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Zur elektronenmikroskopischen Darstellung von Glykogen mit Best's Carmin
J. ULTRASTRUCTURERESEARCH:4, 401--412 (1960)
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Zur elektronenmikroskopischen Darstellung von Glykogen mit Best's Carmin H. THEMANN
Abteilung fiir medizinische Elektronenmikroskopie (Le#er: Prof. Dr. G. Pfefferkorn) der Universitdit Miinster, Deutschland Eingegangen am 29. dull 1960 Es wurde die Anwendung yon Best's Carmin ftir die sublichtmikroskopische Darstellung yon Glykogen untersucht. Als Untersuchungsgut dienten Leber, Niere, Skelett- und Herzmuskulatur von M~tusen. Das Material wurde nach der Fixation in 1% OsOa mit Best's Carmin in ammoniakalischer L6sung behandelt und nach der Differenzierung in Methyl-Nthylalkoholgemisch in Methacrylat bzw. Vestopal eingebettet. Es kann gezeigt werden, dab in den oben aufgeffihrten Geweben nach der Behandlung kontrastreiche sublichtmikroskopische Partikel nachgewiesen werden k6nnen. In der Leber findet sich die Best's Carmin-positive Substanz, vornehmlich im Protoplasma, in der Muskulatur dagegen in erster Linie an den AuBenmembranen der Mitochondrien. Es werden die Grfinde diskutiert, die die Annahme, dab es sich bei den Best's Carmin-positiven Substanzen um Glykogen handelt, rechtfertigen m6gen.
Der Farbstoff Carmin wurde fiir die Darstellung von Glykogen 1906 durch Best (3) in die Lichtmikroskopie eingeftihrt. Seitdem sind zahlreiche Arbeiten fiber die Brauchbarkeit dieser empirisch entwickelten Ffirbemethode von Noll und Becker (14), Davies und Francis (6), Schiebler (18), Papanicolaou (15) u. a. erschienen. Die Anwendung verschiedener Glykogendarstellungsmethoden ergab tibereinstimmende Resultate, so dab die Selektivit/it des Best's Carmin ffir die Darstellung von Glykogen als gesichert angesehen werden kann. Hinsichtlich des Zustandekommens der F/irbung bestehen noch sehr viele Unklarheiten. Dieses ist weitgehend auf die Unkenntnis der chemischen Zusammensetzung des aus Cochinellen gewonnenen Farbstoffes zurfickzuffihren. Teilweise wird angenommen, dab fiir das Zustandekommen der Ffirbung die Proteinkomponente des Glykogens verantwortlich ist (11). Monn6 und Harde (12) vertreten die Auffassung, dab der immer mit Glykogen assoziierte basische Schleim durch Best's Carmin geffirbt wird.
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AuBer Glykogen werden mit Best's Carmin auch andere Substanzen gef~irbt, wie Schleim (5), Fibrin (19), und Granula der Mastzellen (16). Ein gewisse Differenzierung ist jedoch mit der Diastaseprobe mSglich. Fraenkel und Jellinek (7) halten diese Methode fiir nicht unbedenklich, da sie nachweisen konnten, dab Diastase auch gewisse Aminopolysaccharide 15st. Da Glykogen gegentiber den gebr~uchlichen Fixierungsmitteln inert ist und folglich ohne Kontrast im Elektronenmikroskop bleibt (1), sollte i m Rahmen dieser Arbeit die Anwendbarkeit des Best's Carmin ftir die sublichtmikroskopische Darstellung yon Glykogen geprtift werden. Eine sublichtmikroskopische Beschreibung des Glykogens ist bereits yon Morgan und Mowry (13) sowie von Bondareff (4) gegeben. Letzterer konnte mit Hilfe der Gefrierfixation und nachfolgender Perjods/iure-Schiff Reaktion nach Hotchkiss (PAS) Glykogenpartikel in der Leber von Meerschweinchen darstellen. Wegen der Schwierigkeit der Gefrierfixation scheidet diese Methode jedoch far umfangreichere Untersuchungen noch aus. In folgenden sei darum eine yon uns angewandte Methodik und ihre Ergebnisse beschrieben. METHODE Unsere Untersuchungen sind an Lebern von normal gehaltenen M~iusen sowie an Lebern yon Hungertieren und andererseits an Lebern, bei denen die Tiere massiv mit Kohlenhydraten ernfihrt wurden, durchgeftihrt worden. Vergleichsweise untersuchten wit Herzmuskel, Extremit~itenmuskel, Milz und Niere von normal geftitterten M/iusen. Die vergleichende lichtmikroskopische Glykogen-Untersuchung erfolgte an Lebern der gleichen Tiere unter Zuhilfenahme der PAS-Ffirbung, deren Zuverl~issigkeit bekannt ist.
Durchfiihrung der F6rbung 1. Fixation der Gewebsbl6ckchen in l%iger OsO 4. Puffer: KOH-K2Cr207, pH 7,2. Dauer: 2-3 Stunden. 2. Auswaschen in 30%igem Alkohol. Dauer: 1-2 Minuten. 3. Ubertragung der GewebsblSckchen in die Carminl6sung mit folgender Zusammensetzungl: Best'sche Carminstamml6sung 20,0 (vergl. ihre Herstellung, Romeis (16), § 1103 (1948)) + 25 %iges Ammoniak 15,0 + Methylalkohol 30,0 + aqua dest. 15,0 Teile. Dauer: Leber 5-10 Sekunden, maximal 1-2 Minuten; Muskel 2-5 Minuten; Miere 1-2 Minuten; Milz 1-2 Minuten. 4. Differenzierung in Methylalkoho140 ccm + absol. Alkohol 80 ccm + aqua dest. 100 ccm. Dauer: 2-3 Minuten (Fliissigkeitsgemisch 3 × wechseln). 5. Entw~issern in 70%-80%-90%-96% absol. Alkohol bzw. Aceton. 6. Einbettung in Methacrylat bzw. Vetopal. Fiir die Stufen 1-4 empfiehlt sich die Einhaltung niedriger Temperaturen (1-10°C). 1 Es wurde das Carmin sicc. nach Best yon der Firma Chroma-Gesellschaft, Schmidt & Co., Stuttgart-Unter ttirkheim verwendet.
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Eine vorherige Fixation in Formalin (pH 7,2 ffir 2 Stunden) oder in lToiger Kaliumpermanganatl6sung (10) und die nachfolgende F~irbung mit Best's Carmin ftihrte zu unbefriedigenden Ergebnissen. Zu negativen Ergebnissen ftihrte auch die entsprechende Anwendung der PAS-Ffirbung. Eine Celloidinierung der Pr~iparate nach der Originalangabe von Best ist nicht erforderlich. Die Anwendung von Celloidin beeintr~ichtigt jedoch nicht den Ausfall der F~irbung, bzw. den elektronenmikroskopischen Nachweis (20). Die Diastaseprobe wurde in l%iger Diastasel6sung (Diastase gel6st in Thyrodel6sung) bei 37°C ± 1°C, Dauer 1 Stunde, durchgeftihrt. Die Anwendung der Diastase erfolgte entweder vor oder nach der OsO~-Fixation der Prfiparate. Anschliel3end wurde die Ffirbung mit Best's Carmin durchgeftihrt. Ftir die Herstellung der Dtinnschnitte stand ein Ultra-Mikrotom nach Porter-Blum zur VerfiJgung. Die Aufnahmen wurden am Elmiskop I der Fa. Siemens 1 gemacht.
ERGEBNISSE Duch die Behandlung mit Best's Carmin in ammoniakalischer L6sung ist eine gewisse Schfidigung der Ultrastruktur im Vergleich zu den nur O s Q fixierten Pr/iparaten zu erkennen. Dieses gilt im besonderen far die Erhaltung der Mitochondrien, die hfiufig einen Verlust der Cristfi mitochondriales zu verzeichnen haben. Im Falle ihrer Erhaltung ist eine distinkte Darstellung der Doppelmembranen schwierig. Dennoch sind nach der Behandlung alle Zellorganellen deutlich erkennbar (Abb. 1). Insgesamt hat der Kontrast in den Zellen abgenommen. Sehr empfindlich gegentiber Best's Carmin verhfilt sich die Leber, die durch l~tngere Behandlung mit Best's Carmin schwere Schfidigung in ihrem ultrastrukturellen Aufbau aufweist. Darum ist die Einhaltung der oben angegebenen Zeiten erforderlich. Die geringsten Verfinderungen in der Ultrastruktur nach der Behandlung mit Best's Carmin sind in den Muskelzellen zu verzeichnen (Abb. 2). Daraus ergibt sich die M6glichkeit zu einer l~ingeren Behandlung. Im Unterschied zu den nur OsO 4 fixierten Leberprfiparaten weist die behandelte Leberzelle bei normaler Fiitterung zahlreiche mehr oder wenig gleichm~il3ig in der Zelle verteilte stark kontrastierte Komplexe auf (Abb. 3). Diese Komplexe bauen sich aus rundliche Form einnehmenden Granula auf (Gr6f3enordnung: 100-200 m#), in denen wieder kleinere Granula in der Gr6f3enordnung von 20-30 m# zu erkennen sind (Abb. 4). Wir haben die Erfahrung gemacht, dag die Gr/513e der Best's Carminpositiven Partikel mit der Behandlungsdauer der Best's Carminl6sung schwankt. Die Ausmessung der angegebenen Gr6Ben der Best's Carmin-positiven Partikel wurde an Pr~iparaten vorgenommen, die nach der oben angegebenen Methode behandelt wurden. Wegen der geringen Dimension der Partikel muB man mit einem 1 Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft ftir die Zurverfiigungstellung des E1miskop I.
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ABB. 1. Maus-Leber. OsO-4Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 10 Sek. Die Zellen zeigen eine relative gute Strukturerhaltung. Durch die Behandlung ist eine Kontrastabnahme zu verzeichnen. Mitochondrien (M) lassen nur teilweise eine Innenstruktur erkennen. Das Ergostoplasma (Er) ist ohne besonderen Befund. Im Protoplasma erkennt man zahlreiche, in ihrem Kontrast vonder Umgebung herausstechende dunkle Partikel (Glykogen (G)). x 17 000:1.
hohen relativen Fehler rechnen ( ~ 50 %). Die Quantit~tt dieser Granula ist abMngig von der Ernghrung. Tiere mit kohlehydratreicher Ernfihrung zeigen geh~iuft die Komplexe, w~ihrend vergleichend Hungertiere frei bzw. nut vereinzelt solche Granula nach Behandlung mit Best's Carmin erkennen lassen. Die AuBenmembran der Mitochondrien l~igt bei Lebern nur wenige kontrastreiche Punkte erkennen. Es sei erwfihnt, dab auch die Doppelmembranen des Ergastoplasmas Granula erkennen lassen, die im Kontrast und in der Gr/513enordnung mit den beschriebenen im Protoplasma frei vorkommenden Partikeln tibereinstimmen. An den Aul3enmembranen der Mitochondrien yon Niere und Milz sind nach der
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ABB. 2. Maus-Skelett-Muskulatur. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 3 Minuten. Die Muskulatur zeigt eine gute Strukturerhaltung. In dem interfibrillfiren Raum sehr zahlreiche, kontrastreiche Partikel (Glykogen) erkennbar. Die tibrigen Partien der Muskulatur sind frei von Best's Carmin-positiven Partikeln. × 37000:1.
Behandlung mit Best's Carmin zahlreiche kontrastreiche Partikel zu erkennen. D a die Membranen durch die Behandlung leicht geschfidigt werden, lggt sich mit Sicherheit die genaue Lokalisation nicht ermitteln. Wahrscheinlich liegen die Partikel jedoch der fiul3eren Oberflfiche der Mitochondrien auf. In der Milz konnten gelegentlich auch im Plasma freie dunkle Partikel erkannt werden. A m deutlichsten ist dieser Mitochondrienbefund in der Skelett- und Herzmuskulatur ausgeprfigt. Die Granula liegen dort in der Regel so dicht gepackt, dab sich eine dunkle Linie sehr markant abzeichnet (Abb. 5, 6). Weiterhin sind vornehmlich im Skelettmuskel zahlreiche Granula in dem interfibrillfiren R a u m erkennbar (vergl. 2). Diese 20-30 m# messenden Partikel formieren sich nicht wie in der Leber zu gr6i3eren, rundliche F o r m einnehmenden Granula, sondern sie liegen stets vereinzelt. Nach Einwirkung von Diastase nach der O s Q - F i x a t i o n und nachfolgender Behandlung mit Best's Carmin lassen sich die Partikel nicht mehr nachweisen (Abb. 7). Gleiches gilt auch far die Partikel an den Aul3enmembranen der Mitochondrien.
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ABB. 3. Maus-Leber. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 10 Sek. Im Protoplasma der Zelle zahlreiche rundliche Form einnehmende Granula erkennbar (G = Glykogen). In diesen Granula, die eine Gr6genordnung yon 100-200m/~haben, sind kleinere Partikel mit einem Durchmesser yon 10-20 m# erkennbar (Glykogen). Die Mitochondrien (M) lassen am ihren AuBenmembranen sehr vereinzelt dunkle Partikel erkennen (Glykogen). x 54 000. (Siehe Bild.)
Die Diastaseprobe ist ebenfall positiv far die Partikel in der Leber sowie ffir die Best's Carmin-positiven Partikel auf den Mitochondrien der Leber, Milz und Niere (Abb. 9). Es sei darauf hingewiesen, dab die Diastaseprobe stets positiv ausf~illt, wenn die Prfiparate ohne vorherige Fixation damit behandelt werden. Die nach der OsO~-Fixation vorgenommene Diastaseprobe verl~iuft unregelmfil3iger. SpezM1 gilt dieses ftir die Partikel in der Muskulatur. Eine bevorzugte Lagerung yon
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ABe. 4. Maus-Leber. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung, Dauer: 10 Sek. Glykogenpartikel (G). x 116 000.
ABB. 5. Maus-Herz-Muskulatur. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 3 Min. Die AuBenmembranen der Mitochondrien zeigen in dichter Packung die Best's Carminpositiven Partikel (Glykogen). Auch in der Umgebung der Mitochondrien sind solche, einzelne liegende Partikel erkennbar, x 42 000. 2 7 - 60173313 J. Ultrastructure Research
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ABB. 6. Maus-Herz-Muskulatur. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Mitochondrienaugenmembran (M) mit Best's Carmin-positiven Partikeln besetzt. × 75 000.
Best's Carmin-positiven Substanzen in der Zone Z und in den Streifen A konnte nicht beobachtet werden (12). In diesem Bereich lieBen sich nur gelegentlich Partikel nachweisen. DISKUSSION Es konnte gezeigt werden, dab nach Behandlung der Gewebsbl/Scke mit Best's Carmin in den Zellen kontrastreiche Partikel bzw. Komplexe erscheinen, die bei alleiniger OsO4-Fixation ohne besondere Kontraste sind. Ihre H/iufigkeit in der Leber h/ingt eindeutig yon der Ern/ihrung ab. Es lieB sich zeigen, dab in Leberzellen von Tieren mit kohlenhydratreicher Ern/ihrung diese Partikel gehfiuft auftraten, w/ihrend sie bei Hungertieren fehlten. Nach Einwirkung von Diastase, sowohl vor wie nach der Fixation, waren keine Best's Carmin-positiven Substanzen zu erkennen. Die parallel durchgeftihrten lichtmikroskopischen PAS-Ffirbungen verliefen eindeutig gleichsinnig. Wir ziehen daraus den SchluB, dab die Best's Carmin-positiven Substanzen Glykogenpartikel darstellen. Der starke Kontrast, der durch die Verbindung des Farbstoffs mit dem Glykogen bzw. Glykogenkomplex zu verzeichnen ist, lggt
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ABB. 7. Maus-Skelett-Muskulatur. OsO~-Fixation, danach Diastaseprobe, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 3 Min. Nach Einwirkung von Diastase sind keine Best's Carminpositiven Partikel mehr nachweisbar. × 37 000.
sich vielleicht m i t d e m chemischen A u f b a u des Carminfarbstoffs erkl~iren. Eine auf vielen A n h a l t s p u n k t e n basierende Vorstellung von d e m A u f b a u des C a r m i n s ist in d e m H a n d b u c h y o n H a r m s (8) entwickelt worden. D a n a c h ergibt sich folgendes Formelbild:
oH, ,r6--&]
%-ff6 ~ oH,
. ~ o ~ooc o,,,,~. ~o.-..A.... HooG
0
0
~~,~.o~ cH, jg___2H j
o
I. c~ I
o%.
H~o
~.,,,o coo~ ~,--~o..
e~
o
0
b
cooH
I kolO,H ~ c , ~ Lo~_oj c%
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A•B. 8. Maus-Niere. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. MitochondrienMembran, M, mit Best's Carmin-positiven Partikeln besetzt, x 42 000. Die daraus errechnete Bruttoformel yon CssHs~O59Ca3A1~ hat ein theoretisches Molekulargewicht yon 2257. Der ermittelte Al~O3-Gehalt betr~igt zwischen 6-8,4 %, der theoretische CaO-Gehalt 7,45 % (nach Harms). Der elektronenmikroskopische Kontrast ktinnte danach mit dem Aluminium- und Calcium-Gehalt des Farbstoffs zusammenhfingen. Der Chemismus der F~irbung ist noch v/311ig ungekl~irt. Teilweise wird - - wie einleitend erw~ihnt - - vermutet, dab die F~trbung des Glykogens mit Best's Carmin auf dessert Assoziation mit gewissen Proteinen zuriickzufiihren ist. Solche ProteinGlykogenkomplexe sind yon Lison (11) beschrieben worden. Diese Ansicht steht im Widerspruch zu den Untersuchukgsergebnissen von Lazarow (9) sowie Sacks et al. (17), die fiir das Glykogen der Leber nachweisen konnten, dab dieses tiberwiegend ohne Assoziation zu Proteinen vorliegt. Danach miiBte also durch die Behandlung mit Best's Carmin das Glykogen selbst gef~irbt werden. Untersttitzt wird diese Annahme auch durch die Untersuchungsergebnisse yon Bondareff (4), der, wie eingangs erw~ihnt, mit Hilfe der Gefrierfixation und nachfolgender PAS-Reak-
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ABB. 9. Maus-Niere. OsO~-Fixation, danach Diastaseprobe, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 1 Min. Die Mitochondrienaul3enmembranen sind nach Diastase-Einwirkung frei von Best's Carmin-positiven Partikeln (Glykogen). x 37 000.
tion zur Darstellung von Glykogenpartikeln kam, die morphologisch wesentliche l~bereinstimmung mit den Partikeln zeigen, die mit Best's Carmin zu erhalten sind. Bekanntlich liegt der Angriffspunkt der PAS-Reaktion im Glykogen selbst. Unsere Feststellung, dab das Glykogen an die Aul3enmembran gebunden ist, steht ebenfalls mit den Untersuchungsergebnissen von Sacks und Mitarbeitern (17) im Einklang. Letztere hatten u.a. Leber-Mitochondrien von Ratten isoliert und den Glykogengehalt auf biochemischem Wege bestimmt. Sie fanden auBerdem einen hohen Glykogengehalt in der Mikrosomenfraktion. Da eine Mikrosomenfraktion ein heterogenes morphologische ~quivalent haben kann, lassen sich diese Befunde nicht ohne weiteres vergleichen. Es ist jedoch m/Sglich, dab die nach Best's Carmin-Behandlung auf den Doppelmembranen des Ergastoplasmas festzustellenden Partikel (es sind nicht die Palade Granula gemeint) mit Glykogen identisch sind, zumal sie nach Diastaseeinwirkung verschwinden. Zu dieser Frage miissen jedoch weitere Untersuchungen durchgeftihrt werden. Im Zellkern konnten die oben genannten Autoren kein Glykogen nachweisen. Dieses deckt sich ebenfalls mit unseren Befunden. So diirften
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die zuletzt besehriebenen Untersuchungsergebnisse als weitere Stiitze ftir die Spezifitfit des elektronenmikroskopischen Nachweisses von Glykogen mit der beschriebenen Methode herangezogen werden. Wir hoffen, dab es mit dieser Methode m/Sglich sein wird, einen nfiheren Einblick in die Dynamik des Glykogenaufbaues, bzw.-abbaues zu erlangen. SUMMARY Electron microscopical evidence for glycogen was tested by using carmine, which was introduced by Best in 1906, for staining glycogen in light microscopy. The research was carried out on liver, kidney, heart muscle and skeletal muscle. After fixation by OseO4, small pieces of material were washed, and after that placed in an ammoniated carmine solution. Then stained material was differentiated by a mixture of methanol and ethanol, dehydrated in either ethanol or acetone, and embedded in methacrylate or "Vestopal." It can be shown that in the material so treated particles appear that have a very dark contrast. In the liver these particles can be found chiefly in the protoplasm, while in the muscles the particles appear on the outer membrane of the mitochondria, and on the neighborhood of the mitochondria. Points are discussed which may justify our belief that the Best-positive particles are glycogen. LITERATUR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
15. 16. 17. t8. 19. 20.
BAHR, C. F., Exptl. Cell. Research 9, 277 (1955). BERGMANN,R. A. und WALKER,D. G., Bull. Johns Hopkins Hosp. 104, 179 (1959). BEST,F., Z. wiss. Mikroskop. 23, 319 (1906). BONDAREFF,W., Anat. Record 129, 87 (1957). CLARA,M., Z. mikroskop, anat. Forsch. 47, 183 (1940). DAVIES,S. A. F. und FRANCIS,E. T. B., J. Physiol. 100, 329 (1941). FR*NKEL, S. und JELLINEK,C., Biochem. Z. 185, 392 (1927). HARMS,H., Handbuch der Farbstoffe fiir die Mikroskopie, TeillI, 2. Lieferung, Staufenverlag Kamp Lintfort, 1957. LAZAROW,A., Anat. Record 84, 31-50 (1942). LtJFT, J. H., J. Biochem. Biophys. Cytol. 2, 799-802 (1956). LISON, L. Histochimie et cytochimie animales. Gauthier Villars, Ed. Paris, 1953. MONNa, L. und HARDE,SR., Arkiv Zool. 3, 299 (1952). MORGAN,C. und MOWRY, R. W., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 76, 850-852 (1951). NOEL, A. und BECKER, M., Arch. pathol. Anat. u. Physiol., Virchow's 296, 440 (1936). PAPANICOLOLAOU,G. N., TRANT,M. F. und MORCHETTI,A., The Epithelia of Woman's Reproductive Tract, pp. 30-38. New York 1948. ROMEIS,B., Mikroskopische Technik. Mtinchen, 1948. SACKS, J., JOHNSTON, P. M., MORTON, J. and HARVEY, J. A. N., Exptl. Cell Research 12, 537-45 (1957). SCHIEBLER,T. H., Z. Zellforsch. u. mikroskop. Anat. 39, 152 (1953). SEKI, J., Z. wiss. Mikroskop. 51, 267 (1960). THEMANN,H., Naturwiss. 47, 155 (1960).
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Abteilung fiir medizinische Elektronenmikroskopie (Le#er: Prof. Dr. G. Pfefferkorn) der Universitdit Miinster, Deutschland Eingegangen am 29. dull 1960 Es wurde die Anwendung yon Best's Carmin ftir die sublichtmikroskopische Darstellung yon Glykogen untersucht. Als Untersuchungsgut dienten Leber, Niere, Skelett- und Herzmuskulatur von M~tusen. Das Material wurde nach der Fixation in 1% OsOa mit Best's Carmin in ammoniakalischer L6sung behandelt und nach der Differenzierung in Methyl-Nthylalkoholgemisch in Methacrylat bzw. Vestopal eingebettet. Es kann gezeigt werden, dab in den oben aufgeffihrten Geweben nach der Behandlung kontrastreiche sublichtmikroskopische Partikel nachgewiesen werden k6nnen. In der Leber findet sich die Best's Carmin-positive Substanz, vornehmlich im Protoplasma, in der Muskulatur dagegen in erster Linie an den AuBenmembranen der Mitochondrien. Es werden die Grfinde diskutiert, die die Annahme, dab es sich bei den Best's Carmin-positiven Substanzen um Glykogen handelt, rechtfertigen m6gen.
Der Farbstoff Carmin wurde fiir die Darstellung von Glykogen 1906 durch Best (3) in die Lichtmikroskopie eingeftihrt. Seitdem sind zahlreiche Arbeiten fiber die Brauchbarkeit dieser empirisch entwickelten Ffirbemethode von Noll und Becker (14), Davies und Francis (6), Schiebler (18), Papanicolaou (15) u. a. erschienen. Die Anwendung verschiedener Glykogendarstellungsmethoden ergab tibereinstimmende Resultate, so dab die Selektivit/it des Best's Carmin ffir die Darstellung von Glykogen als gesichert angesehen werden kann. Hinsichtlich des Zustandekommens der F/irbung bestehen noch sehr viele Unklarheiten. Dieses ist weitgehend auf die Unkenntnis der chemischen Zusammensetzung des aus Cochinellen gewonnenen Farbstoffes zurfickzuffihren. Teilweise wird angenommen, dab fiir das Zustandekommen der Ffirbung die Proteinkomponente des Glykogens verantwortlich ist (11). Monn6 und Harde (12) vertreten die Auffassung, dab der immer mit Glykogen assoziierte basische Schleim durch Best's Carmin geffirbt wird.
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AuBer Glykogen werden mit Best's Carmin auch andere Substanzen gef~irbt, wie Schleim (5), Fibrin (19), und Granula der Mastzellen (16). Ein gewisse Differenzierung ist jedoch mit der Diastaseprobe mSglich. Fraenkel und Jellinek (7) halten diese Methode fiir nicht unbedenklich, da sie nachweisen konnten, dab Diastase auch gewisse Aminopolysaccharide 15st. Da Glykogen gegentiber den gebr~uchlichen Fixierungsmitteln inert ist und folglich ohne Kontrast im Elektronenmikroskop bleibt (1), sollte i m Rahmen dieser Arbeit die Anwendbarkeit des Best's Carmin ftir die sublichtmikroskopische Darstellung yon Glykogen geprtift werden. Eine sublichtmikroskopische Beschreibung des Glykogens ist bereits yon Morgan und Mowry (13) sowie von Bondareff (4) gegeben. Letzterer konnte mit Hilfe der Gefrierfixation und nachfolgender Perjods/iure-Schiff Reaktion nach Hotchkiss (PAS) Glykogenpartikel in der Leber von Meerschweinchen darstellen. Wegen der Schwierigkeit der Gefrierfixation scheidet diese Methode jedoch far umfangreichere Untersuchungen noch aus. In folgenden sei darum eine yon uns angewandte Methodik und ihre Ergebnisse beschrieben. METHODE Unsere Untersuchungen sind an Lebern von normal gehaltenen M~iusen sowie an Lebern yon Hungertieren und andererseits an Lebern, bei denen die Tiere massiv mit Kohlenhydraten ernfihrt wurden, durchgeftihrt worden. Vergleichsweise untersuchten wit Herzmuskel, Extremit~itenmuskel, Milz und Niere von normal geftitterten M/iusen. Die vergleichende lichtmikroskopische Glykogen-Untersuchung erfolgte an Lebern der gleichen Tiere unter Zuhilfenahme der PAS-Ffirbung, deren Zuverl~issigkeit bekannt ist.
Durchfiihrung der F6rbung 1. Fixation der Gewebsbl6ckchen in l%iger OsO 4. Puffer: KOH-K2Cr207, pH 7,2. Dauer: 2-3 Stunden. 2. Auswaschen in 30%igem Alkohol. Dauer: 1-2 Minuten. 3. Ubertragung der GewebsblSckchen in die Carminl6sung mit folgender Zusammensetzungl: Best'sche Carminstamml6sung 20,0 (vergl. ihre Herstellung, Romeis (16), § 1103 (1948)) + 25 %iges Ammoniak 15,0 + Methylalkohol 30,0 + aqua dest. 15,0 Teile. Dauer: Leber 5-10 Sekunden, maximal 1-2 Minuten; Muskel 2-5 Minuten; Miere 1-2 Minuten; Milz 1-2 Minuten. 4. Differenzierung in Methylalkoho140 ccm + absol. Alkohol 80 ccm + aqua dest. 100 ccm. Dauer: 2-3 Minuten (Fliissigkeitsgemisch 3 × wechseln). 5. Entw~issern in 70%-80%-90%-96% absol. Alkohol bzw. Aceton. 6. Einbettung in Methacrylat bzw. Vetopal. Fiir die Stufen 1-4 empfiehlt sich die Einhaltung niedriger Temperaturen (1-10°C). 1 Es wurde das Carmin sicc. nach Best yon der Firma Chroma-Gesellschaft, Schmidt & Co., Stuttgart-Unter ttirkheim verwendet.
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Eine vorherige Fixation in Formalin (pH 7,2 ffir 2 Stunden) oder in lToiger Kaliumpermanganatl6sung (10) und die nachfolgende F~irbung mit Best's Carmin ftihrte zu unbefriedigenden Ergebnissen. Zu negativen Ergebnissen ftihrte auch die entsprechende Anwendung der PAS-Ffirbung. Eine Celloidinierung der Pr~iparate nach der Originalangabe von Best ist nicht erforderlich. Die Anwendung von Celloidin beeintr~ichtigt jedoch nicht den Ausfall der F~irbung, bzw. den elektronenmikroskopischen Nachweis (20). Die Diastaseprobe wurde in l%iger Diastasel6sung (Diastase gel6st in Thyrodel6sung) bei 37°C ± 1°C, Dauer 1 Stunde, durchgeftihrt. Die Anwendung der Diastase erfolgte entweder vor oder nach der OsO~-Fixation der Prfiparate. Anschliel3end wurde die Ffirbung mit Best's Carmin durchgeftihrt. Ftir die Herstellung der Dtinnschnitte stand ein Ultra-Mikrotom nach Porter-Blum zur VerfiJgung. Die Aufnahmen wurden am Elmiskop I der Fa. Siemens 1 gemacht.
ERGEBNISSE Duch die Behandlung mit Best's Carmin in ammoniakalischer L6sung ist eine gewisse Schfidigung der Ultrastruktur im Vergleich zu den nur O s Q fixierten Pr/iparaten zu erkennen. Dieses gilt im besonderen far die Erhaltung der Mitochondrien, die hfiufig einen Verlust der Cristfi mitochondriales zu verzeichnen haben. Im Falle ihrer Erhaltung ist eine distinkte Darstellung der Doppelmembranen schwierig. Dennoch sind nach der Behandlung alle Zellorganellen deutlich erkennbar (Abb. 1). Insgesamt hat der Kontrast in den Zellen abgenommen. Sehr empfindlich gegentiber Best's Carmin verhfilt sich die Leber, die durch l~tngere Behandlung mit Best's Carmin schwere Schfidigung in ihrem ultrastrukturellen Aufbau aufweist. Darum ist die Einhaltung der oben angegebenen Zeiten erforderlich. Die geringsten Verfinderungen in der Ultrastruktur nach der Behandlung mit Best's Carmin sind in den Muskelzellen zu verzeichnen (Abb. 2). Daraus ergibt sich die M6glichkeit zu einer l~ingeren Behandlung. Im Unterschied zu den nur OsO 4 fixierten Leberprfiparaten weist die behandelte Leberzelle bei normaler Fiitterung zahlreiche mehr oder wenig gleichm~il3ig in der Zelle verteilte stark kontrastierte Komplexe auf (Abb. 3). Diese Komplexe bauen sich aus rundliche Form einnehmenden Granula auf (Gr6f3enordnung: 100-200 m#), in denen wieder kleinere Granula in der Gr6f3enordnung von 20-30 m# zu erkennen sind (Abb. 4). Wir haben die Erfahrung gemacht, dag die Gr/513e der Best's Carminpositiven Partikel mit der Behandlungsdauer der Best's Carminl6sung schwankt. Die Ausmessung der angegebenen Gr6Ben der Best's Carmin-positiven Partikel wurde an Pr~iparaten vorgenommen, die nach der oben angegebenen Methode behandelt wurden. Wegen der geringen Dimension der Partikel muB man mit einem 1 Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft ftir die Zurverfiigungstellung des E1miskop I.
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ABB. 1. Maus-Leber. OsO-4Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 10 Sek. Die Zellen zeigen eine relative gute Strukturerhaltung. Durch die Behandlung ist eine Kontrastabnahme zu verzeichnen. Mitochondrien (M) lassen nur teilweise eine Innenstruktur erkennen. Das Ergostoplasma (Er) ist ohne besonderen Befund. Im Protoplasma erkennt man zahlreiche, in ihrem Kontrast vonder Umgebung herausstechende dunkle Partikel (Glykogen (G)). x 17 000:1.
hohen relativen Fehler rechnen ( ~ 50 %). Die Quantit~tt dieser Granula ist abMngig von der Ernghrung. Tiere mit kohlehydratreicher Ernfihrung zeigen geh~iuft die Komplexe, w~ihrend vergleichend Hungertiere frei bzw. nut vereinzelt solche Granula nach Behandlung mit Best's Carmin erkennen lassen. Die AuBenmembran der Mitochondrien l~igt bei Lebern nur wenige kontrastreiche Punkte erkennen. Es sei erwfihnt, dab auch die Doppelmembranen des Ergastoplasmas Granula erkennen lassen, die im Kontrast und in der Gr/513enordnung mit den beschriebenen im Protoplasma frei vorkommenden Partikeln tibereinstimmen. An den Aul3enmembranen der Mitochondrien yon Niere und Milz sind nach der
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ABB. 2. Maus-Skelett-Muskulatur. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 3 Minuten. Die Muskulatur zeigt eine gute Strukturerhaltung. In dem interfibrillfiren Raum sehr zahlreiche, kontrastreiche Partikel (Glykogen) erkennbar. Die tibrigen Partien der Muskulatur sind frei von Best's Carmin-positiven Partikeln. × 37000:1.
Behandlung mit Best's Carmin zahlreiche kontrastreiche Partikel zu erkennen. D a die Membranen durch die Behandlung leicht geschfidigt werden, lggt sich mit Sicherheit die genaue Lokalisation nicht ermitteln. Wahrscheinlich liegen die Partikel jedoch der fiul3eren Oberflfiche der Mitochondrien auf. In der Milz konnten gelegentlich auch im Plasma freie dunkle Partikel erkannt werden. A m deutlichsten ist dieser Mitochondrienbefund in der Skelett- und Herzmuskulatur ausgeprfigt. Die Granula liegen dort in der Regel so dicht gepackt, dab sich eine dunkle Linie sehr markant abzeichnet (Abb. 5, 6). Weiterhin sind vornehmlich im Skelettmuskel zahlreiche Granula in dem interfibrillfiren R a u m erkennbar (vergl. 2). Diese 20-30 m# messenden Partikel formieren sich nicht wie in der Leber zu gr6i3eren, rundliche F o r m einnehmenden Granula, sondern sie liegen stets vereinzelt. Nach Einwirkung von Diastase nach der O s Q - F i x a t i o n und nachfolgender Behandlung mit Best's Carmin lassen sich die Partikel nicht mehr nachweisen (Abb. 7). Gleiches gilt auch far die Partikel an den Aul3enmembranen der Mitochondrien.
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ABB. 3. Maus-Leber. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 10 Sek. Im Protoplasma der Zelle zahlreiche rundliche Form einnehmende Granula erkennbar (G = Glykogen). In diesen Granula, die eine Gr6genordnung yon 100-200m/~haben, sind kleinere Partikel mit einem Durchmesser yon 10-20 m# erkennbar (Glykogen). Die Mitochondrien (M) lassen am ihren AuBenmembranen sehr vereinzelt dunkle Partikel erkennen (Glykogen). x 54 000. (Siehe Bild.)
Die Diastaseprobe ist ebenfall positiv far die Partikel in der Leber sowie ffir die Best's Carmin-positiven Partikel auf den Mitochondrien der Leber, Milz und Niere (Abb. 9). Es sei darauf hingewiesen, dab die Diastaseprobe stets positiv ausf~illt, wenn die Prfiparate ohne vorherige Fixation damit behandelt werden. Die nach der OsO~-Fixation vorgenommene Diastaseprobe verl~iuft unregelmfil3iger. SpezM1 gilt dieses ftir die Partikel in der Muskulatur. Eine bevorzugte Lagerung yon
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ABe. 4. Maus-Leber. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung, Dauer: 10 Sek. Glykogenpartikel (G). x 116 000.
ABB. 5. Maus-Herz-Muskulatur. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 3 Min. Die AuBenmembranen der Mitochondrien zeigen in dichter Packung die Best's Carminpositiven Partikel (Glykogen). Auch in der Umgebung der Mitochondrien sind solche, einzelne liegende Partikel erkennbar, x 42 000. 2 7 - 60173313 J. Ultrastructure Research
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ABB. 6. Maus-Herz-Muskulatur. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Mitochondrienaugenmembran (M) mit Best's Carmin-positiven Partikeln besetzt. × 75 000.
Best's Carmin-positiven Substanzen in der Zone Z und in den Streifen A konnte nicht beobachtet werden (12). In diesem Bereich lieBen sich nur gelegentlich Partikel nachweisen. DISKUSSION Es konnte gezeigt werden, dab nach Behandlung der Gewebsbl/Scke mit Best's Carmin in den Zellen kontrastreiche Partikel bzw. Komplexe erscheinen, die bei alleiniger OsO4-Fixation ohne besondere Kontraste sind. Ihre H/iufigkeit in der Leber h/ingt eindeutig yon der Ern/ihrung ab. Es lieB sich zeigen, dab in Leberzellen von Tieren mit kohlenhydratreicher Ern/ihrung diese Partikel gehfiuft auftraten, w/ihrend sie bei Hungertieren fehlten. Nach Einwirkung von Diastase, sowohl vor wie nach der Fixation, waren keine Best's Carmin-positiven Substanzen zu erkennen. Die parallel durchgeftihrten lichtmikroskopischen PAS-Ffirbungen verliefen eindeutig gleichsinnig. Wir ziehen daraus den SchluB, dab die Best's Carmin-positiven Substanzen Glykogenpartikel darstellen. Der starke Kontrast, der durch die Verbindung des Farbstoffs mit dem Glykogen bzw. Glykogenkomplex zu verzeichnen ist, lggt
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ABB. 7. Maus-Skelett-Muskulatur. OsO~-Fixation, danach Diastaseprobe, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 3 Min. Nach Einwirkung von Diastase sind keine Best's Carminpositiven Partikel mehr nachweisbar. × 37 000.
sich vielleicht m i t d e m chemischen A u f b a u des Carminfarbstoffs erkl~iren. Eine auf vielen A n h a l t s p u n k t e n basierende Vorstellung von d e m A u f b a u des C a r m i n s ist in d e m H a n d b u c h y o n H a r m s (8) entwickelt worden. D a n a c h ergibt sich folgendes Formelbild:
oH, ,r6--&]
%-ff6 ~ oH,
. ~ o ~ooc o,,,,~. ~o.-..A.... HooG
0
0
~~,~.o~ cH, jg___2H j
o
I. c~ I
o%.
H~o
~.,,,o coo~ ~,--~o..
e~
o
0
b
cooH
I kolO,H ~ c , ~ Lo~_oj c%
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A•B. 8. Maus-Niere. OsO4-Fixation, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. MitochondrienMembran, M, mit Best's Carmin-positiven Partikeln besetzt, x 42 000. Die daraus errechnete Bruttoformel yon CssHs~O59Ca3A1~ hat ein theoretisches Molekulargewicht yon 2257. Der ermittelte Al~O3-Gehalt betr~igt zwischen 6-8,4 %, der theoretische CaO-Gehalt 7,45 % (nach Harms). Der elektronenmikroskopische Kontrast ktinnte danach mit dem Aluminium- und Calcium-Gehalt des Farbstoffs zusammenhfingen. Der Chemismus der F~irbung ist noch v/311ig ungekl~irt. Teilweise wird - - wie einleitend erw~ihnt - - vermutet, dab die F~trbung des Glykogens mit Best's Carmin auf dessert Assoziation mit gewissen Proteinen zuriickzufiihren ist. Solche ProteinGlykogenkomplexe sind yon Lison (11) beschrieben worden. Diese Ansicht steht im Widerspruch zu den Untersuchukgsergebnissen von Lazarow (9) sowie Sacks et al. (17), die fiir das Glykogen der Leber nachweisen konnten, dab dieses tiberwiegend ohne Assoziation zu Proteinen vorliegt. Danach miiBte also durch die Behandlung mit Best's Carmin das Glykogen selbst gef~irbt werden. Untersttitzt wird diese Annahme auch durch die Untersuchungsergebnisse yon Bondareff (4), der, wie eingangs erw~ihnt, mit Hilfe der Gefrierfixation und nachfolgender PAS-Reak-
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ABB. 9. Maus-Niere. OsO~-Fixation, danach Diastaseprobe, anschliessend Best's Carmin-Behandlung. Dauer: 1 Min. Die Mitochondrienaul3enmembranen sind nach Diastase-Einwirkung frei von Best's Carmin-positiven Partikeln (Glykogen). x 37 000.
tion zur Darstellung von Glykogenpartikeln kam, die morphologisch wesentliche l~bereinstimmung mit den Partikeln zeigen, die mit Best's Carmin zu erhalten sind. Bekanntlich liegt der Angriffspunkt der PAS-Reaktion im Glykogen selbst. Unsere Feststellung, dab das Glykogen an die Aul3enmembran gebunden ist, steht ebenfalls mit den Untersuchungsergebnissen von Sacks und Mitarbeitern (17) im Einklang. Letztere hatten u.a. Leber-Mitochondrien von Ratten isoliert und den Glykogengehalt auf biochemischem Wege bestimmt. Sie fanden auBerdem einen hohen Glykogengehalt in der Mikrosomenfraktion. Da eine Mikrosomenfraktion ein heterogenes morphologische ~quivalent haben kann, lassen sich diese Befunde nicht ohne weiteres vergleichen. Es ist jedoch m/Sglich, dab die nach Best's Carmin-Behandlung auf den Doppelmembranen des Ergastoplasmas festzustellenden Partikel (es sind nicht die Palade Granula gemeint) mit Glykogen identisch sind, zumal sie nach Diastaseeinwirkung verschwinden. Zu dieser Frage miissen jedoch weitere Untersuchungen durchgeftihrt werden. Im Zellkern konnten die oben genannten Autoren kein Glykogen nachweisen. Dieses deckt sich ebenfalls mit unseren Befunden. So diirften
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die zuletzt besehriebenen Untersuchungsergebnisse als weitere Stiitze ftir die Spezifitfit des elektronenmikroskopischen Nachweisses von Glykogen mit der beschriebenen Methode herangezogen werden. Wir hoffen, dab es mit dieser Methode m/Sglich sein wird, einen nfiheren Einblick in die Dynamik des Glykogenaufbaues, bzw.-abbaues zu erlangen. SUMMARY Electron microscopical evidence for glycogen was tested by using carmine, which was introduced by Best in 1906, for staining glycogen in light microscopy. The research was carried out on liver, kidney, heart muscle and skeletal muscle. After fixation by OseO4, small pieces of material were washed, and after that placed in an ammoniated carmine solution. Then stained material was differentiated by a mixture of methanol and ethanol, dehydrated in either ethanol or acetone, and embedded in methacrylate or "Vestopal." It can be shown that in the material so treated particles appear that have a very dark contrast. In the liver these particles can be found chiefly in the protoplasm, while in the muscles the particles appear on the outer membrane of the mitochondria, and on the neighborhood of the mitochondria. Points are discussed which may justify our belief that the Best-positive particles are glycogen. LITERATUR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
15. 16. 17. t8. 19. 20.
BAHR, C. F., Exptl. Cell. Research 9, 277 (1955). BERGMANN,R. A. und WALKER,D. G., Bull. Johns Hopkins Hosp. 104, 179 (1959). BEST,F., Z. wiss. Mikroskop. 23, 319 (1906). BONDAREFF,W., Anat. Record 129, 87 (1957). CLARA,M., Z. mikroskop, anat. Forsch. 47, 183 (1940). DAVIES,S. A. F. und FRANCIS,E. T. B., J. Physiol. 100, 329 (1941). FR*NKEL, S. und JELLINEK,C., Biochem. Z. 185, 392 (1927). HARMS,H., Handbuch der Farbstoffe fiir die Mikroskopie, TeillI, 2. Lieferung, Staufenverlag Kamp Lintfort, 1957. LAZAROW,A., Anat. Record 84, 31-50 (1942). LtJFT, J. H., J. Biochem. Biophys. Cytol. 2, 799-802 (1956). LISON, L. Histochimie et cytochimie animales. Gauthier Villars, Ed. Paris, 1953. MONNa, L. und HARDE,SR., Arkiv Zool. 3, 299 (1952). MORGAN,C. und MOWRY, R. W., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 76, 850-852 (1951). NOEL, A. und BECKER, M., Arch. pathol. Anat. u. Physiol., Virchow's 296, 440 (1936). PAPANICOLOLAOU,G. N., TRANT,M. F. und MORCHETTI,A., The Epithelia of Woman's Reproductive Tract, pp. 30-38. New York 1948. ROMEIS,B., Mikroskopische Technik. Mtinchen, 1948. SACKS, J., JOHNSTON, P. M., MORTON, J. and HARVEY, J. A. N., Exptl. Cell Research 12, 537-45 (1957). SCHIEBLER,T. H., Z. Zellforsch. u. mikroskop. Anat. 39, 152 (1953). SEKI, J., Z. wiss. Mikroskop. 51, 267 (1960). THEMANN,H., Naturwiss. 47, 155 (1960).