird durch Fig. 5 illustriert. Das Optimum liegt bei ca. 5 * IO-~ M. Wir wahlten eine Konzentration von I * 10-3 M, da Cobalt in hijhern Konzentrationen im basischen Tris-Puffer der Losung eine storende Eigenfarbe gibt. Zahlreiche Autoren verzichten auf die Cobaltzugabe ganz. Serumkonzentmtion

Unter den angefiihrten Bedingungen besteht zwischen z und 60 ,ul SerumjAnsatz praktisch vollkommene Linearitgt (Fig. 6). Bei grosserer Serummenge entsteht ein

LEUCINAMINOI’EPTIDASE BESTIMMUNG IM SERUM allmahlicher

Abfall der zu erwartenden

Farbintensitat.

527

Die vorliegende

Methode

ar-

beitet mit 20 ~1 pro Ansatz. Es konnen aber statt dessen sehr gut such nur 5 oder IO ,ul verwendet werden. Griissere Serummengen LAP im Blut niemals notwendig.

sind wegen der kraftigen

Aktivitat

der

Inkubationszeit Inkubationszeit und gemessene Aktivitat zeigen eine streng lineare Beziehung (Fig. 7). Wir haben uns fur eine normale Inkubationszeit von I Stunde entschieden, da die grossten Fehler durch Zeitungenauigkeiten entstehen (s. Abschnitt Prizision). In Notfallsituationen ist es aber ohne weiteres oder a Stunde zu reduzieren.

moglich,

die Inkubationszeit

auf +

DIE BILDUNG DES AZOFARBSTOFFES Diverse

Puffer konnen nicht verwendet

werden, da sie mit Echtrot

B unter den

angeftihrten Bedingungen zu Trtibungen oder Ausfallungen ftihren. Dies gilt u.a. fur den bei LAP-Bestimmungen haufig verwendeten Phosphat-Puffer. Am besten hat sich uns ein 0.05 M Tris-Puffer bewahrt. Nach Angaben von BERGMEYER~~ zeigt die LAP in Tris-Puffer die gleiche Aktivitat wie in Veronal- oder Phosphat-Puffer. Das Echtrot B sollte in einer Konzentration von 250 mg/Ioo ml Losung vorliegen (Fig. 8). Fur kleinere @-Naphthylaminmengen gentigten such 50 mg/Ioo ml. Bei grosseren Mengen Echtrot-Konzentrationen.

entsteht aber die optimale Farbintensitat erst bei hoheren Dagegen bewirkt eine noch weitere Steigerung der Kon-

EXT. 1.200

. Se

. lOOpi Standard

1.800

zl]/yoo I

150

Fig. 8. Bildung des Azofarbstoffes IOO ,ul ,%Naphthylamin-Standard

zentration

keine Zunahme

,

2w

:

2WSfandad

250 mg ECHTROT/lDOm:

in Abhlngigkeit (3.49

van der Echtrot B-Konzentration. m&f), 2.0 ml Aq. bidest und I ml Echtrot

der Farbintensitat

mehr, fiihrt

20 ,ul bzw. B-LSsung.

aber zu starkerer

Eigen-

farbe der Lbsungen, zu rascherer Zersetzung des Echtrots und zu hoheren Leerwerten. Zur Priifung der Farbkonstanz des gebildeten Azofarbstoffes wurden die Farbintensitaten von Analyse und Leerwert tiber langere Zeit gemessen (Fig. 9). Die Liisungen wurden dabei normalem Tageslicht ausgesetzt. Die Farbe bildet sich im wesentlichen innerhalb der ersten beiden Minuten nach Zugabe des Echtrots zum B-Naphthylamin. Etwa von der IO. bis zur 30. min bleiben die Farbintensitaten von Analyse und Leerwert konstant. Danach beginnt bei der Analyse ein ganz leichter Abfall. Nach 4 Stunden liegt die Intensitat bei etwa go% des Ausgangswertes. Nach(‘[in. Chim.

Acta,

IO (1964)

5z1-yzg

52s

H. WEI3ER

her erfolgt wieder ein leichtcr Anstieg. Der Leerwert steigt nach ca. i Stundc gztn;l langsam an und erreicht etwa nach 6 Stunden das Doppelte des Ausgangs\vcrte_;. Bei nicht ikterischen Seren ist der Leerwert hauptsachlich durch die Eigenfartx der Echtrotlijsung bedingt. Bei griisseren Serien geniigt CS, die Lterwcrtc van z- .s normalen und van allen ikterischen Seren zu bestimmen. Zwischen Naphthylaminmenge und Farbintensitgt besteht bis zu Extinktionen von ca. 1.500 strenge Linearitgt einen weiten Bereich erfiillt.

300-

(Fig.

IO).

Das Lambert-Beersche

(&s&z

ist iibcr

l.AOO-

l

*NAL”SE

+------*---._.

I.200

-

/

G $

l.OOO..900 -

200-

a

l/

.KOO.LOO-

700 0

.._.-.-

I 0

1 10

._._. I 20

-.-. 30

10

50

DIE ZUVERL&SIGKEIT

‘,“sar,tat

zwrrctlm

,3 - Naphtylammkonz + Farb,ntsns,lif

/* ,

60 MINKEN

Fig. 9. Priifung auf Farbkonstanz des Azofarbstoffes bei normalen Tageslicht.

/

.2OO-

LEERWERT

.’

I ! I / , I I I 20 LO 60 80 100 120 1~0 IbD 180200 ~1 STANDARD

Fig. I o. Be&hung zwischen ,!-Naphthylaminkonzentration und Farbintensitat.

DER METHODE

L-Leucin$-Naphthylamid gilt allgemein als geeignetes Substrat zur Bestimmung der LAP. Wahrscheinlich besteht keine absolute Spezifitgt, dagegen ist die Affinitgt der LAP zu diesem Substrat

doch wesentlichgrijsser

als diejenige

anderer Peptidasen.

Van einem einzigen Serum wurden an verschiedenen Tagen, von verschiedenen Personen und mit verschiedenen Pipetten 20 Einfachbestimmungen durchgeftihrt. Das Ergebniss dieser Untersuchungen lautet : Mittelwert Standardabweichung Variationskoeffizient:

X = 60.2 I.U. s = 1.47 1.11’.

. IOO=

2.44qd

Der methodische Fehler ist damit fiir eine Routinemethode klein. Es hat sich gezeigt, dass der grijsste Teil dieses Fehlers durch Ungenauigkeiten bei der Einhaltung der Inkubationszeit entsteht. Wenn von einem einzigen Serum von verschiedenen Personen, mit verschiedenen Pipetten aber genau gleicher Inkubationszeit Parallelbestimmungen vorgenommen werden kann man noch zu besseren Resultaten gelangen :

2 = jg.0 = 0.67 t-k =

1.14

Ferner wurde von einer Gruppe von 21 Seren an je eine Bestimmung durchgeftihrt und die Korrelation

2

aufeinanderfolgenden Tagen (nach Pearson) zwischen den

LEUCINAMINOPEPTIDASE

BESTIMMUNG IM SERUM

529

beiden Gruppen berechnet. Der resultierende Korrelationskoeffizient betrug 0.993. Auch dieses Ergebnis weist auf die gute Prgzision der ~ethode hin. An unserem Spital sind bisher mit dieser Methode ca. 3000 Bestimmungen durchgefiihrt worden. Uber die Resultate, die vor allem in Verbindung mit der alkalischen Phosphatase und den Transaminasen sehr aufschlussreich sind, werden wir in einer speziellen Arbeit berichten. DANK

Die vorliegende Arbeit wurde durch Untersttitzung des Schweizerischen Nationalfonds zur Forderung der wissenschaftlichen Forschung (Projekt Nr. 2703) ermoglicht. Frgulein L. BRAUR danke ich fiir die unermiidhche und exakte Wtarbeit.

Es wird eine Ultra-Mikromethode zur Bestimmung der LAP im Serum beschriehen, die gegeniiber den bisher publizierten Verfahren den Vorteil grosser Einfachheit hat. 0.02 ml Serum werden mit 2.0 ml Tris-Puffer-L-Leucin-B_Naphthylamid wahrend 60 oder 30 min bei einem pH von 7.2 und bei 37’ inkubiert und das dabei freigesetzte ,%Naphthylamin durch Zugabe von I ml Echtrot B-Losung direkt bestimmt. Die Verwendung von Echtrot B an Stelle des sonst fast ausschliesslich gebrauchten Echtrot 3 GL bringt entscheidende Vorteile mit sich. LITERATUR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12

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