Der Umsatz von Anthocyanen bei in vivo und in vitro kultivierten Blüten von Petunia hybrida

Lehrstuhl fur Botanische Entwicklungsphysiologie der Universitat Hohenheim

Der Umsatz von Anthocyanen bei in vivo und in vitro kultivierten Bliiten von Petunia hybrida A. M. STEINER Mit 4 Abbildungen Eingegangen am 28. September 1972

Summary The Turnover of Anthocyanins in flowers of Petunia hybrida kept in vivo and in vitro In the flowers of the delphinidin-genotype of Petunia hybrida the turnover of the 3-monoglucosides of delphinidin, petunidin, and malvidin was studied in vivo in flowers on whole plants kept in the greenhouse and also in vitro in intact flowers on defoliated pedicels kept in a Knop-solution with and without 0,5 M sucrose. In pulse labeling experiments cinnamateHC or acetate-HC was injected into the pedicels of young flowers just below the sepals and thereafter the kinetic of labeling of the 3 anthocyanins was followed during the flower development. Under both experimental conditions likewise a turnover of the different anthocyanins was observed during their linear accumulation phase with biological half-lives in the range of 30-50 hours. The entire anthocyanin molecules are turned over. There are principally no differences with respect to the anthocyanin turnover in isolated petals (STEINER, 1971) and in the intact flowers.

Einleitung Die lineare Akkumulation cler 3-Monoglucosidedes Del, Pet und Malt) erwies sich in isolierten Petalen des Delphinidin-G,enotyps von Petunia hybrida stets als das Resultat aus Synthese und Umsatz (STEINER, 1971). Dabei kann sowohl die SynthCiseals auch die Umsatzgeschwindigk,eit in unters,chi!edlicher Weise von der Lichtquali1at abhangig sein, wobei Isich die einzelnen Anthocyan-3-monoglucoside noch zusatzlich verschieden v,erhalten konnen (STEINER, 1972 a). Ferner ist die Intensitatsabhangigkeit der Akkumulation der einzelnen Anthocyane in verschiedenen Lichtqualitaten unterschiedlich. (STEINER, 1972 b). Bei allen diesen Versuchen zur Biochemie ,der Anthocyanakkumulation und ihrer Regulation durch Licht wUJ}den isolierte P,etalen des Delphinidin-G,enotyps v,erwendet, ,da ein Ver,suchsans(1Jtz mit isolierten Petalen einfacher und 'sicherer zu handhahen ist und derartige Untersuchungen experimentell erst zuganglich macht. 1m Zusammenhang mit dem Nachweis eines Umsatzes der Anthocyane wahrend der Phase ihrer lichtabhangigen linearen Akkumulation wurden nun aber verschiedentlich und wiederholt folgende Einwande gemacht: 1. Da die isolierten Petalen in destilliertem Wasser inkubiert wurden, konnte der Umsatz der Anthocyane lediglich die Folge 1) Folgende Abkurzungen werden verwendet: Del = Delphinidin-3-monoglucosid; Pet = Petunidin-3-monoglucosid; Mal = Malvidin-3-monoglucosid.

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eines Hungerstoffwechsels sein und somit in intakten Bliiten in VlVO eln nennenswerter Umsatz notwendigerweise nicht in Erscheinung treten. Die Beobachtung, daB Saccharos,e bei ilsolierten Petalen und in vitro kultivierten Bliiten die Lichtwirkung zu e~setzen vermag bzw. im Licht die Anthocyanakkumulation unspezifisch steigert (STEINER, 1972 c) scheint diesen Einwand zu stiitzen. 2. Da die Pulsmarkierungsversuche mit Acetat- 14 C durchgefiihrt wurden, das sowohl in den A-Ring der Anthocyanidine als auch in die Glucos'e der Anthocyan-3-monoglucoside leingebaut wird, sei niaht hinHinglich erwiesen, daB nicht nur cler glucosidische Anteil, sondern auch die Anthocyani1dine 'selbst umgesetzt wiirden. Auf diese moglichen Einwande war bereits in den vorhergehenden Arbeit,en sowohl unter Zugrundelegung experimenteller DClJten zur Anthocyansynthes,e als auch aufgrund der Kenntnisse zur Biochemie anderer Flavonoide ,eingegangen 'worden. Dabei konnten ,die Einwande nach Idem -derzeitigen Wissensstand als nicht hinreichend begriindetangesehen werden (STEINER, 1971, 1972 a). Um offensichtl[ch dennoch verbliebene Zw'eifel auszuraumen, werden nun nachfolgend Jeinig.e Untersuchungen mitget,eilt, bei welchen in Pulsmarkier:un~sexperimentennach Fiitterung von Zimtsaure14 14C und Acetat- C ein Anthocyanumsaltz auch in intakten in vivo und in vitro kultivierten Bliiten nachgewiesen 'wirld.

Material und Methoden Das Material, die Versuchsbedingungen, der Analysengang sowie die MeBmethoden wurden bereits beschrieben (STEINER 1970, 1971). Acetat-2- 14 C, spezifische Aktividit 56 mCi mMol-1, wurde von Amersham Buchler, Braunschweig, Zimtsaure-3- 14 C, spezifische Aktivitat 54 mCi mMol-1, vom Departement des Radioelements, Gif-Sur-Yvette, Frankreich, bezogen. Das Na-Acetat wurde in destilliertem Wasser, die Zimtsaure in 0,4 % Na-Hydrogencarbonat (BARZ und HasEL, 1971) aufgenommen. Die Applikation der Aktivitaten erfolgte durch Einspritzen von 2-3 fll der radioaktiyen Losungen mittels Mikroliterspritzen in die Bliitenstiele, 2-3 mm unterhalb des Sepalenansatzes. Die Verwundung beeintrachtigt den normalen Verlauf der Bliitenentwicklung nicht. Fiir die Versuche in vitro wurden Stengel mit Bliiten der Lange 19-21 mm von den im Gewachshaus gehaltenen Pflanzen mittleren Alters abgeschnitten. Die nicht erwiinschten Bliiten und Knospen sowie Blatter wurden anschlieBend entfernt, die Bliitenstengel auf 6-8 em Lange gekiirzt und einzeln in Reagenzglaser mit 50 ml Nahrlosung gebracht. Die Offnung der Reagenzglaser war mit Parafilm verschlossen. Durch diesen hindurch wurden die Stengel bis zur Bliite eingehangt. Als Nahrlosung diente eine Knop-Losung von pH = 5,2-5,4, die bei einigen Experimenten 0,5 M an Saccharose war. Die Bliiten wurden im FluoreszenzweiBlichtDauerlicht (Osram Leuchtstoffrohren L 40 W/15) bei 5000 Lux and 25° C gehalten. Zwischen Versuchsansatzen, bei welchen die Nahrlosung und die Bliitenstengel sterilisiert wurden, und Versuchsansatzen ohne diese Behandlung ergaben sich wahrend der gewahlten Versuchsdauer keine meBbaren Unterschiede. Bei rein mineralischer Nahrlosung wurden im Versuchszeitraum Kontaminationen nur selten beobachtet, die entsprechenden Ansatze ausgeschieden. Bei Versuchen mit Saccharosezusatz konnte nach etwa 60 Std. verschiedentlich das Auftreten von Kontaminationen beobachtet werden, weshalb in diesem Fall die Versuchsdauer auf 48 Std. begrenzt wurde. Die Akkumulation der 3 untersuchten Anthocyane zeigt bei dieser Versuchsanstellung bei in vitro gehaltenen Bliiten im Vergleich zum Akkumulationsverhalten von Bliiten in vivo prinzipiell keine Unterschiede; die relativen Proportionen der Akkumulationsraten bleiben

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innerhalb der natiirlichen Streuungsbreite und Fehlergrenzen unverandert. Allein im Gegensatz zu den Verhaltnissen in vivo ist die Anthocyanakkumulation in vitro lichtabhangig. Eine Saccharosezugabe kann die Lichtwirkung ersetzen bzw. im Licht die Anthocyanakkumulation steigern (STEINER, 1972 c).

Ergebnisse 1. Versuche zum Umsatz der Anthocyane in vivo Die Durchfiihrung von Ver,suchen mit radioaktiven Isotopen an ganzen Pfrlanzen im Gewachshaus bereitet Schwierigkeiten. Ziel des vorliegenrden VersiUchsansatzes

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Zeit nach Zugabe von Zimtsaure - 14C

Abb. 1. Versuche zum Umsatz der Anthocyane des Delphinidin-Genotyps von Petunia hybrida in vivo. Zu Versuchsbeginn, 9.30 Uhr, erhielten Bliiten der Lange 18-21 mm direkt an den Pflanzen jeweils 0,9 {lCi Zimtsaure-3- 14 C. Die Bliiten wuchsen im Gewachshaus bei etwa 20 0 C unter Tageslichtbedingungen. Mittelwerte aus 2 Versuchen vom 23.3. und 2.5.72 mit jeweils 25-28 Bliiten pro Versuchspunkt.

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war esdeshalb lediglich grundsatzlich nachzuweisen, daB auch in situ in den Bliiten ein Umsatz der Anthocyane stantfindet. Wie Abb. 1 zeiglt, beohachtet man wahr,end des Versuchszeitraums eine lineare Anthocyanakkumulation. 24 Std. nach Applikation der Zimtsaure- 14 C wurden bei 2 gleichsinnig verlaufenen Versuchen im Mittel beim Del, Pet und Mal pro Bltite Gesa,mtaktivitaten von 7330, 670 und 220 Zrerf. min- 1 gemessen. Nach w,eiteren 30 Std. nahmen ,dire entspr'echenden Aktivitaten auf 5250, 460 und 150 Zerf. min- 1 abo Damit ergibt sich ftir aIle 3 Anthocyane wahrend dieses Zeitraums eine Abnahme der Gesamtaktivitat von etwa 30 0/0, mi,th~n eine biologische Halbwerrtsz,eit von etwa 50 Std. Infolge der linearen Zunahme der Anthocyangehalte :ist die Abnahm,e .cler spezifischen Aktivitaten der einzelnen Anthocyane noch ausgepragter. 1m gleichen Zeitraum nimmt die Trockenmasse der Bli.iten urn 5,6 mg (50 0/0), die Bltiltenlange urn 6,6 'mm (18 0/0) zu (Abb. 2). 2. Versuche zum Umsatz der Anthocyane in vitro

Zwei ,den Versuchen in vivo (Abb. 1) entsprechende Pulsmarkierungsversuche mit Zimtsaure- 14 C wurden auch in vitro durchgeftihrt. Die Kinetiken der Anthocyanakkumulation, der G,esamitaktivitaten und spezifischen Aktivitaten wurden tiber einen

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Zeit nach Zugabe der 14C-Vorstufe

Abb. 2. Lange ( - - - ) und Trockenmasse (- - - -) der Bliiten des Delphinidin-Genotyps von Petunia hybrida bei den Versuchen zum Umsatz der Anthocyane. Versuche zum Umsatz in vivo mittels Markierung durch Zimtsaure- 14 C: X (vgl. Abb. 1). Versuche zum Umsatz in vitro mittels Pulsmarkierung durch Zimtsaure- 14 C: + (vgl. Abb. 3); durch Acetat14e mit Saccharosezugabe: • (vgl. Abb. 4).

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Z,eitraum von 96 Std. verfolgt (Abb. 3) und verliefen in heiden Versuchen gleichsinnig. Auch hier beginnt bereits 24 Std. nach Applikation der markierten Zimtsaure, bei einer Zunahme der Anthocyangehalte, eine Abnahme der reingehauten Aktivitaten und entsprechend auch der spezifischen Aktivitaten. Wahrend 24-48 Std., dem V,ersuchszeitraum, welcher dem in vivo Experiment entspricht (Abb. 1), nehm,en die Gesan1taktivitaten des Del, Pet und Mal pro Bliite von 7130, 700 und 465 auf 5130,

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[Std]

Zeit nach Zugabe von Zimtsaure- 14 C

Abb. 3. Versuche zum Umsatz der Anthocyane des Delphinidin-Genotyps von Petunia hybrida in vitro. Zu Versuchsbeginn erhielten die Bliiten jeweils 0,85 !lCi Zimtsaure-3- 14 C, die Bliiten wurden in Knop-Losung gehalten. Mittelwerte aus 2 Versuchen vom 27. 7. und 30.7.71 mit jeweils 26 Bliiten pro Versuchspunkt.

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520 und 270 Zerf. min- t abo Daraus errechnen sich flir Del, P;et und Mal biologische Halbwertzeiten von 43, 47 und 30 Std. Nach 48 Std. nimmt ,die Umsatzgeschwindigkeit der Anthocyane ab, doch wird wahrend der gesamten Ve:rsuchsdauer ein Umsatz beoba;chtete Die Trockenmasseder Blliten nimmt bis 96 Std. linear zu, die Bllitenlange erreicht zu diesem Zeitpunkt annahrend ihren Endwert (Abb. 2), ,die Blliten beginnen sich zu entfalten.

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Zeit nach Zugabe von Acetat-

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Abb. 4. Versuche zum Umsatz der Anthocyane des Delphinidin-Genotyps yon Petunia hybrida in vitro. Zu Versuchsbeginn erhielten die Bliiten jeweils Mengen zwischen 0,4-0,6 flCi Acetat-2- 14 C. Die Bliiten wurden in Knop-Losung gehalten, die 0,5 M an Saccharose war. Mittelwerte aus 4 Versuchen yom 26./28./30.4. und 3.5.71 mit jeweils 22-30 Bliiten pro Versuchspunkt.

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Urn eine weitere Vergleichsrnoglichkeit zu den Versuchen zum Anthocyanurnsatz in isolierten Petalen (STEINER, 1971) herzustellen, wurde der vorhergehende Versuch noch derart abgewandelt, daB die Bluten, urn einen Hungerstoffwechsel auszuschlieBen, in einer saccha.rosehaltigen Knop-Losung kuhiviert und die Anthocyane mit Acetat- 14 C rnarkiert wurden. Die Mittelwerte aus 4 Versuch,$lansatzen, die in 2 Analysengangen aufgearheitet wurden, sind in Abb. 4 dargestell,t; die Ansatze zeig'ten gleichsinniges Verhalt,en. Infolge ,der Saccharosezugahe nimmt der Anthocyangehalt hier im Vergleich zu den Versuchen mit Zimtsaurefutterung ohne Saccharosle stark zu (vgl. Abb. 3; STEINER, 1972 c). 12 Std. nach Acetat- 14 C-Applikation werden pro Blute beim Mal mit 165 Zerf. min- t und 24 Std. nach der Zugahe beim Del mlit 910 und beirn Pet mit 250 Zerf. min- t die hochsten Werte cler Gesamtaktivitaten gemlessen. 48 Std. nach der Acetat- 14 C-Applikation liegen die Gesamtaktivitaten des Del, Pet und Mal pro Blute bei 730, 185 und 115 Zerf. min-to Fur den Versuchszeitraum von 24-48 Std.errechnen sich damit fur Del und Pet biologische Halbwertszeiten von 60 und 45 Std., fur den Zeitraum von 12-48 Std. fur Mal eine Halbwertszeit von 60 Std. Bei diesen Versuchen mit Saccharosezugabe nehmen sowohl die Trockenmasse cler Bluten als auch die Blutenlange wahrend cler gesamten V,ersuchsdauer linear stark zu (Abb. 2), die Bluten beginnen sich nach 48 Std. bereits zu entfalten. Die Mittelwerte zweier entsprechender Versuche mit Acetat- 14 C-Applikation aher ohne Saccharosezugabe sind in cler Tabelle wiedergeg,eben. Die Auswertung erfolgte Tabelle 1 Versuche zum Umsatz der Anthocyane des Delphinidin-Genotyps von Petunia hybrida in vitro. Zu Versuchsbeginn erhielten die Bli.iten jeweils 0,45 fiCi Acetat-2- 14 C. Die Bli.iten wurden in Knop-Losung gehalten. Mittelwerte aus 2 Versuchen yom 1. 6. und 7.6.71 mit jeweils 20 Bli.iten pro Versuchspunkt. Zeit nach Versuchsbeginn (Std.) 48 72

Anthocyangehalt (uMol) Del Pet Mal 0,418 0,436

0,105 0,116

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Spezif. Aktivitat (Zerf. min- 1 f'lMol) Pet Del Mal

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2430 1890

48 und 72 Std. nach Versuchsbeginn. Bei annahernd gleichbleibenden Anthocyangehalten nehmen die Gesamtaktivitaten in diesem Zeitraum noch ab, wie es sich besonders deutlich in der Abnahme der spezifischen Aktivitaten zeigt. Fur diesen, im Vergleich zu den anderen Versuchen 24 Std. spater liegenden Zeitraum, errechnen sich biologis,che Halbwertszeiten fur Del, P,et und Mal von 240, 100 und 60 Std. Bemerkenswert ist, daB die Einbauraten bei Acetat- 14 C-Applikation nach 48 Std. fur Del, Pet und Mal in rein mineralischer Nahrlosung 0,17; 0,04; 0,02 %, in mine,ralischer Nahrlosung mit 0,5 M Saccharose aber nur 0,07; 0,02; 0,01 % betragen. Bei Saccharosezugabe betragen die Einbaura'ten noch etwa 50 %.

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Stellt man 24 Std. nach Zimtsaure- 14 C-Applikation einen Ve~gleich der Einbauraten in vivo und in vitro an, ergibt sich nur beim Mal ein Unterschied: die Einbauraten flir Del, Pet und Mal sind in vivo 0,37; 0,034; 0,011 % und in vitro 0,38; 0,038; 0,025 0/0. Dabei ist die Verdoppelung der Einbaurate beim Mal wahrscheinlich darauf zurlickzuflihren, daB im FluoreszenzweiBlicht im Vergleich zum Tageslicht im Gewachshaus die Mal-Akkumulation gefordert ist (STEINER, 1971, 1972 a). Auch die Einbauraten von Zimtsaure- 14 C und Aceta/t- 14 C (ohne Saccharosezugabe, Tabel1e) liegen in der gleichen GroBenordnung. 48 Std. nach Applikation erg,eben sich flir Del, Pet und Mal bei Verwendung von Zimtsaure- 14 C Werte von 0,27; 0,03; 0,02 % und bei Acetat- 14 C Werte von 0,17; 0,04; 0,02 0/0. Ungeachtet dessen, daB die beiden markierten Vorstufen an verschiedenen Stellen in die Anthocyan-3-monoglucoside eingebaut werden, sind sie zur allgemeinen Markierung in etwa gleichem MaBe geeignet. Diskussion Die Ergebnisse der Pulsmarkierungsexperimente unter Verwendung von Zimtsaure14C belegen, daB in den Petalen intakter Blliten von Petunia sowohl bei Kultur in vivo als auch in vitro ein Umsatz der Anthocyan-3-monoglucoside stattfindet. Die bei diesen Experimenten flir die 3 Anthocyane gemessenen biologischen Halbwertszeiten betragen 30-50 Std. Auch bei Verwendung von Acetat- 14 C zur Markierung und unter Zusatz von Saccharose zum Nahrmedium, urn einem moglichen Mangel an Substrat vorzubeugen, wurde ein Umsatz der 3 Anthocyane mit biologischen Halbwertszeiten zwischen 45-60 Std. festgestellt. Bei isolierten P,etalen betrugen die biologischen Halbwertszeiten bei 7 Versuchen im Mittel 25-30 Std. (STEINER, 1971). Die bei intakten Blliten gemessenen Werte liegen noch in dem, inshesonders durch Unterschiede im Ausgangsmaterial bedingten, relativ groBen Streuungsbereich der bei solchen Ver,suchen beobachteten Einzelwerte. Auch bei Studien zum Umsatz des Isoflavons Formononetin bei der Kichererbse wurde z. B. in einem Fall cine hiologische Halbw.ertszeit von 50 Std. (BARZ, 1969), in einem andern eine solche von 67 Std. (BARZ und ROTH-LAUTERBACH, 1969) gefunden. Deshalb laBt sich bei den intakten Blliten aufgrund der Mittelwerte aus 2 Versuchen auch noch nicht entscheiden, ob hier, wie bei isolierten Petalen nachgewiesen, im einzelnen Unter,schiede in den Umsatzgeschwindigkeiten der verschiedenen Anthocyane vorliegen. Die Befunde schlieBen jedoch zweifelsfrei jeden Verdacht aus, daB es sich bei Petunia, bei dem in isolierten Petalen gefundenen Umsatz der Anthocyane, urn einen experimentellen Artefakt infolge eines Hungetstoffwechsels handeln konnte. Die zur Markierung der Anthocyane verwendete radioaktive Vorstufe ZimtsaureHC wird vornehmlich in den B-Ring der Anthocyanidine eingebaut, das Acetat- 14 C vornehmlich in den A-Ring und die Glucose. Bei der Verwendung der einen oder anderen Vorstufe in den Pulsmarkierungsexperimenten lieBen sich keine Unterschiede in den Umsatzgeschwindigkeiten beobachten. Dies ist nur dann verstandlich, wenn es sich beim Umsatz der Anthocyan-3-monoglucoside stets urn den Umsatz des ganzen

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Molekuls, Aglycon und glucosidischer Anteil, handelt. Daten zum Umsatz anderer Vertreter der Klasse der Flavonoide lieBen dies auch schon bisher als fur die Anthocyane zutreffend erscheinen (Diskussion bei STEINER, 1971, 1972 a). Die geschilderten Experimente bestatig.en und erweitern ganz wesentlich hereits in anderem Zusammenhang durchgefuhrte vergleichende Untersuchen an Bluten und isolierten Petalen (HESS, 1967; STEINER, 1972 a): Beim Delphinidin-Genotyp von Petunia hybrida kann das Akkumulationsverhalten der Anthocyane bei isolierten Petalen als reprasentativ fur die Verhaltnisse bei Bluten in situ betrachtet werden. Ferner kann aufgrund dieser Befunde als gesichert ang.esehen werden, daB yom Umsatz die ganzen Anthocyan-3-monoglucosidmolekule betroffen sind. Die angesichtsder Versuche mit isolierten Petalen erhobenen, eingangs geschilderten Einwande erweisen sich damit als gegenstandslos. Fraulein K. MENZ danke ich herzlich fur Ihre Hilfe bei der Durchfuhrung der Experimente, Herrn Gartenmeister G. BLAICH fur die Pflege cler Petunien. Die Arbeit wurde durch Sachbeihilfen des Bundesministeriums fur Bildung und Wissenschaft unterstutzt, die mir dankenswerterweise von Herrn Prof. Dr. D. HESS zur Verfugung gestellt wurden.

Literatur BARZ, W.: Z. Naturforsch. 24 b, 234 (1969). BARZ, W., und W. HOSE.L: Phytochemistry 10, 335 (1971). BARZ, W., uncl B. ROTH-LAUTERBACH: Z. Naturforsch. 24 b, 638 (1969). HESS, D.: Z. Pflanzenphysiol. 56, 12 (1967). STEINE.R, A. M.: Z. Pflanzenphysiol. 63, 370 (1970). - Z. pflanzenphysiol. 65, 210 (1971). - Z. Pflanzenphysiol. 66, 133 (1972 a). - Z. Pflanzenphysiol. 68, 266 (1972 b). - VI. Intern. Congr. Photobiol., Abstr. Nr. 188. Bochum, 1972 c. A. M. STEINER, Lehrstuhl fur Botanische Entwicklungsphysiologie, Universitat Hohenheim~ D-7 Stuttgart 70 (Hohenheim), Emil-Wolff-StraBe 25.

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