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Antifongiques : cibles cellulaires et mécanismes de résistance
Thérapie 2006 Mai-Juin; 61 (3): 195–199 DOI: 10.2515/therapie:2006048
S ÉMINAIRE
c 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
Antifongiques : cibles cellulaires et mécanismes de résistance Isabelle Accoceberry et Thierry Noël Laboratoire de Mycologie Moléculaire, Université de Bordeaux 2, Bordeaux, France
Mots clés : Candida ; antifongique ; cible cellulaire ; résistance
Résumé – Les antifongiques systémiques utilisés pour traiter les infections fongiques disséminées ou profondes se répartissent en quatre familles chimiques principales et possèdent globalement trois cibles cellulaires chez le champignon : les pyrimidines fluorées agissent sur la réplication de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et la synthèse des protéines ; les polyènes et les azolés ont pour cible l’ergostérol et sa voie de biosynthèse ; les lipopeptides inhibent la biosynthèse de glucanes pariétaux. Les mécanismes de résistance mis en place par certaines souches de champignons sont maintenant mieux connus, en particulier chez les levures du genre Candida. Dans la majorité des cas, ces mécanismes reposent soit sur des mutations qui ont pour effet de modifier la cible de l’antifongique ou d’en bloquer l’accès, soit sur la surexpression de gènes codant pour la cible ou pour des transporteurs membranaires impliqués dans un rejet actif de l’antifongique.
Keywords: Candida; antifungal; cellular target; resistance
Abstract – Antifungals Cellular Targets and Mechanisms of Resistance. Antifungals of systemic use for the treatment of invasive fungal infections belong to four main chemical families which have globally three cellular targets in fungal cells: fluorinated pyrimidines act on deoxyribonucleic acid (DNA) replication and protein synthesis; polyenes and azoles are toxic for ergosterol and its biosynthetic pathway; lipopeptides inhibit the synthesis of cell wall β glucans. The resistance mechanisms that are developed by some fungi begin to be well understood particularly in Candida yeasts. The underlying bases of these mechanisms are either mutations that modify the antifungal target, or that block access to the target, and, on the other hand, the overexpression of genes encoding the target, or some membrane proteins involved in the active efflux of antifungal drugs.
Le traitement d’une infection fongique grave peut poser un véritable défi au praticien. Il n’a à sa disposition que peu de molécules antifongiques, tout au plus sept ou huit, qui se répartissent en quatre familles chimiques, et qui n’ont que trois cibles chez le champignon : la machinerie cellulaire (réplication, traduction), l’ergostérol et la paroi. Tout en jonglant avec les problèmes de toxicité de certains antifongiques, comme l’amphotéricine B, le praticien doit aussi tenir compte du possible développement de résistances au traitement par les champignons. Grâce à la mobilisation internationale des chercheurs dans ces quinze dernières années, les mécanismes moléculaires des résistances aux antifongiques sont aujourd’hui mieux connus.[1] Même s’il reste du travail à accomplir, cette connaissance a permis d’influer sur les pratiques cliniques (prophylaxie, doses, durée du traitement) afin de limiter le risque d’échec thérapeutique lié aux résistances. Par ailleurs, la caractérisation des gènes de résistance peut dans certains cas être utilisée comme un outil d’épi-
démiologie moléculaire afin d’étudier les flux de populations, les possibilités de transferts nosocomiaux, ou réaliser des études de cladistique.[2] Enfin, pour peu qu’il s’exprime de façon fréquente, un mécanisme de résistance peut contribuer au développement de nouveaux inhibiteurs dirigés contre lui. Nous nous limiterons dans cette revue à décrire le mécanisme d’action des principaux antifongiques utilisables en traitement systémique, ainsi que les mécanismes moléculaires de résistance les plus fréquemment rencontrés.
1. Déterminisme des résistances et mécanismes cellulaires Deux types de résistance sont généralement distingués : – La résistance primaire, ou résistance naturelle, se rencontre chez certaines espèces fongiques qui sont insensibles à un
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Accoceberry et Noël
antifongique donné, ou tout au moins pour lesquelles les concentrations minimales inhibitrices (CMI) d’antifongiques sont supérieures aux concentrations utilisables en thérapie. Ce type de résistance est un caractère d’espèce exprimé par tous les individus constituant l’espèce. L’un des exemples le plus connu est sans doute la résistance primaire de la levure Candida krusei vis-à-vis du fluconazole.[3] – La résistance secondaire, ou résistance acquise, se développe chez des champignons qui appartiennent à une espèce a priori sensible. Cette résistance est la conséquence d’un événement qui a eu lieu préalablement ou pendant le traitement antifongique. C’est un caractère de souche, qui n’affecte que de rares individus au sein de l’espèce et qui ne leur confère un avantage sélectif que lorsqu’ils sont exposés à l’antifongique. Les résistances acquises ont toutes un déterminisme génétique. Elles résultent généralement d’événements mutationnels, ou de la dérégulation de l’expression de certains gènes, ce qui conduit le plus souvent à leur surexpression. Les conséquences de ces événements d’un point de vue cellulaire et les mécanismes mis en jeu par le microorganisme pour résister à l’action d’un antifongique sont multiples et dépendent de l’antifongique utilisé. La résistance peut provenir : (i) d’un défaut de transport ou de pénétration de l’antifongique à l’intérieur de la cellule fongique ; (ii) d’un défaut de transformation de l’antifongique en forme active toxique ; (iii) d’une surproduction de la cible cellulaire de l’antifongique ; (iv) d’une modification de la cible, qui conduit à la diminution de son affinité pour l’antifongique ; (v) d’une disparition de la cible et de son remplacement par le recrutement ou le détournement d’un autre métabolite ; (vi) d’un efflux actif de l’antifongique. Ces différents mécanismes ne sont pas équivalents en fréquence et en efficacité, et certains d’entre eux sont spécifiques de certains antifongiques.
2. Résistance à la flucytosine La flucytosine, ou 5-fluorocytosine (5-FC), est une pyrimidine fluorée d’origine synthétique dont la cible générale est la réplication de l’ADN et la traduction des protéines.[4] La flucytosine est une prodrogue. Pour être active, la molécule doit pénétrer à l’intérieur de la cellule fongique en empruntant un transporteur spécifique, la cytosine perméase codée par le gène FCY2 (Figure 1). Dans le cytoplasme, la flucytosine sera désaminée par une cytosine désaminase codée par le gène FCY1, en 5-fluorouracile (5FU) qui est le véritable produit toxique. Le 5FU sera ensuite converti en 5-fluoro-uridine monophosphate (5FUMP) par l’uridine phosphoribosyl transférase codée par le gène FUR1. Plusieurs activités enzymatiques seront encore nécessaires pour générer différents métabolites fluorés qui vont soit inhiber la thymic 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
Fig. 1. Mécanisme d’action de la flucytosine et principaux gènes et enzymes impliqués dans son métabolisme. 5FC : Flucytosine ou 5-fluorocytosine ; 5FU : 5-fluoro-uracile ; 5F(d)UMP : 5-fluoro-desoxy-uridine monophosphate ; 5FUTP : 5-fluoro-uridine triphosphate.
dylate synthase, une enzyme nécessaire à la synthèse de thymidine, et donc à la réplication de l’ADN, soit être incorporés au niveau des acides ribonucléiques (ARN) messagers et inhiber la synthèse des protéines. Les résistances vont provenir de la surexpression de l’enzyme cible thymidylate synthase, ou bien, plus fréquemment, de mutations dans les gènes nécessaires au métabolisme de la 5FC pour empêcher sa conversion en 5FU. Parmi ces gènes, les trois premiers sont les plus importants : l’inactivation des gènes FCY1 ou FUR1 confère une résistance totale à la 5FC, tandis que l’inactivation du gène FCY2 confère un niveau de résistance moins élevé, mais malgré tout à des concentrations supérieures aux doses thérapeutiques.[5] Le nombre important d’étapes enzymatiques nécessaires à l’action de la 5FC offre au champignon, grâce aux mutations, de multiples possibilités pour résister à l’antifongique. De fait, la fréquence des résistances à la 5FC est élevée, ce qui, sans renier l’efficacité et les qualités inhibitrices de cette molécule, ne permet pas de l’utiliser en monothérapie, mais toujours en association.[4]
3. Résistance aux azolés Les antifongiques azolés sont des molécules synthétiques comprenant les imidazolés et les triazolés de 1re et de 2e génération dont la cible générale est la voie de biosynthèse de l’ergostérol, le principal stérol de la membrane fongique. Plus particulièrement, les azolés ont pour cible la CYP51 (CYP pour cytochrome P450), une C14-alpha-déméthylase codée par le gène ERG11. Cette enzyme clé est nécessaire à l’élimination d’un groupement méthyl sur le carbone 14 du squelette stéroïde, et son blocage aboutit à l’accumulation de stérols 14-méthyl 3,6 diol toxiques pour la cellule (Figure 2). L’utilisation massive des azolés à titre Thérapie 2006 Mai-Juin; 61 (3)
Résistance aux antifongiques
Fig. 2. Schéma simplifié de la voie de biosynthèse de l’ergostérol à partir de l’acétyl-CoA et de ses possibles ramifications. Les numéros correspondent aux principaux gènes ERG qui peuvent être impliqués dans la résistance à l’amphotéricine B et/ou aux azolés. ERG2 : ∆8,7 isomérase ; ERG3 : ∆5,6 désaturase ; ERG5 : C22 stérol désaturase ; ERG6 : C24 stérol méthyl transférase ; ERG11 : C14-alpha déméthylase.
curatif ou prophylactique, liée à leur efficacité et à leur faible toxicité pour l’être humain, a fortement contribué à la sélection de résistance. Grâce au dynamisme de quelques équipes de recherche, les mécanismes de résistance aux azolés sont aujourd’hui assez bien connus.[1] Les plus fréquents ont trois origines différentes. Le premier mécanisme résulte de la surexpression de la cible CYP51, généralement par une simple augmentation de la transcription du gène ERG11,[6] plus rarement par un phénomène de duplication et d’amplification génique tel que cela a été rapporté pour une souche de C. glabrata.[7] Le deuxième mécanisme se déclenche à la suite de mutations ponctuelles du gène ERG11. Ce sont les mutations qui se traduisent par la substitution d’un acide aminé important pour la structure tridimensionnelle de la protéine en relation avec son affinité pour l’antifongique qui sont sélectionnées.[1] Moins d’une dizaine de mutations importantes ont été répertoriées à ce jour, dont les effets peuvent être validés grâce à la structure de la protéine obtenue de sa cristallisation.[8] Le troisième mécanisme est basé sur le transport d’efflux qui permet le rejet de l’antifongique à l’extérieur de la cellule. Chez les levures, deux c 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
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familles de transporteurs (appelés aussi pompes) sont impliquées dans la résistance aux azolés. Elles se distinguent par l’énergie nécessaire à leur fonctionnement (c’est un transport actif), et par leur spectre vis-à-vis des substrats antifongiques. Les transporteurs de type MF (Major Facilitator), codés par le gène MDR1 chez C. albicans,[9] fonctionnent avec un gradient électrochimique de protons, et ont un spectre réduit vis-à-vis des azolés, avec pour seul substrat le fluconazole. En revanche, ces transporteurs sont capables d‘évacuer d’autres toxiques tels que le bénomyl (inhibiteur de la polymérisation des microtubules) ou le méthotrexate (inhibiteur de la dihydrofolate réductase). Les transporteurs de type ABC (ATP-Binding Cassette), codés par les gènes CDR1 et CDR2 chez C. albicans,[1] fonctionnent grâce à l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate (ATP), ont un spectre large visà-vis de la plupart des antifongiques azolés, et transportent également d’autres molécules antifongiques telles que l’amorolfine, la terbinafine, la cycloheximide et la caspofungine.[10–12] En situation normale, les transporteurs de type MDR ou CDR sont exprimés à un niveau de base dans la cellule fongique, même quand elle n’est pas exposée à un antifongique. La résistance résulte de la surexpression des gènes codants et de l’accumulation des pompes dans la membrane. Cette surexpression est sous le contrôle de facteurs de transcription qui commencent à être identifiés. Les gènes TAC1 et CaNDT80 ont été caractérisés de façon concomitante par deux équipes.[13, 14] TAC1, un activateur de transcription de la famille « Zn(2)-Cys(6) finger », code une protéine ayant un domaine de fixation à l’ADN, dans la région promoteur du gène CDR2, au niveau d’une région conservée DRE (pour Drug Responsive Element) constituée par des répétitions du triplé –CGG–. Le gène CaNDT80, quant à lui, serait un facteur de transcription du gène CDR1, dont l’effet activateur pourrait être contrebalancé par un répresseur de l’expression du gène CDR1 récemment mis en évidence.[15] C’est lorsque ce répresseur s’éteint que l’expression du gène CDR1 augmente pour jouer son rôle d’efflux. Il reste à élucider comment ces activateurs ou répresseurs de transcriptions sont eux mêmes régulés et comment ils perçoivent la présence d’une drogue.
4. Résistance à l’amphotéricine B Après plus d’un demi-siècle d’utilisation, l’amphotéricine B reste un antifongique de référence contre lequel peu de résistances ont été décrites. La cible de ce polyène d’origine naturelle - découvert chez les actinomycètes - est l’ergostérol, auquel il se lie de façon covalente pour former des pores dans la membrane plasmique, à travers lesquels les électrolytes vont transiter de façon incontrôlée, et provoquer la mort du champignon. Le principe de la résistance à l’amphotéricine B repose sur un système de disparition de cible en deux étapes : une première étape consiste en un Thérapie 2006 Mai-Juin; 61 (3)
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blocage de la voie de biosynthèse de l’ergostérol de façon à soustraire la cible à l’action de l’antifongique ; une deuxième étape est alors nécessaire pour remplacer l’ergostérol dans les membranes par d’autres stérols viables. La résistance à l’amphotéricine B ne résulte donc que des seules mutations des gènes de biosynthèse de l’ergostérol. Par ailleurs, peu de stérols méthylés peuvent remplacer de façon équitable l’ergostérol. Enfin, la voie de biosynthèse de l’ergostérol est complexe et ramifiée (Figure 2). Lorsqu’une branche métabolique conduisant à l’ergostérol est bloquée, il peut y avoir sauvetage ou compensation par une autre branche. Cette complexité explique que les mécanismes de résistance sont plutôt rares. In vitro, il a été montré que les mutations des gènes ERG2 (∆7-8 isomérase), ERG5 (C22 stérol désaturase) ou ERG6 (C24 stérol méthyl transférase) pouvaient à des degrés divers conférer une résistance aux polyènes chez des modèles comme Saccharomyces cerevisiae, Candida lusitaniae ou Cryptococcus neoformans.[16–18] Sur le plan clinique, ce sont les mutations du gène ERG3 codant une ∆5-6 stérol désaturase qui ont été mises en évidence chez C. albicans.[19, 20] Ces altérations du gène ERG3 sont extrêmement redoutées car elles confèrent non seulement une résistance à l’amphotéricine B, mais également une résistance croisée aux azolés. En effet, la mutation de ERG3 permet l’accumulation de 14 méthyl fécostérol, un stérol méthylé viable, et empêche la formation de 14 méthyl 3,6 diol toxique. Dans cette configuration, la cellule n’a plus besoin d’utiliser le gène ERG11 dont le produit fonctionne en aval, et les antifongiques azolés n’ont par conséquent plus d’effet inhibiteur.
5. Résistance à la caspofungine La dernière innovation en thérapie antifongique est un lipopeptide d’origine naturelle – isolé du champignon Glarea lozoyensis – dont la cible est la paroi fongique, plus particulièrement l’enzyme β-(1,3)-D-glucane synthase qui élabore les glucanes majoritaires de la paroi.[21] C’est une enzyme de structure complexe qui comprend deux sous-unités membranaires, Fks1 et Fks2, en liaison avec la protéine régulatrice Rho1 ayant une activité GTPase (GTP = guanosine triphosphate), placée en amont d’une cascade de régulation faisant intervenir une protéine kinase C et des MAP kinases (Figure 3). La protéine Rho1 reçoit des informations de la part de protéines (Mid2, Wsc1) qui sondent en permanence l’état de la paroi et déterminent les besoins de synthèse qui seront transmis aux sous-unités Fks. Fks1 et Fks2 ne sont pas des sousunités équivalentes ; elles fonctionnent dans des conditions physiologiques différentes. La sous-unité Fks1 serait la cible de la caspofungine car des mutants délétés pour le gène correspondant,[22] ou portant des mutations ponctuelles, sont résistants à la caspofungine ou à d’autres échinocandines.[23] La voie de signalisation c 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
Fig. 3. Structure et régulation de la ß(1,3)D-glucane synthase, le complexe enzymatique cible de la caspofungine.
qui régule l’activité des sous-unités Fks1 et Fks2 peut également être impliquée dans les phénomènes de résistance,[24] tout comme certaines protéines de l’appareil de Golgi, qui ont un rôle dans le transport des macromolécules pariétales, comme la protéine Sbe.[25] Enfin, il a été démontré que la caspofungine pouvait être le substrat de la pompe d’efflux Cdr2.[12] Si les aspects in vitro de la résistance à la caspofungine commencent à être élucidés, on ne sait pas encore quelle sera la fréquence de résistance en clinique, ni quels en seront les mécanismes privilégiés.
6. Conclusion Devant la multiplicité des mécanismes de résistance acquise qui peuvent être mis en jeu par les champignons, on pourrait penser que l’avenir de la thérapie antifongique est obéré. Il n’en est rien. La règle générale chez la plupart des espèces de champignons est la sensibilité aux antifongiques, ce qui semble être confirmé par les études multicentriques de surveillance des fréquences de résistances, comme le réseau international SENTRY.[26] Une préoccupation viendrait plutôt des espèces montrant des résistances primaires, en particulier certaines moisissures, contre lesquelles nous disposons de peu de moyens de lutte. Le risque serait qu’à la faveur de la pression de sélection antifongique, ces espèces deviennent plus fréquentes dans les pathologies humaines. A nous tous, soignants, chercheurs et acteurs économiques de la santé, de faire en sorte que cette menace ne devienne pas une réalité en essayant de mettre en évidence des cibles spécifiques originales chez les champignons pour le développement de nouveaux anti-infectieux. Thérapie 2006 Mai-Juin; 61 (3)
Résistance aux antifongiques
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c 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
Correspondance et offprints : Thierry Noël, Laboratoire de Mycologie Moléculaire, UMR 5162 CNRS-Université de Bordeaux 2, Génomique Fonctionnelle des Trypanosomatides, 146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex, France. E-mail : [email protected]
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Antifongiques : cibles cellulaires et mécanismes de résistance Isabelle Accoceberry et Thierry Noël Laboratoire de Mycologie Moléculaire, Université de Bordeaux 2, Bordeaux, France
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Résumé – Les antifongiques systémiques utilisés pour traiter les infections fongiques disséminées ou profondes se répartissent en quatre familles chimiques principales et possèdent globalement trois cibles cellulaires chez le champignon : les pyrimidines fluorées agissent sur la réplication de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et la synthèse des protéines ; les polyènes et les azolés ont pour cible l’ergostérol et sa voie de biosynthèse ; les lipopeptides inhibent la biosynthèse de glucanes pariétaux. Les mécanismes de résistance mis en place par certaines souches de champignons sont maintenant mieux connus, en particulier chez les levures du genre Candida. Dans la majorité des cas, ces mécanismes reposent soit sur des mutations qui ont pour effet de modifier la cible de l’antifongique ou d’en bloquer l’accès, soit sur la surexpression de gènes codant pour la cible ou pour des transporteurs membranaires impliqués dans un rejet actif de l’antifongique.
Keywords: Candida; antifungal; cellular target; resistance
Abstract – Antifungals Cellular Targets and Mechanisms of Resistance. Antifungals of systemic use for the treatment of invasive fungal infections belong to four main chemical families which have globally three cellular targets in fungal cells: fluorinated pyrimidines act on deoxyribonucleic acid (DNA) replication and protein synthesis; polyenes and azoles are toxic for ergosterol and its biosynthetic pathway; lipopeptides inhibit the synthesis of cell wall β glucans. The resistance mechanisms that are developed by some fungi begin to be well understood particularly in Candida yeasts. The underlying bases of these mechanisms are either mutations that modify the antifungal target, or that block access to the target, and, on the other hand, the overexpression of genes encoding the target, or some membrane proteins involved in the active efflux of antifungal drugs.
Le traitement d’une infection fongique grave peut poser un véritable défi au praticien. Il n’a à sa disposition que peu de molécules antifongiques, tout au plus sept ou huit, qui se répartissent en quatre familles chimiques, et qui n’ont que trois cibles chez le champignon : la machinerie cellulaire (réplication, traduction), l’ergostérol et la paroi. Tout en jonglant avec les problèmes de toxicité de certains antifongiques, comme l’amphotéricine B, le praticien doit aussi tenir compte du possible développement de résistances au traitement par les champignons. Grâce à la mobilisation internationale des chercheurs dans ces quinze dernières années, les mécanismes moléculaires des résistances aux antifongiques sont aujourd’hui mieux connus.[1] Même s’il reste du travail à accomplir, cette connaissance a permis d’influer sur les pratiques cliniques (prophylaxie, doses, durée du traitement) afin de limiter le risque d’échec thérapeutique lié aux résistances. Par ailleurs, la caractérisation des gènes de résistance peut dans certains cas être utilisée comme un outil d’épi-
démiologie moléculaire afin d’étudier les flux de populations, les possibilités de transferts nosocomiaux, ou réaliser des études de cladistique.[2] Enfin, pour peu qu’il s’exprime de façon fréquente, un mécanisme de résistance peut contribuer au développement de nouveaux inhibiteurs dirigés contre lui. Nous nous limiterons dans cette revue à décrire le mécanisme d’action des principaux antifongiques utilisables en traitement systémique, ainsi que les mécanismes moléculaires de résistance les plus fréquemment rencontrés.
1. Déterminisme des résistances et mécanismes cellulaires Deux types de résistance sont généralement distingués : – La résistance primaire, ou résistance naturelle, se rencontre chez certaines espèces fongiques qui sont insensibles à un
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antifongique donné, ou tout au moins pour lesquelles les concentrations minimales inhibitrices (CMI) d’antifongiques sont supérieures aux concentrations utilisables en thérapie. Ce type de résistance est un caractère d’espèce exprimé par tous les individus constituant l’espèce. L’un des exemples le plus connu est sans doute la résistance primaire de la levure Candida krusei vis-à-vis du fluconazole.[3] – La résistance secondaire, ou résistance acquise, se développe chez des champignons qui appartiennent à une espèce a priori sensible. Cette résistance est la conséquence d’un événement qui a eu lieu préalablement ou pendant le traitement antifongique. C’est un caractère de souche, qui n’affecte que de rares individus au sein de l’espèce et qui ne leur confère un avantage sélectif que lorsqu’ils sont exposés à l’antifongique. Les résistances acquises ont toutes un déterminisme génétique. Elles résultent généralement d’événements mutationnels, ou de la dérégulation de l’expression de certains gènes, ce qui conduit le plus souvent à leur surexpression. Les conséquences de ces événements d’un point de vue cellulaire et les mécanismes mis en jeu par le microorganisme pour résister à l’action d’un antifongique sont multiples et dépendent de l’antifongique utilisé. La résistance peut provenir : (i) d’un défaut de transport ou de pénétration de l’antifongique à l’intérieur de la cellule fongique ; (ii) d’un défaut de transformation de l’antifongique en forme active toxique ; (iii) d’une surproduction de la cible cellulaire de l’antifongique ; (iv) d’une modification de la cible, qui conduit à la diminution de son affinité pour l’antifongique ; (v) d’une disparition de la cible et de son remplacement par le recrutement ou le détournement d’un autre métabolite ; (vi) d’un efflux actif de l’antifongique. Ces différents mécanismes ne sont pas équivalents en fréquence et en efficacité, et certains d’entre eux sont spécifiques de certains antifongiques.
2. Résistance à la flucytosine La flucytosine, ou 5-fluorocytosine (5-FC), est une pyrimidine fluorée d’origine synthétique dont la cible générale est la réplication de l’ADN et la traduction des protéines.[4] La flucytosine est une prodrogue. Pour être active, la molécule doit pénétrer à l’intérieur de la cellule fongique en empruntant un transporteur spécifique, la cytosine perméase codée par le gène FCY2 (Figure 1). Dans le cytoplasme, la flucytosine sera désaminée par une cytosine désaminase codée par le gène FCY1, en 5-fluorouracile (5FU) qui est le véritable produit toxique. Le 5FU sera ensuite converti en 5-fluoro-uridine monophosphate (5FUMP) par l’uridine phosphoribosyl transférase codée par le gène FUR1. Plusieurs activités enzymatiques seront encore nécessaires pour générer différents métabolites fluorés qui vont soit inhiber la thymic 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
Fig. 1. Mécanisme d’action de la flucytosine et principaux gènes et enzymes impliqués dans son métabolisme. 5FC : Flucytosine ou 5-fluorocytosine ; 5FU : 5-fluoro-uracile ; 5F(d)UMP : 5-fluoro-desoxy-uridine monophosphate ; 5FUTP : 5-fluoro-uridine triphosphate.
dylate synthase, une enzyme nécessaire à la synthèse de thymidine, et donc à la réplication de l’ADN, soit être incorporés au niveau des acides ribonucléiques (ARN) messagers et inhiber la synthèse des protéines. Les résistances vont provenir de la surexpression de l’enzyme cible thymidylate synthase, ou bien, plus fréquemment, de mutations dans les gènes nécessaires au métabolisme de la 5FC pour empêcher sa conversion en 5FU. Parmi ces gènes, les trois premiers sont les plus importants : l’inactivation des gènes FCY1 ou FUR1 confère une résistance totale à la 5FC, tandis que l’inactivation du gène FCY2 confère un niveau de résistance moins élevé, mais malgré tout à des concentrations supérieures aux doses thérapeutiques.[5] Le nombre important d’étapes enzymatiques nécessaires à l’action de la 5FC offre au champignon, grâce aux mutations, de multiples possibilités pour résister à l’antifongique. De fait, la fréquence des résistances à la 5FC est élevée, ce qui, sans renier l’efficacité et les qualités inhibitrices de cette molécule, ne permet pas de l’utiliser en monothérapie, mais toujours en association.[4]
3. Résistance aux azolés Les antifongiques azolés sont des molécules synthétiques comprenant les imidazolés et les triazolés de 1re et de 2e génération dont la cible générale est la voie de biosynthèse de l’ergostérol, le principal stérol de la membrane fongique. Plus particulièrement, les azolés ont pour cible la CYP51 (CYP pour cytochrome P450), une C14-alpha-déméthylase codée par le gène ERG11. Cette enzyme clé est nécessaire à l’élimination d’un groupement méthyl sur le carbone 14 du squelette stéroïde, et son blocage aboutit à l’accumulation de stérols 14-méthyl 3,6 diol toxiques pour la cellule (Figure 2). L’utilisation massive des azolés à titre Thérapie 2006 Mai-Juin; 61 (3)
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Fig. 2. Schéma simplifié de la voie de biosynthèse de l’ergostérol à partir de l’acétyl-CoA et de ses possibles ramifications. Les numéros correspondent aux principaux gènes ERG qui peuvent être impliqués dans la résistance à l’amphotéricine B et/ou aux azolés. ERG2 : ∆8,7 isomérase ; ERG3 : ∆5,6 désaturase ; ERG5 : C22 stérol désaturase ; ERG6 : C24 stérol méthyl transférase ; ERG11 : C14-alpha déméthylase.
curatif ou prophylactique, liée à leur efficacité et à leur faible toxicité pour l’être humain, a fortement contribué à la sélection de résistance. Grâce au dynamisme de quelques équipes de recherche, les mécanismes de résistance aux azolés sont aujourd’hui assez bien connus.[1] Les plus fréquents ont trois origines différentes. Le premier mécanisme résulte de la surexpression de la cible CYP51, généralement par une simple augmentation de la transcription du gène ERG11,[6] plus rarement par un phénomène de duplication et d’amplification génique tel que cela a été rapporté pour une souche de C. glabrata.[7] Le deuxième mécanisme se déclenche à la suite de mutations ponctuelles du gène ERG11. Ce sont les mutations qui se traduisent par la substitution d’un acide aminé important pour la structure tridimensionnelle de la protéine en relation avec son affinité pour l’antifongique qui sont sélectionnées.[1] Moins d’une dizaine de mutations importantes ont été répertoriées à ce jour, dont les effets peuvent être validés grâce à la structure de la protéine obtenue de sa cristallisation.[8] Le troisième mécanisme est basé sur le transport d’efflux qui permet le rejet de l’antifongique à l’extérieur de la cellule. Chez les levures, deux c 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
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familles de transporteurs (appelés aussi pompes) sont impliquées dans la résistance aux azolés. Elles se distinguent par l’énergie nécessaire à leur fonctionnement (c’est un transport actif), et par leur spectre vis-à-vis des substrats antifongiques. Les transporteurs de type MF (Major Facilitator), codés par le gène MDR1 chez C. albicans,[9] fonctionnent avec un gradient électrochimique de protons, et ont un spectre réduit vis-à-vis des azolés, avec pour seul substrat le fluconazole. En revanche, ces transporteurs sont capables d‘évacuer d’autres toxiques tels que le bénomyl (inhibiteur de la polymérisation des microtubules) ou le méthotrexate (inhibiteur de la dihydrofolate réductase). Les transporteurs de type ABC (ATP-Binding Cassette), codés par les gènes CDR1 et CDR2 chez C. albicans,[1] fonctionnent grâce à l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate (ATP), ont un spectre large visà-vis de la plupart des antifongiques azolés, et transportent également d’autres molécules antifongiques telles que l’amorolfine, la terbinafine, la cycloheximide et la caspofungine.[10–12] En situation normale, les transporteurs de type MDR ou CDR sont exprimés à un niveau de base dans la cellule fongique, même quand elle n’est pas exposée à un antifongique. La résistance résulte de la surexpression des gènes codants et de l’accumulation des pompes dans la membrane. Cette surexpression est sous le contrôle de facteurs de transcription qui commencent à être identifiés. Les gènes TAC1 et CaNDT80 ont été caractérisés de façon concomitante par deux équipes.[13, 14] TAC1, un activateur de transcription de la famille « Zn(2)-Cys(6) finger », code une protéine ayant un domaine de fixation à l’ADN, dans la région promoteur du gène CDR2, au niveau d’une région conservée DRE (pour Drug Responsive Element) constituée par des répétitions du triplé –CGG–. Le gène CaNDT80, quant à lui, serait un facteur de transcription du gène CDR1, dont l’effet activateur pourrait être contrebalancé par un répresseur de l’expression du gène CDR1 récemment mis en évidence.[15] C’est lorsque ce répresseur s’éteint que l’expression du gène CDR1 augmente pour jouer son rôle d’efflux. Il reste à élucider comment ces activateurs ou répresseurs de transcriptions sont eux mêmes régulés et comment ils perçoivent la présence d’une drogue.
4. Résistance à l’amphotéricine B Après plus d’un demi-siècle d’utilisation, l’amphotéricine B reste un antifongique de référence contre lequel peu de résistances ont été décrites. La cible de ce polyène d’origine naturelle - découvert chez les actinomycètes - est l’ergostérol, auquel il se lie de façon covalente pour former des pores dans la membrane plasmique, à travers lesquels les électrolytes vont transiter de façon incontrôlée, et provoquer la mort du champignon. Le principe de la résistance à l’amphotéricine B repose sur un système de disparition de cible en deux étapes : une première étape consiste en un Thérapie 2006 Mai-Juin; 61 (3)
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blocage de la voie de biosynthèse de l’ergostérol de façon à soustraire la cible à l’action de l’antifongique ; une deuxième étape est alors nécessaire pour remplacer l’ergostérol dans les membranes par d’autres stérols viables. La résistance à l’amphotéricine B ne résulte donc que des seules mutations des gènes de biosynthèse de l’ergostérol. Par ailleurs, peu de stérols méthylés peuvent remplacer de façon équitable l’ergostérol. Enfin, la voie de biosynthèse de l’ergostérol est complexe et ramifiée (Figure 2). Lorsqu’une branche métabolique conduisant à l’ergostérol est bloquée, il peut y avoir sauvetage ou compensation par une autre branche. Cette complexité explique que les mécanismes de résistance sont plutôt rares. In vitro, il a été montré que les mutations des gènes ERG2 (∆7-8 isomérase), ERG5 (C22 stérol désaturase) ou ERG6 (C24 stérol méthyl transférase) pouvaient à des degrés divers conférer une résistance aux polyènes chez des modèles comme Saccharomyces cerevisiae, Candida lusitaniae ou Cryptococcus neoformans.[16–18] Sur le plan clinique, ce sont les mutations du gène ERG3 codant une ∆5-6 stérol désaturase qui ont été mises en évidence chez C. albicans.[19, 20] Ces altérations du gène ERG3 sont extrêmement redoutées car elles confèrent non seulement une résistance à l’amphotéricine B, mais également une résistance croisée aux azolés. En effet, la mutation de ERG3 permet l’accumulation de 14 méthyl fécostérol, un stérol méthylé viable, et empêche la formation de 14 méthyl 3,6 diol toxique. Dans cette configuration, la cellule n’a plus besoin d’utiliser le gène ERG11 dont le produit fonctionne en aval, et les antifongiques azolés n’ont par conséquent plus d’effet inhibiteur.
5. Résistance à la caspofungine La dernière innovation en thérapie antifongique est un lipopeptide d’origine naturelle – isolé du champignon Glarea lozoyensis – dont la cible est la paroi fongique, plus particulièrement l’enzyme β-(1,3)-D-glucane synthase qui élabore les glucanes majoritaires de la paroi.[21] C’est une enzyme de structure complexe qui comprend deux sous-unités membranaires, Fks1 et Fks2, en liaison avec la protéine régulatrice Rho1 ayant une activité GTPase (GTP = guanosine triphosphate), placée en amont d’une cascade de régulation faisant intervenir une protéine kinase C et des MAP kinases (Figure 3). La protéine Rho1 reçoit des informations de la part de protéines (Mid2, Wsc1) qui sondent en permanence l’état de la paroi et déterminent les besoins de synthèse qui seront transmis aux sous-unités Fks. Fks1 et Fks2 ne sont pas des sousunités équivalentes ; elles fonctionnent dans des conditions physiologiques différentes. La sous-unité Fks1 serait la cible de la caspofungine car des mutants délétés pour le gène correspondant,[22] ou portant des mutations ponctuelles, sont résistants à la caspofungine ou à d’autres échinocandines.[23] La voie de signalisation c 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
Fig. 3. Structure et régulation de la ß(1,3)D-glucane synthase, le complexe enzymatique cible de la caspofungine.
qui régule l’activité des sous-unités Fks1 et Fks2 peut également être impliquée dans les phénomènes de résistance,[24] tout comme certaines protéines de l’appareil de Golgi, qui ont un rôle dans le transport des macromolécules pariétales, comme la protéine Sbe.[25] Enfin, il a été démontré que la caspofungine pouvait être le substrat de la pompe d’efflux Cdr2.[12] Si les aspects in vitro de la résistance à la caspofungine commencent à être élucidés, on ne sait pas encore quelle sera la fréquence de résistance en clinique, ni quels en seront les mécanismes privilégiés.
6. Conclusion Devant la multiplicité des mécanismes de résistance acquise qui peuvent être mis en jeu par les champignons, on pourrait penser que l’avenir de la thérapie antifongique est obéré. Il n’en est rien. La règle générale chez la plupart des espèces de champignons est la sensibilité aux antifongiques, ce qui semble être confirmé par les études multicentriques de surveillance des fréquences de résistances, comme le réseau international SENTRY.[26] Une préoccupation viendrait plutôt des espèces montrant des résistances primaires, en particulier certaines moisissures, contre lesquelles nous disposons de peu de moyens de lutte. Le risque serait qu’à la faveur de la pression de sélection antifongique, ces espèces deviennent plus fréquentes dans les pathologies humaines. A nous tous, soignants, chercheurs et acteurs économiques de la santé, de faire en sorte que cette menace ne devienne pas une réalité en essayant de mettre en évidence des cibles spécifiques originales chez les champignons pour le développement de nouveaux anti-infectieux. Thérapie 2006 Mai-Juin; 61 (3)
Résistance aux antifongiques
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c 2006 Société Française de Pharmacologie et de Thérapeutique
Correspondance et offprints : Thierry Noël, Laboratoire de Mycologie Moléculaire, UMR 5162 CNRS-Université de Bordeaux 2, Génomique Fonctionnelle des Trypanosomatides, 146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux Cedex, France. E-mail : [email protected]
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