Dosage fluorimetrique de la bilirubine

CLINICA CHIMICA ACTA

DOSAGE

Laboratoive (RCCU

FLUORIMETRIQUE

Centval de l’Ho^pital Cantonal

lc.jma

DE LA BILIRUBINE

Uiniversitazre,

GenBue (Suzssr)

1967)

SUMMARY Fhorimetric

Assay of Bilirubin

A simple and sensitive assay of total bilirubin in serum is presented. 50 yl serum are mixed with 0.6 ml H,PO, 85%, 3 ml water are added after I min or more and the fluorescence is measured in a filter fluorimeter. Maximum excitation and fluorescence wavelengths are 435 and 500 nm respectively. Blanks are made by mixing serum and water first, and then adding H,PO,. The method shows good correlation with the usual diazo-coupling method. It is highly precise, even in the normal range, and specific. The presence of albumin is necessary for the intensification of fluorescence; serum samples containing more than IIO mg/l bilirubin are diluted with a 6$/, solution of bovine albumin. The assay has also been adapted to urine: 50 ~1 urine are mixed with 50 ~1 6’$/, albumin solution and 0.6 ml H,PO, 85%; after I min or more, 3 ml of water are added and the fluorescence is measured. Blanks are made as above. Values for total bilirubin in the serum of 36 healthy individuals ranged from 3.5 to 9.9 mg/l.

Lors d’investigations initialement consacrees au dosage de faibles quantites d’hemoglobine, nous avons constate que la bilirubine, en presence de concentrations appropriees d’albumine et d’ions Hf, se transforme en une forme fluorescente. L’Ctude plus approfondie de cette propriete nous a conduit a la mise au point d’une methode de dosage fluorimetrique de la bilirubine totale dans le serum et dans l’urine, methode que nous decrivons ci-apres. Par rapport aux techniques colorimetriques courantes, elle offre l’avantage de la simplicite, d’une bonne reproductibilite et d’une grande sensibilite.

Riactifs utilisb Bilirubine

(Merck), acide phosphorique 85 “/o (D = 1.71)pour analyse (Merck), cristallisee (British Drug Houses), ovalbumine (Riedel de Haen). Soldio-tz d’albumine bovine d 6%: 60 g/l dans une solution de NaCl a 9 g/l. halon de bilirubine (IOO mg/l): I mg de bilirubine est agite a l’obscurite avec

albumine

bovine

Clin.

Chim.

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JSS

0.2 ml de NaOH 0.05 h:. Apres environ 6 min, la dissolution est complete. On ajoute alors 9.6 ml de solution d’albumine bovine a 6:/o, melange, ajoute 0.2 ml de HCl 0.05 N et melange & nouveau. Congelee a -20°, cette solution est stable au moins trois mois. Les riisultats obtenus avec cet &talon etaient en accord avec ceux don&s par une preparation commerciale (Bilirubin Control Dade).

Les mesures fluorimetriques sont effectuees avec un fluorimetre a tiltres (Photovolt, modele 540) equip6 d’une lampe a vapeur de mercure Q haute pression (No. cat. 4251). Le filtre primaire est un filtre M 420 (No. cat. 4161, bande passante 400~440 nm) et le filtre secondaire, un filtre Corning CS 3-71. La fluorescence est mesuree par rapport 8. une solution-etalon d’acridine orange & I pg/ml dans le dimethylformamide, ajustee a la valeur IOO (stable I h; on la prepare a partir d’une solution-stock a IOO pg/ml dans H,O). Les spectres de fluorescence ont ete enregistres avec un spectrofluorimetre Farrand. CARACTERISTIQUESDE LA REACTION Si l’on melange du serum riche en bilirubine avec un volume triple de H,SO, concentre (D = 1.84) et dilue une partie du melange obtenu avec 14 parties d’eau, on obtient une solution fluorescente. L’examen spectrofluorimetrique montre que les maxima d’excitation et de fluorescence se situent respectivement a 435 nm et 500 nm. La solution se trouble par suite de la precipitation de proteines, mais cet inconvenient ne se produit pas si l’on remplace l’acide sulfurique par une quantite appropriee d’acide orthophosphorique. La Fig. I. montre l’intensite de fluorescence en fonction de la quantite d’acide phosphorique ajoutee. Un rapport entre le serum et l’acide phosphorique 857; de

I

1

0.2

,

0.4

0.6

ml

0.6 H,PO,

1.0

1.2

1.4

16

1.8

2.0

85V.

Fig. I. Tnfluencc de la quantiti: d’acide phosphorique. 50 ,ul de sdrum contenant 33 mg/l de bllirubine totale sont meYang& avec des qua&it& variables de HJ’O, 85q;, puis Ic volume cst complCt& B 3.5 ml par H,O. l fluorescence (unit& arbitraires), 3 pH de la solution finale. Clin. Chinr. .4cta,

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l’ordre de I : 12 donne les fluorescences les plus fortes. Le pH de la solution (0.6) n’est cependant pas le pH optimum pour la fluorescence du produit forme. Si on amenait ensuite le pH Q 3 par addition de soude caustique, on se placerait dans les conditions de fluorescence maximum; toutefois, on provoquerait en m&me temps une precipitation de proteines. Pour cette raison, nous avons prefer+ diluer le melange serum-acide phosphorique avec de l’eau. On obtient ainsi 609/~ de l’intensite de fluorescence que l’on aurait a pH 3. La presence de proteines dans la solution est determinante pour la production d’une fluorescence. A pH 0.6, en I’absence de proteines, une solution a 6pug/ml de bilirubine n’est que tres faiblement Auorescente. En presence de serumalbumine humaine ou bovine ou d’ovalbumine (0.8 mg/ml), par contre, sa fluorescence est plus de 60 fois plus intense. 11 s’agit probablement d’une liaison entre la proteine et la bilirubine, Its molecules de cette derniere se trouvant alors stabilisees sous une forme fluorescente. On connait d’autres exemples de molecules qui deviennent fluorescentes en presence d’albumine1-4.

I

4

40

80 Bilirubine

120 (mgjl

160

200

I

Fig. 2. Fluorescence en fonction de la quantitg de bilirubine. o, IO, LO, 30, 40 et 50 ,ul de sirurn-test Dade (contenant zoo mg/l de bilirubine) sont complCtCs A un volume total de 50 pl avec un &rum normal. On ajoute 0.6 ml de H,PO, 85%. mklange et dilue par 2.85 ml d’eau. Pour le calcul des taux de bilirubine, on n’a pas tenu compte de la teneur en bilirubine du s&urn normal utilis~.

Un pH fortement acide est necessaire a la formation d’un compose de bilirubine et d’albumine fluorescent. Ce compose une fois forme est relativement stable. L’intensite de fluorescence est proportionnelle a la concentration de bilirubine pour autant que le taux de celle-ci dans le serum ne depasse pas IIO mg/l, et que le serum n’ait pas un taux d’albumine inferieur B la normale. La Fig. z montre l’intensite de fluorescence en fonction de la quantite de bilirubine ajoutee a du serum normal. Au-dessus de 120 mg/l, le rapport entre l’intensite de fluorescence et la concentration cesse d’etre constant; il diminue, ce qui indique que les proteines sont saturees de bilirubine. La formation d’une fluorescence est relativement specifique de la bilirubine. Une preparation de biliverdine (Fluka) a donne 6:/, de la fluorescence obtenue avec la bilirubine, tandis que le cholesterol et l’hemoglobine n’en donnaient pratiquement aucune. Les essais decrits plus loin montrent que la bilirubine conjuguee reagit comme la bilirubine libre, de sorte que la methode fournit une mesure de la bilirubine totale. Clin.

Chirn.

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Si on laisse un serum riche en bilirubine expose a la lumiere, il perd peu a peu sa couleur jaune, ainsi que sa reactivite a l’egard de l’acide sulfanilique diazote; par contre, la reaction de fluorescence subsiste, livrant une fluorescence legerement plus forte. I1 est probable que les produits de photooxydation de la bilirubine donnent egalement

la reaction

fluorigene.

MtiTHOl)ES

En nous fondant sur les resultats des experiences precedentes, nous avons Ctabli les methodes pour le dosage fluorimetrique de la bilirubine dans le serum et l’urine d&rites Dosage

ci-dessous. de la bilirubi~ze dam

le s&urn

Dans une eprouvette, mettre 50 ,ul de serum et 0.6 ml d’acide phosphorique 85(:/b; melanger et laisser I min, ou davantage; ajouter 3 ml d’eau distillee, melanger et mesurer la fluorescence, qui reste stable pendant I h. Un blanc est prepare de la man&e suivante: dans une eprouvette, melanger 50 ~1 de serum avec 3 ml d’eau distill&e; ajouter

0.6 ml d’acide phosphorique

85?:,,

melanger

et lire la fluorescence.

La valeur du blanc variant peu d’un individu a l’autre, on peut, pour le travail de routine, ne preparer qu’un blanc par serie de dosages. Dans chaque serie d’echantillons on incorpore un serum-Ctalon contenant entre 40 et IIO mg/l de bilirubine. Le fluorimetre peut Ctre regle par rapport a cet etalon et son blanc, ou par rapport a une solution d’acridine orange. Les serums contenant plus de IIO mg/l de bilirubine seront dilues cinq fois avec une solution d’albumine bovine a 6%. Avant d’etre doses, les Cchantillons de serum peuvcnt etre conserves au moins un jour a temperature ordinaire et au moins une semaine a +4’. Le dosage est egalement possible avec 20 ~1 de serum; dans ce cas, on melangera avec 0.25 ml de H,PO,

85% et diluera avec 3 ml d’eau.

Dosage

l’urine melanger

de la bilirubine dam Dans une eprouvette,

50 ~1 d’urine, 50 ,ul de solution d’albumine bovine a 60/, et 0.6 ml de H,PO, 85Sb; apres une minute ou davantage, ajouter 3 ml d’eau, melanger et mesurer la fluorescence dans l’heure qui suit. On prepare un blanc pour chaque urine. Pour cela, on melange l’urine, la solution d’albumine et l’eau et ajoute ensuite l’acide phosphorique au melange. Dans chaque serie, on inclut un etalon constitue par un melange de 50 ~1 d’eau, 50 ~1 de serum-etalon et 0.6 ml de H,PO, 8596, melange que l’on dilue comme cidessus par 3 ml d’eau. Les urines tres riches en bilirubine taux soit inferieur B II0 mg/l.

seront

diluecs avec de l’eau afin que leur

La methode fluorimetrique de dosage dans le serum a etC comparee avec une methode colorimetrique, selon Jendrassik et Grofj, modifiee par Michatlsson6. Un ensemble de 96 serums provenant de patients de 1’Hopital et presentant des taux de bilirubine totale s’etendant de 1.5 B 220 g/l a fourni des resultats montrant une excel-

UOSAGE

DE LA BILIRUBINE

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l&e correlation entre les valeurs obtenues par fluorim~trie et Ies taux de bilirubin~ totale mesure par colorimetrie (coefficient de corr&ation I = 0.96). II n’y a pas de correlation avec les taux de bilirubine directe. La correlation avec les taux de bilirubine totale s’observe aussi bien avec des serums riches en bilirubine libre (prematures icteriques) yu’avec des serums riches en bilirubine directe (icteres par obstruction), ce qui indique que la reaction de fluorescence s’applique tant ri la bilirubine libre qu’& ses glucuronoconjugu~s. La reproductibilite, pour un serum normal, est meilleure que & zDj. Dam le but d’etablir les valeurs normales de la methode, nous avons effectui: le dosage sur 36 serums de personnes saines. La moyenne des resultats obtenus fut de 6.1 mg/l avec une deviation standard de & 1.85 mg/l; la valeur la plus basse fut de 3.5 mg/l et la plus ClevCe de 9.9 mgjl. Le dosage dans I’urine a donne des valeurs nettement ClevCes chaque fois que la reaction & l’iode Ctait positive. Le dosage d’urines normales ne presente pas de difficult&; des Cchantillons provenant de 41 sujets normaux ont donne des valeurs situ&es entre 8 et 105 mg/l.

Parmi les dosages courants de la chimie clinique, celui de la bilirubine est l’un de ceux qui posent encore de strieux problemes, notamment en ce qui concerne l’etalonnage, la reproductibilite et la sensibilite. Les methodes basees sur la reaction de Hijmans van den Bergh7, qui sont les plus utilisees, souffrent d’un certain manque de simplicite. La reaction de fluorescence que nous detrivons a le merite de permettre un dosage simple, sensible et p&is de la bilirubine dans le serum. La precision est particulierement appreciable pour la mise en evidence de bilirubinemies qui ne sont que legerement augment&es par rapport 5. la normale. 11 est m&me possible de detecter des hypobilirubinCmies. Actuellement, la methode ne permet malheureusement pas le dosage di~~rentiel des bilirubines libre et conjuguee. On sait que l’urine ne contient que de la bilirubine conjuguee. La methode fluorimetrique appliquee a l’urine permet un dosage de la bilirubinurie si simple et en m&me temps si precis que son utilisation pour le diagnostic des icthes par obstruction se justifie. Elle n’exige en effet guere plus de temps que les tests qualitatifs sommaires genbalement utilises. Une caracteristique de la reaction est la necessite de la presence d’albumine dans le melange initial. Nous proposons l’utilisation d’albumine bovine a 67; pour diluer les serums trop riches en bilirubine. L’exaltation de fluorescence est alors la m&me que celle produite par une concentration normale de proteines seriques. L’ovalbumine a 10% (P/V) fournit des fluorescences plus intenses. On peut l’utiliser pour le dosage dans l’urine, mais now preferons employer l’albumine bovine B 6%, de maniere B n’avoir qu’un seul reactif et un seul Ctalon pour le serum et I’urine. REMERCIEMENT

Je remercie

Mademoiselle

S. Wiederhold

de sa devouee et efficace collaboration.

C&t.

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L’auteur presente une methode fluorimetrique simple et sensible pour le dosage de la bilirubine totale dans le serum et l’urine. On melange 50 ,~l de serum avec 0.6 ml de H,PO, 85%; apr&s I min ou davantage, on ajoute 3 ml d’eau, melange et mesure la fluorescence avec un fluorimetre a filtres. Les longueurs d’onde donnant le maximum de fluorescence sont de 435 nm pour l’excitation et de 500 nm pour l’emission. Pour preparer le blanc, on melange d’abord le serum et l’eau, puis on ajoute H,PO,. La correlation entre cette methode et la methode colorimetrique courante par diazoreaction est bonne. La precision est excellente, m&me dans la zone des valeurs normales. La methode est specifique de la bilirubine. La presence d’albumine est necessaire a la production d’une fluorescence; les echantillons de serum contenant plus de IIO mg/l de bilirubine sont dilues avec une solution a 6% d’albumine bovine. Le dosage est irgalement applicable a l’urine: 50 ,ul d’urine sont melanges avec 50 ~1 de solution a 60/6 d’albumine et 0.6 ml de H,PO, 85%; apres I min ou plus, on ajoute 3 ml d’eau, melange et mesure la fluorescence. Les blancs sont prepares comme plus haut. Les valeurs obtenues avec cette methode pour la bilirubine totale chez 36 sujects normaux se situent entre 3.5 et 9.9 mg/l. 13IBLlOGIIAPHlE I J, J. HETHEIL, H. \V. JOHNSTON ET J. II.SCHLEGEL, Fedwafio~zProc., IL (1953) 1.5 L G. \VEBER ET 1).J, I<.LAURENCE, Biochem. J., 56 (1954) xxxi. 3 V. H. KEES, J. E. FILDES ET I).J. Ii.LAUREKCE, j. Clin.Pathol.,7 (1954) .i'O. 1 J. J. BETHEIL, Anal. Chm., 32 (1960) 560. 5 I,. JENDRASSIK ET P. GROF, Biochem. Z., 297 (1938) 81. 6 M. MICHA~LSSON, Scazd. J. Clin. Lab. Invest., 13 (1961) SuppI. 56, 46. 7 .I. .A. HIJRIANS VAN DEN BERGH ET P. MULLER, Biochem. Z., 77 (1916) 90. Clzn. Chin?. Acta,

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