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Células endoteliales y micropartículas circulantes en pacientes portadores de anticuerpos antifosfolípidos
Med Clin (Barc). 2011;136(10):431–433
www.elsevier.es/medicinaclinica
Original breve
Ce´lulas endoteliales y micropartı´culas circulantes en pacientes portadores de anticuerpos antifosfolı´pidos Vicenta Martı´nez-Sales a, Virtudes Vila a, Luisa Mico´ b, M. Teresa Contreras c, Agusti Escandell b y Edelmiro Reganon a,* a b c
Unidad de Bioquı´mica, Centro de Investigacio´n, Hospital Universitario La Fe, Valencia, Espan˜a Servicio de Medicina Interna, Hospital Universitario La Fe, Valencia, Espan˜a Servicio de Ana´lisis Clı´nicos, Hospital Universitario La Fe, Valencia, Espan˜a
´ N D E L A R T I´ C U L O INFORMACIO
R E S U M E N
Historia del artı´culo: Recibido el 29 de abril de 2010 Aceptado el 17 de junio de 2010 On-line el 3 de noviembre de 2010
Fundamento y objetivo: Determinar si los valores de ce´lulas endoteliales circulantes (CEC), micropartı´˜o culas circulantes (MP) y factor von Willebrand (FvW), marcadores establecidos de disfuncio´n/dan endotelial, esta´n elevados en pacientes portadores de anticuerpos antifosfolı´pidos (AAF) y si existe correlacio´n con marcadores de inflamacio´n y coagulacio´n. Pacientes y me´todo: Se estudian 12 pacientes portadores de AAF y 12 sujetos sanos. Se determinaron CEC, MP, FvW, proteı´na C reactiva (PCR), fibrino´geno (Fg), a´cido sia´lico (AS), interleucina 6, factor tisular (FT), generacio´n de trombina (GT) y fragmentos de protrombina (F1 + 2) y de fibrina (DD). Resultados: En los pacientes esta´n significativamente elevados los valores de los marcadores de: ˜ o endotelial (CEC, MP y FvW), inflamacio´n (Fg y PCR) y coagulacio´n (FT y DD). El ana´lisis disfuncio´n/dan bivariante muestra correlacio´n significativa entre CEC y Fg, AS, PCR y DD, ası´ como entre CEC y FvW y MP. Conclusio´n: Los pacientes portadores de AAF presentan una disfuncio´n endotelial asociada a un proceso inflamatorio, que, unido a los valores elevados de Fg, FT y DD, puede inducir un estado de hipercoagulabilidad. ß 2010 Elsevier Espan˜a, S.L. Todos los derechos reservados.
Palabras clave: Anticuerpos antifosfolı´pidos Ce´lulas endoteliales circulantes Micropartı´culas circulantes ˜ o endotelial Disfuncio´n/dan Inflamacio´n Coagulacio´n
Circulating endothelial cells and microparticles in patients with antiphospholipid antibodies A B S T R A C T
Keywords: Antiphospholipid antibodies Circulating endothelial cells Circulating microparticles Endothelial dysfunction/damage Inflammation Coagulation
Background and objective: To determine whether circulating endothelial cells (CECs), circulating microparticles (MPs) and von Willebrand factor (vWF), established markers of endothelial dysfunction/damage, are elevated in patients with antiphospholipid antibodies (aPL) and its possible correlation with inflammation and coagulation. Patients and methods: Twelve patients with aPL and 12 healthy subjects were studied. Levels of CECs, MPs, vWF, C reactive protein (CRP), fibrinogen (Fg), sialic acid (SA), interleukin 6 (IL-6), tissue factor (TF), thrombin generation (TG) and prothrombin (F1 + 2) and fibrin (DD) fragments were determined. Results: In patients, markers of dysfunction/damage endothelial, CECs, MPs and vWF; inflammation, Fg and CRP and coagulation, TF and DD were significantly elevated. The bivariate analysis showed significant correlation among CECs and Fg, AS, CRP and DD, as well as between CECs and vWF and MPs. Conclusion: Patients with aPL had endothelial dysfunction associated with an inflammatory process, which, together with high levels of Fg, TF and DD, may be responsible for the hypercoagulable state. ˜ a, S.L. All rights reserved. ß 2010 Elsevier Espan
Introduccio´n
* Autor para correspondencia. Correo electro´nico: [email protected] (E. Reganon).
El sı´ndrome antifosfolipı´dico (SAF) se caracteriza por presentar una amplia variabilidad clı´nica mediada por la presencia de anticuerpos antifosfolı´pidos (AAF) que pueden favorecer procesos
˜ a, S.L. Todos los derechos reservados. 0025-7753/$ – see front matter ß 2010 Elsevier Espan doi:10.1016/j.medcli.2010.06.020
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V. Martı´nez-Sales et al / Med Clin (Barc). 2011;136(10):431–433
trombo´ticos e inflamatorios1–4. Los AAF son, al mismo tiempo, marcadores para el diagno´stico formal del SAF y autoanticuerpos pato´genos1. En la actualidad existen evidencias experimentales que sugieren una accio´n de los AAF sobre el endotelio, ya que pueden actuar directamente sobre la ce´lula endotelial, ˜ o que puede ser responsable tanto induciendo una disfuncio´n/dan del estado pro-inflamatorio4,5 como pro-coagulante3,5,6, que contribuirı´an directamente a la patoge´nesis de la enfermedad. Recientemente se ha observado que pacientes con SAF muestran una alteracio´n endotelial en ausencia de otros factores tradicionales de arteriosclerosis7. En consecuencia, el presente estudio se inicio´ para determinar si los niveles de ce´lulas endoteliales circulantes (CEC), micropartı´culas circulantes (MP) y factor von ˜o Willebrand (FvW), marcadores establecidos de disfuncio´n/dan endotelial, esta´n elevados en los pacientes portadores de AAF y si esta elevacio´n se asocia con la evidencia de inflamacio´n y coagulacio´n. Pacientes y me´todo Se han incluido 12 pacientes portadores de AAF para estudio y tratamiento en el Servicio de Medicina Interna del hospital. A todos los pacientes se les ha realizado una evaluacio´n clı´nica, exa´menes de laboratorio y ecodoppler carotı´deo. Se considera que un paciente es portador de AAF tras positividad de e´stos en 2 controles sucesivos con un intervalo entre ellos no inferior a 6 semanas. El diagno´stico de SAF se confirmo´ cuando los pacientes con AAF positivo presentaron trombosis arteriales o venosas o patologı´a obste´trica. Paralelamente a los pacientes se han estudiado 12 sujetos sanos, de la misma edad y sexo que los pacientes. El estudio se ha realizado respetando los principios fundamentales establecidos en la Declaracio´n de Helsinki. Todos los pacientes y controles dieron por escrito el consentimiento informado para participar en el estudio (anexo I). Las muestras de sangre de los pacientes y controles se obtuvieron por puncio´n venosa en tubos Vacutainer con y sin anticoagulante y se centrifugaron a 1.500 x g, a 4 8C, durante 30 minutos. El plasma y el suero se almacenaron a 80 8C hasta su ana´lisis. Los anticuerpos anticardiolipinas (AAC) IgG e IgM se han determinado por enzimoinmunoana´lisis (BIomed GMBH). El anticoagulante lu´pico (AL) se ha determinado por tiempo de coagulacio´n en un ACL-TOP (Instrumentation Laboratory). Marcadores de inflamacio´n La proteı´na C reactiva (PCR) se ha determinado por inmunometrı´a (Dade-Behring) (lı´mite deteccio´n 0,1 mg/L), el fibrino´geno (Fg) por medida de turbidimetrı´a de la cine´tica de formacio´n del coa´gulo (lı´mite deteccio´n 20 mg/dL), el a´cido sia´lico (AS) mediante un me´todo enzima´tico-colotime´trico (Boehringer Mannheim) (lı´mite deteccio´n 15 mg/dL) y la interleucina 6 (IL-6) por enzimoinmunoana´lisis (Diaclone Research) (lı´mite deteccio´n 1,56 pg/mL). Marcadores de dan˜o endotelial Las CEC se cuantificaron en sangre total, mediante una te´cnica inmunomagne´tica, con el anticuerpo CD146 y la lectina-1 de Ulex Europaeus conjugada con fluoresceı´na y microscopı´a, siguiendo la te´cnica descrita por Woywodt et al8 (lı´mite deteccio´n 0 CEC/ml). Las MP totales se cuantificaron por citometrı´a de flujo (EPICS XL; Beckman Coulter) en muestras de plasma marcadas con anexina V-FITC (lı´mite deteccio´n 60 MP/mL). Para la determinacio´n del FvW se utilizo´ un ACL-TOP (Instrumentation Laboratoty) (lı´mite deteccio´n 40%).
Marcadores de coagulacio´n El factor tisular (FT) se determino´ por enzimoinmunoana´lisis (America Diagnostica) (lı´mite deteccio´n 50 pg/ml), la generacio´n endo´gena de trombina (GT) por el me´todo de trombograma calibrado automatizado (CAT, Thrombinoscope BV) (lı´mite deteccio´n 5,5 nM), el fragmento 1 + 2 de protrombina (F1 + 2) se midio´ por enzimoinmunoana´lisis (Dade-Behring) (lı´mite deteccio´n 0,04 nmol/L) y el fragmento D dı´mero de fibrina (DD) se midio´ en un ACL-TOP (Instrumentation Laboratoty) (lı´mite deteccio´n 20 ng/mL). Ana´lisis estadı´stico Las variables cuantitativas se han expresado como media DE. La comparacio´n entre los grupos de pacientes y controles se ha realizado por la prueba ‘‘t’’ de Student. La correlacio´n bivariante se determino´ por el test de Spearman. El estudio de la influencia de los factores de riesgo cardiovascular sobre la tasa de CEC en los pacientes con AAF se realizo´ por el ana´lisis de regresio´n mu´ltiple. Valores de p < 0,05 se consideraron significativos. El ana´lisis de los datos se ha realizado con el programa SSPS 11.0. Resultados En la tabla 1 se recogen las caracterı´sticas clı´nicas de los pacientes en la admisio´n al estudio y de los controles. Se observa que los pacientes tienen mayor nu´mero de factores de riesgo aterotrombo´tico (dislipidemia, hipertensio´n arterial, obesidad, tabaquismo y sedentarismo) que el grupo control. El 66 y el 42% de los pacientes presentan un valor de AAF IgG y de AAF IgM ma´s elevado que el valor superior del intervalo de normalidad (0-15 GPL y 0-13 MPL). El 58% de los pacientes habı´a sido diagnosticado de SAF primario (obste´trico en 2 casos). El 75% presento´ AL positivo (7 casos asociados a valores de AAC elevados, fundamentalmente del tipo IgG). El 25% de pacientes presento´ arteriosclerosis subclı´nica. El 83,3% de los pacientes llevaba tratamiento con a´cido acetilsalicı´lico (100 mg/dı´a). Dos de los pacientes estaban tratados con anticoagulantes (uno con acenocumarol y otro con heparina de bajo peso molecular). Cuatro pacientes estaban tratados con hipotensores y 5 con hipolipidemiantes. No se observo´ relacio´n estadı´sticamente significativa entre la tasa de CEC y los factores de riesgo cardiovasculares (dislipidemia, hipertensio´n arterial, obesidad, tabaquismo y sedentarismo) presentes en los pacientes. El estudio comparativo de los grupos de pacientes y controles mostro´ que los pacientes tenı´an unos valores de CEC, MP y FvW significativamente aumentados con respecto al grupo control Tabla 1 Caracterı´sticas clı´nicas de 12 pacientes portadores de anticuerpos antifosfolı´pidos y de 12 sujetos sanos (controles)
Edad media DE (rango), an˜os Mujeres/varones (n) Sı´ndrome antifosfolipı´dico (n) Aborto (n) Anticoagulante lu´pico (n) AAC IgG (n) AAC IgM (n) Ecodoppler carotı´deo patolo´gico (n) Dislipidemia (n) Hipertensio´n arterial (n) Obesidad (n) Tabaquismo (n) Sedentarismo (n) Sı´ndrome nefro´tico (n)
Pacientes
Controles
43 15 (23-74) 11/1 7 2 9 8 5 3 5 4 3 2 2 1
45 14 (26-70) 11/1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AAC IgG: anticardiolipina IgG; AAC IgM: anticardiolipina IgM; DE: desviacio´n esta´ndar; n: nu´mero de casos.
V. Martı´nez-Sales et al / Med Clin (Barc). 2011;136(10):431–433 Tabla 2 ˜ o endotelial, inflamacio´n y coagulacio´n determiMarcadores de disfuncio´n/dan nados en 12 pacientes portadores de anticuerpos antifosfolı´pidos y en 12 sujetos sanos (controles) Pacientes
Controles
p
74 30 148 64 6.336 3.788
95 110 15 1.299 709
<0,001 <0,05 <0,001
Inflamacio´n Fg (mg/dL) AS (mg/dL) PCR (mg/L) IL-6 (pg/mL)
351 114 62 19 5,1 4,7 3,1 5,4
261 43 51 6 1,1 0,8 0,4 0,2
<0,05 0,07 <0,05 0,11
Coagulacio´n GT (nM trombina) FT (pg/mL) F1 + 2 (nmol/L) DD (ng/mL)
174 54 270 137 0,23 0,2 406 310
196 90 171 49 0,17 0,04 166 54
0,5 <0,05 0,20 <0,05
Disfuncio´n/dan˜o endotelial CEC (ce´lulas/mL) FvW (%) MP (nu´mero/mL)
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elevados de Fg, FT y DD, puede inducir un estado de hipercoagulabilidad. Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningu´n conflicto de intereses.
Valores expresados como media desviacio´n esta´ndar. AS: a´cido sia´lico; CEC: ce´lulas endoteliales circulantes; DD: fragmento D-dı´mero de fibrina; Fg: fibrino´geno; FT: factor tisular; FvW: factor von Willebrand; F1 + 2: fragmento 1 + 2 protrombina; GT: generacio´n de trombina; IL-6: interleucina 6; MP: micropartı´culas circulantes; PCR: proteı´na C reactiva.
(p < 0,0001-0,05) (tabla 2). Todos los marcadores de inflamacio´n estaban elevados en los pacientes; sin embargo, los incrementos encontrados eran estadı´sticamente significativos so´lo en el Fg y la PCR (p < 0,05). Con respecto a los para´metros de coagulacio´n, los valores de FT y DD mostraron un aumento significativo (p < 0,05), mientras que los valores de F1 + 2 y GT no se diferenciaron de los valores del grupo control (tabla 2). El estudio de las correlaciones mostro´ que los valores de CEC se correlacionaron fuerte y positivamente con los valores de Fg (r = 0,69, p < 0,05), AS (p = 0,66, p > 0,05), PCR (p = 0,75, p < 0,05), DD (r = 0,74, p > 0,05), FvW (r = 0,59, p > 0,05) y MP (r = 0,65, p < 0,01).
Agradecimientos ´ rsula Salina, Dn ˜ a. U ˜ a. Josefa Llorens y Dn ˜ a. Agradecemos a Dn Aurelia Royo su participacio´n en la realizacio´n de las te´cnicas de Laboratorio.
Anexo I. Modelo de consentimiento informado Para sujetos adultos y menores de 18 an˜os Yo,. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . ., He leı´do la hoja de informacio´n que se me ha entregado. He podido hacer preguntas sobre el estudio. He recibido suficiente informacio´n sobre el estudio. He hablado con:. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . . Comprendo que mi participacio´n es voluntaria. Comprendo que puedo retirarme del estudio: Cuando quiera. Sin tener que dar explicaciones. Sin que esto repercuta en mis cuidados me´dicos. Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio. Fecha: . . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .
Discusio´n Firma del participante: . . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . . El presente estudio de pacientes portadores de AAF evidencia una funcio´n endotelial alterada como consecuencia de los incrementos de FvW, CEC y MP, marcadores circulantes de ˜ o endotelial. La elevada concentracio´n de CEC y disfuncio´n/dan FvW observada en estos pacientes esta´ de acuerdo con los resultados recientemente publicados en pacientes con SAF5. En nuestro estudio, el incremento de las CEC y MP se observa tanto en los pacientes diagnosticados de SAF como en los pacientes con AAF sin sı´ntomas. Este hecho puede corroborar la influencia de los AAF sobre la integridad del endotelio, produciendo un aumento de los valores de CEC y MP circulantes. Nuestros resultados muestran que la alteracio´n de la funcio´n endotelial observada esta´ asociada con un proceso de inflamacio´n presente en los pacientes, objetivado por el aumento de Fg y PCR, marcadores establecidos de inflamacio´n. Por otro lado, en el 66% de los pacientes se observa un nivel de Fg mayor de 312 mg/dl, valor establecido como punto de corte para accidentes cardiovasculares9. Todos estos pacientes con elevado nivel de Fg presentan, tambie´n, valores elevados del marcador plasma´tico de lisis de fibrina (DD). Estos resultados ponen de manifiesto que los pacientes portadores de AAF presentan una disfuncio´n endotelial mediada por un proceso de inflamacio´n, que, unido a la presencia de valores
Bibliografı´a 1. Giannakopoulos B, Passam F, Rahgozar S, Krilis SA. Current concepts on the pathogenesis of the antiphospholipid syndrome. Blood. 2007;109:422–30. 2. Ruiz-Irastorza G, Martinez-Berriotxoa A, Egurbide MV. The antiphospholipid syndrome in the 21st century. Med Clin (Barc). 2009;133:390–6. 3. Ruiz-Irastorza G. Diagnosis of antiphospholipid syndrome: More actors, same protagonists. Med Clin (Barc). 2010;134:445–7. 4. Alijotas-Reig J. The complement system as a main actor in the pathogenesis of obstetric antiphospholipid syndrome. Med Clin (Barc). 2010;134:30–4. 5. Pierangeli SS, Chen PP, Raschi E, Scurati S, Grossi C, Borghi MO, et al. Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome: pathogenic mechanisms. Semin Thromb Hemost. 2008;34:236–50. 6. De Angelis V, Scurati S, Raschi E, Liutkus A, Belot A, Borghi MO, et al. Proinflammatory genotype as a risk factor for aPL-associated thrombosis: Report of a family with multiple anti-phospholipid positive members. J Autoimmun. 2009;32:60–3. 7. Cugno M, Borghi MO, Lonati LM, Ghiadoni L, Gerosa M, Grossi C, et al. Patients with antiphospholipid syndrome display endothelial perturbation. J Autoimmun. 2010;34:105–10. 8. Woywodt A, Blann AD, Kirsch T, Erdbruegger U, Banzet N, Haubitz M, et al. Isolation and enumeration of circulating endothelial cells by immunomagnetic isolation: proposal of a definition and a consensus protocol. J Thromb Haemost. 2006;4:671–7. 9. Reganon E, Vila V, Ferrando F, Martı´nez-Sales V, Fayos L, Ruano M, et al. Elevated high molecular weight fibrinogen in plasma is predictive of coronary ischemic events after acute myocardial infarction. Thromb Haemost. 1999;82:1403–5.
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Ce´lulas endoteliales y micropartı´culas circulantes en pacientes portadores de anticuerpos antifosfolı´pidos Vicenta Martı´nez-Sales a, Virtudes Vila a, Luisa Mico´ b, M. Teresa Contreras c, Agusti Escandell b y Edelmiro Reganon a,* a b c
Unidad de Bioquı´mica, Centro de Investigacio´n, Hospital Universitario La Fe, Valencia, Espan˜a Servicio de Medicina Interna, Hospital Universitario La Fe, Valencia, Espan˜a Servicio de Ana´lisis Clı´nicos, Hospital Universitario La Fe, Valencia, Espan˜a
´ N D E L A R T I´ C U L O INFORMACIO
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Historia del artı´culo: Recibido el 29 de abril de 2010 Aceptado el 17 de junio de 2010 On-line el 3 de noviembre de 2010
Fundamento y objetivo: Determinar si los valores de ce´lulas endoteliales circulantes (CEC), micropartı´˜o culas circulantes (MP) y factor von Willebrand (FvW), marcadores establecidos de disfuncio´n/dan endotelial, esta´n elevados en pacientes portadores de anticuerpos antifosfolı´pidos (AAF) y si existe correlacio´n con marcadores de inflamacio´n y coagulacio´n. Pacientes y me´todo: Se estudian 12 pacientes portadores de AAF y 12 sujetos sanos. Se determinaron CEC, MP, FvW, proteı´na C reactiva (PCR), fibrino´geno (Fg), a´cido sia´lico (AS), interleucina 6, factor tisular (FT), generacio´n de trombina (GT) y fragmentos de protrombina (F1 + 2) y de fibrina (DD). Resultados: En los pacientes esta´n significativamente elevados los valores de los marcadores de: ˜ o endotelial (CEC, MP y FvW), inflamacio´n (Fg y PCR) y coagulacio´n (FT y DD). El ana´lisis disfuncio´n/dan bivariante muestra correlacio´n significativa entre CEC y Fg, AS, PCR y DD, ası´ como entre CEC y FvW y MP. Conclusio´n: Los pacientes portadores de AAF presentan una disfuncio´n endotelial asociada a un proceso inflamatorio, que, unido a los valores elevados de Fg, FT y DD, puede inducir un estado de hipercoagulabilidad. ß 2010 Elsevier Espan˜a, S.L. Todos los derechos reservados.
Palabras clave: Anticuerpos antifosfolı´pidos Ce´lulas endoteliales circulantes Micropartı´culas circulantes ˜ o endotelial Disfuncio´n/dan Inflamacio´n Coagulacio´n
Circulating endothelial cells and microparticles in patients with antiphospholipid antibodies A B S T R A C T
Keywords: Antiphospholipid antibodies Circulating endothelial cells Circulating microparticles Endothelial dysfunction/damage Inflammation Coagulation
Background and objective: To determine whether circulating endothelial cells (CECs), circulating microparticles (MPs) and von Willebrand factor (vWF), established markers of endothelial dysfunction/damage, are elevated in patients with antiphospholipid antibodies (aPL) and its possible correlation with inflammation and coagulation. Patients and methods: Twelve patients with aPL and 12 healthy subjects were studied. Levels of CECs, MPs, vWF, C reactive protein (CRP), fibrinogen (Fg), sialic acid (SA), interleukin 6 (IL-6), tissue factor (TF), thrombin generation (TG) and prothrombin (F1 + 2) and fibrin (DD) fragments were determined. Results: In patients, markers of dysfunction/damage endothelial, CECs, MPs and vWF; inflammation, Fg and CRP and coagulation, TF and DD were significantly elevated. The bivariate analysis showed significant correlation among CECs and Fg, AS, CRP and DD, as well as between CECs and vWF and MPs. Conclusion: Patients with aPL had endothelial dysfunction associated with an inflammatory process, which, together with high levels of Fg, TF and DD, may be responsible for the hypercoagulable state. ˜ a, S.L. All rights reserved. ß 2010 Elsevier Espan
Introduccio´n
* Autor para correspondencia. Correo electro´nico: [email protected] (E. Reganon).
El sı´ndrome antifosfolipı´dico (SAF) se caracteriza por presentar una amplia variabilidad clı´nica mediada por la presencia de anticuerpos antifosfolı´pidos (AAF) que pueden favorecer procesos
˜ a, S.L. Todos los derechos reservados. 0025-7753/$ – see front matter ß 2010 Elsevier Espan doi:10.1016/j.medcli.2010.06.020
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V. Martı´nez-Sales et al / Med Clin (Barc). 2011;136(10):431–433
trombo´ticos e inflamatorios1–4. Los AAF son, al mismo tiempo, marcadores para el diagno´stico formal del SAF y autoanticuerpos pato´genos1. En la actualidad existen evidencias experimentales que sugieren una accio´n de los AAF sobre el endotelio, ya que pueden actuar directamente sobre la ce´lula endotelial, ˜ o que puede ser responsable tanto induciendo una disfuncio´n/dan del estado pro-inflamatorio4,5 como pro-coagulante3,5,6, que contribuirı´an directamente a la patoge´nesis de la enfermedad. Recientemente se ha observado que pacientes con SAF muestran una alteracio´n endotelial en ausencia de otros factores tradicionales de arteriosclerosis7. En consecuencia, el presente estudio se inicio´ para determinar si los niveles de ce´lulas endoteliales circulantes (CEC), micropartı´culas circulantes (MP) y factor von ˜o Willebrand (FvW), marcadores establecidos de disfuncio´n/dan endotelial, esta´n elevados en los pacientes portadores de AAF y si esta elevacio´n se asocia con la evidencia de inflamacio´n y coagulacio´n. Pacientes y me´todo Se han incluido 12 pacientes portadores de AAF para estudio y tratamiento en el Servicio de Medicina Interna del hospital. A todos los pacientes se les ha realizado una evaluacio´n clı´nica, exa´menes de laboratorio y ecodoppler carotı´deo. Se considera que un paciente es portador de AAF tras positividad de e´stos en 2 controles sucesivos con un intervalo entre ellos no inferior a 6 semanas. El diagno´stico de SAF se confirmo´ cuando los pacientes con AAF positivo presentaron trombosis arteriales o venosas o patologı´a obste´trica. Paralelamente a los pacientes se han estudiado 12 sujetos sanos, de la misma edad y sexo que los pacientes. El estudio se ha realizado respetando los principios fundamentales establecidos en la Declaracio´n de Helsinki. Todos los pacientes y controles dieron por escrito el consentimiento informado para participar en el estudio (anexo I). Las muestras de sangre de los pacientes y controles se obtuvieron por puncio´n venosa en tubos Vacutainer con y sin anticoagulante y se centrifugaron a 1.500 x g, a 4 8C, durante 30 minutos. El plasma y el suero se almacenaron a 80 8C hasta su ana´lisis. Los anticuerpos anticardiolipinas (AAC) IgG e IgM se han determinado por enzimoinmunoana´lisis (BIomed GMBH). El anticoagulante lu´pico (AL) se ha determinado por tiempo de coagulacio´n en un ACL-TOP (Instrumentation Laboratory). Marcadores de inflamacio´n La proteı´na C reactiva (PCR) se ha determinado por inmunometrı´a (Dade-Behring) (lı´mite deteccio´n 0,1 mg/L), el fibrino´geno (Fg) por medida de turbidimetrı´a de la cine´tica de formacio´n del coa´gulo (lı´mite deteccio´n 20 mg/dL), el a´cido sia´lico (AS) mediante un me´todo enzima´tico-colotime´trico (Boehringer Mannheim) (lı´mite deteccio´n 15 mg/dL) y la interleucina 6 (IL-6) por enzimoinmunoana´lisis (Diaclone Research) (lı´mite deteccio´n 1,56 pg/mL). Marcadores de dan˜o endotelial Las CEC se cuantificaron en sangre total, mediante una te´cnica inmunomagne´tica, con el anticuerpo CD146 y la lectina-1 de Ulex Europaeus conjugada con fluoresceı´na y microscopı´a, siguiendo la te´cnica descrita por Woywodt et al8 (lı´mite deteccio´n 0 CEC/ml). Las MP totales se cuantificaron por citometrı´a de flujo (EPICS XL; Beckman Coulter) en muestras de plasma marcadas con anexina V-FITC (lı´mite deteccio´n 60 MP/mL). Para la determinacio´n del FvW se utilizo´ un ACL-TOP (Instrumentation Laboratoty) (lı´mite deteccio´n 40%).
Marcadores de coagulacio´n El factor tisular (FT) se determino´ por enzimoinmunoana´lisis (America Diagnostica) (lı´mite deteccio´n 50 pg/ml), la generacio´n endo´gena de trombina (GT) por el me´todo de trombograma calibrado automatizado (CAT, Thrombinoscope BV) (lı´mite deteccio´n 5,5 nM), el fragmento 1 + 2 de protrombina (F1 + 2) se midio´ por enzimoinmunoana´lisis (Dade-Behring) (lı´mite deteccio´n 0,04 nmol/L) y el fragmento D dı´mero de fibrina (DD) se midio´ en un ACL-TOP (Instrumentation Laboratoty) (lı´mite deteccio´n 20 ng/mL). Ana´lisis estadı´stico Las variables cuantitativas se han expresado como media DE. La comparacio´n entre los grupos de pacientes y controles se ha realizado por la prueba ‘‘t’’ de Student. La correlacio´n bivariante se determino´ por el test de Spearman. El estudio de la influencia de los factores de riesgo cardiovascular sobre la tasa de CEC en los pacientes con AAF se realizo´ por el ana´lisis de regresio´n mu´ltiple. Valores de p < 0,05 se consideraron significativos. El ana´lisis de los datos se ha realizado con el programa SSPS 11.0. Resultados En la tabla 1 se recogen las caracterı´sticas clı´nicas de los pacientes en la admisio´n al estudio y de los controles. Se observa que los pacientes tienen mayor nu´mero de factores de riesgo aterotrombo´tico (dislipidemia, hipertensio´n arterial, obesidad, tabaquismo y sedentarismo) que el grupo control. El 66 y el 42% de los pacientes presentan un valor de AAF IgG y de AAF IgM ma´s elevado que el valor superior del intervalo de normalidad (0-15 GPL y 0-13 MPL). El 58% de los pacientes habı´a sido diagnosticado de SAF primario (obste´trico en 2 casos). El 75% presento´ AL positivo (7 casos asociados a valores de AAC elevados, fundamentalmente del tipo IgG). El 25% de pacientes presento´ arteriosclerosis subclı´nica. El 83,3% de los pacientes llevaba tratamiento con a´cido acetilsalicı´lico (100 mg/dı´a). Dos de los pacientes estaban tratados con anticoagulantes (uno con acenocumarol y otro con heparina de bajo peso molecular). Cuatro pacientes estaban tratados con hipotensores y 5 con hipolipidemiantes. No se observo´ relacio´n estadı´sticamente significativa entre la tasa de CEC y los factores de riesgo cardiovasculares (dislipidemia, hipertensio´n arterial, obesidad, tabaquismo y sedentarismo) presentes en los pacientes. El estudio comparativo de los grupos de pacientes y controles mostro´ que los pacientes tenı´an unos valores de CEC, MP y FvW significativamente aumentados con respecto al grupo control Tabla 1 Caracterı´sticas clı´nicas de 12 pacientes portadores de anticuerpos antifosfolı´pidos y de 12 sujetos sanos (controles)
Edad media DE (rango), an˜os Mujeres/varones (n) Sı´ndrome antifosfolipı´dico (n) Aborto (n) Anticoagulante lu´pico (n) AAC IgG (n) AAC IgM (n) Ecodoppler carotı´deo patolo´gico (n) Dislipidemia (n) Hipertensio´n arterial (n) Obesidad (n) Tabaquismo (n) Sedentarismo (n) Sı´ndrome nefro´tico (n)
Pacientes
Controles
43 15 (23-74) 11/1 7 2 9 8 5 3 5 4 3 2 2 1
45 14 (26-70) 11/1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AAC IgG: anticardiolipina IgG; AAC IgM: anticardiolipina IgM; DE: desviacio´n esta´ndar; n: nu´mero de casos.
V. Martı´nez-Sales et al / Med Clin (Barc). 2011;136(10):431–433 Tabla 2 ˜ o endotelial, inflamacio´n y coagulacio´n determiMarcadores de disfuncio´n/dan nados en 12 pacientes portadores de anticuerpos antifosfolı´pidos y en 12 sujetos sanos (controles) Pacientes
Controles
p
74 30 148 64 6.336 3.788
95 110 15 1.299 709
<0,001 <0,05 <0,001
Inflamacio´n Fg (mg/dL) AS (mg/dL) PCR (mg/L) IL-6 (pg/mL)
351 114 62 19 5,1 4,7 3,1 5,4
261 43 51 6 1,1 0,8 0,4 0,2
<0,05 0,07 <0,05 0,11
Coagulacio´n GT (nM trombina) FT (pg/mL) F1 + 2 (nmol/L) DD (ng/mL)
174 54 270 137 0,23 0,2 406 310
196 90 171 49 0,17 0,04 166 54
0,5 <0,05 0,20 <0,05
Disfuncio´n/dan˜o endotelial CEC (ce´lulas/mL) FvW (%) MP (nu´mero/mL)
433
elevados de Fg, FT y DD, puede inducir un estado de hipercoagulabilidad. Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningu´n conflicto de intereses.
Valores expresados como media desviacio´n esta´ndar. AS: a´cido sia´lico; CEC: ce´lulas endoteliales circulantes; DD: fragmento D-dı´mero de fibrina; Fg: fibrino´geno; FT: factor tisular; FvW: factor von Willebrand; F1 + 2: fragmento 1 + 2 protrombina; GT: generacio´n de trombina; IL-6: interleucina 6; MP: micropartı´culas circulantes; PCR: proteı´na C reactiva.
(p < 0,0001-0,05) (tabla 2). Todos los marcadores de inflamacio´n estaban elevados en los pacientes; sin embargo, los incrementos encontrados eran estadı´sticamente significativos so´lo en el Fg y la PCR (p < 0,05). Con respecto a los para´metros de coagulacio´n, los valores de FT y DD mostraron un aumento significativo (p < 0,05), mientras que los valores de F1 + 2 y GT no se diferenciaron de los valores del grupo control (tabla 2). El estudio de las correlaciones mostro´ que los valores de CEC se correlacionaron fuerte y positivamente con los valores de Fg (r = 0,69, p < 0,05), AS (p = 0,66, p > 0,05), PCR (p = 0,75, p < 0,05), DD (r = 0,74, p > 0,05), FvW (r = 0,59, p > 0,05) y MP (r = 0,65, p < 0,01).
Agradecimientos ´ rsula Salina, Dn ˜ a. U ˜ a. Josefa Llorens y Dn ˜ a. Agradecemos a Dn Aurelia Royo su participacio´n en la realizacio´n de las te´cnicas de Laboratorio.
Anexo I. Modelo de consentimiento informado Para sujetos adultos y menores de 18 an˜os Yo,. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . ., He leı´do la hoja de informacio´n que se me ha entregado. He podido hacer preguntas sobre el estudio. He recibido suficiente informacio´n sobre el estudio. He hablado con:. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . . Comprendo que mi participacio´n es voluntaria. Comprendo que puedo retirarme del estudio: Cuando quiera. Sin tener que dar explicaciones. Sin que esto repercuta en mis cuidados me´dicos. Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio. Fecha: . . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .
Discusio´n Firma del participante: . . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . .. . . El presente estudio de pacientes portadores de AAF evidencia una funcio´n endotelial alterada como consecuencia de los incrementos de FvW, CEC y MP, marcadores circulantes de ˜ o endotelial. La elevada concentracio´n de CEC y disfuncio´n/dan FvW observada en estos pacientes esta´ de acuerdo con los resultados recientemente publicados en pacientes con SAF5. En nuestro estudio, el incremento de las CEC y MP se observa tanto en los pacientes diagnosticados de SAF como en los pacientes con AAF sin sı´ntomas. Este hecho puede corroborar la influencia de los AAF sobre la integridad del endotelio, produciendo un aumento de los valores de CEC y MP circulantes. Nuestros resultados muestran que la alteracio´n de la funcio´n endotelial observada esta´ asociada con un proceso de inflamacio´n presente en los pacientes, objetivado por el aumento de Fg y PCR, marcadores establecidos de inflamacio´n. Por otro lado, en el 66% de los pacientes se observa un nivel de Fg mayor de 312 mg/dl, valor establecido como punto de corte para accidentes cardiovasculares9. Todos estos pacientes con elevado nivel de Fg presentan, tambie´n, valores elevados del marcador plasma´tico de lisis de fibrina (DD). Estos resultados ponen de manifiesto que los pacientes portadores de AAF presentan una disfuncio´n endotelial mediada por un proceso de inflamacio´n, que, unido a la presencia de valores
Bibliografı´a 1. Giannakopoulos B, Passam F, Rahgozar S, Krilis SA. Current concepts on the pathogenesis of the antiphospholipid syndrome. Blood. 2007;109:422–30. 2. Ruiz-Irastorza G, Martinez-Berriotxoa A, Egurbide MV. The antiphospholipid syndrome in the 21st century. Med Clin (Barc). 2009;133:390–6. 3. Ruiz-Irastorza G. Diagnosis of antiphospholipid syndrome: More actors, same protagonists. Med Clin (Barc). 2010;134:445–7. 4. Alijotas-Reig J. The complement system as a main actor in the pathogenesis of obstetric antiphospholipid syndrome. Med Clin (Barc). 2010;134:30–4. 5. Pierangeli SS, Chen PP, Raschi E, Scurati S, Grossi C, Borghi MO, et al. Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome: pathogenic mechanisms. Semin Thromb Hemost. 2008;34:236–50. 6. De Angelis V, Scurati S, Raschi E, Liutkus A, Belot A, Borghi MO, et al. Proinflammatory genotype as a risk factor for aPL-associated thrombosis: Report of a family with multiple anti-phospholipid positive members. J Autoimmun. 2009;32:60–3. 7. Cugno M, Borghi MO, Lonati LM, Ghiadoni L, Gerosa M, Grossi C, et al. Patients with antiphospholipid syndrome display endothelial perturbation. J Autoimmun. 2010;34:105–10. 8. Woywodt A, Blann AD, Kirsch T, Erdbruegger U, Banzet N, Haubitz M, et al. Isolation and enumeration of circulating endothelial cells by immunomagnetic isolation: proposal of a definition and a consensus protocol. J Thromb Haemost. 2006;4:671–7. 9. Reganon E, Vila V, Ferrando F, Martı´nez-Sales V, Fayos L, Ruano M, et al. Elevated high molecular weight fibrinogen in plasma is predictive of coronary ischemic events after acute myocardial infarction. Thromb Haemost. 1999;82:1403–5.