Etude de la phospholipase A2 de la membrane cytoplasmique de l'adipocyte

BIOCHIMIE, 1977, 59, 115-118.

Etude de la phospholipase de la membrane cytoplasmique de l'adipocyte. C. W O L F , O. COLARD~TORQUEBIAU, G. BEREZtAT et J. POLONOVSKI Q. C.H.U. Saint-Antoine, Laboratoire de Bioehimie. 27, rue Chaligny - - 75012 Paris.

(25-11-1976).

I --

II - - M A T E R I E L E T M E T H O D E S .

INTRODUCTION.

Les t r a v a u x de R o d b e l l [1] et B l e e h e r [2, 3] o n t m o n t r 6 l'effet ¢ i n s u l i n - l i k e ~> de d i f f 6 r e n t e s p h o s p h o l i p a s e s s u r les a d i p o c y t e s e n t i e r s .

1 °) Prdparation des membranes d'adipocytes. La m 6 t h o d e de f r a c t i o n n e m e n t u t i l i s 6 e e s t a d a p t 6 e de L. J a r r e t t [7]. Le proe6d~ d ' h o m o g 6 n 6 i s a t i o n d~ tissu adipeux entier qui permet d'obtenir les rendem e n t s l e s p l u s 61ev6s e n m e m b r a n e s est le s u i v a n t ( c o m m u n i c a t i o n p e r s o n n e l l e de J. P. G i a c o b i n o ) : le t i s s u a d i p e u x 6 p i d i d y m a i r e de r a t m,file W i s t a r p e s a n t e n t r e 200 et 250 g e s t ~ m i n c 6 a u e i s e a u , i n c u b 6 e n p r e s e n c e d ' i n s u l i n e d a n s les c o n d i t i o n s d 6 e r i t e s p l u s b a s , s'il y a l i e u , p u i s p r e s s d avee le d o i g t h t r a v e r s u n t i s s a de soie n ° 12 ( D u r i e u x ) . L'homog~n$isation est ensuite eompldt~e par 3 passages dans un appareil Potter (Teflon/Verre clearance 0 , 1 5 - 0 , 2 3 , 1800 r p m ) . L e s ~ t a p e s de e e n t r i f u g a t i o n d i f f ~ r e n t i e l l e et ee]le de c e n t r i f u g a t i o n i s o p y e n i q u e s u r g r a d i e n t de Fieoll s o n t i d e n l i q u e s h eelles d ~ e r i t e s p a r L. J a r r e t t . C e p e n d a n t ]e r e n d e m e n t e n p r o t f i n e s

R S c e m m e n t , les c o n n a i s s a n e e s s u r l'effet m e m b r a n a i r e de l ' i n s u l i n e o n t 6t6 e n r i e h i e s p a r 2 o r d r e s de fait : I °) ]es o b s e r v a t i o n s e n m i c r o s e o p i e 6 1 e e t r o n i q u e p a r la t e c h n i q u e de c r y o d 6 c a p a g e , o n t m o n t r 6 a n a e e r o i s sement du nombre des granules intramembranaires darts les m e m b r a n e s c y t o p l a s m i q u e s d ' a d i p o c y t e s i n e u b6s e n p r 6 s e n e e d ' i n s u l i n e [41. 2 °) l'ATPase-M,g ÷~ d ~ p e n d a n t e d e s m e m b r a n e s p l a s m i q u e s d ' a d i p o c y t e s est activ6e p a r l ' i n s u l i n e [5]. N o u s a v o n s donc c h e r c h 6 h m e t t r e e n ~videnee, u n e a e t i v i t 6 p h o s p h o l i p a s i q u e de t y p e A, a n s e i n m ~ m e de

TABLEAU I. Activitds enzymaiiques des fractions sabcellulaires d'adipocytes.

Fraction

Succinodeshydrog6- [ oase (nanomoles ] de eytoehrome c r6duil / m n / m g proteine)

5' aucl6otidase (nanomoles de P lib6r6es/mu/mg proteine)

NADH-eytoehrome e r~duetase rol6nouer6sistante

I

240

200

!-

95

920

! Membranes

40

M i c r o s o m e s (a) (*)

ND

Mitoehondrics

360

ND

ND

Homogfinat (surnag e a n t 1300 g: 20 nan)

ND

40

115

ND : n o n d e t e r m i n f i . (*) (a) : les m i e r o s o m e s p u r i f i 6 s s o n t p r 6 p a r ~ s a p r 6 s e h o c o s m o t i q u e p a r la t e 6 h n i q u e de G i a e o b i n o et al. [13]. L e s e n z y m e s m a r q u e u r s s o n t d o s 6 s p a r la t e e h n i q u e de D i x o n ~141 p o u r la 5 ' n u c l 6 o t i d a s e , de S o t t o c a s a [15] p o u r la s u c c i n a t e - c y t o c h r o m e c r ~ d u c t a s e , de M a e k l e r [8] p o u r l a N A D H 2 - e y t o e h r o m e e r 6 d u c t a s e en p r 6 s e n c e de r o t ~ n o n e ( S i g m a : 30 ~tg e n s o l u t i o n ~ t h a n o l i q u e ) .

la m e m b r a n e c y t o p l a s m i q u e de l ' a d i p o e y t e , et h dfitect e r u n e d v e n t u e l l e a c t i o n de l ' i n s u l i n e s u r eette a c t i vit6, les g r a n u l e s i n t r a m e m b r a n a i r e s 6tant souvent c o n s i d 6 r 6 s c o m r n e d e s e n s e m b l e s de p r o t 6 i n e s i n t r i n s6ques duns lesqnels on trouve eertaines aetivit6s e n z y m a t i q u e s r.6]. ,~ A qui t o u t e c o r r e s p o n d a n c e doit ~tJe a d r e s s g e .

m e m b r a n a i r e s ~ t a n t de l ' o r d r e de 1 m g p o u r 5 r a t s , les q u a n t i t ~ s de m a t e r i e l s o n t r ~ d u i t e s et f i n a l e m e n t la c e n t r i f u g a t i o n d a n s a n r o t o r S W 25:1 de g r a n d e c a p a cit6 e s t r e m p l a e ~ e p a r u n e c e n t r i f u g a t i o n de 45 m i n u t e s h 2 5 0 0 0 r p m d a n s u n r o t o r S~,V 39 s u r u n g r a d i e n t d i s c o n t i n u e o n s t i t u 6 p a r 2 m l de Ficoll 15 p: c e n t et 2 m l de Ficoll 9 p. c e n t d a n s s u c r o s e 0,25 M --- T r i s HC1 10 m M - - E D T A 1 m M p H 7,4 ( m i l i e u I).

116

C. W o l f

Le tableau I r6sume la d i s t r i b u t i o n des enzymes m a r q u e u s e s : 5'nucl6otidase, succinodeshydrog6nase, NADH-cytoehrome c r6ductase dos6e en pr6sence de rot6none. 2 °) Dosage de l'activit~ phospholipasique A1 ei A~. La pr6paration d'uu s u b s t r a t radioactif de haute activit6 sp6cifique (4,3 ~Ci/.~mole) n6cessaire h une bonne pr6cision des mesures, est effectu6e par une technique d6riv6e de celle de Waite, M. et al. [9]. Ceci p e r m e t d ' o b t e n i r une p h o s p h a t i d y l c h o l i n e marqu6e en p o s i t i o n 2 par l'acide linol6ique [1-14C] avec une sp6cificit6 de 90 p. cent (v6rifi6e par l ' h y d r o l y s e par du venin de Crotalus adamantens (Sigma)). La p h o s p h a t i d y l 4 t h a n o l a m i n e est ensuite pr6par6e par t r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o n selon la technique de Yaug et al. [10]. Ce s u b s t r a t est ntilis6 sous f o r m e d'une microdispersion obtenue par u l t r a s o n a t i o n p e n d a n t 1 m i n u t e envir o n en pr6sence d'une quantit6 6quimol6culaire de d6soxycholate de sodium, dont on 4tablit qu'il n ' i n h i b e pas l'activit6 p h o s p h o l i p a s i q u e Ao. Les incubations sont r6alis6es duns un b a i n - m a r i e h 37°C avec agitation. La r~action est initi6e par a d d i t i o n de l ' e n z y m e et stopp6e p a r 4 ml de c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l ( 2 / 1 : v/v) pour un volume de 250 i~1 d'incubation. Les produits de la r4action e n z y m a t i q u e sour ensuite e x t r a i t s et s6par6s selon la technique d6erite p a r Gullis [11]. Les spots c h r o m a t o g r a p h i q u e s sont mis en 4vidence, soit par l'iode et la n i n h y d r i n e , soit par autoradiographic. Apr~s grattage, ils sont compt6s par scintillation dans le m61ange P P O / P O P O P / t o l u ~ n e (5 g/0,3 g/ 1 litre toluene). Les r6sultats sont exprim6s p a r la p r o p o r t i o n de radioactivit6 lib6r6e sous f o r m e d'acide gras (phospholipase Ao) et par la p r o p o r t i o n de radioactivit6 lib4r6e sous f o r m e de lysod6riv6s (phospholipase A1). I1 nous semble que cette mani~re d ' e x p r i m e r les r6sultats soit ]a plus pr6cise possible darts la mesure off nous m o n t r o n s que, dans ies conditions off les incubations sont effectu6es il n'y a aucune activit6 lysop h o s p h o l i p a s i q u e c o n t a m i n a n t e (d4montr6e en incub a n t les m e m b r a n e s avec la l[1-14C]-sf6aroyl-lysop h o s p h a t i d y l 6 t b a n o l a m i n e purifi6e, aussi bien en l'absenee qu'en pr6sence de d6soxycholate d e sodium). P o u r 6tudier l'action de l'insuline in vivo, on ineube 45 m i n u t e s ~t ~7°C des moreeaux 4min~6s de tissu adipeux dans un milieu Krebs-Ringer b i c a r b o n a t e pH 7,4 additionn6 de 2 p. cent (p/v) de s 6 r u m a l b u m i n e bovine (fraction V : Sigma) et de glucose (3 m g / m l ) pr6alab l e m e n t gaz6 par 02 92 p. cent-CO._. 5 p. cent p e n d a n t 10 m i n u t e s [4]. L'insuline (insuline eristallis6e de bceuf : Sigma) est additionn6e darts les fioles d'incub a t i o n en solution duns le milieu Krebs-Ringer an t e m p s z6ro.

et coll. m e m b r a n e s p l a s m a t i q u e s de l'h6patocyte [12]. La figure 4 m o n t r e un pH o p t i m u m d'action h 8,5. La cin6tique e n z y m a t i q u e en fonction de la concentration en s u b s t r a t (figure 5) m o n t r e que la vitesse m a x i m u m d ' a t t a q u e d n s u b s t r a t est atteinte pour une concentration de 90 ~xM environ.

cpm ac- gras 5

1.

i

50

100

145

200

[.,p.

Fro. 1.

Actioitd phospholipasique A, en ]ouction de centration en protdines membranaires : CaCle NaC1 0,1 M, Tris HC1 50 mM pH 8,5, 1 aeyl-2 l i n o l e y l p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e (32 l~tM) final 250 i~l : incubation 15 m n ~ 37°C. cprn ac.~]ras cpm totaux

la con5 raM, El14C] volume

(%}

25.

./

20.

15_

10.

/

III. - - RESULTATS. Les figures 1 et 2 m o n t r e n t la lin6arit6 de la lib6ration d'aeides gras en fonction de la concentration en prot6ine m e m b r a n a i r e et en fonction du temps d'ineubation, j u s q u ' h respectivement, 0,8 m g / m l de prot6ine et 40 minutes. La f o r m a t i o n de lysod6riv6s radioaetifs, c o r r e s p o n d a n t h une aetivit6 p h o s p h o l i p a sique AD est faible dans les conditions oft les incubations sont r6alis6es (de l'ordre de 0,2 n a n o m o l e s / m g prot6ine m e m b r a n a i r e / m n ) . On s'est done surtout attach6 ici ~ caraet4riser l'activit6 p h o s p h o l i p a s i q u e A~, les conditions f a v o r i s a n t l'activit6 A~ r e s t a n t h d6terminer. La phospbolipase Ae m e m b r a n a i r e est d6pendante de la pr6sence de Ca ++ (figure 3) comme celle des BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 1.

i

10

i

20

•

30

40

mn

FIe,. 2.

Actioitd phospholipasique A~ en fonction du temps d'incubation : CaCl2 5 raM, NaG1 0,1 M, Tris HCI 50 mM pH 8,5, 1 acyl-2 [114C] l i n o l e v l p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e 92 I~M, 225 ~tg de prot6ines m e m b r a n a i r e s , volume final 250 ~tl.

A~-phospholipase

of rat fat cells plasma

Les c o n c e n t r a t i o n s i n d i q u 6 e s s o n t des v a l e u r s a p p a rentes, car u n e p a r t i e i m p o r t a n t e de s u b s t r a t , iei s o u s f o r m e de l i p o s o m e s , n ' e s t p a s accessible h l ' e n z y m e .

¢pm ac. gras cpm totaux

(%)

117

membranes.

observ6e in vivo est de l'ordre de 30 p. cent et s e m b l e m a x i m u m d6s 100 .~U/mt. Ces fortes c o n c e n t r a t i o n s d ' i n s u l i n e n ' o n t 6 v i d e m m e n t pas la signification d ' u n e concentration plasmatique pnisqu'elles correspondent h la c o n c e n t r a t i o n d ' h o r m o n e qui doit diffuser h t r a vers le r d s e a u v a s c u l a i r e d u f r a g m e n t t i s s u l a i r e incub6. On note que, p u i s q u e l'effet a c t i v a t e u r se m a i n t i e n t a n cours de la p r 6 p a r a t i o n des m e m b r a n e s , la p e r t u r b a t i o n m e m b r a n a i r e i n d u i t e p a r l ' i n s u l i n e est peu r6versible d a n s ces conditions. Le lot d ' i n s u l i n e utilisde ici est e x e m p t de toute activitd p h o s p h o l i p a s i q u e p a n c r 6 a tique c o n t a m i n a n t e . L'effet a c t i v a t e u r p e u t ~tre retrouv~ in vitro q u a n d les m e m b r a n e s s o n t pr6ineubdes 10 m n en presence

1(;

nmoles d'acgras l i b e r e e $ / m n / m g

1.

•

e

2"0

1'0

4"0

~

e

mr4

FIG. 3. Activitd phospholipasique A, en fonction de la concentration en CaCl~ : NaC1 0,1' M, T r i s HC1 50 mM pH 8,5, 1 acyl-2 [114C] l i n o l e y l p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e 92 I~M, 225 ~g de prot6ines m e m b r a n a i r e s , incub a t i o n 15 m i n u t e s h 37°C. corn ac. gras

cpm totaux (%) lb

sb

16o

pM

FIG. 5. Activitd phospholipasique A2 en [onction de la concenlration eu substrat : 5 mM CaC1._,, 0,1 M NaCI, T r i s HCI 50 mM pH 8,5, 95 I~g de protdines m e m b r a n a i r e s ; i n c u b a t i o n 15 m i n u t e s ~ 37°C. TABLEAU II, Effet de l'insuline in vivo et in vitro sur l'activitd phospholipasique As des membranes cytoplasmiques d' adipocytes. Membranes t6m0in

t

t

t

i

i

=

6.5

7

7.5

8

8.5

9

OH

Fit;. 4. Activitd phospholipasique A~ en fonction du pH : CaCI~ 5 mM NaC1 0,1 M, T r i s HCl 50 mM, 1 aeyl-2 [D4C] l i n o l ~ y l p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e 32 luM, 100 ~g de prot~ines m e m b r a n a i r e s : 30 m i n u t e s h 37°C.

Le t a b l e a u II m o n t r e l ' a c c r o i s s e m e n t de l'activitd p h o s p h o l i p a s i q u e A: a u s s i b i e n in vivo, c'est-h-dire q u a n d les f r a g m e n t s de t i s s u a d i p e u x 6minc6s s o n t prdincub6s en prdsence d ' i n s u l i n e , que in vitro, c'esta-dire q u a n d l ' i n s u l i n e est d i r e c t e m e n t ajout6e h la p r d p a r a t i o n m e m b r a n a i r e . L ' a c c r o i s s e m e n t d'activit6

BIOCHIMIE, 1977, 59, 11" 1.

Membranes pr6par6es partir de tissu a d i p e u x trait6 par l'insuline Membranes t6moin incub6es in vitro en pr6sence d'insuline

0,68 nanomoles d'acides gras lib6r6s/mg prot6ine membranaire/mn 100 ?.U/ml

0,89

1000 y.U/ml

0 90

10 ?.U/ml

0,71

50 ,u.U/ ml

0,82

215 ~g de prot6ines m e m b r a n a i r e s sont incub6s en pr6sence de 1 aeyl 2 [114C] l i n o l 6 y l p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e (100 .lxM), CaC12 (5 mM), NaC1 (0,1 M) Tris HCl pH 8,5 (10 raM) d a n s u n v o l u m e final de 250 l~l, pend a n t 15 m i n u t e s h 37°C. Les m e m b r a n e s s o n t pr6pardes soit h p a r t i r de t i s s u a d i p e u x incubd en pr6sencc d'ins u l i n e p e n d a n t 45 m i n u t e s h 37°C (Voir Mat6riel et M6thodes), soit pr6-ineub6es 10 m i n u t e s h 37°C en pri'sence de 10 ou 50 II~U d ' i n s u l i n e / m l d a n s les exp6riences in vitro ( n o m b r e d'exp6rienees = 3).

C. Wolf et coll.

118

d'insuline h concentration physiologique. L'activit~ sp~eiflque de la p h o s p h o l i p a s e A2 s'aeerolt de 20 p. cent pour une concentration de 50 ~U/ml. IV - - DISCUSSION. Dang ce travail une activit~ p h o s p h o l i p a s i q u e A.~ a ~t~ raise en ~vidence au niveau de la m e m b r a n e eytop l a s m i q u e de l'adipocyte. Les principales caract~ristiques sont la d~pendance au Ca ++ et le pH o p t i m u m d'aetion alealin (pH 8,5). Dans une 6tude pr~liminaire [16] nous avons montr~ que les p h o s p h o l i p a s e s m e m b r a n a i r e s ne sont pas aetiv~es par I'AMP cyclique, c o n t r a i r e m e n t h l ' e n s e m ble des phospholipascs d'un homog~nat eomplet d'adipocytes [17]. L'activation de la p h o s p h o l i p a s e A, par l ' i n s u l i n e p e r m e t d'envisager u n mode d'aetion m e m b r a n a i r e ne f a i s a n t pas i n t e r v e n i r le syst6me ad6nylcyelasique qni ne r e n d compte que des effets endocellulaires de eette h o r m o n e . La p h o s p h o l i p a s e A.~ m e m h r a n a i r e , aetiv6e par l'insuline, h y d r o l y s e les p h o s p h o l i p i d e s m e m b r a n a i r e s , done modifle la fluidit6 m e m b r a n a i r e et peut faciliter les ddplaeements du t r a n s p o r t e u r du glucose. Des exp6rienees pr61iminaires nous ont montr6 que la concentration i n t r a m e m b r a n a i r e d'aeides gras libres mesur6e par c h r o m a t o g r a p h i c gazeuse a u g m e n t a i t plus f o r t e m e n t lorsque les m e m b r a n e s sont inenb6es en presence d'insuline qu'en l'ahsence d ' h o r m o n e [18], mais il reste h d6montrer qne les aeides gras sont lib6r~s h p a r t i r des phospholipides. P a r ailleurs on envisage de m o n t r e r par des m o y e n s physiques (RPE) l'accroissement de fluidit6 m e m b r a naire au cours de eette hydrolyse. Ce travail a ~t6 r~alis~ grfice h l'aide du CEA et de la I)RME.

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 1.

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