Versuche zur Transformation an höheren Pflanzen: Nachweis von Heterozygoten in Versuchen zur Transplantation von Genen für Anthocyansynthese bei Petunia hybrida

Lehrstuhl fur Botanische Entwicklungsphysiologie der Universitat Hohenheim

Versuche zur Transformation an hoheren Pflanzen: Nachweis von Heterozygoten in Versuchen zur Transplantation von Genen fur Anthocyansynthese bei Petunia hybrida DIETER HESS

Mit 2 Abbildungen Eingegangen am 18. Mai 1971

Summary Transformation experiments in higher plants: Tracking out of plants heterozygous by transplantation of anthocyanin genes In earlier investigations we could proof the existence of plants homozygous for a functioning gene locus of anthocyanin synthesis, obtained by treatment of the white flowering mutant 34 d 10 of petunia with DNA of the red flowering cyanidin type of petunia. One of these plants was heterozygous for a second gene locus of anthocyanin synthesis (HESS 1969 a, b; 1970 a). The present paper deals with the appearance of transplantation heterozygous plants which should be expected in such transformation experiments. As pointed out by crossing transplantation homozygous plants with the white flowering mutant the flowers of transplantation heterozygous plants are slightly pink or show anthocyanins only along the veins leaving the throat (fig. 1; HESS 1970 a). For one pink flower, obtained by treatment with cyanidin type DNA, we could proof heterozygosity (tab. 1). The plant in question was a chimera. In several cases treatments of seedlings or ovaries after fertilization with cyanidin type DNA increased significantly the percentage of plants with anthocyanins along the veins of the flowers (tab. 2 and 3). By selfing at random flowers with anthocyanins along the veins in experiment and control in one case an effect of the DNA treatment on the Fcgeneration could be found (tab. 4). Nevertheless, the chance to find transplantation heterozygous plants in this way is rather low because there is a background of flowers with anthocyanins in the controls too. An other, more promising but also more time consuming way was to evaluate all flowers on all experimental plants in respect to anthocyanin synthesis along the veins. In one experiment we found a transplantation homozygous plant following treatment with cyanidin type DNA (HESS 1971 a) and two plants with a strong anthocyanin synthesis along the veins in all the flowers (fig. 1, 2). The flowers of cuttings showed the same phenotype. These plants prooved to be heterozygous by selfing (tab. 5) and by back crossing with the mutant 34 d 10 (tab. 6). Besides the low expressivity of the transplanted gene material there is a further difficulty, the partial sterility of the seeds of transplantation heterozygous plants (tab. 5).

Zusammenfassung In frliheren Arbeiten waren in Versuchen zur Transplantation von Genen der Anthocyansynthese Transplantationshomozygote nachgewiesen worden. In derartigen Transformationsexperimenten sind aber besonders Transplantationsheterozygote zu erwarten. Solche Trans-

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plantationsheterozygote werden in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen. Aufgrund der geringen Expressividit des transplantierten Genmaterials und aufgrund von Sterungen, die die Transplantationsheterozygoten in ihrer Fortpflanzung aufweisen kennen, gestaltet sich dieser Nachweis schwierig.

Einleitung Bei Petunia hybrida war es moglich, in weiBbluhenden Mutanten durch Behandlung mit DNS aus einer rotbluhenden Form eine bei vegetativer und sexueller Fortpflanzung konstante Anthocyansynthese zu induzieren (HESS 1969 a, b; 1971 a). Einige Pflanzen, die nach DNS-Behandlung eine besonders starke Anthocyansynthese aufwiesen, wurden einer genetischen Analyse unterworfen. Sie erwiesen sich in einem Genort fur Anthocyansynthese als homozygot. Eine der Pflanzen war daruber hinaus fur einen zweiten Genort fur Anthocyansynthese heterozygot (HESS 1970 a). Bei derartigen Transformationsversuchen sind nun Heterozygote weitaus wahrscheinlicher als Homozygote. Eine Transplantationsheterozygotie wurde bereits im Rahmen von Versuchen zur Dbertragung von Genen fur Blattform nachgewiesen (HESS 1970 b). Das Auffinden von Heterozygoten in unseren Versuchen zur Dbertragung von Genen zur Anthocyansynthese war wegen der geringen Expressivitat des ubertragenen Genmaterials mit Schwierigkeiten verbunden. Schon die Transplantationshomozygoten weisen eine weitaus schwachere Anthocyansynthese auf als die normalen Homozygoten. Durch Kreuzungen mit der weiBbluhenden Mutante konnten aus solchen Transplantationshomozygoten Transplantationsheterozygote gewonnen werden. Sie wiesen entweder eine nur sehr schwache Anthocyansynthese uber die ganze Oberflache der Bluten hinweg auf oder bildeten Anthocyan nur entlang der aus dem Schlund herausstreichenden Adern. In diesen Adern ist auch normalerweise die Anthocyansynthese am intensivsten (HESS 1970 a). Erst nachdem durch diese Untersuchungen ermittelt worden war, welcher Phanotypus bei Transplantationsheterozygoten uberhaupt zu erwarten war, schien eine Suche nach ihnen in unseren Transformationsexperin1enten erfolgversprechend. Dariiber wird in dieser Arbeit berichtet. Material und Methoden DNS-Donator war der rotbliihende Cyanidintyp von Petunia hybrida, DNS-Acceptor die weiBbliihende Mutante 34 d 10 ebenfalls von Petunia hybrida. Die DNS-Aufarbeitung erfolgte wie beschrieben (HESS 1969 b). Die DNS wurde in den meisten Versuchen Keimlingen zugefiihrt (HESS 1969 b). AuBerdem wurde noch eine andere Technik der Applikation eingesetzt: DNS wurde durch einen entfetteten Baumwollfaden in den Bliitenstiel oder in den Fruchtknoten zu verschiedenen Terminen nach der Besdiubung hineingesaugt. Auf diese Weise zugefiihrte DNS wird vom SproBsystem nicht nur aufgenommen, sondern - wie Versuche mit doppelmarkierter DNS zeigten - auch ohne Degradation geleitet (EBERHARDT und HESS, in Vorbereitung). Zur Kontrolle dienten weiBbliihende Mutanten, die entweder nur mit dem Lesungsmittel oder mit DNS ebenfalls aus weiBbliihenden Mutanten behandelt worden waren. Die statistische Absicherung erfolgte mit Hilfe des X2 - Testes (WEBER 1967) oder mit Hilfe des WILCoxON-Testes fiir zwei Stichproben (DOCUMENTA GEIGY 1960).

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Versuche zur Transformation an hoheren pflanzen

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Ergebnisse und Diskussion

Wie in der Einleitung erwahnt, weisen uber entsprechende Kreuzungen hergestellte Transplantationsheterozygote entweder sehr leicht rosa gefarbte Bluten oder weiBe Bliiten mit Anthocyan entlang der Adern auf. Es wurde nun iiberpriift, ob sich nach einer DNS-Behandlung Transplantationsheterozygote mit diesen beiden Phanotypen nachweisen lieBen.

1. Transplantationsheterozygotie bei Leicht rosa ge/arbten Bliiten

In unseren ersten Versuchen erhielten wir in Kontrolle wie Versuch recht hohe Prozentsatze an Pflanzen mit leicht rosa gefarbten Bliiten. Von diesen Pflanzen lieBen sich die Transplantationshomozygoten durch eine starkere Anthocyansynthese einwandfrei differenzieren (HESS 1969 a, b). Die zugrundeliegenden Versuche waren in Koln-Vogelsang und dann im ersten Jahr unseres Hohenheimer Aufenthaltes durchgefiihrt worden. In allen weiteren Versuchen - in den Jahren 1968 Mitte his 1971 Mitte - erhielten wir diese hohen Prozentsatze an schwach rosabliihenden Pflanzen in Kontrolle und Versuch nicht mehr. Die Ursachen hierfiir sind unbekannt. Man konnte die veranderten Kulturbedingungen verantwortlich machen, vielleicht spielt aber eine Virusinfektion eine Rolle. Denn die in Vogelsang gehaltenen Petunien waren generell virusverseucht. DaB diese Virusinfektion nichts mit der Anthocyansynthese in Transplantationshomozygoten zu tun hat, wurde schon belegt (HESS 1969 a, h; 1970 a).

In unseren seit Mitte 1968 durchgefiihrten Versuchsreihen traten in Versuchen wie Kontrollen nur noch ganz vereinzelt Pflanzen mit nur ein oder zwei derartigen leicht rosa gefarbten Bliiten auf. DaB diese leichte Rosafarbung bei Kontrollpflanzen nicht konstant weitergegeben wird, wurde schon belegt (HESS 1969 a, b). Wiederholungen dieser Stichproben fiihrten zu dem gleichen Ergebnis (Tab. 1 oben). Selbstet man rosa Bluten an sonst weiBbluhenden Pflanzen, die im Keimlingsstadium mit DNS aus dem Cyanidintyp behandelt worden waren, so stellt man in der Mehrzahl der FaIle ebenfalls keine Weitergabe der Fahigkeit zur Anthocyansynthese fest. In einem Fall jedoch spaltete die Nachkommenschaft auf, und zwar wie zu erwarten in Pflanzen mit dem leichten Rosaton der Elternbliite (Transplantationsheterozygote) in stark rosa bliihende Pflanzen (Transplantationshomozygote) und Pflanzen mit weiBen Bliiten (homozygot rezessive Mutante 34d10). Die Zahl der Nachkommen war gering. Wie auch unsere weiteren Versuche (siehe unten) zeigten, kann es in solchen Transplantationsheterozygoten zu Storungen bei der Fortpflanzung kommen. Jedoch ist trotz der geringen Zahlen durch das Herausspalten der erwarteten Phanotypen der heterozygote Charakter der Ausgangsbliite belegt. Es sei noch einmal betont, daB die ubrigen Bliiten an den betreffenden Pflanzen eine weiBe Farbung aufwiesen. Durch die Aufspaltung wird also nicht nur die Transplantationsheterozygotie fur die Ausgangsblute, sondern auch der Charakter einer Chimaere fur die gesamte pflanze belegt. Solche Chimaeren waren bei unseren Versuchen zu erwarten.

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Tabelle 1 Transplantationsheterozygotie bei leicht rosa geHirbten Bliiten. Die Bliiten hatten sich auf im Keimlingsstadium wie angegeben behandelten Pflanzen (vgl. HESS 1969 b) entwickelt. Selbstung und Auswertung der Fl. Table 1. Transplantation heterozygosity in slightly pink flowers. The flowers developed on plants treated as indicated (cf. HESS 1969 b). Selfing and evaluation of the Fl.

Versuch

Nr. Pflanze

rosa Bliite

Puffer DNS aus 34 d 10::-) DNS aus dem Cyanidintyp::-) DNS aus dem Cyanidintyp::-) DNS aus dem Cyanidintyp::-) DNS aus dem Cyanidintyp::-) DNS aus dem Cyanidintyp::-)

25 26 36 36

2

36

3

Behandlung

50 56

F l aus der Selbstung der rosa Bliiten Summe F l Phanotyp 20 68 81

aBe weiB alle weiB aBe weiB

135

aBe weiB

88

aBe weiB

25

3 stark rosa: 10 leicht rosa : 12 weiB aBe weiB

34

r

::-) Konzentrationen 100-140 Iml

2. T ransplantationsheterozy go tie bei Bluten mit Anthocyansynthese entlang der Adern

Wie erwahnt, fanden sich in unserem Pflanzenmaterial seit 1968 sowohl in Versuch wie in Kontrolle nur vereinzelt «Hintergrundpflanzen» mit einer schwachen Anthocyansynthese in der gesamten Bliitenoberflache. Eine genaue Examination der Bliiten ergab aber dann~ daB ein anderer Hintergrund auftreten kann, namlich eine leichte Anthocyansynthese entlang der Adern. Die Anthocyansynthese entlang der Adern ist bei Transplantationsheterozygoten weitaus starker (Abb. 2). Es kann jedoch zu flieBenden Dbergangen kommen. Fur die erste Auswertung unserer Versuche diente deshalb als Kriterium: Anthocyansynthese entlang der Adern mindestens einer Bliite, ganz gleich, wie stark oder wie schwach diese Anthocyansynthese war. a) Anthocyansynthese in der behandelten Generation Ober die Anthocyansynthese in der behandelten Generation orientieren die Tab. 2 und 3. Wie ersichtlich lieB sich der Prozentsatz derjenigen Pflanzen, die in mindestens einer Bliite Anthocyan entlang der Adern fiihrten, durch Behandlung von Keimlingen mit DNS aus dem Cyanidintyp in einigen Fallen statistisch signifikant steigern (Tab. 2). Die DNS-Zufuhr durch den Blutenstiel fiihrte zu keinem statistisch signifikanten Effekt. Die betreffenden Zahlen werden deshalb hier nicht gebracht. Dagegen kam es bei einer DNS-Zufuhr durch den Fruchtknoten zu einem statistisch signifikanten An·-

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Tabelle 2

HESS

749 1971 a)

561

541

663

850 701

258 237 423 160 3253 1529 678 1069 1251

362 327 493 181 3608 1606 695 1259 1428

(29 '0/ 0) (27 0/0) (14 0/0) (12 %) (10 0/0) (5 %) (3 0/0) (15 %) (12 '0/ 0)

188

160

(24 '0/ 0)

(22 0/0)

186::-) (21 0/ 0)

104 90 70 21 355 77 17 190 177

Pha.notyp der behandelten Generation Summe WeiB Anthocyan

::-) zuzuglich eine Transplantationshomozygote (vgl. ::.::-) vgl. HESS 1971 a und diese Arbeit unten

4/58K

4/57K

DNS Cya, abgebaut durch 1 min DNase-Behandlung::-::-) DNS Cya, abgebaut durch 2 min DNase-Behandlung::-::-)

DNS Cya DNS Cya DNS 34dl0 Puffer DNS Cya DNS 34dl0 Puffer DNSCya DNS Cya, abgebaut durch 5 min DNase- Behandlung DNSCya

1/22V 1/23V 1/26K l/K 2/36V 2/37K 2/38K 3/50V 3/51K

4/56V

Behandlung

Nr.

x

=

0,001

4/56V gegen die Kontrollen nicht abgesichert

3/50V gegen 3/51K fur x = 0,05

2/36V gegen 2/37K fur x

l/22V gegen 1/26K fur x = 0,001 1/23V gegen 1/26K fur x = 0,001

Differenz gesichert bei a

x2 - Test

Table 2 The effect of DNA treatments on the anthocyanin synthesis along the veins in the treated generation. Treatment of seedlings, DNA concentrations 100-400 ~vlml (methods cf. HESS 1969 b). Anthocyan = plant with at least one flower showing anthocyanins along the veins leaving the throat; WeiB = plant with white flowers. V = experiment; !( = control. Only some representative experiments are given.

Die Wirkung von DNS-Behandlungen auf das Auftreten von Anthocyan entlang der .A.dern in der behandelten Generation. Behandelt wurden Keimlinge mit DNS-Konzentrationen von ca. 100-400 r/ml (zur Methodik vgl. HESS 1969 b). Anthocyan = Pflanze mit mindestens einer Blute, die Anthocyan entlang der aus dem Schlund ausstreichenden Adern fuhrte; WeiB = Pflanze mit weiBen Bliiten. V = Versuch; K = Kontrolle. Es werden nur einige reprasentative Experimente wiedergegeben.

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D.

HESS

stieg cler Pflanzen mit Anthocyan entlang der Adern, jedoch nur dann, wenn die DNS 2,5 Tage nach cler Bestaubung, cl. h. nach cler Befruchtung zugefiihrt wurcle. Die Behancllungen zu friiheren Terminen blieben wirkungslos (Tab. 3). Tabelle 3 Die Wirkung von DNS-Behandlungen auf das Auftreten von Anthocyan entlang der Adern in der behandelten Generation. DNS in Konzentrationen von 100-400 rlml wurde liber einen entfetteten Baumwollfaden 0,5, 1,5 und 2,5 Tage nach der Bestaubung in Fruchtknoten aufgesaugt. (Die Befruchtung fand ungefahr 1,5 bis 2,0 Tage nach der Bestaubung statt.) Pro Pflanze wurde nur ein Fruchtknoten behandelt. WeiB = Pflanze mit weiBen Blliten; Anthocyan = Pflanze mit mindestens einer Bllite, die Anthocyan entlang der aus dem Schlund ausstreichenden Adern flihrte. V = Versuch, K = Kontrolle. Die Behandlungen 0,5 und 1,5 Tage nach der Bestaubung zeigten keinen Effekt. Die betreffenden Werte sind nicht aufgeflihrt. Nur die Behandlung 2,5 Tage nach der Bestaubung flihrte 7..U einer signifikanten (WILCoxON-Test flir paarweise Stichproben, Differenz 42V gegen 42K bei a = 0,01 gesichert) Steigerung der Anthocyanpflanzen. Table 3 The effect of DNA treatment on the anthocyanin synthesis along the veins in the treated generation. DNA in concentrations between 100 and 400 rlml was sucked into the ovaries over a defatted cotton thread 0,5, 1,5 and 2,5 days following pollination (fertilization took place about 1,5-2,0 days after pollination). Only one ovary per plant was treated. WeiB = plant with white flowers. Anthocyan = plant with at least one flower showing anthocyanins along the veins leaving the throat. V = experiment, K = control. Treatments 0,5 and 1,5 days after pollination showed no effect. Only the treatment 2,5 days after pollination caused a statistically significant (WILCOXON test, difference 42V I 42K significant at a = 0,01) increase in anthocyanin plants. Nr.

Kapsel

Behandlung

42V

a

DNS Cyanidintyp 2,5 Tage nach Bestaubung

42K

b c d e a

Puffer 2,5 Tage nach Bestaubung

b c d

Phanotyp der behandelten Generation Summe WeiB Anthocyan 35

25

10 (28 %)

20 25 7 17 12

10 19 5 14 11

10 6 2 3 1

18 17 61

16 16 58

(50 %) (24 '0/0 ) (29 '%) (18%) (8 '0/ 0)

2 (11 %) 1 (6 %) 3 (5 %)

b) Anthocyansynthese in cler F1 cler behandelten Generation Behancllungen mit DNS aus clem Cyaniclintyp konnen also bei cler weiBbliihenclen Mutante in cler behanclelten Generation clie Zahl cler Pflanzen mit Anthocyan entlang cler Aclern signifikant erhohen. Damit ist noch nichts clariiber ausgesagt, claB sich unter cliesen Pflanzen Transplantationsheterozygote befinclen. Zur Beweisfiihrung waren Selbstungen von Bliiten mit Anthocyan entlang cler Aclern notwenclig.

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Versuche zur Transformation an hoheren Pflanzen

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Zunachst wurden Stichproben in der Art durchgefiihrt, daB in Versuch wie Kontrolle Bliiten geselbstet wurden, die Anthocyan entlang der Adern aufwiesen. Dabei wurde nicht darauf geachtet, ob auch die nachfolgenden Bliiten an den betreffenden Pflanzen Anthocyan in ihren Adern enthielten. In den Serien, die aus der DNS-Behandlung von Fruchtknoten resultierten, konnte in den Nachkommenschaften in keinem Fall eine statistisch signifikante Steigerung des Prozentsatzes der Pflanzen mit Anthocyanadern festgestellt werden. In den Versuchsreihen, die auf der Behandlung von Keimlingen basierten, war in einem Fall der Prozentsatz der Pflanzen, die Anthocyanadern fiihrten, statistisch signifikant erhoht (Tab. 4). Der Effekt der DNSBehandlung wurde also iiber die Generationen weitergegeben. Es fan den sich jedoch keine stark rosa bliihenden Pflanzen, die man als Transplantationshomozygote hatte ansprechen konnen. Solche Homozygote hatten aber nach Selbstung von TransplantaTabelle 4 Die Wirkung von DNS-Behandlungen auf das Auftreten von Anthocyan entlang der Adern in der F t der behandelten Generation. An 5 bis 15 Pflanzen aus den meisten Versuchs-Nr. cler Tab. 2 und 3 wurde je eine Bliite mit Anthocyan entlang der Adern geselbstet. Nur in dem unten angegebenen Fall war eine Wirkung der DNS-Behandlung auch in der F t festzustellen. In allen anderen Fallen waren die Differenzen zwischen Versuch und Kontrolle nicht signifikant. Die Differenz zwischen den Reihen 36V und 38K ist uber die Berechnung des dreifachen mittleren Fehlers und uber den WILCoxoN-Test (fur a = 0,05) knapp abgesichert. P = Parentalgeneration. WeiB und Anthocyan = wie in Tab. 2 und 3. Table 4 The effect of DNA treatments on the anthocyanin synthesis along the veins in the F 1 of the treated generation. On 5 to 15 plants out of nearly every experimental group of tab. 2 and 3 one flower with anthocyanins along the veins was selfed. Only in the experiment shown in the tab. there was an effect on the Ft. In all other cases the differences between experiment and control were not significant. WILCOXON test: difference 36V / 38K significant at a = 0,05.

Nr.

P Behandlung

36V

38K

Ft WeiB

Anthocyan

32 163 26 178 304 246 55 51 45

27 160 16 124 225 170 37 23 16

5 3 10 54 79 96 18 28 29

(16 %) (2 ()/o) (38 %) (32 %) (26 %) (39 %) (33%) (55 0/0) (64 %)

132 45 66 53 83

120 41 57 35 75

12 4 9 18 8

(9 0/0) (9 %) (14%) (34%) (10 0 / 0)

Nr. der P-Pflanze

Summe

DNS eya

36V1 36V2 36V3 36V4 36V5 36V6 36V7 36V8 36V9

Puffer

38K1 38K2 38K3 38K4 38K5

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Pflanzenphysiologie Bd. 66

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tionsheterozygoten auftreten miissen. Ihr Fehlen konnte auf Fertilitatsstorungen zuriickgehen (vgl. unten). Dariiber hinaus sind die Chancen, bei solchen Stichproben Transplantationsheterozygote zu fassen, insofern gering, als ja ein «Hintergrund» an Pflanzen von ahnlichem Phanotyp - Anthocyan entlang der Adern - gegeben ist. Damit lauft man bei der aus raumlichen Griinden niedrigen Zahl der Stichproben stets Gefahr, nur «Hintergrundpflanzen» zu selbsten. In einer weiteren Versuchsserie gingen wir deshalb auf andere Weise vor. Es wurden nicht mehr ganz einfach Bliiten geselbstet, die Anthocyan in ihren Adern fiihrten, sondern die Pflanzen wurden genau von Bliite zu Bliite beobachtet. Ais Kriterium fiir eine mogliche Transplantationsheterozygote galt: aile Bliiten der Pflanzen mit Anthocyan entlang der Adern und starke Anthocyanbildung entlang der Adern. Als starke

Abb. 1. Von links nach rechts: Blute der Mutante 34dl0, Blute einer durch Kreuzung zwischen der Transplantationshomozygoten A (vgl. HESS 1969 b, 1979 a) und 34dl0 erhaltenen Transplantationsheterozygoten und Blute der durch DNS-Behandlung erhaltenen Transplantationsheterozygoten Al (vgl. Tab. 5). Fig. 1. Left to right: flower of the mutant 34dl0, flower of a transplantation heterozygous plant obtained by crossing the transplantation homozygous plant A (cf. HESS 1969 b, 1970 a) with 34d10 and flower of the transplantation heterozygous plant A1 obtained by DNA treatment (cf. tab. 5).

Anthocyanbildung wurde eine Anthocyansynthese bezeichnet, die derjenigen in durch Kreuzung hergestellten Transplantationsheterozygoten entsprach (Abb. 1, 2). In einer unserer Versuchsreihen war zwar der Prozentsatz der Pflanzen mit Anthocyan entlang der Adern in mindestens einer Bliite durch DNS-Behandlung nicht gesteigert worden (Tab. 2, Versuchsreihe Nr. 4). In diesem Versuch war aber eine Transplantationshomozygote aufgefunden worden (HESS 1971 a). Dariiber hinaus fanden sich in dieser Versuchsreihe zwei Pflanzen (A 1 und A 2), die den oben aufgestellten Kriterien voll und ganz entsprachen. Auch wenn man von ihnen Stecklinge nahm, bildeten alle Bliiten an allen Stecklingen Anthocyan entlang der Adern. Diese beiden Pflanzen wurden einer weiteren genetischen Analyse unterzogen, und zwar durch Selbstungen und durch Kreuzungen mit der Mutante 34d10.

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DNSCya, durch DNase abgebaut

DNSCya

Behandlung

Kl K2 K3

A2

Al

Nr. der P-Pflanze

schwache Farbung entlang der Adern nur in den geselbsteten Bliiten

starke Farbung endang der Adern in allen Bliiten

Phanotyp der P-Pflanze

Kla K2a K3a K3b K3c

Ala Alb A2a A2b

Nr. der Kapsel

1)

83 98 110 44

Summe der Samen

20 227 21 151 19

17 16 29 6

F1 Summe der Pflanzen

1) nicht gezahlt, bei Kontrollen in der Regel 95 % Keimung ::-) starke Anthocyanfarbung entlang der Adern in allen Bliiten wie in den P-Pflanzen :~::-) schwache Anthocyanfarbung entIang der Adern in mindestens einer Bliite, nicht in allen Bliiten

4/57K

4/56V

VersuchsNr.

P

20 227 29 117 19

-

Phanotyp WeiB

8::-::-) 34::-::")

17::-) 16::-) 29::-) 6::-)

Anthocyan

Table 5 The effect of DNA treatments on the anthocyanin synthesis along the veins in the F 1 of the treated generation. On two plants out of the experimental group 4/56 V (cf. tab. 2), showing in contrast to the plants of tab. 4 a strong anthocyanin coloration along the veins in all flowers several flowers were selfed. On some plants OUt of the control 4/57K (cf. tab.2) several flowers with a slight anthocyanin production along the veins were selfed as well (there was no strong anthocyanin production in the control flowers). Legends cf. tab. 4.

Tabelle 5 Die Wirkung von DNS-Behandlungen auf die Anthocyansynthese endang der Adern in der F 1 der behandelten Generation. Aus der Versuchs-Nr. 4/56V der Tab. 2 wurden mehrere Bliiten an zwei Pflanzen geselbstet, die im Gegensatz zu den Pflanzen aus Tab. 4 nicht nur in einer, sondern in allen Bliiten eine starke AnthocyanHirbung endang der Adern aufwiesen. In der Kontrolle 4/57K der Tab. 2 wurden an verschiedenen Pflanzen Bliiten mit einer schwachen Anthocyansynthese endang cler Adern geselbstet (Bliiten mit einer ahnlich starken Anthocyansynthese wie im Versuch fanden sich in der Kontrolle nicht). Legende vgl. Tab. 4.

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Bei Selbstungen wurden von verschiedenen Samenkapseln beider Pflanzen nur Nachkommenschaften mit dem Phanotyp der Eltern, also mit Anthocyan entlang der Adern, erhalten. Wie eine Durchzahlung ergab, kommen jedoch iiber % der Samen iiberhaupt nicht zur Keimung (Tab. 5). Ganz offensichtlich fiihren also die DNSBehandlungen zu Storungen im genetischen Apparat der behandelten Zellen und der folgenden Zellgenerationen, die sich im Ausfall ganzer Phanotypenklassen manifestieren. q03

q02 q,01 fC M/100mg 34d10

A1

A2

Abb.2. Anthocyangehalt in ,.uM/100 mg Bliitentrockenpulver von 34dl0 (nur Bliiten des «Hintergrundes» mit etwas Anthocyan entlang der Adern) und von den beiden Transplantationsheterozygoten Al und A2 (alle Bliiten mit sdirkerer Anthocyanbildung entlang der Adern, vgl. Tab. 5). Fig. 2. Anthocyanin in ttM/l00 mg flower dry weight of 34dl0 (only «background» flowers with a slight anthocyanin production along the veins) and of the two transplantation heterozygous plants Al and A2 (all flowers with stronger anthocyanin synthesis along the veins, cf. tab. 5).

Bei Kreuzungen der n1utmaBlichen Transplantationsheterozygoten kommt es in der F 1 zu einem Aufspalten 1 : 1 Genetisch weiB : Genetisch geadert. «Genetisch» deshalb, weil bei den Berechnungen bereits der Hintergrund an aderfiihrenden Pflanzen beriicksichtigt wurde (Tab. 6). Das der Erwartung entsprechende Aufspalten beweist den heterozygoten Charakter der betreffenden Pflanzen. 3. Besprechung Die oben gebrachten Versuche belegen, daB in unseren Transformationsversuchen wie zu erwarten auch Heterozygote auftreten, sie zeigen allerdings auch, daB sich der Nachweis solcher Heterozygoten schwierig gestalten kann. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Moglichkeiten eines solchen Nachweises erprobt. Die erste bestand darin, stichprobenartig Bliiten aus Versuch und Kontrolle zu selbsten, die eine leichte Anthocyansynthese entlang der Adern aufwiesen oder bei denen die gesamte Bliite leicht rosa gefarbt war. Ob die weiteren Bliiten an den betreffenden Pflanzen ebenfalls Anthocyan fiihrten oder nicht, blieb unberiicksichtigt. Dieses Verfahren kann angesichts der aus raumlichen Grunden geringen Zahl an Stichproben nur selten Erfolg haben. Denn man lauft stets Gefahr, auch im Versuch Bliiten mit Anthocyan-«Hintergrund» zu selbsten (vgl. Tab. 1 und 4).

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Versuche zur Transfonnation an hoheren Pflanzen

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Tabelle 6 Ruckkreuzung der mutmaBlichen Transplantationsheterozygoten Al aus Tab. 5 mit der weiBbluhenden Mutante 34dl0. Aufspalten der R-Generation im Verhaltnis 1 : 1. a = mutiertes Allel fur Anthocyansynthese; At = funktionsfahiges transplantiertes Allel fur Anthocyansynthese. Bei der Berechnung ist der Hintergrund an Anthocyanpflanzen (14,4 %, ermittelt durch parallele Aufzucht von 34dl0) bereits berucksichtigt. Anthocyan = Anthocyan entlang der Adern in allen Bluten. Table 6 Back cross of the plant Al out of tab. 5, probably heterozygous by gene transplantation, with the white flowering mutant 34d10. 1 : 1 segregation of the R-generation. a = mutant allele of anthrocyanin synthesis, At = functioning transplanted allel of anthocyanin synthesis. The background of anthocyanin plants (14.4 00/0 in this experiment) was already taken into calculation. Anthocyan = anthocyanins along the veins in all flowers. Ruckkreuzung

Summe R (4 Kapseln)

Aufspalten von R

Al x 34d10 Genotyp aAt x aa

216

Genotyp Phanotyp Verhaltnis erw. Haufigkeit erw. gef. 30 PO) 50

<

<

aAt Anthocyan 1 108 102

aa WeiB 1 108 114

Das zweite Nachweisverfahren bestand darin, Pflanze fur Pflanze und an der gegebenen Pflanze Blute fur Blute auf Anthocyanbildung entlang der Adern zu beobachten. Nur solche Pflanzen, die in allen Bltiten eine zudem noch in ihrer Starke sich deutlich vom «Hintergrund» absetzende Anthocyansynthese aufwiesen, wurden geselbstet. Dieses Verfahren fuhrte zum Erfolg (Tab. 5 und 6). Chimaeren werden mit ihm allerdings nicht erfaBt. AuBerdem ist es zeitlich so aufwendig, daB seine Anwendung bei hohen Pflanzenzahlen in der Regel auf Schwierigkeiten stoBen wird. Ein weiterer, ebenfalls nicht unerwarteter Befund ist, daB Pflanzen, die wie unsere Transplantationsheterozygoten einen faBbaren genetischen Effekt der DNS-Behandlung zeigen, Storungen in der Fortpflanzung aufweisen konnen. Entsprechende Befunde wurden nicht nur in unseren Versuchen zur Obertragung von Genen der Anthocyansynthese gemacht, sondern auch in Experimenten zur Dbertragung von Genen der Blattform (HESS, in Vorbereitung). Diese Storungen sind kaum verwunderlich. Denn man muB stets berucksichtigen, daB ja mit Gesamt-DNS-Praparaten behandelt wird und somit eine Aufnahme von DNS an den verschiedensten Stellen des genetischen Apparates moglich ist, nicht nur an den gerade untersuchten Genorten fur Blattform und Anthocyansynthese. DaB exogen zugefuhrte DNS von hoheren Pflanzen und Tieren in die Zellen aufgenommen und mit dem eigenen genetischen Material assoziiert werden kann, ist inzwischen wiederholt belegt worden (BHARGAVA and SHANMUGAM 1971). Es ist verstandlich, daB eine solche DNS-Aufnahme Folgen fur die sexuelle Fortpflanzung haben kann. Es sei nur an die Vorgange der Meiosis erinnert.

Z.

Pfl4nz~nphysiol.

Bd. 66. S. 155-166. 1972,

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D. HESS

Der Befund, daB im Keimlingsstadium behandelte Pflanzen Storungen bei der Fortpflanzung aufweisen, laBt sich also voll und ganz mit DNS-Transplantationen vereinbaren. Wenn wir Bilanz ziehen, so HiBt sich feststellen: in rund 2 Dutzend Transformationsversuchen, in denen etwa 13 000 Mutanten mit DNS aus dem Cyanidintyp behandelt und in denen etwa ebenso viele Kontrollpflanzen (unbehandelt oder mit der eigenen DNS behandelt) aufgezogen worden waren, fanden wir bislang 5 Transplantationshomozygote. Dariiber hinaus konnten, wie in der vorliegenden Arbeit belegt, mit Sicherheit 3 Transplantationsheterozygote gefaBt werden. Dabei diirfte die wahre Zahl der Transplantationsheterozygoten angesichts der Nachweisschwierigkeiten hoher liegen. Diese Zahlen gelten nur fiir die Versuche zur Dbertragung von Anthocyangenen. Sie zeigen, daB Transformationsversuche an hoheren Pflanzen selbst im giinstigsten Fall wenig aussichtsreich sein diirften. Ob methodische Verbesserungen, zum Beispiel das Arbeiten mit isolierten Protoplasten oder mit Haploiden (vgl. dazu HESS 1971 b und c), hier Abhilfe schaffen konnen, miissen weitere Untersuchungen zeigen. Fraulein B. NEUHAUS danke ich fur ihre interessierte technische Mitarbeit, Herrn Gartenmeister G. BLAICH fur die Betreuung der Pflanzen. Die Arbeiten wurden mit Unterstutzung des Bundesministers fur Bildung und Wissenschaft durchgefuhrt, dem hierfur ebenfalls gedankt sei.

Literatur DOCUMENTA GEIGY: Wissenschaftliche Tabellen. Basel 1960. BHARGAVA, P. M., and G. SHANUGAM: Progr. Nucleic Acid Res. 11, 104 (1971). HESS, D.: Z. Pflanzenphysiol. 60, 348 (1969 a). - Z. Pflanzenphysiol. 61,286 (1969 b). - Z. Pflanzenphysiol. 63, 31 (1970 a). - Z. Pflanzenphysiol. 63,461 (1970 b). - Naturwissenschaften 58, 366 (1971 a). - Saatgutwirtschaft/Safa 23, 172 (1971 b). - Ber. dt. Bot. Ges. 83,278 (1971 c). WEBER, E.: GrundriB der Biologischen Statistik. Gustav Fischer, 6. Auf!., Stuttgart 1967. Professor Dr. DIETER HESS, Lehrstuhl fur Botanische Entwicklungsphysiologie der Universitat Hohenheim, D-7000 Stuttgart 70 (Hohenheim), Emil-Wolff-Str. 25

Z. Pflanzenphysiol. Bd. 66. S. 155-166. 1972.