Culture de protoplastes de mésophylle de Nicotiana alataLink et Otto haploide

Laboratoire de Biologie cellulaire, INRA, Versailles, France

Culture de protoplastes de mesophylle de N icotiana alata LINK et OTTO haploide Culture of Haploid Mesophyll Protoplasts from Nicotiana alata

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P. BOURGIN et C. MISSONIER

A vee 4 figures Re~u

Ie 19 octobre 1977 . Accepte Ie 7 novembre 1977

Summary Mesophyll protoplasts were isolated from leaves of haploid Nicotiana alata plants by a one step enzymatic procedure. Up to 60 Ofo of the protoplasts divided in a CaCl 2 enriched To medium (BOURG!N et aI., 1976). Bud differentiation from the calli obtained was induced on a modified MURASHIGE and SKOOG'S medium (1962) and observed after transfer to a medium deprived of any growth substance. Of 15 regenerated plants which were cytologically analyzed none was haploid; all of them were of mixed ploidy, displaying euploid and aneuploid chromosome numbers, either in the diploid (2n = 18), triploid (3n = 27) or tetraploid range (4n= 36).

Key words: Haploid protoplast, Nicotiana alata, plant regeneration.

Introduction L'isolement de plantes pn~sentant differents types de mutations a partir de cellules de Tabac cultivees in vitro a ete decrit ces dernieres annees (voir, par exemple, pour une revue, MALIGA, 1976). Mais Ie Tabac, Nicotiana tabacum, etant une espece amphidiplolde (2n = 48), ~ il est probable que pour un certain nombre de fonctions metaboliques essentielles des ceHules de Tabac haploide se com portent comme des ceHules diploldes (CARLSON,

1970).

a

Appreciant les qualites qu'offrent I'experimentateur les suspensions de protoplastes, nous avons entrepris de trans poser des plantes haploides produites a partir de certaines especes diploldes du genre Nicotiana, en particulier Nicotiana sylvestris (BOURGIN et aI., 1976), les techniques de preparation et de culture de protoplastes deja couramment utili sees dans Ie cas du Tabac (CHUPEAU et aI., 1974). Nous rapportans ici les premiers resultats obtenus a partir d'une plante haploide (n = 9) fJ 1!1 OJ de Nicotiana alata LINK et OTTO (2n = 18). II s'agit de I'une des especes diploYdes

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Fig. 13. Movement of the Lhe centres cenlIi of gravity of both feet in the gait without load in experiment II. II. (Right fool, black; black ; left foot, foot red)

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presentant Ie plus petit nomhre de chromosomes connu dans Ie genre Nicotiana. Du fait de son autoincompatihilite - qui peut etre surmontee par Ia technique de pollinisation des houtons (PANDEY, 1963) - elle a fait I'ohjet de nomhreuses etudes genetiques et physiologiques (voir par exemple NETTANCOURT et aI., 1975; GAS TEL, 1976).

Materiel et Methodes Materiel vegetal

Par culture d'antheres de plantes issues de graines de Nicotiana alata transmises par M. SCHILTZ (Institut Experimental du Tabac, F 24108-BERGERAc) nous avons obtenu plusieurs plantes haploldes et une plante diplolde. Quatre de ces plantes haploldes on ,he multipliees vegetativement par des fractionnements repetes sui vis de bouturages in vitro sur un milieu simple derive de celui de MURASHIGE et SKOOG (1962), (BOURGIN et MISSONIER, 1973), mais la plupart des experiences ont ete realisees avec des plantes d'un seul des clones ainsi etablis. Conformement aux indications de CHUPEAU et al. (1974) ces plantes ont ete cultivees dans des serres bien ombrees sur un melange de sable et de tourbe arrose regulierement d'une solution nutritive (Colc et LESAINT, 1971). Le nombre de chromosomes de ces plantes a ete contr81e periodiquement sur des pointes de racines. Lorsque des plantes diploldes, facilement reconnaissables a leurs feuilles plus larges, sont apparues au cours du processus de multiplication elles ont et~ mises a l'ecart. Les feuilles utilisees pour la preparation de protoplastes ont ete preIevees dans Ie tiers superieur des plantes. Preparation des protoplastes

La technique de maceration enzymatique utilisee a etc celIe dec rite par CHUPEAU et a1. (1974). Apres sterilisation des feuilIes, l'epiderme inferieur a ete enleve a l'aide de pinces et des fragments de feuilles ainsi prepares ont ete deposes a la surface de la solution de maceration decrite dans Ie tableau 1. Au bout de 15 a 18 heures de maceration les bohes de Petri contenant la solution ont ete agitees doucement a la main afin de liberer les protoplastes. La suspension de protoplastes ainsi obtenue a ete concentree par centrifugation a 100 g environ pendant 4 minutes; Ie surnageant etant ensuite enleve a la pipette, les protoplastes ont ete remis en suspension dans du milieu de rins:age. Selon les experiences les protoplastes ont ainsi ete soumis au total a deux ou trois centrifugations avant d'hre repris dans Ie milieu de culture final. Culture des protoplastes

Les protoplastes ont ete cultives par fractions de 3 ml dans des boites de Petri en polystyrene de 50 mm de diamerre, soit en milieu liquide, soit en milieu gelose contenant 0,6 Ofo d'agar, a une densite celIulaire initiale comprise entre 10 3 et 12.10 3 unites/m!. Les boites de Petri, scellees au Parafilm®, ont ete placees dans une salle de culture dont Ie degre hygrometrique etait maintenu entre 70 et 80 Ofo et la temperature entre 24 et 27°C. D'abord a l'obscurite pendant 48 a 72 h (ENZMANN-BECKER, 1973), eUes ont ere en suite soumises, raison de 16 h d'eclairage par jour, une intensite de 800 Ix pendant une semaine, puis ulterieurement de 2000 Ix. La composition du milieu de culture de base des protoplastes To est dec rite dans Ie tableau 1. Deux variantes de ce milieu, T1 et T 2 , ayant res:u en suppIement respectivement 1 gil et 2 gil de chlorure de calcium hydrate, ont egalement ete testees, ainsi qu'un milieu KA1 derive du milieu nO 3 de KAO (KAo et aI., 1974).

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T2 KA,

Induction du bourgeonnement (R4)

Dcveloppement des bourgeons et enracinement (B)

Tween 80 0,001 %3) Macroelements Macroelements de de MURASHIGE et Macroelements MURASHIGE et SKOOG 4 ) du milieu nO 3 SKOOG 4 ) dilues Macroe!ements de dilues de moitie de moitie de KAO et aJ.5) MURASHIGE et SKOOG 4 ) + CaCI2 , 2H2 0 (gil) 012 Microelements de HELLER 6 ), mais ou FeCI" est remplace par FeEDTA4) Vitamines de MOREL et WETMORE 7 ) Benzyladenine 1 mg/l Benzyladenine 1 mg/l Acide naphtalene-acetique 3 mg/l Acide indole-acetique 0,5 mg!l 20 gil 10 gil 20 gil 0, sauf indication 80 gil 80 gil, puis 60 gil 80 gil contraire dans Ie texte 6 gil o ou 6 gil 6 gil

Macroelements de MURASHIGE et SKOOG 4 ) dil ues de moi tie

Macerozyme R 10') 0,02% Cellulase Onozuka R10t) 0,1 0/" Driselase 2 ) 0,05 %

To

Culture

Yakult Biochemical Co, Ltd, 8-21 Shingikancho, Nishinomiya, Japan. Kyowa Hakko Co, Ltd, Ohtemachi Bldg., Ohtemachi, Chioyadaku, P.O. Box 5170, Tokyo International 100-31 Japan. CHUPEAU, Y. et aI., 1974: C.R. Acad. Sci., Paris, Ser. D, 278,1565-1568. MURASHIGE, T. and SKOOG, F., 1962: Physiol. Plant., 15, 473-497 . KAO, K. N. et aI., 1974: Planta, 120, 215-227. HELLER, R., 1953: Ann. Sc. nat. Bot. BioI. veg., 14, 1-223. MOREL, G. and WETMORE, R. H., 1951: Amer. J. Bot., 38,141-143.

Agar

Saccharose Mannitol

Microe!ements Vitamines Substances de croissance

Macroe!ements

Agent mouillant

Melange enzymatique

Preparation

Table 1: Composition of the media used for the isolation and culture of mesophyll protoplasts of haploid Nicotiana alata to the regeneration of plants.

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Tableau 1: Composition des milieux utilises pour la preparation de protoplastes de mesophylle de Nicotiana alata haploide, leur culture, et la regeneration de pI antes partir des colonies obtenues.

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Regeneration de plantes

Un mois et demi a trois mois apres la mise en culture de protoplastes, des colonies de de diametre prelevees dans des bohes a faible den site cellulaire ont ete repiquees sur Ie milieu R4 dont la composition est Mcrite dans Ie tableau 1, puis un mois et demi plus tard sur un milieu identique a R4 mais dont la teneur en mannitol avait ete ramenee a 6 Ofo. Apres un nouveau mois de culture sur ce milieu les colonies ont ete transferees sur Ie milieu B decrit dans Ie tableau 2 ou des variantes de ce milieu contenant 3 ou 6 % de mannitol. Les bourgeons apparus sur ce milieu ont ete repiques sur Ie m~me milieu B. Celles des plantules qui ont forme des racines ont ete ensuite transferees en pots et eIevees en serre en conditions non aseptiques.

a 3 mm

Cytologie

Le denombrement des dtromosomes a ete effectue sur des pointes de racines prelevees sur des plantes adultes. Apres un pretraitement d'une nuit a 4 °C dans une solution saturee d'a-dtloronaphthalene les pointes de racines ont ete fixees par un passage de 30 minutes dans l'acide acetique, transferees a deux reprises dans de l'hhanol a 90°, puis dans de l'ethanol a 70°, ou elles ont ete conservees a 4 °C si necessaire. Apres trois rin~ages a l'eau distillee les pointes de racines ont ete hydrolysees par un traitement de 12 minutes a 60°C dans de l'acide dtlorhydrique IN, ramollies par un passage de 30 minutes a temperature ambiante dans une solution a 1 Ofo de pectinase Rhozyme (don de Rohm and Haas, Philadelphia, PA 19105, USA), puis traitees pendant une heure par Ie reactif de Feulgen. Enfin elles ont ete transferees dans de l' eau distillee et ecrasees sous une lamelle apres addition d'une goutte de carmin acetique de Belling.

Resultats

a

Le nombre de protoplastes obtenus a varie selon les experiences de 5 9.10 5 par gramme de poids frais de feuille. L'elimination de l'epiderme inferieur s'etant souvent revelee techniquement difficile, Ie nombre total de protoplastes recueillis au cours d'une experience utilisant une douzaine de feuilles etait du m&me ordre de grandeur. Les tentatives de maceration de feuilles decoupees au scalpel en lanieres de 0,8 mm de largeur (DORION et aI., 1975) ou traitees au carborundum (BEIER et BRUENING, 1975) ont donne des resultats irreguliers. La sedimentation des protoplastes au cours des centrifugations s'effectuant assez mal lorsqu'ils etaient en suspension dans un milieu de culture dont la pression osmotique etait assuree essentiellement par Ie mannitol nous nous sommes inspires des observations de BINDING (1974) et nous avons teste l'efficacite comme milieu de rinpge d'un melange salin elabore par CHUPEAU (communication personnelle, tableau 2) partir des propositions de RUES INK et THIMANN (1966) et de KAMEYA et UCHIMIYA (1972). Avant la 1ere centrifugation un volume de cette solution egal celui de la solution de maceration etait ajoute cette derniere. Alors qu'apres deux centrifugations dans Ie milieu To Ie pourcentage de protoplastes recuperes oscillait entre 50 et 75 Ofo de la population de protoplastes initiale ce pourcentage avoisinait 100 quand les protoplastes avaient ete centrifuges en suspension dans Ie melange salin. Toutefois, lors des experiences port ant sur la comparaison de differents milieux de culture, les centrifugations n'ont pas ete realisees dans Ie melange salin mais dans les milieux de culture respectifs.

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Tableau 2: Composition du milieu salin utilise pour Ie rins:age des protoplastes. Table 2: Composition of the saline medium used for washing the protoplasts. 2 gil 25 gil

CaCl t ,2H t O KCI

Figures 1-4: Plant regeneration from haploid Nicotiana alata protoplasts. Fig. 1: Freshly isolated mesophyll protoplasts.

Fig. 2: Cell colonies regenerated from protoplasts after 5 days of culture in liquid medium.

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Fig. 3: Bud regenerated from a protoplast-derived callus (6 months). Les premIeres divisions des ceHules regenerees a partir des protoplastes ont ete observees des Ie 3eme jour de culture en milieu Iiquide et des Ie 4eme ou 5eme jour en milieu gelose. Le pourcentage de protoplastes ayant regen ere une colonie cellulaire au bout de deux semaines de culture dans Ie milieu To gelose a varie selon les experiences, entre 5 et 15010 (les limites extr&mes etant respectivement 0,5 et 25%). En milieu liquide To, en revanche, ce pourcentage etait generalement de l'ordre de 1010. L'addition de calcium au milieu To a permis d'augmenter considerablement ce pourcentage comme Ie montre, par exemple, l'experience dont les resultats sont rapportes dans Ie tableau 3. Lors d'autres experiences, Ie milieu KAI a permis d'obtenir des pourcentages compris entre 45 et 60 % quand ces pourcentages variaient entre 30 et 40010 sur Ie milieu T 1 • Les resultats rapportes dans Ie tableau 3 illustrent egalement l'effet de la concentration initiale en protoplastes sur Ie pourcentage de divisions, la concentration optimale paraissant se situer entre 2 et 8.10 3 protoplastes/ml. Enfin il faut noter que des les premiers jours de culture des colonies cellulaires se sont necrosees, dans une proportion ayant atteint environ 50 % en quinze jours lors de certaines experiences. La differenciation de bourgeons n'a ete observee qu'exceptionnellement sur Ies cals formes apres repiquage des colonies sur Ie milieu R4 dont la teneur en substances de croissance permet la neoformation de bourgeons a partir de cals de Nicotiana Z. PJlanzenphysiol. Bd. 87. S. 55-64. 1978.

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Fig. 4: Flowering mixoploid plant (18, 19, 20) regenerated from mesophyll protoplast (10 months).

Tableau 3: Effet de la concentration en calcium du milieu de culture (liquide) sur Ie pourcentage de protoplastes rcgcnerant une colonie. Table 3: Cell colony forming ability of protoplasts CaCle levels.

+ CaCI 2,2HP + CaCl z, 2H zO

liquid culture media with different Pourcentage de protoplastes ayant n!gem!re une colonie Densite cellulaire initiale (X 10 6 protoplaste/ml) 3 6 12

Concentration finale en CaCl 2 (mM)

Milieu de culture To Tl (To T, (To

In

1 gil) 2 gil)

o

1,5 8,3 15,1

16

o 28

10 7

tabacum ou de Nicotiana sylvestris (BOURGIN et al., 1976). L'abaissement a 100 ,ug/l de la concentration en benzyladenine du milieu R4 ou Ie remplacement de la benzyladenine par la zeatine n'ont pas modifie la frequence de ce processus. Ce n'est qu'apres Ie transfert des cals sur Ie milieu B depourvu de substances de croissance que des bourgeons ont ete obtenus regulierement partir des cals, mais dans une

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proportion qui est restee faible, de I'ordre de 10 it 20 % pour les milieux B contenant 3 ou 6 % de mannitol qui assuraient la meilleure reprise des cals apres leur transfert. L'enracinement des bourgeons apres repiquage sur Ie milieu B n'a ete obtenu que dans un cas sur deux et I'addition it ce milieu d'acide indole acetique it raison de 100 fig/I n'a pas permis d'augmenter cette proportion. Les plantules racinees transferees en serre se sont developpees normalement jusqu'it floraison. Sur 15 plantes issues de 4 experiences differentes et soumises it une analyse cytologique aucune n'etait haploide; elles etaient toutes mixoploides avec des nombres de chromosomes etales autour des valeurs des complements diploide (2 n 18), triploide (3n = 27) ou tetraploide (4n = 36). Discussion Aucune des plantes regenerees n'etant haplolde, on ne peut exclure, en toute rigueur, qu'elles aient pour origine soit des cellules de feuilles non haploides (BENNIeI et aI., 1968; NETTANCOURT et aI., 1971), soit plut6t des protoplastes proven ant des fusions spontanees qui se produisent durant la maceration enzymatique (WITHERS et COCKING, 1972), et dont Ie pourcentage a atteint 15 Ofo lors de certaines experiences. II no us parah cependant plus probable que Ie nombre eleve de chromosomes des pi antes regenerees et leur constitution mixoploide sont dus des phenomenes d'endomitose et autres aberrations de la division cellulaire dont les consequences ont ete frequemment decrites chez les plantes regenerees it partir de tis sus cultives in vitro, en particulier dans Ie cas du Tabac, Nicotiana tabacum (par exemple: OGURA, 1976; NOVAK et VYSKOT, 1975). II semble, en eHet, que la ten dance it l'endopolyploidisation des cellules de N. alata en culture in vitro soit particulierement forte: si NISHIYAMA et TAIRA (1966) n'ont trouve que des plantes diploides et une plante trisomique parmi les plantes regenerees it partir de tissus de moe1le de N. alata diploide partir de fragments de cultives in vitro, les plantes obtenues par NITSCH (1962) petioles de N. alata haploide etaient diploides. De notre c6te nous avons observe deux plantes diploides et une plante tetraploide parmi trois pi antes regenerees it partir de fragments de feuilles de N. alata haploide et les plantes que nous avons rcgenerees partir de protoplastes de N. alata diploides ont presente des nombres de chromosomes variant autour des valeurs des complements diploide (2n = 18) ou tetraploide (4n = 36) de cette espece (resultats non publies). Malgre les reserves mentionnees plus haut sur l'origine des pi antes regenerees, les resultats obtenus dans la culture des protoplastes de N. alata haploide et la regeneration de pi antes it partir de ces protoplastes nous semblent indiquer qu'un tel systeme pourrait constituer un modele interessant en genetique cellulaire vegetale. S'il parah difficile de remedier au handicap technique que constitue pour la preparation rapide de populations cellulaires nombreuses Ie relativement petit nombre de cellules dis ponible par feuille, on peut, en revanche, envisager de remedier it certains des defauts des techniques decrites:

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a) en reduisant la proportion de fusions spontanees par une preplasmolyse precedant la maceration enzymatique (FREARSON et aI., 1973); b) en ameliorant encore les conditions de culture des protoplastes de fa~on it eviter que les taux de division tout it fait satisfaisants obtenus sur les meilleurs milieux ne soient compromis par 1a necrose d'une partie des colonies cellulaires ainsi formees; c) en recherchant si une reduction de la concentration en substances de croissance compatible avec I'induction de la division des protoplastes et de la regeneration de bourgeons permet de diminuer la proportion de genotypes polyploides et aneuplo·ides parmi les plantes regenerees (N JIZEKI, 1974; BROSSARD, 1976). Remerciemen ts NollS remercions, M. GOUJAUD qui a eleve les pi antes avec competence, Mme Y. CAUDERON et M. G. GAY dont les conseils ont ete precieux pour les analyses cytologiques, Mme D. Bur DANG HA, M. M. Y. CHUPEAU et M. DEVREUX avec qui nous avons eu d'interessantes discussions it propos de la realisation de ce travail, Ie CNRS qui nous a aides financierement (ATP nO A 651-2610).

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