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β-1,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen
ZbI. Bakt. II. Abt. 135 (1980), 696 -703 [Aus der Forschungsabteilung des VEB Prowiko Schonebeck und dem Institut fUr Chemie, Slowakische Akademie der Wissenschaften, Bratislava]
P-1 ,3-1 ,4-G lucanase in sporen bildenden Mikroorganismen III. Substratspezifitat und Wirkungsweise einiger Bacillus-p-Glucan-Hydrolasen fJ-l,3-1,4-Glucanase in Sporeforming Microorganisms III. Substrate Specifity and Action Patterns of some Bacillus-fJ-Glucan-Hydrolases R. BORRISS und J. ZEMEK Mit 4 Abbildungen
Summary Comparative investigations were carried out concerning substrate specifity and action patterns of seven Bacillus-endo-p-glucanases produced by the species B. 8ubtili8, B. maceran8, B. amyloliquefacien8, B. circulan8, B. latero8poru8, B. pumilus and B. polymyxa. All enzymes with the exception of p-glucanase from B. macerans hydrolyze lichenan and barleyp-glucan only and were without action on laminaran and CM-cellulose. It was suggested that hydrolysis products of p-glucanase produced by B. maceran8 were markedly different from the products of the other enzymes. We conclude that B. macerans enzyme, which cleaves laminaran and p-1,3-1,4-glucans, represents "laminarinase" type (1-3-p-D-glucan glucanohydrolase, E.C. 3.2.1.6). On the other hand the glucanases produced by the other Bacillus strains belong to "licheninases" 1-3,1-4-p-D-glucan glucanohydrolases, E.C. 3.2.1.73).
Zusammenfassung Substratspezifitat und Wirkungsweise von sieben Bacillu8-Endo-p-Glucanasen, deren Produzentenstamme den Arten B. 8ubtilis, B. maceran8, B. amyloliquefacien8, B. circulan8, B. latero8porus, B. pumilu8 und B. polymyxa angehoren, wurden vergleichend untersucht. AIle Enzyme mit Ausnahme der p-Glucanase von B. maceran8 hydrolysierten nur Lichenin und Gerstenglucan, nicht aber Laminarin und CM-Cellulose. Die Hydrolyseprodukte der pGlucanase von B. macerans unterschieden sich deutlich von den Produkten der anderen Enzyme. Das B. macerans Enzym, das Laminarin und p-1,3-1,4-Glucane spaltet, ist so mit als "Laminarinase" (1-3-p-D-Glucan Glucanohydrolase, E. C. 3.2.1.6) anzusehen. 1m Gegensatz dazu gehoren die p-Glucanasen der anderen Bacillus-Stamme dem "Licheninase"-Typ 1-3,1-4-p-D-Glucan Glucanohydrolase, E. C. 3.2.1. 73) an.
Das Vorkommen von extrazellularen Enzymen, die fJ-1,3-1,4-Glucane (CerealienfJ-Glucane, Lichenin) abbauen, ist innerhalb der Gattung Bacillus auf wenige Arten beschrankt. fJ-Glucanase produzieren B. pumilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. polymyxa, B. macerans, B. laterosporus und B. circulans (BORRISS, ZEMEK, AUGUSTIN, PAC OVA und KUNIAK, 1980). Eine genaue Charakterisierung dieser Enzyme hinsichtlich Substratspezifitat und der wahrend der Depolymerisation der p-Glucane freigesetzten Hydrolyseprodukte erfolgte bisher nur fur die p-Glucanasen von B. subtilis (MOSCATELLI, HORN and RICKES 1961). B. pumilus (SUZUKI and KANEKO 1976) und B. IMET B 376 (BORRISS 1978). Diese drei Enzyme sind nach der Definition von SUZUKI u. KANEKO (1976) als "echte" Licheninasen zu betrachten, da ihre Spezifitat auf gemischte Polyglucane, die gleichzeitig ,8-1,3- und ,8-1,4-Bindungen
p-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen
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beinhalten, begrenzt ist. Von FLEET U. PHAFF (1974) wurde berichtet, daB die P-1,3Glucanase von B. circulans WL-12 ebenfalls zur hydrolytischen Spaltllng von Lichenin befahigt ist. Ein weiteres Lichenin-abbauendes Enzym, eine p-1,4-Glucanase, die insbesondere bei Aspergillus- und Streptomyces-Stammen (ANDERSON and STONE 1975) verbreitet zu sein scheint, konnte innerhalb des Genus Bacillus bisher nicht nachgewiesen werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine erste Charakterisierung der von sieben verschiedenen Bacillus-Species gebildeten Endo-p-Glucanasen, die eine Zuordnung zu einem der drei o. g. Glucanasetypen erlaubt, durchzufUhren.
Material und Methoden Die Stamme B. sub til is 168 (CCM 2267), B. macerans ATCC 8244 (CCM 2012), B. laterosporu8 ATCC 64 (CCM 2116), B. pumilus ATCC 72 (CCM 1697) und B. polymyxa CN 1417 (CCM 1609) erhielten wir von der Tschechoslowakischen Stammsammlung der Mikroorganismen, J. E. Purkyne Universitat, Bruo, CSSR. Fur die Uberlassung von B. amyloliquefaciens ATCC 1581 und B. circulans SG 124 danken wir Herru Dr. GRUNOW, Institut fUr Technische Mikrobiologie und Enzymologie, Berlin und Herrn Prof. Dr. WEIDE, Erust-Moritz-Arndt-Universitat Greifwald. Zu Beginn der Kultivierung wurden die lyophilisierten Sporenkonserven auf Nahragar ausgestrichen und bis zum Erreichen einer Optischen Dichte von 1,0 -1,5 in Glukose-Nahrbouillon unter Schutteln inkubiert. Danach erfolgte die Uberimpfung in ein komplexes Schrotmedium ("Medium 3", BORRISS 1978). Nach drei Tagen Schuttelkultur in 500-ml-Rundkolben (50 ml Medienfiillung, 240 U/min) bei 30°C erfolgte die Gewinnung p-glucanasehaltiger Rohenzympraparate in folgender Weise: Die Kulturliisung wurde auf 10-15°C abgekuhlt und jeweils 50 ml Kulturflussigkeit mit einem ml 35%iger CaC12 -Liisung versetzt. Der pH wurde mittels 1 N NaOH bei pH 6,7-6,8 konstant gehalten. Nach einstundigem Stehen wurde 15 min bei 5000 U/ min zentrifugiert und das Sediment verworfen. Der klare Uberstand wurde abgekuhlt und mit Ammoniumsulfat bis zu 80%iger Sattigung versetzt. Das ausgefallte Protein wurde bei 10000 U/ min in der Kalte abgetrennt, in 5 ml destilliertem Wasser aufgenommen und gegen 10 I 0,002 M Phosphat puffer (pH 7) 36 Std. unter mehrfachem Wechsel des Dialysepuffers dialysiert. Das dialysierte Rohenzym wurde gefriergetrocknet. Nach mehrmonatiger Aufbewahrung der lyophilisierten Praparaten bei 4°C war keine Aktivitatsminderung feststellbar. Die Praparation von Lichenin aus Islandischem Moos (Cetraria islandica) erfolgte im wesentlichen nach HAFNER (1968/69): 200 g Islandisches Moos wurden mit 21 Isopropanol 1 Std. am Ruckflu13 gekocht und dann mit Leitungswasser gespiilt. Zur Entfernung der Tannine wurde das extrahierte Sediment in 21 2,5%iger Sodaliisung 1 Std. geruhrt. Danach alkalifrei gewaschen. Die Extraktion des Lichenins erfolgte mit kochendem Leitungswasser (3 1 unter Ruhren 2 Std. gekocht). Das Filtrat wurde 10-12 Std. bei 5 °C stehengelassen. Die Umfullung des in der Kalte ausfallenden galltertartigen Niederschlags kann durch Isopropanol, Aceton, Methanol bzw. Athanol erfolgen. Fur 11 Licheninliisung wurden 0,51 Isopropanol verwendet. Nach 3 Std. wurde der Niederschlag erneut in 1,5-21 Wasser aufgenommen und ein zweites Mal mit Athanol gefaUt. Die Abtrennung starkehaltiger Verunreinigungen erfolgte durch Behandlung mit einer glucanasefreien Amylase ("Thermamyl" der Fa. Novo Ind., Danemark) und nachfolgender Dialyse. Das nochmals ausgefallte Lichenin wurde in einer Reibschale mit 100 ml Athanol 5 min verrieben und getrocknet. Nach kompletter Hydrolyse mit 1 N HCl war Glucose als einziger Zucker im Hydrolysat nachweisbar. Die Praparation von Gersten-p-Glucan erfolgte nach HAFNER (1968/69) in analoger Weise. Aus 200 g Islandischem Moos wurden 20 - 30 g Lichenin, aus 1 kg Gerstenschrot 5 -7 g Gersten,B-Glucan erhalten. Ausfiihrung der ,B-Glucanase-Bestimmung: 1 ml 0,5%ige Licheninliisung in 0,1 M Acetatpuffer (pH 6) wurde bei 50°C prainkubiert. Der Start der Reaktion erfolgte durch Zugabe von 0,1 ml der Enzymprobe. 20 min nach der Zugabe des Enzyms wird die Reaktion mit 0,5 ml Dinitrosalicylsaure-Reagenz (1 % 3,5-Dinitrosalicylsaure + 3 % Kaliumnatriumtartrat in 0,4 N NaOH) beendet. Die Riihrchen werden im siedenden Wasserbad 5 min gekocht und anschlie13end sofort abgekuhlt. Vor der Messung des gebildeten braunroten Farbkomplexes werden 5 ml dest.
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R. BORRISS und J. ZEMEK
Wasser hinzugefiigt. Die Messung erfolgt gegen einen Blindwert ohne Enzym in l·cm-Kiivetten bei 530 nm. Eine Glucanase-Einheit 1st als diejenige Enzymmenge definiert, die bei 50°C aus einer 0,5%igen Lichenin10sung soviel Substratbruchstiicke pro min freisetzt, deren reduzierende Wirkung l,uMol Glucose entspricht. Die Proteinbestimmung wurde nach LOWRY (1951) mit Rinderserumalbumin als Proteinstandard durchgefiihrt. Die chromatographische Auftrennung der Oligosaccharide erfolgte durch aufsteigende Chromatographie auf FND-Cellulose (VEB Filtrak, Niederschlag, Ergeb.) mit n-Butanol (6) - Pyridin (4) - Wasser (3) als Laufmittel. Die Anfarbung der Chromatogramme erfolgte nach zwei ver· schiedenen Methoden: Bei dem Nachweis mit alkoholischer Losung von o-Dianisidin, Anilin und Phthalsaure wurden 50 ml einer 2%igen alkoholischen Losung von Dianisidinhydrochlorid unter Zugabe von 2,6 g Phthalsaure gemischt. Nach dem Bespriihen des Chromatogramms mit diesem Reagenz wurden diese bei 100°C im Trockenschrank aufbewaIlrt, bis braunrote Flecken sichtbar wurden. Ein zweiter Zuckernachweis wurde.nach TREVELYAN (1954) mit acetonischem Silbernitrat durchgefiihrt. Dazu wurde 1 ml gesattigte Silbernitrat16sung mit 100 ml gereinigtem Aceton versetzt. Zu dem Reagenz wurde soviel Wasser hinzugefiigt, bis sich der gebildete Niederschlag gerade aufloste. Das Chromatogramm wurde damit bespriiht, getrocknet und anschliel3end mit 2%iger athanolischer Natronlauge erneut behandelt. Es entstanden braune Flecken auf weil3em Grund, die durch eine nachfolgende Behandlung mit handelsiiblichem Fixierbad halt bar gemacht wurden.
Ergebnisse Reinigung Aus der Kulturfliissigkeit verschiedener p-GluClmase-produzierender BacillusStamme wurden nach Ausfallung mit Ammoniumsulfat und Dialyse lyophilisierte Trockenpraparate hergestellt (s.Material und Methoden). Die spezifischen Aktivitaten der Rohenzympraparationen sind in der Tabelle 1 zusammengefaBt. Die hochste spezifische Aktivitat wies die p-Glucanase von B. amyloliquefaciens auf. Tabelle 1. Spezifische Aktivitat der p-Glucan.Hydrolasen verschiedener Bacillu8-Species!) p-Glucanase von
Spezifische Aktivitat
B.8Ubtili8 168 (COM 2267) B. maceran8 ATOO 8244 B. amyloliquefacien8 ATCC 1581 B. circulan8 SG 124 B.latero8poru8 ATCC 64 B. pumilu8 ATCO 72 B. polymyxa COM 1609
7,0 Ejmg Protein 12,1 Ejmg Protein 75,2 Ejmg Protein 20,2 Ejmg Protein 13,1 Ejmg Protein 11,1 Ejmg Protein 3,0 Ejmg Protein
1) Zur Isolierung der p-Glucanasen s. Material und Methoden.
Substratspezifitat und Hydrolysespektrum AIle eingesetzten Enzympraparationen hydrolysierten Gerstenglucan und Lichenin. Mit Ausnahme der p-Glucanase von B. macerans waren die von uns untersuchten Glucanasen nicht zur Hydrolyse von Laminarin oder CM-Cellulose fahig (Tabelle 2). Nach 24stiindiger Hydrolyse einer 1 %igen Licheninlosung durch die p-Glucanasen der Arten B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B. circulans und B. polymyxa .wurde stets ein identisches Reaktionsprodukt erhalten, das auf Grund seines RrWertes und nach den Ergebnissen von SUZUKI u. KANEKO (1976) als Cellobiosyl-DGlucose angesehen wird (Abb. 1).
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p-I,3 -1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen Tabelle 2. Substrat-Spezifitat del' Bacillus-p-Glucanasen ,B-Glucanase von
Licheninl )
Gerstenglucan
L aminarin
B. subtilis 168 B. maceran8 B. amyloliquefaciens B. circulans SG 124 B.laterosporus B. pumilus B. polymyxa
+ + + + + + +
+ + +
+
Hefeglucan2 )
OM-Cellulose
+ +
(+)
+
+
+ + +
(+)
(+)
(+)
1) Konzentration del' eingesetzten Substrate: 5 mg/mi. Nachweis del' Hydrolyseprodukte mit 3,5Dinitrosalicylsaure. Gegeniiber Salicin, N-Acetylglucospyranosid und N-Acetylglucosamin wurde keine hydrolytische Aktivitat festgestellt. 2) Das von uns eingesetzte H efeglucan wurde von Herrn Dipi.-Chem. GRIM~fECKE (Friedrich-SchillerUniversitat Jena) aus Candida·Zellwanden prapariert.
Bei der Hydrolyse von Gerstenglucan ergab sich unter identischen Reaktionsbedingungen ein ahnliches Bild. Auch hier war Cellobiosyl.D.Glucose das wichtigste Hydroiyseprodukt. Daneben war cine Verbindung, die auf Grund ihres niedrigen Rf·Wertes als Tetraose anzusehen ist, in allen Hydralysaten nachweisbar (Abb. 2). Fur die Enzyme von B. subtilis und B. pumilus wurde bereits der Nachweis gefiihrt, daB es sich bei diesem Produkt der p.Glucan·Hydrolyse urn Cellotriosyl.D-Glucose handelt (ANDERSON and STONE 1976, SU2;UKI and KANEKO 1976). Fur die Endo·p·Glucanase von B. macerans wurden abweichende Ergebnisse erhalten. Das Enzym setzt aus Lichenin neben der Triose auch ein Mono· und Di· saccharid sowie eine Tetraose frei (Abb. 1). Bestatigt wurden diese Befunde durch die Analyse der enzymatischen Hydrolyse von Gerstenglucan. Nach chromatographi. scher Auftrennung der freigesetzten Zucker wurden mehrere Verbindungen nacho
LICHENIN
Gl G2
(JJ)
• •••• ••• W
f/l!}
(jJ)
2
3
4
5
6
7
Abb.1. Produkte del' Lichenin.Hydrolyse durch p·Glucanaseprapara tionen von B. subtilis 168 (1), B. amyloliquefaciens ATCC 1581 (2), B . macerans A.TCC 8244 (3), B . circulans SG 124 (4), B. laterosporus ATCC 64 (5), B. pumilus ATCC 72 (6) und B. polymyxa CCM 1609 (7).
700
R.
BORRISS
und J.
ZEMEK
GERSTENGLUCAN
,~
•• • • •• •• •• •• •• •• •• @
2
®
3
®
~
t,..
@
5
6
@
7
f/l)
G1
@
G2 G3
8
Abb. 2. Produkte der Gerstenglucan-Hydrolyse durch p-Glucanasepraparationen von B. amyloliquefaciens (1), B. pumilus (2), B. macerans (3, 4), B. polymyxa (5), B. circulans SG 124 (6), B. laterosporus (7) und B. subtilis (8)_
/
)
..---
) /
Abb.3. Enzymatische Hydrolyse von Gerstenglucan durch die extrazelluliire p-Glucanase von B. macerans ATCC 8244 (30a-30c).
fl-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen
701
LAMINARIN
G1 G2
• •
234567 Abb. 4. Produkte der Laminarin-Hydrolyse durch die fl-Glucanase von B. macerans ATCC 8244 (1). B. subtilis- (2), B. amyloquefacien8- (3), B. circulans SG 124- (4), B. laterosporu8 -(5), B. pumilU8- (6) und B. polymyxa-Praparationen (7) produzierten keine nachweisbaren Hydrolyseprodukte nach 12stiindiger Inkubation mit einer 1 %igen LaminarinlOsung.
gewiesen, die nach ihrem R f - Wert als Mono- und Disaccharide anzusehen sind (Abb.3)_ Durch die Endo-fJ-Glucanase von B_ macerans wird Laminarin zu zwei niedermolekularen Zuckern abgebaut, von denen einer als Glucose identifiziert werden konnte (Abb. 4).
Diskussion In der Vergangenheit wurden drei verschiedene Endo-fJ-Glucanasetypen, die gegenuber Lichenin und Cerealien-fJ-Glucanen hydrolytisch wirksam werden, beschrieben (ANDERSON and STONE 1975): fJ-1,4-Glucanasen ("Cellulasen", E. C. 3_2_1.4) spalten die 1,4-Bindungen der fJ-Glucane unabhangig davon, welche Bindungsart die benachbarte Verknupfung der Glucosemonomere im Molekul aufweist. fJ-1,3-Glucanasen ("Laminarinasen", E. C_ 3.2_1.6), z. B. von Rhizopus arrhizus (CLARK, JOHNSON, CHUNG, and KIRKWOOD 1978) oder Bacillus circulans WL-12 (FLEET and PHAFF 1974), hydrolysieren sowohl reine fJ-1,3-Glucane (Laminarin, Pachyman) als auch Glucane, die nebeneinander fJ-l,3- und fJ-l,4-Bindungen beinhalten. Das Enzym hydrolysiert bevorzugt fJ-l,3-Bindungen, spaltet jedoch auch fJ-l,4-Bindungen, wenn sie am nichtreduzierenden Ende mit fJ-l,3-Bindungen benachbart sind. "Echte" Licheninasen (fJ-1,3-1,4-Glucanase, E. C. 3.2.1.73) hydrolysieren ausschlieBlich Cerealien-fJ-Glucane und Lichenin und bleiben gegenuber reinen fJ-1,3- oder fJ-1,4-Glucanen ohne Wirkung. Derartige Enzyme wurden im Malz (An-Endo-fJ-Glucanase, LUCHSINGER and RICHARDS 1964) und in der Kulturflussigkeit verschiedener Bacillus-Stamme nachgewiesen (Tabelle 3). ANDERSON 46 Zbl. Bakt. II. Abt., Bd.135
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R. BORRISS und J. ZEMEK
STONE (1975) konnten zeigen, daB dieser Enzymtyp zur Entfaltung seiner katalytischen Aktivitat eine -G-3-G-4-G-Anordnung in dem Glykosylrest seines Substrates erfordert. Die j3-1,4-glykosidische Bindung zwischen zwei Glucosemonomeren wird nur hydrolysiert, wenn diesem Bindungstyp eine G-3-G-Sequenz unmittelbar benachbart ist.
U.
Nach unseren Ergebnissen gehOrt die Mehrzahl der Bacillus-Endo-j3-Glucanasen dem dritten Enzymtyp an (Tabelle 3). Die j3-Glucanasen von B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B. laterosporus, B. polymyxa und B. circulans SG 124 (im Gegensatz zu dem von FLEET u. PHAFF 1974 beschriebenen Enzym von B. circulans WL-12) waren in ihrer Spezifitat auf die Substrate Lichenin und Gerstenglucan begrenzt. Die aus Lichenin und Gerstenglucan gebildeten Hydrolyseprodukte stimmen in ihren Rr-Werten mit den hauptsachlichen Produkten des durch die j3-Glucanasen von B. subtilis (ANDERSON and STONE 1975) und B. pumilus (SUZUKI and KANEKO 1976) katalysierten Glucanabbau 3-0-Cellobiosyl-D-Glucose und 3-0Cellotriosyl-D-Glucose iiberein (Abb. 1, 2). Die Endo-j3-Glucanase von B. macerans muB dem zweiten Enzymtyp ("Laminarinase", vgl. Tabelle 3) zugerechnet werden. Dafiir sprechen die Hydrolyse von Laminarin (Abb.4) und das von den iibrigen Enzympraparaten deutlich abweichende Hydrolysespektrum von Lichenin (Abb. 1) und Gerstenglucan (Abb. 2, 3) Die Hydrolyse dieser Substrate erfolgte ebenso wie die Laminarinhydrolyse unter Freisetzung schnellwandernder oligomerer Bruchstiicke (u. a. Glucose und Laminaribiose). Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daB verschiedene in dem von uns eingesetzten Rohenzympraparat anwesende Enzymspecies fiir die nachgewiesenen oligomeren Produkte des Glucanabbaus verantwortlich sind. Diese Frage kann erst nach dem Einsatz einer hochgereinigten B. macerans-Endo-j3Glucanase entschieden werden.
Tabelle 3. Charakterisierung der Bacillus-p-Glucanasen nach der Einteilung von ANDERSON u. STONE (1978) Endo-p-Glucanase
Erforderliche p-Glucan-Sequenz
E. C. 3.2.1.6 Endo-l,3-p-D-Glucan Glucanohydrolase
(1 -G-3-G
E. C. 3.2.1.73 Endo-1,3-1,4-p-DGluean Glueanohydrolase
-G-3-G (1
-1-+ 3) (1 --+ 4)
G-
-\-+ 4) G-
1) Nachweis in dieser Publikation gefiihrt.
t
Nachweis bei
RhizopU8 arrhizus (CLARK und Mitarb. 1978) B. circulans WL-12 (FLEET and PHAFF 1974) B. macerans l )
B. subtilis (ANDERSON and STONE 1976) B. pumilus (SUZUKI and KANEKO 1976) B. IMET B. 376 (BORRISS 1978) B. amyloliquefaciensl ) B. circulans SG 1241) B. laterosporus l ) B. polymyxa l )
(J-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen
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Literatur ANDERSON, M. A., and STONE, B. A.: A new substrate for investigating the specifity of p-glucan hydrolases. FEBS Letters 52 (1975), 202-207. - - Enzymic degradation of chemically modified extracellular polysaccharides from Rhizobia. Carbohydrate Res. 61 (1978), 479-492. BORRISS, R.: Extrazellulare Glucanasen sporenbildender Mikroorganismen - Produktion und Eigenschaften. Diss. B, Martin-Luther-Universitat Halle (1978). ZEMEK, J., AUGUSTIN, J., PACOVA, Z., und KUNIAK, L.: p-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen. II. Bildung von p-Glucan-Hydrolasen durch verschiedene Bacillus-Arten. ZbI. Bakt. II 135 (1980), 435 - 442. CLARK, D. R., JOHNSON, J., CHUNG, K. H., and KIRKWOOD, S.: Purification, characterization, and action-pattern studies on the endo-I-3-p-D-Glucanase from Rhizopus arrhizus QM 1032. Carbohydrate Res. 61 (1978), 457 -477. FLEET, G. H., and PHAFF, H. J.: Lysis of yeast cell-walls: glucanases from Bacillus circulans WL-12. J. Bact. 119 (1974), 207 -219. HAFNER, B.: Herstellung und Charakterisierung eines Substrates iiir p-Glukanase. Symp. Ber., 2. Int. Symp. Garungsind. Berlin 1968, 3'0, S. 135-140. LOWRY, O. H., ROSEBROUGH, N. J., FARR, A. L., and RANDALL, R. J.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. BioI. Chern. 193 (1951), 265-275. LUCHSINGER, W. W., and RICHARDS, A. W.: The mechanism of malt p-glucanases. 5. Separation of the p-glucanases of germinated barley by dialysis and ion-exchange chromatography on phosphorylated cellulose. Arch. Biochem. Biophys. 106 (1964),65-70. MOSCATELLI, E. A., HORN, E. A., and RICKES, E. L.: Enzymatic properties of a p-glucanase from Bacillu8 8ubtili8. J. BioI. Chern. 236 (1961), 2558-2562. SUZUKI, H., and KANEKO, T.: Degradation of barley glucan and lichenan by a Bacillu8 pumilu8 enzyme. Agr. BioI. Chern. 40 (1976), 577 - 586. TREVELYAN, "V. E., PROCTER, D. P., and HARRISON, J. S.: Detection of sugars on paper chromatograms. Nature (London) 166 (1954), 444-445. Anschrift des Verfassers: Dr. RAINER BORRISS, Forschungsabteilung VEB Prowiko Schonebeck, DDR - 3300 Schonebeck/ Elbe, Welsleber StraBe 61.
P-1 ,3-1 ,4-G lucanase in sporen bildenden Mikroorganismen III. Substratspezifitat und Wirkungsweise einiger Bacillus-p-Glucan-Hydrolasen fJ-l,3-1,4-Glucanase in Sporeforming Microorganisms III. Substrate Specifity and Action Patterns of some Bacillus-fJ-Glucan-Hydrolases R. BORRISS und J. ZEMEK Mit 4 Abbildungen
Summary Comparative investigations were carried out concerning substrate specifity and action patterns of seven Bacillus-endo-p-glucanases produced by the species B. 8ubtili8, B. maceran8, B. amyloliquefacien8, B. circulan8, B. latero8poru8, B. pumilus and B. polymyxa. All enzymes with the exception of p-glucanase from B. macerans hydrolyze lichenan and barleyp-glucan only and were without action on laminaran and CM-cellulose. It was suggested that hydrolysis products of p-glucanase produced by B. maceran8 were markedly different from the products of the other enzymes. We conclude that B. macerans enzyme, which cleaves laminaran and p-1,3-1,4-glucans, represents "laminarinase" type (1-3-p-D-glucan glucanohydrolase, E.C. 3.2.1.6). On the other hand the glucanases produced by the other Bacillus strains belong to "licheninases" 1-3,1-4-p-D-glucan glucanohydrolases, E.C. 3.2.1.73).
Zusammenfassung Substratspezifitat und Wirkungsweise von sieben Bacillu8-Endo-p-Glucanasen, deren Produzentenstamme den Arten B. 8ubtilis, B. maceran8, B. amyloliquefacien8, B. circulan8, B. latero8porus, B. pumilu8 und B. polymyxa angehoren, wurden vergleichend untersucht. AIle Enzyme mit Ausnahme der p-Glucanase von B. maceran8 hydrolysierten nur Lichenin und Gerstenglucan, nicht aber Laminarin und CM-Cellulose. Die Hydrolyseprodukte der pGlucanase von B. macerans unterschieden sich deutlich von den Produkten der anderen Enzyme. Das B. macerans Enzym, das Laminarin und p-1,3-1,4-Glucane spaltet, ist so mit als "Laminarinase" (1-3-p-D-Glucan Glucanohydrolase, E. C. 3.2.1.6) anzusehen. 1m Gegensatz dazu gehoren die p-Glucanasen der anderen Bacillus-Stamme dem "Licheninase"-Typ 1-3,1-4-p-D-Glucan Glucanohydrolase, E. C. 3.2.1. 73) an.
Das Vorkommen von extrazellularen Enzymen, die fJ-1,3-1,4-Glucane (CerealienfJ-Glucane, Lichenin) abbauen, ist innerhalb der Gattung Bacillus auf wenige Arten beschrankt. fJ-Glucanase produzieren B. pumilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. polymyxa, B. macerans, B. laterosporus und B. circulans (BORRISS, ZEMEK, AUGUSTIN, PAC OVA und KUNIAK, 1980). Eine genaue Charakterisierung dieser Enzyme hinsichtlich Substratspezifitat und der wahrend der Depolymerisation der p-Glucane freigesetzten Hydrolyseprodukte erfolgte bisher nur fur die p-Glucanasen von B. subtilis (MOSCATELLI, HORN and RICKES 1961). B. pumilus (SUZUKI and KANEKO 1976) und B. IMET B 376 (BORRISS 1978). Diese drei Enzyme sind nach der Definition von SUZUKI u. KANEKO (1976) als "echte" Licheninasen zu betrachten, da ihre Spezifitat auf gemischte Polyglucane, die gleichzeitig ,8-1,3- und ,8-1,4-Bindungen
p-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen
697
beinhalten, begrenzt ist. Von FLEET U. PHAFF (1974) wurde berichtet, daB die P-1,3Glucanase von B. circulans WL-12 ebenfalls zur hydrolytischen Spaltllng von Lichenin befahigt ist. Ein weiteres Lichenin-abbauendes Enzym, eine p-1,4-Glucanase, die insbesondere bei Aspergillus- und Streptomyces-Stammen (ANDERSON and STONE 1975) verbreitet zu sein scheint, konnte innerhalb des Genus Bacillus bisher nicht nachgewiesen werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine erste Charakterisierung der von sieben verschiedenen Bacillus-Species gebildeten Endo-p-Glucanasen, die eine Zuordnung zu einem der drei o. g. Glucanasetypen erlaubt, durchzufUhren.
Material und Methoden Die Stamme B. sub til is 168 (CCM 2267), B. macerans ATCC 8244 (CCM 2012), B. laterosporu8 ATCC 64 (CCM 2116), B. pumilus ATCC 72 (CCM 1697) und B. polymyxa CN 1417 (CCM 1609) erhielten wir von der Tschechoslowakischen Stammsammlung der Mikroorganismen, J. E. Purkyne Universitat, Bruo, CSSR. Fur die Uberlassung von B. amyloliquefaciens ATCC 1581 und B. circulans SG 124 danken wir Herru Dr. GRUNOW, Institut fUr Technische Mikrobiologie und Enzymologie, Berlin und Herrn Prof. Dr. WEIDE, Erust-Moritz-Arndt-Universitat Greifwald. Zu Beginn der Kultivierung wurden die lyophilisierten Sporenkonserven auf Nahragar ausgestrichen und bis zum Erreichen einer Optischen Dichte von 1,0 -1,5 in Glukose-Nahrbouillon unter Schutteln inkubiert. Danach erfolgte die Uberimpfung in ein komplexes Schrotmedium ("Medium 3", BORRISS 1978). Nach drei Tagen Schuttelkultur in 500-ml-Rundkolben (50 ml Medienfiillung, 240 U/min) bei 30°C erfolgte die Gewinnung p-glucanasehaltiger Rohenzympraparate in folgender Weise: Die Kulturliisung wurde auf 10-15°C abgekuhlt und jeweils 50 ml Kulturflussigkeit mit einem ml 35%iger CaC12 -Liisung versetzt. Der pH wurde mittels 1 N NaOH bei pH 6,7-6,8 konstant gehalten. Nach einstundigem Stehen wurde 15 min bei 5000 U/ min zentrifugiert und das Sediment verworfen. Der klare Uberstand wurde abgekuhlt und mit Ammoniumsulfat bis zu 80%iger Sattigung versetzt. Das ausgefallte Protein wurde bei 10000 U/ min in der Kalte abgetrennt, in 5 ml destilliertem Wasser aufgenommen und gegen 10 I 0,002 M Phosphat puffer (pH 7) 36 Std. unter mehrfachem Wechsel des Dialysepuffers dialysiert. Das dialysierte Rohenzym wurde gefriergetrocknet. Nach mehrmonatiger Aufbewahrung der lyophilisierten Praparaten bei 4°C war keine Aktivitatsminderung feststellbar. Die Praparation von Lichenin aus Islandischem Moos (Cetraria islandica) erfolgte im wesentlichen nach HAFNER (1968/69): 200 g Islandisches Moos wurden mit 21 Isopropanol 1 Std. am Ruckflu13 gekocht und dann mit Leitungswasser gespiilt. Zur Entfernung der Tannine wurde das extrahierte Sediment in 21 2,5%iger Sodaliisung 1 Std. geruhrt. Danach alkalifrei gewaschen. Die Extraktion des Lichenins erfolgte mit kochendem Leitungswasser (3 1 unter Ruhren 2 Std. gekocht). Das Filtrat wurde 10-12 Std. bei 5 °C stehengelassen. Die Umfullung des in der Kalte ausfallenden galltertartigen Niederschlags kann durch Isopropanol, Aceton, Methanol bzw. Athanol erfolgen. Fur 11 Licheninliisung wurden 0,51 Isopropanol verwendet. Nach 3 Std. wurde der Niederschlag erneut in 1,5-21 Wasser aufgenommen und ein zweites Mal mit Athanol gefaUt. Die Abtrennung starkehaltiger Verunreinigungen erfolgte durch Behandlung mit einer glucanasefreien Amylase ("Thermamyl" der Fa. Novo Ind., Danemark) und nachfolgender Dialyse. Das nochmals ausgefallte Lichenin wurde in einer Reibschale mit 100 ml Athanol 5 min verrieben und getrocknet. Nach kompletter Hydrolyse mit 1 N HCl war Glucose als einziger Zucker im Hydrolysat nachweisbar. Die Praparation von Gersten-p-Glucan erfolgte nach HAFNER (1968/69) in analoger Weise. Aus 200 g Islandischem Moos wurden 20 - 30 g Lichenin, aus 1 kg Gerstenschrot 5 -7 g Gersten,B-Glucan erhalten. Ausfiihrung der ,B-Glucanase-Bestimmung: 1 ml 0,5%ige Licheninliisung in 0,1 M Acetatpuffer (pH 6) wurde bei 50°C prainkubiert. Der Start der Reaktion erfolgte durch Zugabe von 0,1 ml der Enzymprobe. 20 min nach der Zugabe des Enzyms wird die Reaktion mit 0,5 ml Dinitrosalicylsaure-Reagenz (1 % 3,5-Dinitrosalicylsaure + 3 % Kaliumnatriumtartrat in 0,4 N NaOH) beendet. Die Riihrchen werden im siedenden Wasserbad 5 min gekocht und anschlie13end sofort abgekuhlt. Vor der Messung des gebildeten braunroten Farbkomplexes werden 5 ml dest.
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R. BORRISS und J. ZEMEK
Wasser hinzugefiigt. Die Messung erfolgt gegen einen Blindwert ohne Enzym in l·cm-Kiivetten bei 530 nm. Eine Glucanase-Einheit 1st als diejenige Enzymmenge definiert, die bei 50°C aus einer 0,5%igen Lichenin10sung soviel Substratbruchstiicke pro min freisetzt, deren reduzierende Wirkung l,uMol Glucose entspricht. Die Proteinbestimmung wurde nach LOWRY (1951) mit Rinderserumalbumin als Proteinstandard durchgefiihrt. Die chromatographische Auftrennung der Oligosaccharide erfolgte durch aufsteigende Chromatographie auf FND-Cellulose (VEB Filtrak, Niederschlag, Ergeb.) mit n-Butanol (6) - Pyridin (4) - Wasser (3) als Laufmittel. Die Anfarbung der Chromatogramme erfolgte nach zwei ver· schiedenen Methoden: Bei dem Nachweis mit alkoholischer Losung von o-Dianisidin, Anilin und Phthalsaure wurden 50 ml einer 2%igen alkoholischen Losung von Dianisidinhydrochlorid unter Zugabe von 2,6 g Phthalsaure gemischt. Nach dem Bespriihen des Chromatogramms mit diesem Reagenz wurden diese bei 100°C im Trockenschrank aufbewaIlrt, bis braunrote Flecken sichtbar wurden. Ein zweiter Zuckernachweis wurde.nach TREVELYAN (1954) mit acetonischem Silbernitrat durchgefiihrt. Dazu wurde 1 ml gesattigte Silbernitrat16sung mit 100 ml gereinigtem Aceton versetzt. Zu dem Reagenz wurde soviel Wasser hinzugefiigt, bis sich der gebildete Niederschlag gerade aufloste. Das Chromatogramm wurde damit bespriiht, getrocknet und anschliel3end mit 2%iger athanolischer Natronlauge erneut behandelt. Es entstanden braune Flecken auf weil3em Grund, die durch eine nachfolgende Behandlung mit handelsiiblichem Fixierbad halt bar gemacht wurden.
Ergebnisse Reinigung Aus der Kulturfliissigkeit verschiedener p-GluClmase-produzierender BacillusStamme wurden nach Ausfallung mit Ammoniumsulfat und Dialyse lyophilisierte Trockenpraparate hergestellt (s.Material und Methoden). Die spezifischen Aktivitaten der Rohenzympraparationen sind in der Tabelle 1 zusammengefaBt. Die hochste spezifische Aktivitat wies die p-Glucanase von B. amyloliquefaciens auf. Tabelle 1. Spezifische Aktivitat der p-Glucan.Hydrolasen verschiedener Bacillu8-Species!) p-Glucanase von
Spezifische Aktivitat
B.8Ubtili8 168 (COM 2267) B. maceran8 ATOO 8244 B. amyloliquefacien8 ATCC 1581 B. circulan8 SG 124 B.latero8poru8 ATCC 64 B. pumilu8 ATCO 72 B. polymyxa COM 1609
7,0 Ejmg Protein 12,1 Ejmg Protein 75,2 Ejmg Protein 20,2 Ejmg Protein 13,1 Ejmg Protein 11,1 Ejmg Protein 3,0 Ejmg Protein
1) Zur Isolierung der p-Glucanasen s. Material und Methoden.
Substratspezifitat und Hydrolysespektrum AIle eingesetzten Enzympraparationen hydrolysierten Gerstenglucan und Lichenin. Mit Ausnahme der p-Glucanase von B. macerans waren die von uns untersuchten Glucanasen nicht zur Hydrolyse von Laminarin oder CM-Cellulose fahig (Tabelle 2). Nach 24stiindiger Hydrolyse einer 1 %igen Licheninlosung durch die p-Glucanasen der Arten B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B. circulans und B. polymyxa .wurde stets ein identisches Reaktionsprodukt erhalten, das auf Grund seines RrWertes und nach den Ergebnissen von SUZUKI u. KANEKO (1976) als Cellobiosyl-DGlucose angesehen wird (Abb. 1).
699
p-I,3 -1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen Tabelle 2. Substrat-Spezifitat del' Bacillus-p-Glucanasen ,B-Glucanase von
Licheninl )
Gerstenglucan
L aminarin
B. subtilis 168 B. maceran8 B. amyloliquefaciens B. circulans SG 124 B.laterosporus B. pumilus B. polymyxa
+ + + + + + +
+ + +
+
Hefeglucan2 )
OM-Cellulose
+ +
(+)
+
+
+ + +
(+)
(+)
(+)
1) Konzentration del' eingesetzten Substrate: 5 mg/mi. Nachweis del' Hydrolyseprodukte mit 3,5Dinitrosalicylsaure. Gegeniiber Salicin, N-Acetylglucospyranosid und N-Acetylglucosamin wurde keine hydrolytische Aktivitat festgestellt. 2) Das von uns eingesetzte H efeglucan wurde von Herrn Dipi.-Chem. GRIM~fECKE (Friedrich-SchillerUniversitat Jena) aus Candida·Zellwanden prapariert.
Bei der Hydrolyse von Gerstenglucan ergab sich unter identischen Reaktionsbedingungen ein ahnliches Bild. Auch hier war Cellobiosyl.D.Glucose das wichtigste Hydroiyseprodukt. Daneben war cine Verbindung, die auf Grund ihres niedrigen Rf·Wertes als Tetraose anzusehen ist, in allen Hydralysaten nachweisbar (Abb. 2). Fur die Enzyme von B. subtilis und B. pumilus wurde bereits der Nachweis gefiihrt, daB es sich bei diesem Produkt der p.Glucan·Hydrolyse urn Cellotriosyl.D-Glucose handelt (ANDERSON and STONE 1976, SU2;UKI and KANEKO 1976). Fur die Endo·p·Glucanase von B. macerans wurden abweichende Ergebnisse erhalten. Das Enzym setzt aus Lichenin neben der Triose auch ein Mono· und Di· saccharid sowie eine Tetraose frei (Abb. 1). Bestatigt wurden diese Befunde durch die Analyse der enzymatischen Hydrolyse von Gerstenglucan. Nach chromatographi. scher Auftrennung der freigesetzten Zucker wurden mehrere Verbindungen nacho
LICHENIN
Gl G2
(JJ)
• •••• ••• W
f/l!}
(jJ)
2
3
4
5
6
7
Abb.1. Produkte del' Lichenin.Hydrolyse durch p·Glucanaseprapara tionen von B. subtilis 168 (1), B. amyloliquefaciens ATCC 1581 (2), B . macerans A.TCC 8244 (3), B . circulans SG 124 (4), B. laterosporus ATCC 64 (5), B. pumilus ATCC 72 (6) und B. polymyxa CCM 1609 (7).
700
R.
BORRISS
und J.
ZEMEK
GERSTENGLUCAN
,~
•• • • •• •• •• •• •• •• •• @
2
®
3
®
~
t,..
@
5
6
@
7
f/l)
G1
@
G2 G3
8
Abb. 2. Produkte der Gerstenglucan-Hydrolyse durch p-Glucanasepraparationen von B. amyloliquefaciens (1), B. pumilus (2), B. macerans (3, 4), B. polymyxa (5), B. circulans SG 124 (6), B. laterosporus (7) und B. subtilis (8)_
/
)
..---
) /
Abb.3. Enzymatische Hydrolyse von Gerstenglucan durch die extrazelluliire p-Glucanase von B. macerans ATCC 8244 (30a-30c).
fl-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen
701
LAMINARIN
G1 G2
• •
234567 Abb. 4. Produkte der Laminarin-Hydrolyse durch die fl-Glucanase von B. macerans ATCC 8244 (1). B. subtilis- (2), B. amyloquefacien8- (3), B. circulans SG 124- (4), B. laterosporu8 -(5), B. pumilU8- (6) und B. polymyxa-Praparationen (7) produzierten keine nachweisbaren Hydrolyseprodukte nach 12stiindiger Inkubation mit einer 1 %igen LaminarinlOsung.
gewiesen, die nach ihrem R f - Wert als Mono- und Disaccharide anzusehen sind (Abb.3)_ Durch die Endo-fJ-Glucanase von B_ macerans wird Laminarin zu zwei niedermolekularen Zuckern abgebaut, von denen einer als Glucose identifiziert werden konnte (Abb. 4).
Diskussion In der Vergangenheit wurden drei verschiedene Endo-fJ-Glucanasetypen, die gegenuber Lichenin und Cerealien-fJ-Glucanen hydrolytisch wirksam werden, beschrieben (ANDERSON and STONE 1975): fJ-1,4-Glucanasen ("Cellulasen", E. C. 3_2_1.4) spalten die 1,4-Bindungen der fJ-Glucane unabhangig davon, welche Bindungsart die benachbarte Verknupfung der Glucosemonomere im Molekul aufweist. fJ-1,3-Glucanasen ("Laminarinasen", E. C_ 3.2_1.6), z. B. von Rhizopus arrhizus (CLARK, JOHNSON, CHUNG, and KIRKWOOD 1978) oder Bacillus circulans WL-12 (FLEET and PHAFF 1974), hydrolysieren sowohl reine fJ-1,3-Glucane (Laminarin, Pachyman) als auch Glucane, die nebeneinander fJ-l,3- und fJ-l,4-Bindungen beinhalten. Das Enzym hydrolysiert bevorzugt fJ-l,3-Bindungen, spaltet jedoch auch fJ-l,4-Bindungen, wenn sie am nichtreduzierenden Ende mit fJ-l,3-Bindungen benachbart sind. "Echte" Licheninasen (fJ-1,3-1,4-Glucanase, E. C. 3.2.1.73) hydrolysieren ausschlieBlich Cerealien-fJ-Glucane und Lichenin und bleiben gegenuber reinen fJ-1,3- oder fJ-1,4-Glucanen ohne Wirkung. Derartige Enzyme wurden im Malz (An-Endo-fJ-Glucanase, LUCHSINGER and RICHARDS 1964) und in der Kulturflussigkeit verschiedener Bacillus-Stamme nachgewiesen (Tabelle 3). ANDERSON 46 Zbl. Bakt. II. Abt., Bd.135
702
R. BORRISS und J. ZEMEK
STONE (1975) konnten zeigen, daB dieser Enzymtyp zur Entfaltung seiner katalytischen Aktivitat eine -G-3-G-4-G-Anordnung in dem Glykosylrest seines Substrates erfordert. Die j3-1,4-glykosidische Bindung zwischen zwei Glucosemonomeren wird nur hydrolysiert, wenn diesem Bindungstyp eine G-3-G-Sequenz unmittelbar benachbart ist.
U.
Nach unseren Ergebnissen gehOrt die Mehrzahl der Bacillus-Endo-j3-Glucanasen dem dritten Enzymtyp an (Tabelle 3). Die j3-Glucanasen von B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, B. laterosporus, B. polymyxa und B. circulans SG 124 (im Gegensatz zu dem von FLEET u. PHAFF 1974 beschriebenen Enzym von B. circulans WL-12) waren in ihrer Spezifitat auf die Substrate Lichenin und Gerstenglucan begrenzt. Die aus Lichenin und Gerstenglucan gebildeten Hydrolyseprodukte stimmen in ihren Rr-Werten mit den hauptsachlichen Produkten des durch die j3-Glucanasen von B. subtilis (ANDERSON and STONE 1975) und B. pumilus (SUZUKI and KANEKO 1976) katalysierten Glucanabbau 3-0-Cellobiosyl-D-Glucose und 3-0Cellotriosyl-D-Glucose iiberein (Abb. 1, 2). Die Endo-j3-Glucanase von B. macerans muB dem zweiten Enzymtyp ("Laminarinase", vgl. Tabelle 3) zugerechnet werden. Dafiir sprechen die Hydrolyse von Laminarin (Abb.4) und das von den iibrigen Enzympraparaten deutlich abweichende Hydrolysespektrum von Lichenin (Abb. 1) und Gerstenglucan (Abb. 2, 3) Die Hydrolyse dieser Substrate erfolgte ebenso wie die Laminarinhydrolyse unter Freisetzung schnellwandernder oligomerer Bruchstiicke (u. a. Glucose und Laminaribiose). Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daB verschiedene in dem von uns eingesetzten Rohenzympraparat anwesende Enzymspecies fiir die nachgewiesenen oligomeren Produkte des Glucanabbaus verantwortlich sind. Diese Frage kann erst nach dem Einsatz einer hochgereinigten B. macerans-Endo-j3Glucanase entschieden werden.
Tabelle 3. Charakterisierung der Bacillus-p-Glucanasen nach der Einteilung von ANDERSON u. STONE (1978) Endo-p-Glucanase
Erforderliche p-Glucan-Sequenz
E. C. 3.2.1.6 Endo-l,3-p-D-Glucan Glucanohydrolase
(1 -G-3-G
E. C. 3.2.1.73 Endo-1,3-1,4-p-DGluean Glueanohydrolase
-G-3-G (1
-1-+ 3) (1 --+ 4)
G-
-\-+ 4) G-
1) Nachweis in dieser Publikation gefiihrt.
t
Nachweis bei
RhizopU8 arrhizus (CLARK und Mitarb. 1978) B. circulans WL-12 (FLEET and PHAFF 1974) B. macerans l )
B. subtilis (ANDERSON and STONE 1976) B. pumilus (SUZUKI and KANEKO 1976) B. IMET B. 376 (BORRISS 1978) B. amyloliquefaciensl ) B. circulans SG 1241) B. laterosporus l ) B. polymyxa l )
(J-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen
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Literatur ANDERSON, M. A., and STONE, B. A.: A new substrate for investigating the specifity of p-glucan hydrolases. FEBS Letters 52 (1975), 202-207. - - Enzymic degradation of chemically modified extracellular polysaccharides from Rhizobia. Carbohydrate Res. 61 (1978), 479-492. BORRISS, R.: Extrazellulare Glucanasen sporenbildender Mikroorganismen - Produktion und Eigenschaften. Diss. B, Martin-Luther-Universitat Halle (1978). ZEMEK, J., AUGUSTIN, J., PACOVA, Z., und KUNIAK, L.: p-l,3-1,4-Glucanase in sporenbildenden Mikroorganismen. II. Bildung von p-Glucan-Hydrolasen durch verschiedene Bacillus-Arten. ZbI. Bakt. II 135 (1980), 435 - 442. CLARK, D. R., JOHNSON, J., CHUNG, K. H., and KIRKWOOD, S.: Purification, characterization, and action-pattern studies on the endo-I-3-p-D-Glucanase from Rhizopus arrhizus QM 1032. Carbohydrate Res. 61 (1978), 457 -477. FLEET, G. H., and PHAFF, H. J.: Lysis of yeast cell-walls: glucanases from Bacillus circulans WL-12. J. Bact. 119 (1974), 207 -219. HAFNER, B.: Herstellung und Charakterisierung eines Substrates iiir p-Glukanase. Symp. Ber., 2. Int. Symp. Garungsind. Berlin 1968, 3'0, S. 135-140. LOWRY, O. H., ROSEBROUGH, N. J., FARR, A. L., and RANDALL, R. J.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. BioI. Chern. 193 (1951), 265-275. LUCHSINGER, W. W., and RICHARDS, A. W.: The mechanism of malt p-glucanases. 5. Separation of the p-glucanases of germinated barley by dialysis and ion-exchange chromatography on phosphorylated cellulose. Arch. Biochem. Biophys. 106 (1964),65-70. MOSCATELLI, E. A., HORN, E. A., and RICKES, E. L.: Enzymatic properties of a p-glucanase from Bacillu8 8ubtili8. J. BioI. Chern. 236 (1961), 2558-2562. SUZUKI, H., and KANEKO, T.: Degradation of barley glucan and lichenan by a Bacillu8 pumilu8 enzyme. Agr. BioI. Chern. 40 (1976), 577 - 586. TREVELYAN, "V. E., PROCTER, D. P., and HARRISON, J. S.: Detection of sugars on paper chromatograms. Nature (London) 166 (1954), 444-445. Anschrift des Verfassers: Dr. RAINER BORRISS, Forschungsabteilung VEB Prowiko Schonebeck, DDR - 3300 Schonebeck/ Elbe, Welsleber StraBe 61.