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A propos de la reaction d'hemagglutination de la grippe equine. Etude de quelques parametres
Comp. Immun. Microbiol. infect. Dis., Vol. 3, pp. 83-91 ?~ Pergamon Press Ltd., 1980. Printed in Great Britian
0147-9571/80/0601-0083 $02.00/0
A PROPOS DE LA REACTION D'HEMAGGLUTINATION DE LA GRIPPE EQUINE. ETUDE DE QUELQUES PARAMETRES CHRISTIANE DURET, BERNARD DEVAUX et ANDRI~ BRUN IFFA-M~rieux, 254, rue Marcel M6rieux, 69007 Lyon, France Resume-Des essais, tendant fi d/~terminer l'influence de certains param~tres des r~actions d'h~magglutination et d'inhibition de l'h~magglutination grippe ~quine, sont d6crits. Ils ont port~ sur la concentration en hematies, sur la nature de l'antig6ne utilis~ et sur la relation existant entre concentration antig~nique et titre s6rique. Les resultats montrent l'importance de ces facteurs et leur corrblation certaine. Ils permettent d'expliquer les variantes que l'on peut observer entre divers laboratoires, et plus particuli/:rement propos du seuil de positivitb des s6rums. Mots-clefs: Grippe equine, IHA, anticorps, diagnostic
HEMAGGLUTINATION EQUINE INFLUENZA.
TEST APPLIED TO
STUDY OF SOME PARAMETERS
Al~straet--Trials conducted to determine the influence of some parameters on the hemagglutination and hemagglutination inhibition tests applied to equine influenza are described. These trials involved red blood cells concentration, antigen nature and relation between the antigen concentration and serum titre. The results show the importance of these factors and their definite correlation. They provide an explanation for the variants observed in various laboratories, and more especially regarding the threshold of positivity of the sera. Key words." Equine influenza, HIT, antibody, diagnosis
INTRODUCTION Le contr61e d'activit6 de nos vaccins g r i p p e 6quine nous a c o n d u i t fi rechercher des c h e v a u x sensibles [1,2], a y a n t un titre en a n t i c o r p s i n h i b a n t l ' h b m a g g l u t i n a t i o n , inf~rieur a u 1/10 [3]. Or, un effet r a p p e l p o u v a i t 6tre observb sept j o u r s apr6s vaccination, chez des a n i m a u x consid6r6s c o m m e n6gatifs a v a n t vaccination. Ce fait nous a amenbs fi tenter d'am61iorer la sensibilit6 de n o t r e m ~ t h o d e de titrage des anticorps. U n e technique de base a 6t6 pr6cis6e, d~finissant certains p a r a m 6 t r e s relatifs au mat6riel et fi la m b t h o d e . Puis, nous a v o n s cherch6 fi d 6 t e r m i n e r l'influence d ' a u t r e s p a r a m 6 t r e s c o m m e la c o n c e n t r a t i o n en hbmaties, la n a t u r e de l'antig6ne et la relation existant entre c o n c e n t r a t i o n antig6nique et titre en anticorps. MATERIEL ET METHODE - - M i c r o p l a q u e s G r e i n e r p o u r h ~ m a g g l u t i n a t i o n - c u p u l e s fi f o n d c o n i q u e de 0,5 ml. - - M i c r o d i l u t e u r s de 50 pl. - - D i l u a n t : e a u p h y s i o l o g i q u e t a m p o n n 6 e fi p H 7, 15. - - V i r u s : liquide a l l a n t o i d i e n centrifug6, trait6 ou n o n fi l'~ther. 4
83
84
CHRIST1ANE DURET, BERNARD DEVAUX et ANDRE BRUN
--Serums fi tester: inactives fi 56' pendant 30 min, traites au kaolin, puis aux hematies. --HOmaties de poulet. Les reactions se f o n t / t temperature du laboratoire.
Titrage de l'hOmagglutinine --Dilutions virales de 2 en 2, g l'aide de microdiluteurs. - - A u x 50 gl de dilution virale, addition de 50 I~l de suspension globulaire. --Lecture apres sedimentation des t6moins hematies. La derni+re cupule donnant une hemagglutination complhte, contient une unit6 hemagglutinante.
Titrage du sOrum --Dilutions sariques de 2 en 2,/~ l'aide de microdiluteurs. - - A u x 50 lal de dilution serique, addition de 50 gl de suspension virale, contenant quatre unites hemagglutinantes. - - C o n t a c t : une heure. - - A d d i t i o n de 50 lal de suspension globulaire. - - L e c t u r e apr6s 12 hr fi 4'C. Le titre du serum correspond fila plus haute dilution capable d'inhiber completement l'hemagglutination.
RESULTATS
Concentration en hOmaties Le titrage de l'hemagglutinine est realise comme il a 6te dhcrit precedemment, mais vis-fivis de differentes concentrations de globules rouges. Les Figs 1 et 2 montrent que le titre hemagglutinant de l'antigene est inversement proportionnel au nombre d'hematies, mais que, au-detfi d'une certaine concentration d'h~maties, il ne varie plus.
Nature de l'antig~ne Trente serums, issus d'animaux vaccines fi l'aide de vaccin anti-grippe equine, ont ere titres vis-fi-vis d'antigenes A 1 Prague et A 2 Miami et de ces antigenes traitbs fi l'ether. Les Tableaux 1 et 2 montrent les resultats obtenus : l'utilisation d'un antigene trait6 Other semble 'bonifier' les titres de 0,3 log environ.
Concentration antig~nique et titre s&ique Seize serums ont 6te titres vis-fi-vis de 2, 4 et 8 unites hemagglutinantes des antig6nes A 1 Prague et A 2 Miami. L'essai a ete realise trois fois. Nous averts differencie trois groupes de serums: le groupe 1 rassemblant des serums negatifs, le groupe 2 des serums positifs et le groupe 3 des serums tres positifs.
R/~action d'hemagglutinationde la grippe &luine
85
10000 x
AI
Prague
"1-
x
500g
~11 X+
•
4+
I OOC
I
I
I
I0
20
30
XA
] XA 40
d'hemafies/mt
Nbre
4-
x
106
+ 2 0 0 0 --
A2 Miami -r × F-
I000
--
+
e~ X
•
• X +
X
+
100 - -
I
I0
Figs
1 e t 2.
+ X
I
20
I
30
+ X
X
I
40
Nbre d'h~mafles/m[xlOa Titre du virus en fonction du n o m b r e d'h~maties.
Les Tableaux 3 et 4 et les courbes contenues dans la Fig. 3, montrent les r~sultats obtenus: le titre en anticorps du sbrum testb est lib au nombre d'unitbs hbmagglutinantes introduites dans la rbaction. En passant de 2 & 8 UHA, le sbrum voit son titre diminuer de plus de la moiti&
Titre de l'antigkne et titre sbrique
A la suite des rbsultats obtenus pr6cbdemment, il nous a semblb intbressant de titrer des sbrums dans trois 'zones' diffbrentes de la courbe titre du virus = f (nombre d'hbmaties). Essai 1. Dans la partie exponentielle correspondant & la concentration de: 15.106 hbmaties/ml,
86
CHR1STIANE DURET~ BERNARD DEVAUX et ANDRE BRt;N
Tableau 1. Titres en anticorps IHA, exprimes en log 10, determines vis-fi-vis d'antigenes traites el non traites/~ l'ether Valences Serums
Antigenes non traites A2 Miami A 1 Prague
1 2 3 4 5 6 7
2.5 2,8 3.1 2,8 2,5 -,-'~ 2.5
Antig+nes traites A2 Miami A1 Prague
2,5 2,5 2.5 2,2 2.5 1,9 ~
2.8 3.1 2,8 2,8 3.1 2.8 3,1
8
2,5
2.8
3,1
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
3,1 2,8 2.8 2.5 "~ 1.9 2.2 2.8 2.5 " " 3.1 2,5 22 1.9 "~ 1.6 1,6 1.9 1,9 ~ 2,8 1.9
2.5 2.5 2.5 2.5 "" 1.9 1.6 ~_,." 1,9 1.9 1.6 2.2 2.2 1.9 ~" 1,6 1.9 1,6 1,0 ~ -,-~ 2,2
2.5 3 .,8 2,8 2.5 2,8 2,5 2.5 ~ .,8 .,5 .,5 2.5 2,2 2,5 2,5 2,5 1,9 _.5 . v 1,9 2,8 2.8 2,8
Moyennes
2,38
.~ 1~.
.
.
.
.
_.8 _.5 _,8 2.5 _.5 ..-~ ~" 0,5 2,8 L4 2.8 ~.8 2.5 2.5 2.2 2,5 2,8 2,2 2.5 2,5 2.2 "" !,9 t.9 . v 1,3 ~ 1,(~ 2.5
~ 6v
2,40
Tableau 2 (recapitule le Tableau 1). Moyennes des titres en anticorps IHA, exprimes en log 10, de 30 s t r u m s test6s vis-~i-vis d'antigenes traites et non traites ~ l'ether
E s s a i 2. D a n s
Valences Antigenes
A 1 Prague
A 2 Miami
Traites ether N o n trait~s ether Ecarts
2,62 2,38 0,24
2,40 2, t2 (I,28
la z o n e d u c h a n g e m e n t
de pente
correspondant
fi la c o n c e n t r a t i o n
de:
22.106 hbmaties/ml, E s s a i 3. D a n s
la z o n e a s y m p t o t i q u e ,
correspondant
~t la c o n c e n t r a t i o n
soit de : 37.106 h6maties/ml, L'essai 0 est une r6p&ition
d e l ' e s s a i 1, r e a l i s 6 u n a u t r e j o u r .
g l o b u l a i r e d e 0,5'~,
R6action d'hemagglutination de la grippe 6quine
87
Tableau 3. Titres en anticorps I H A , exprim6s en log 10 et determin6s vis-~i-vis de 2,4 et 8 unites h6maggtutinantes Nombre UHA No. s6rums Groupe 1
2
4
8
No. 1
1,6 1,3 1,0
1,3 1,3 <1,0
1,3 1,0 <1,0
No. 2
1,3 1,0 1,3
1,0 1,0 <1,0
<0,7 <0,7 <1,0
No. 3
1,9 1,9 1,0
1,3 1,3 <1,0
1,0 1,0 <1,0
No. 4
1,9 1,9 1,3
1,3 1,3 1,3
1,0 <0,7 <1,0
No. 7
1,6 1,3 1,3 1,3
1,0 1,0 1,0 1,3
<0,7 <0,7 <0,7 <1,0
No. 8
1,0 <0,7 1,0
<0,7 <0,7 <1,0
<0,7 <0,7 <1,0
No. 6
2,2 1,9 2,2
1,9 1,9 1,9
1,9 1,9 1,6
No. 16
2,2 1,9 2,2
1,9 1,9 1,9
1,9 1,9 1,6
No. 17
2,2 2,2 2,2
1,6 1,9 1,6
1,9 1,9 1,6
No. 18
1,9 1,6 1,9
1,6 1,6 1,6
1,3 1,3 1,3
No. 5
2,5 2,8 2,8
2,5 2,8 2,8
2,2 2,8 2,5
No. 11
2,8 2,8 3,1
2,8 2,8 2,8
2,5 2,5 2,8
No. 12
2,8 2,8 2,5
2,5 2,5 2,2
2,2 2,5 2,2
No. 13
2,8 2,8 2,8
2,8 2,5 2,8
2,5 2,2 2,5
No. 14
2,5 2,8 2,5
2,5 2,5 2,2
2,2 2,2 2,2
No. 15
2,8 2,5 2,8
2,5 2,5 2,5
2,5 2,2 2,2
Serums n~gatifs
Groupe 2
Serums positifs
Groupe 3
Serums tr6s positifs
88
CHRISTIANE DURET, BERNARD DEVAUX et ANDRI~ BRUN
Tableau 4 (recapitule le Tableau 3). Moyennes de 48 titrages de serums en anticorps IHA vis-fi-vis de 2, 4 el 8 unites hc?magglutinantes Expression des titres en valeurs
Log I0
Serums Negatifs Positifs Tres positifs
2
4
1,35 2,05 2,73
1,1 1,78 2,58
,,\ rithmetique
Nombre U H A z
8
< 0,9 1,68 2,38
4
32 123 586
14
63 484
S~rums fr~s positifs -%.
2,5
-
~50
~x +, ",+
T
IOO
.L 2,0 O
-%
¢'~"
Se'rums positifs
I I
F-
50
1,5
i2
50
""+- ~-'£~-_-~ms n~gotifs
I,O
I
2
1
4
O
I
8
Nbre unites h~rnoggtutinentes Fig. 3. Titres seriques en fonction du nombre d'unites hemagglutinantes.
,~ .:
55 261
R6action d'hhnagglutination de la grippe equine
89
Le Tableau 5 montre les titres hbmagglutinants des antig6nes en fonction des diffbrentes
concentrations globulaires et les dilutions correspondantes contenant quatre unit6s h&nagglutinantes. Tableau 5 Essais No. No. No. No.
0 1 2 3
H6maties~i:
Titres
15.106/ml 15.106/ml 22.106/ml 37.106/ml
5120 10240 5120 2560
A 1 Prague Dilutions contenant 4 UHA
Titres
1/1280e 1/2560e 1/1280e 1/640e
A 2 Miami Dilutions contenant 4 UHA
1280 1024 512 256
1/320e 1/256e 1/128e 1/64e
Le Tableau 6 et la Fig. 4 indiquent les titres en anticorps des s6rums de 20 animaux avant et apr~s vaccination, selon qu'ils ont bt~ appr6ci~s en pr6sence de concentrations antigbniques diff6rentes, d6pendantes des concentrations globulaires diff6rentes. Le titre en anticorps du s6rum est li6 ~i la concentration en h6maties choisie: plus le hombre d'h~maties est important, plus le titre du virus est faible; et, par consequent, plus on introduit, dans la r6action d'inhibition, des unitbs hbmagglutinantes.
+"~---........AAIPrague
A2 Miami
2,.'
30C
20C
ZOO
-+
"'+,
..7
J
T
I00
-2-'
"1"
'oo
i 2,£ ..4..
E
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~+
I-
4C I,E
5C
++:..~-...._..
-----. ~.
~-..~.
,tz-~ .... - 20
"-~. "'--.÷ ......... IC--
I,O
I 15
I 22
I
37
--fO
I
15
t
22
t
37
Nbre d' hdmafies x 106/mr Fig. 4. Titre s6rique en fonction du nombre d'h6maties. DISCUSSION D u fait des variations enregistr~es dans l'expression des titres h~magglutinants ou des titres en anticorps inhibant l'h+magglutination entre diff6rents laboratoires, du fait de la
moyennes en log 10 moyennes arithmetiques
5
2 3 4
1
2 3 4 5
1
de cobayes
2 3 7 9
1
de chevaux 8 4 6
de ref. ( - ) de ref. ( + )
PS essai serums
1.46 32
51
1,3 1,3 1.3 1,3 1,3
1,62
1,3 1,3 1,3 1,3 1,3
1,3 1,6 1,6 1,6 1,9 1,6 1,3 1,6
<1~ 3,1
1,6 1,9 1,9 1,9 1,9 1,6 1,9 1,9
1
0
28
1,34
<1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0
1,6 1,6 1,6 1,3 1,9 1,6 1,3 1,6
<1,0 2,8
2
13
1,09
<1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0
1,3 1,3 1,3 <1,0 1.3 1,0 1,0 1,0
<1,0 2,8
3
578
2.57
2,2 2,5 2,5 2,5 2,2 3,4 3,4 2,8 2,8 2,8
2,2 2,2 2,5 2,5 2,5 2,2 2,5 2,5
0
400
2,53
2,2 2,5 2,5 2,5 2,5 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8
2,2 2,2 2,5 2,2 2,8 2,2 2,8 2,5
1
329
_,_ 8
1,9 2,2 2,2 1,9 1,9 2,8 2,8 2,8 2,8 2.8
2,5 2,2 2,2 1,9 2,8 2,2 2,5 2,5
2
Valence A1 Prague Avant vaccination Awes vaccination
181
_._ 8
1,9 2,5 2,5 2,2 2,2 2,5 2,8 2,8 2,8 3,1
1,16 15
17
1,3 1,3 1,3 1.3 1,3 1,34
1,3 1,3 1,3 1,3 1.3
< 1,0
1.6
< 1,0 1,3
1,9
2,5 2,5
< 1,0 < 1,0
1,3 < 1,0 < 1,0
1,6 1,3 1,3
<113 3,4
<1.3 3,1
< 1,0 1,3
1
0
1,3 1,6
"~ "~ -,22 1,9 _,_~ "~
3
< 11
( 1,02
<1,0 <1,0 <1,0 <1,0
< 1,0 < 1,0
< 1,0
< 1,0 < 1,0 < 1,0
< 1,0 1,3
<113 2,8
2
< 10
,< 1,0
<1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0
< le0 < 1,0
< 1,0
< 1,0 < 1,0 < 1,0
< 1,0 < 1,0
< 1,0 2,8
3
_~"12 181
", "7 .~3,
2.2 1,9 1,9 1,9 1,9 2,2 2,5 2,5 2,8 2.5
2,5 1,9
1,6
2,2 1,3 ~,~'"~ ~
1,9
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1
,," 1"-
2,2 1,9 1,9 1,9 1,9 2,8 2,8 2,5 2,8 2.5
2,5 1,9
1,6
"~ "~ .,.'~"~ 2,2 2,2 2,2
0
14t
1.38
2,2 1,9 1,9 1,9 1,6 2,2 2,5 2,2 2,8 2,5
1,9 1,6
1,3
1,9 1,6 1,9
1,9 1,9
2
Valence A2 Miami Avant vaccination Apr+s vaccination
Tableau 6. Titres en anticorps IHA, exprimes en log 10 en tonction du titre du virus dependant de la concentration en hematies
<
72
1.75
1,9 1,6 1,9 1,9 1,6 1,9 2,2 1,9 2,2 2,2
1,9 1,3
1,0
1,6 1,6 1,6 1,3 1,9
Z
Z
>
x
<
Z
~J
Z ,,m
R~action d'hemagglutination de la grippe &luine
91
difficult6 fi appr~cier le seuil de positivit6 des s~rums, nous avons tent~ de pr~ciser l'influence de certains param6tres des r~actions. C o m m e les essais de Brugh [4] sur le virus de la pseudo peste aviaire l'ont mis en 6vidence, nos r6sultats m o n t r e n t que le titre en anticorps d ' u n s6rum d6pend du n o m b r e d'unit6s h6magglutinantes introduites dans la r6action. Or ce titre en h+magglutinine est li6 au n o m b r e d'h~maties selon une courbe exponentielle. En utilisant la concentration fi 0,5~o d'h+maties, on diminue le titre h+magglutinant d ' u n antigone; de ce fait, la m6thode appliqu+e au titrage des anticorps d ' u n s6rum perd de sa sensibilit6, ce qui est d'importance, lorsqu'il s'agit de tester la positivit6 d'un s6rum, et n o t a m m e n t celle de s6rums de chevaux. Cependant, ainsi que l'observait M a d a m e Fontaine ~[5], l'utilisation d'un antigone trait+ par l'6ther permet d'am61iorer la sensibilit6 de la r+action des titrages en anticorps. Ces essais nous conduisent fi a d o p t e r une technique permettant de d+celer la plus grande quantit6 d'antig6nes, c'est-5.-dire ~i titrer l'h+magglutinine dans la zone de c h a n g e m e n t de pente. D a n s les r6actions d'inhibition d'h~magglutination, ils nous m o n t r e n t l'importance d ' a v o i r des t~moins qui v+rifient la concentration antig+nique et les titres en anticorps de s6rums de r6f6rence n6gatif et positif. Toute c o m p a r a i s o n de r6sultats doit &re accompagn6e d'une c o m p a r a i s o n des techniques employ6es. A cet effet, un effort de standardisation des techniques pourrait 6tre envisag+ ou, fi d6faut, l'utilisation de s6rums de r~f6rence p e r m e t t r a i t / t tout laboratoire de dbfinir le seuil de sensibilit~ de sa technique. BIBLIOGRAPHIE 1. Dannacher, G., Coudert, M., Fedida, M. et Perrin, M., La grippe ~quine : etude quantitative de l'~tat immunitaire post-vaccinal et des corr61ations entre ses diffbrents aspects, Rev. reed. vet. 128 (3), 323-341 (1977). 2. Frerichs, G., Burrows, R. et Frerichs, C., Serological response of horses and laboratory animals to equine influenza vaccine, Proc. 3rd int. Conf. Equine Infectious Diseases, Paris 503-509 (1972). 3. Lucam, F., Fedida, M., Dannacher, G., Coudert, M. et Peillon, M., La grippe ~quine. Caract6re de la maladie experimentale et de l'immunite post-vaccinale, Rev. reed. vet. 125 (10), 1273-1293 (1974). 4. Brugh, M., Beard, C. et Wilkes, W., The influence of test conditions on Newcastle disease hemagglutination-Inhibition Titers, Avian Dis. 22 (2), (1978). 5. Fontaine, M., Aymard-Henry, M. (1) et Fontaine, M., Fontaine, M. (2), Contribution ~i l'6tude antig6nique des virus influenza des animaux. (1) Neuraminidase des virus influenza bquins. (2) Anticorps antineuraminidase chez le cheval : condition d'apparition et importance, Annls Rech. Vbt. 6 (4), 397-420 (1975).
0147-9571/80/0601-0083 $02.00/0
A PROPOS DE LA REACTION D'HEMAGGLUTINATION DE LA GRIPPE EQUINE. ETUDE DE QUELQUES PARAMETRES CHRISTIANE DURET, BERNARD DEVAUX et ANDRI~ BRUN IFFA-M~rieux, 254, rue Marcel M6rieux, 69007 Lyon, France Resume-Des essais, tendant fi d/~terminer l'influence de certains param~tres des r~actions d'h~magglutination et d'inhibition de l'h~magglutination grippe ~quine, sont d6crits. Ils ont port~ sur la concentration en hematies, sur la nature de l'antig6ne utilis~ et sur la relation existant entre concentration antig~nique et titre s6rique. Les resultats montrent l'importance de ces facteurs et leur corrblation certaine. Ils permettent d'expliquer les variantes que l'on peut observer entre divers laboratoires, et plus particuli/:rement propos du seuil de positivitb des s6rums. Mots-clefs: Grippe equine, IHA, anticorps, diagnostic
HEMAGGLUTINATION EQUINE INFLUENZA.
TEST APPLIED TO
STUDY OF SOME PARAMETERS
Al~straet--Trials conducted to determine the influence of some parameters on the hemagglutination and hemagglutination inhibition tests applied to equine influenza are described. These trials involved red blood cells concentration, antigen nature and relation between the antigen concentration and serum titre. The results show the importance of these factors and their definite correlation. They provide an explanation for the variants observed in various laboratories, and more especially regarding the threshold of positivity of the sera. Key words." Equine influenza, HIT, antibody, diagnosis
INTRODUCTION Le contr61e d'activit6 de nos vaccins g r i p p e 6quine nous a c o n d u i t fi rechercher des c h e v a u x sensibles [1,2], a y a n t un titre en a n t i c o r p s i n h i b a n t l ' h b m a g g l u t i n a t i o n , inf~rieur a u 1/10 [3]. Or, un effet r a p p e l p o u v a i t 6tre observb sept j o u r s apr6s vaccination, chez des a n i m a u x consid6r6s c o m m e n6gatifs a v a n t vaccination. Ce fait nous a amenbs fi tenter d'am61iorer la sensibilit6 de n o t r e m ~ t h o d e de titrage des anticorps. U n e technique de base a 6t6 pr6cis6e, d~finissant certains p a r a m 6 t r e s relatifs au mat6riel et fi la m b t h o d e . Puis, nous a v o n s cherch6 fi d 6 t e r m i n e r l'influence d ' a u t r e s p a r a m 6 t r e s c o m m e la c o n c e n t r a t i o n en hbmaties, la n a t u r e de l'antig6ne et la relation existant entre c o n c e n t r a t i o n antig6nique et titre en anticorps. MATERIEL ET METHODE - - M i c r o p l a q u e s G r e i n e r p o u r h ~ m a g g l u t i n a t i o n - c u p u l e s fi f o n d c o n i q u e de 0,5 ml. - - M i c r o d i l u t e u r s de 50 pl. - - D i l u a n t : e a u p h y s i o l o g i q u e t a m p o n n 6 e fi p H 7, 15. - - V i r u s : liquide a l l a n t o i d i e n centrifug6, trait6 ou n o n fi l'~ther. 4
83
84
CHRIST1ANE DURET, BERNARD DEVAUX et ANDRE BRUN
--Serums fi tester: inactives fi 56' pendant 30 min, traites au kaolin, puis aux hematies. --HOmaties de poulet. Les reactions se f o n t / t temperature du laboratoire.
Titrage de l'hOmagglutinine --Dilutions virales de 2 en 2, g l'aide de microdiluteurs. - - A u x 50 gl de dilution virale, addition de 50 I~l de suspension globulaire. --Lecture apres sedimentation des t6moins hematies. La derni+re cupule donnant une hemagglutination complhte, contient une unit6 hemagglutinante.
Titrage du sOrum --Dilutions sariques de 2 en 2,/~ l'aide de microdiluteurs. - - A u x 50 lal de dilution serique, addition de 50 gl de suspension virale, contenant quatre unites hemagglutinantes. - - C o n t a c t : une heure. - - A d d i t i o n de 50 lal de suspension globulaire. - - L e c t u r e apr6s 12 hr fi 4'C. Le titre du serum correspond fila plus haute dilution capable d'inhiber completement l'hemagglutination.
RESULTATS
Concentration en hOmaties Le titrage de l'hemagglutinine est realise comme il a 6te dhcrit precedemment, mais vis-fivis de differentes concentrations de globules rouges. Les Figs 1 et 2 montrent que le titre hemagglutinant de l'antigene est inversement proportionnel au nombre d'hematies, mais que, au-detfi d'une certaine concentration d'h~maties, il ne varie plus.
Nature de l'antig~ne Trente serums, issus d'animaux vaccines fi l'aide de vaccin anti-grippe equine, ont ere titres vis-fi-vis d'antigenes A 1 Prague et A 2 Miami et de ces antigenes traitbs fi l'ether. Les Tableaux 1 et 2 montrent les resultats obtenus : l'utilisation d'un antigene trait6 Other semble 'bonifier' les titres de 0,3 log environ.
Concentration antig~nique et titre s&ique Seize serums ont 6te titres vis-fi-vis de 2, 4 et 8 unites hemagglutinantes des antig6nes A 1 Prague et A 2 Miami. L'essai a ete realise trois fois. Nous averts differencie trois groupes de serums: le groupe 1 rassemblant des serums negatifs, le groupe 2 des serums positifs et le groupe 3 des serums tres positifs.
R/~action d'hemagglutinationde la grippe &luine
85
10000 x
AI
Prague
"1-
x
500g
~11 X+
•
4+
I OOC
I
I
I
I0
20
30
XA
] XA 40
d'hemafies/mt
Nbre
4-
x
106
+ 2 0 0 0 --
A2 Miami -r × F-
I000
--
+
e~ X
•
• X +
X
+
100 - -
I
I0
Figs
1 e t 2.
+ X
I
20
I
30
+ X
X
I
40
Nbre d'h~mafles/m[xlOa Titre du virus en fonction du n o m b r e d'h~maties.
Les Tableaux 3 et 4 et les courbes contenues dans la Fig. 3, montrent les r~sultats obtenus: le titre en anticorps du sbrum testb est lib au nombre d'unitbs hbmagglutinantes introduites dans la rbaction. En passant de 2 & 8 UHA, le sbrum voit son titre diminuer de plus de la moiti&
Titre de l'antigkne et titre sbrique
A la suite des rbsultats obtenus pr6cbdemment, il nous a semblb intbressant de titrer des sbrums dans trois 'zones' diffbrentes de la courbe titre du virus = f (nombre d'hbmaties). Essai 1. Dans la partie exponentielle correspondant & la concentration de: 15.106 hbmaties/ml,
86
CHR1STIANE DURET~ BERNARD DEVAUX et ANDRE BRt;N
Tableau 1. Titres en anticorps IHA, exprimes en log 10, determines vis-fi-vis d'antigenes traites el non traites/~ l'ether Valences Serums
Antigenes non traites A2 Miami A 1 Prague
1 2 3 4 5 6 7
2.5 2,8 3.1 2,8 2,5 -,-'~ 2.5
Antig+nes traites A2 Miami A1 Prague
2,5 2,5 2.5 2,2 2.5 1,9 ~
2.8 3.1 2,8 2,8 3.1 2.8 3,1
8
2,5
2.8
3,1
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
3,1 2,8 2.8 2.5 "~ 1.9 2.2 2.8 2.5 " " 3.1 2,5 22 1.9 "~ 1.6 1,6 1.9 1,9 ~ 2,8 1.9
2.5 2.5 2.5 2.5 "" 1.9 1.6 ~_,." 1,9 1.9 1.6 2.2 2.2 1.9 ~" 1,6 1.9 1,6 1,0 ~ -,-~ 2,2
2.5 3 .,8 2,8 2.5 2,8 2,5 2.5 ~ .,8 .,5 .,5 2.5 2,2 2,5 2,5 2,5 1,9 _.5 . v 1,9 2,8 2.8 2,8
Moyennes
2,38
.~ 1~.
.
.
.
.
_.8 _.5 _,8 2.5 _.5 ..-~ ~" 0,5 2,8 L4 2.8 ~.8 2.5 2.5 2.2 2,5 2,8 2,2 2.5 2,5 2.2 "" !,9 t.9 . v 1,3 ~ 1,(~ 2.5
~ 6v
2,40
Tableau 2 (recapitule le Tableau 1). Moyennes des titres en anticorps IHA, exprimes en log 10, de 30 s t r u m s test6s vis-~i-vis d'antigenes traites et non traites ~ l'ether
E s s a i 2. D a n s
Valences Antigenes
A 1 Prague
A 2 Miami
Traites ether N o n trait~s ether Ecarts
2,62 2,38 0,24
2,40 2, t2 (I,28
la z o n e d u c h a n g e m e n t
de pente
correspondant
fi la c o n c e n t r a t i o n
de:
22.106 hbmaties/ml, E s s a i 3. D a n s
la z o n e a s y m p t o t i q u e ,
correspondant
~t la c o n c e n t r a t i o n
soit de : 37.106 h6maties/ml, L'essai 0 est une r6p&ition
d e l ' e s s a i 1, r e a l i s 6 u n a u t r e j o u r .
g l o b u l a i r e d e 0,5'~,
R6action d'hemagglutination de la grippe 6quine
87
Tableau 3. Titres en anticorps I H A , exprim6s en log 10 et determin6s vis-~i-vis de 2,4 et 8 unites h6maggtutinantes Nombre UHA No. s6rums Groupe 1
2
4
8
No. 1
1,6 1,3 1,0
1,3 1,3 <1,0
1,3 1,0 <1,0
No. 2
1,3 1,0 1,3
1,0 1,0 <1,0
<0,7 <0,7 <1,0
No. 3
1,9 1,9 1,0
1,3 1,3 <1,0
1,0 1,0 <1,0
No. 4
1,9 1,9 1,3
1,3 1,3 1,3
1,0 <0,7 <1,0
No. 7
1,6 1,3 1,3 1,3
1,0 1,0 1,0 1,3
<0,7 <0,7 <0,7 <1,0
No. 8
1,0 <0,7 1,0
<0,7 <0,7 <1,0
<0,7 <0,7 <1,0
No. 6
2,2 1,9 2,2
1,9 1,9 1,9
1,9 1,9 1,6
No. 16
2,2 1,9 2,2
1,9 1,9 1,9
1,9 1,9 1,6
No. 17
2,2 2,2 2,2
1,6 1,9 1,6
1,9 1,9 1,6
No. 18
1,9 1,6 1,9
1,6 1,6 1,6
1,3 1,3 1,3
No. 5
2,5 2,8 2,8
2,5 2,8 2,8
2,2 2,8 2,5
No. 11
2,8 2,8 3,1
2,8 2,8 2,8
2,5 2,5 2,8
No. 12
2,8 2,8 2,5
2,5 2,5 2,2
2,2 2,5 2,2
No. 13
2,8 2,8 2,8
2,8 2,5 2,8
2,5 2,2 2,5
No. 14
2,5 2,8 2,5
2,5 2,5 2,2
2,2 2,2 2,2
No. 15
2,8 2,5 2,8
2,5 2,5 2,5
2,5 2,2 2,2
Serums n~gatifs
Groupe 2
Serums positifs
Groupe 3
Serums tr6s positifs
88
CHRISTIANE DURET, BERNARD DEVAUX et ANDRI~ BRUN
Tableau 4 (recapitule le Tableau 3). Moyennes de 48 titrages de serums en anticorps IHA vis-fi-vis de 2, 4 el 8 unites hc?magglutinantes Expression des titres en valeurs
Log I0
Serums Negatifs Positifs Tres positifs
2
4
1,35 2,05 2,73
1,1 1,78 2,58
,,\ rithmetique
Nombre U H A z
8
< 0,9 1,68 2,38
4
32 123 586
14
63 484
S~rums fr~s positifs -%.
2,5
-
~50
~x +, ",+
T
IOO
.L 2,0 O
-%
¢'~"
Se'rums positifs
I I
F-
50
1,5
i2
50
""+- ~-'£~-_-~ms n~gotifs
I,O
I
2
1
4
O
I
8
Nbre unites h~rnoggtutinentes Fig. 3. Titres seriques en fonction du nombre d'unites hemagglutinantes.
,~ .:
55 261
R6action d'hhnagglutination de la grippe equine
89
Le Tableau 5 montre les titres hbmagglutinants des antig6nes en fonction des diffbrentes
concentrations globulaires et les dilutions correspondantes contenant quatre unit6s h&nagglutinantes. Tableau 5 Essais No. No. No. No.
0 1 2 3
H6maties~i:
Titres
15.106/ml 15.106/ml 22.106/ml 37.106/ml
5120 10240 5120 2560
A 1 Prague Dilutions contenant 4 UHA
Titres
1/1280e 1/2560e 1/1280e 1/640e
A 2 Miami Dilutions contenant 4 UHA
1280 1024 512 256
1/320e 1/256e 1/128e 1/64e
Le Tableau 6 et la Fig. 4 indiquent les titres en anticorps des s6rums de 20 animaux avant et apr~s vaccination, selon qu'ils ont bt~ appr6ci~s en pr6sence de concentrations antigbniques diff6rentes, d6pendantes des concentrations globulaires diff6rentes. Le titre en anticorps du s6rum est li6 ~i la concentration en h6maties choisie: plus le hombre d'h~maties est important, plus le titre du virus est faible; et, par consequent, plus on introduit, dans la r6action d'inhibition, des unitbs hbmagglutinantes.
+"~---........AAIPrague
A2 Miami
2,.'
30C
20C
ZOO
-+
"'+,
..7
J
T
I00
-2-'
"1"
'oo
i 2,£ ..4..
E
.Q E
~+
I-
4C I,E
5C
++:..~-...._..
-----. ~.
~-..~.
,tz-~ .... - 20
"-~. "'--.÷ ......... IC--
I,O
I 15
I 22
I
37
--fO
I
15
t
22
t
37
Nbre d' hdmafies x 106/mr Fig. 4. Titre s6rique en fonction du nombre d'h6maties. DISCUSSION D u fait des variations enregistr~es dans l'expression des titres h~magglutinants ou des titres en anticorps inhibant l'h+magglutination entre diff6rents laboratoires, du fait de la
moyennes en log 10 moyennes arithmetiques
5
2 3 4
1
2 3 4 5
1
de cobayes
2 3 7 9
1
de chevaux 8 4 6
de ref. ( - ) de ref. ( + )
PS essai serums
1.46 32
51
1,3 1,3 1.3 1,3 1,3
1,62
1,3 1,3 1,3 1,3 1,3
1,3 1,6 1,6 1,6 1,9 1,6 1,3 1,6
<1~ 3,1
1,6 1,9 1,9 1,9 1,9 1,6 1,9 1,9
1
0
28
1,34
<1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0
1,6 1,6 1,6 1,3 1,9 1,6 1,3 1,6
<1,0 2,8
2
13
1,09
<1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0
1,3 1,3 1,3 <1,0 1.3 1,0 1,0 1,0
<1,0 2,8
3
578
2.57
2,2 2,5 2,5 2,5 2,2 3,4 3,4 2,8 2,8 2,8
2,2 2,2 2,5 2,5 2,5 2,2 2,5 2,5
0
400
2,53
2,2 2,5 2,5 2,5 2,5 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8
2,2 2,2 2,5 2,2 2,8 2,2 2,8 2,5
1
329
_,_ 8
1,9 2,2 2,2 1,9 1,9 2,8 2,8 2,8 2,8 2.8
2,5 2,2 2,2 1,9 2,8 2,2 2,5 2,5
2
Valence A1 Prague Avant vaccination Awes vaccination
181
_._ 8
1,9 2,5 2,5 2,2 2,2 2,5 2,8 2,8 2,8 3,1
1,16 15
17
1,3 1,3 1,3 1.3 1,3 1,34
1,3 1,3 1,3 1,3 1.3
< 1,0
1.6
< 1,0 1,3
1,9
2,5 2,5
< 1,0 < 1,0
1,3 < 1,0 < 1,0
1,6 1,3 1,3
<113 3,4
<1.3 3,1
< 1,0 1,3
1
0
1,3 1,6
"~ "~ -,22 1,9 _,_~ "~
3
< 11
( 1,02
<1,0 <1,0 <1,0 <1,0
< 1,0 < 1,0
< 1,0
< 1,0 < 1,0 < 1,0
< 1,0 1,3
<113 2,8
2
< 10
,< 1,0
<1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0
< le0 < 1,0
< 1,0
< 1,0 < 1,0 < 1,0
< 1,0 < 1,0
< 1,0 2,8
3
_~"12 181
", "7 .~3,
2.2 1,9 1,9 1,9 1,9 2,2 2,5 2,5 2,8 2.5
2,5 1,9
1,6
2,2 1,3 ~,~'"~ ~
1,9
~' "~
1
,," 1"-
2,2 1,9 1,9 1,9 1,9 2,8 2,8 2,5 2,8 2.5
2,5 1,9
1,6
"~ "~ .,.'~"~ 2,2 2,2 2,2
0
14t
1.38
2,2 1,9 1,9 1,9 1,6 2,2 2,5 2,2 2,8 2,5
1,9 1,6
1,3
1,9 1,6 1,9
1,9 1,9
2
Valence A2 Miami Avant vaccination Apr+s vaccination
Tableau 6. Titres en anticorps IHA, exprimes en log 10 en tonction du titre du virus dependant de la concentration en hematies
<
72
1.75
1,9 1,6 1,9 1,9 1,6 1,9 2,2 1,9 2,2 2,2
1,9 1,3
1,0
1,6 1,6 1,6 1,3 1,9
Z
Z
>
x
<
Z
~J
Z ,,m
R~action d'hemagglutination de la grippe &luine
91
difficult6 fi appr~cier le seuil de positivit6 des s~rums, nous avons tent~ de pr~ciser l'influence de certains param6tres des r~actions. C o m m e les essais de Brugh [4] sur le virus de la pseudo peste aviaire l'ont mis en 6vidence, nos r6sultats m o n t r e n t que le titre en anticorps d ' u n s6rum d6pend du n o m b r e d'unit6s h6magglutinantes introduites dans la r6action. Or ce titre en h+magglutinine est li6 au n o m b r e d'h~maties selon une courbe exponentielle. En utilisant la concentration fi 0,5~o d'h+maties, on diminue le titre h+magglutinant d ' u n antigone; de ce fait, la m6thode appliqu+e au titrage des anticorps d ' u n s6rum perd de sa sensibilit6, ce qui est d'importance, lorsqu'il s'agit de tester la positivit6 d'un s6rum, et n o t a m m e n t celle de s6rums de chevaux. Cependant, ainsi que l'observait M a d a m e Fontaine ~[5], l'utilisation d'un antigone trait+ par l'6ther permet d'am61iorer la sensibilit6 de la r+action des titrages en anticorps. Ces essais nous conduisent fi a d o p t e r une technique permettant de d+celer la plus grande quantit6 d'antig6nes, c'est-5.-dire ~i titrer l'h+magglutinine dans la zone de c h a n g e m e n t de pente. D a n s les r6actions d'inhibition d'h~magglutination, ils nous m o n t r e n t l'importance d ' a v o i r des t~moins qui v+rifient la concentration antig+nique et les titres en anticorps de s6rums de r6f6rence n6gatif et positif. Toute c o m p a r a i s o n de r6sultats doit &re accompagn6e d'une c o m p a r a i s o n des techniques employ6es. A cet effet, un effort de standardisation des techniques pourrait 6tre envisag+ ou, fi d6faut, l'utilisation de s6rums de r~f6rence p e r m e t t r a i t / t tout laboratoire de dbfinir le seuil de sensibilit~ de sa technique. BIBLIOGRAPHIE 1. Dannacher, G., Coudert, M., Fedida, M. et Perrin, M., La grippe ~quine : etude quantitative de l'~tat immunitaire post-vaccinal et des corr61ations entre ses diffbrents aspects, Rev. reed. vet. 128 (3), 323-341 (1977). 2. Frerichs, G., Burrows, R. et Frerichs, C., Serological response of horses and laboratory animals to equine influenza vaccine, Proc. 3rd int. Conf. Equine Infectious Diseases, Paris 503-509 (1972). 3. Lucam, F., Fedida, M., Dannacher, G., Coudert, M. et Peillon, M., La grippe ~quine. Caract6re de la maladie experimentale et de l'immunite post-vaccinale, Rev. reed. vet. 125 (10), 1273-1293 (1974). 4. Brugh, M., Beard, C. et Wilkes, W., The influence of test conditions on Newcastle disease hemagglutination-Inhibition Titers, Avian Dis. 22 (2), (1978). 5. Fontaine, M., Aymard-Henry, M. (1) et Fontaine, M., Fontaine, M. (2), Contribution ~i l'6tude antig6nique des virus influenza des animaux. (1) Neuraminidase des virus influenza bquins. (2) Anticorps antineuraminidase chez le cheval : condition d'apparition et importance, Annls Rech. Vbt. 6 (4), 397-420 (1975).