Zur Spezifität des Amaranthus-Cytokinintests

Flora, Abt. A, Bd. 159, S.

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(1968)

Aus dem Botanischen Institut, Abt. Allgemeine Botanik, der Ernst· Moritz. Arndt· Universitat Greifswald

Zur Spezifitat des Amaranthus-Cytokinintests III. Benzimidazolderivate und andere Verbindungen Von K. H. KoHLER und K. CoNRAD Mit 3 Abbildungen (Eingegangen am 17. April 1968)

Zur Vervollstandigung unserer Kenntnisse iiber die Spezifitat des auf der Betacyanbildung beruhenden Amaranthus- Tests zur quantitativen Bestimmung von Cytokininen (7, 12) haben wir Benzimidazol, mehrere seiner Derivate und Adenosintriphosphat, y-Aminobuttersaure, Leucin, Thioharnstoff, Trigonellin, Traumatinsaure und einige Hydroxyverbindungen auf ihre Wirksamkeit gepriift. Mit einigen Abweichungen von unseren friiheren Angaben (12) wurde der Test folgendermaBen durchgefiihrt: Samen von Amaranthus caudatus L. var. viridis wurden mit 1 %igem Bromwasser sterilisiert, mit sterilem Wasser gespiilt und auf einem FlieBpapierkeimbett mit Aktivkohlezusatz (vgl. BoRRISS 1940) im Dunkeln bei 20 oc im Verlauf von 48 Std. zum Keimen gebracht. Dann iibertrugen wir bei diffusem Tageslicht je 55 Keimlinge in eine Deckelschale mit 10 ml Testmedium, das auBer der zu priifenden Substanz 1% Agar, 0,01% L-Tyrosin, 0,1% KN0 3 (vgl. 7) und 1 / 75 mol/Z Na- K-phosphatpuffer (pH 6,3) enthielt. Die Sterilisation des Mediums erfolgte durch 30miniitiges Erhitzen im Dampftopf. Nach 3tagigem Wachstum im Dunkeln bei 20 oc wurden je 50 Keimlinge entnommen, gewaschen, abgetrocknet und mit 5 ml Wasser eingefroren. Nach Wiederauftauen und mehrmaligem Schiitteln maBen wir mit einem Spektralphotometer die Extinktion des Dekantats in 0,5 em dicker Schicht bei 542 nm. Von dies em Wert zogen wir die bei 620 nm ermittelte Extinktion ab, urn den EinfluB geringer Triibungen auszuschalten. Als Kontrolle diente die korrigierte Extinktion von Proben, in deren Medium die zu testende Substanz weggelassen war. Die Cytokininnatur des Benzimidazols wurde zunachst dadurch bekannt, daB etwa gleichzeitig mit RICHMONDS und LANGS (1957) Entdeckung der vergilbungsverzogernden Wirkung des Kinetins an Xanthium- Blattern PERSON, SAMBORSKI und FoRSYTH (1957) einen entsprechenden Effekt von Benzimidazol an isolierten Weizenblattern fanden, der in den folgenden Jahren eingehend untersucht wurde (z. B. WAYGOOD 1965 ).

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K. H.

KoHLER

und K.

CoNRAD

Im Amaranthus- Test stellten wir eine Erhohung der Farbstoffbildung durch 10-3 moljl Benzimidazol auf 176% fest. Angeregt durch die im vorigen Jahr erschienenen Arbeiten von ENGELBRECHT, BRAUNIGER und KOINE (8) und von KuRAISHI und YAMAKI (13), in denen der EinfluB der chemischen Struktur einer Serie von Benzimidazolderivaten auf die Cytokininwirksamkeit in mehreren Tests untersucht wird, entschlossen wir uns zu einer ahnlichen Stu die an Amaranthus- Keimlingen. Die Benzimidazolderivate wurden uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. BRAUNIGER zur Verfugung gestellt, der zusammen mit KOINE die Synthese in mehreren Arbeiten beschrieben hat (3, 4, 5 ). Wir testeten einerseits 3mal unabhangig voneinander Konzentrationsreihen der einzelnen Substanzen, andererseits prtiften wir aile Derivate gleichzeitig in einer Konzentration von 10-4 moljl. Auf Grund des Hinweises von KuRAISHI und YAJ\IAKI

Benzimidazol

as~~-+-----r---

0

-3 -.> -+ log moll/ Abb. 1. Die Beeinflussung der Betacyanbildung durch Benzimidazolderivate. BI = Benzimidazol ( • - •) 5-F = 6-Furfurylamino-BI (L,-L,) 4-F = 4-Furfurylamino-BI (0-0) 4-B = 4-Benzylamino-BI ( e-e) 5-B = 5-Benzylamino-BI (A. -A.) K = Kinetin (0-D) Ordinate: Amaranthin-Extinktion bei 542 nm. -co

-7

-6

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(1967), da£ 4- Benzylamino benzimidazol instabil sein soll, benutzten wir nur frisch angesetzte Losungen und reduzierten hier die Zeit vom Auslegen der Keimlinge bis zur Entnahme von 72 auf 48 Std. Diese Ma£nahme ftihrt zwar zu kleineren Pigmentmengen, la£t aber, wie frtiher nachgewiesen (11), die Relationen unbertihrt. Alle Experimente ergaben prinzipiell das in Abb. 1 dargestellte Resultat. Die dort eingetragenen Punkte sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhangigen Bestimmungen. Aus dem Diagramm geht hervor, da£ Benzimidazol (BI), 4-Benzylamino-BI, 4-Furfurylamino-BI, 5-Benzylamino-BI und 5-Furfurylamino-BI die Betacyansynthese fordern. Die hochste Wirksamkeit besitzt 4-Benzylamino-BI, dessen Aktivitat etwa 10mal geringer als die des Kinetins und etwa 10mal hoher als die des Benzimidazols ist. Ahnlich wie 6-Benzylaminopurin dem Kinetin im AmaranthusTest urn eine Zehnerpotenz tiberlegen ist (12), wirkt 4-Benzylamino-BI starker als 4-Furfurylamino-BI. Die im Vergleich zu anderen Benzimidazolderivaten hohe Aktivitat der in 4-Position substituierten Benzimidazole steht in Einklang mit den Ergebnissen von ENGELBRECHT, BR"~UNIGER und KoiNE (1967) im Gersten-Chlorophylltest und von KuRAISHI und YAMAKI (1967) im Raphanus-Blattscheiben-Wachstumstest. Neu gegentiber den Befunden im Chlorophyllerhaltungstest ist die Wirksamkeit von 5-Benzylamino-BI und 5-Furfurylamino-BI. Ahnlich wie bei den 6-Aminopurinen und den 4-Aminobenzimidazolen tibertrifft das Benzylderivat die Furfurylverbindung. Mit Bakterienfilter sterilisierte Losungen von 5-Benzylamino-BI und 5-Furfurylamino-BI wirken nicht schwacher als im Dampftopf erhitzte, so da£ ausgeschlossen erscheint, da£ die Aktivitat der 5-Aminobenzimidazole durch eine hitzebedingte Substituentenumlagerung zur 4-Position vorgetauscht wird (vgl.17). Ebenso wie bei Kinetin (vgl. 10, 11) kann die durch die aktiven Benzimidazole hervorgerufene Steigerung der Pigmentsynthese durch cine z. B. 4stiindige Belichtung mit wci£em Leuchtstoffrohrenlicht (700 lx) noch verstarkt werden (z. B. Extinktion nach Applikation von 10- 4 moljl 4-Furfurylamino-BI: dunkel = 0,316; belichtet = 0,480. Kontrolle: dunkel = 0,250; belichtet = 0,285 ). Nur eine geringe Aktivitat, die eine Forderung der Farbstoffbildung urn 40% nicht iiberschreitet, besitzt 4-p-Methoxy-Benzylamino-BI (3 · 10- 4 mol/Z). Ohne Einflu£ auf die Farbstoffbildung blieben folgende Verbindungen (10- 7 bis 10-3 moljZ): 5-p-Methoxy-Benzylamino-BI, 4-p-Nitro- Benzylamino-BI, 5-p-Nitro-BenzylaminoBI, 1-a-D-Glucopyranosyl-BI (Dihydrat ), 1-{3-D-Glucopyranosyl-BI (Monohydrat ), 1-a-D-Galaktopyranosyl-BI, 1-a-L-Arabopyranosyl-BI, 1-{3-D-(2'-Amino-2' -desoxyglucopyranosyl)-BI (Monohydrat ), 1-{3-D-Xylopyranosyl-BI, 1-{3-D-Glucopyranosylbenzotriazol und 1-a-L-Arabopyranosylbenzotriazol (Synthese der Triazole bei 2). In diesem Zusammenhang mu£ erwahnt werden, da£ alle 4-substituierten Verbindungen vor allem in hoheren Konzentrationen zu einer bis zur Hypokotylgrenze reichenden charakteristischen Blaufarbung der Keimwurzeln fiihren. In gleicher Weise verursachen die 5-substituierten Derivate eine Braunfarbung (vgl. 8). 20

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296 mg FG

0

-co

-7

-6

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log moll/ Abb. 2. Der EinfluB von Benzimidazolderivaten auf das Frischgewieht von Amarantlws-Keimlingen. Ordinate: mg Frischgew.j:JO Keimlinge. Abkiirzungen siehe Abb. 1.

Aus Abb. 2 geht hervor, da/3 die Benzimidazolderivate in Konzentrationen oberhalb von 10- 4 mol/Z eine deutliche Abnahme des Frischgewichtes der Keimlinge bewirken. Zugleich hemmen sie die Streckung der Hypokotyle. Ebenso wie beispielsweise bei einer Konzentration von 10- 4 mol/Z Kinetin liegen bei einer Konzentration von 5 . 10- 4 molfl an Benzimidazolen die Keimlinge auf dem Medium und richten sich nicht auf. Cyanocobalamin, in dessen Strukturformel eine Benzimidazolgruppierung vorkommt, zeigt im Amamnthus-Test in den Konzentrationen 10-8 bis 3 · 10- 4 mol/Z keinen Effekt. Dberhaupt nicht oder weit weniger als die aktiven Benzimidazole beeinflu/3ten die im folgenden untersuchten Verbindungen heterogener Konstitution die Farbstoffausbeute. Da zu vermuten war, da./3 Adenosintriphosphat als Energielieferant oder als Precursor cines endogenen Cytokinins einen fordernden Einflu/3 auf die Betacyansynthese ausiiben konnte, priiften wir das Dinatriumsalz dieser Purinverbindung in Konzentrationen von 10- 7 bis 10-2 molfl. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,3 eingestellt. Nur die starksten Konzentrationen bewirken eine schwache Forderung (10- 3 molfZ: 109%, 10-2 molfZ: 123%).10- 7 bis 10- 1 mol/Z y-Aminobuttersaure

t

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L!.E in% der /(onfr. 180

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log moll/ Abb. 3. Pigmentbildung in Gegenwart von Hydroxyverbindungen. Pr-1 = Propanol-1, Pr-2 = Propanol-2, Th = Thymol, Ph = Phenol. Ordinate: Extinktion in Prozent der Extinktion der Kontrolle.

und 10- 7 bis 10- 4 moljl Leucin haben praktisch keinen Effekt, wahrend 10-3 bis 3 · 10- 2 moljl Leucin die Farbstoffbildung vermindern. Thioharnstoff, der ebenso wie Cytokinine (14) die Keimung von Salatachanen im Dunkeln fordert (THOMPSON und KosAR 1939), laBt in Konzentrationen von 10-6 bis 10-2 moljl die Betacyanbiosynthese so gut wie unbeeinfluBt, hohere Konzentrationen hemmen. Auch das Pyrimidinderivat Trigonellin, das nach KARSTEN (1966) im Triticum- Vergilbungstest eine schwache kinetinahnliche Wirkung zeigt, beschleunigt die Betacyansynthese nicht (10- 7 bis 10-4 moljl, 10-3 moljl: 80%). Als Beitrag zu der Frage, ob die sogenannten Wundhormone vom Typ der Traumatinsaure eine Beziehung zu den Cytokininen haben (vgl. 6), testeten wir 6 1-Decen-1,10-dicarboxylsaure in den Konzentrationen 10-8 bis 10- 4 moljl. Bis auf die starkste Dosis, die die Farbstoffausbeute herabsetzt, erwies sich der Stoff als inaktiv. Der pH-Wert wurde mit KOH auf 6,3 korrigiert. Eine Fortsetzung unserer Untersuchungen iiber den EinfluB von Hydroxyverbindungen auf den Amaranthus-Test fiihrte zu den in Abb. 3 dargestellten Ergebnissen (Testmedium ohne KN0 3 , 4 Std. belichtet wie bei 7). Propanol-1 und Propanol-2, die in wiiBriger Verdiinnung mittels Bakterienfilter sterilisiert wurden. 29*

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fOrdern ebenso wie Thymol in gewissen Konzentrationen die Pigmentbildung, wahrend bei Phenol keine tiber dem Kontrollwert liegenden Extinktionen festzustellen waren. Da die Stimulation der Farbstoffbildung jeweils mit einer Hemmung des Hypokotylwachstums auf mindestens die Halfte der Kontrolle gekoppelt ist, nehmen wir an, daB es sich urn eine unspezifische Vergiftungsreaktion handelt. Summary 27 compounds, mostly benzimidazole and derivatives, were tested for promotion of betaeyanin formation in the Amaranlhus seedling bioassy. Benzimidazole (BI), 4-benzylamino-BI, 4-furfurylamino-BI, 5-benzylamino-BI and 5-furfurylamino-BI show cytokinin activity. ATP, hi ourea and traumatic acid are practically inactive. Fiir die Uberlassung von Chemikalien danken wir neben Herrn Prof. Dr. BRAUNIGER, Jena, auch Frau Dr. GouRGAUD, Clermont-Ferrand, Frau Dr. ENGELBRECHT, Halle, und Herrn Dr. KARSTEN, Berlin. Herrn Prof. Dr. BoRRISS danken wir fiir seine Unterstiitzung, Fraulein B. Tm:RAU und Frau J. CoNRAD fiir ihre Mitarbeit.

Literatur 1. 2. 3. 4. .5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 1G. 17. 18. 19.

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Anschrift der Verfasser: Dr. K.-H. KoHLER und Dr. K. CONRAD, Botanisches Institut der Universitat Greifswald, Abt. Allgemeine Botanik, 22 Greifswald, Grimmer StraBe 88.