Evaluation d'une technique immuno-enzymatique de dosage de la prolactine. Etude de quelques variations physiologiques de la prolactinémie

Immunoanal. Biol. Sp~c. (1989) 17, 53-58 © Elsevier, Paris

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Techniques au quotidien

Evaluation d'une technique immuno-enzymatique de dosage de la prolactine. Etude de quelques variations physiologiques de la prolactinemie

J. Liefooghe et D. Ponchaux

Laboratoire de physiologie, facultdlibre de Mddecine, 56, rue du Port, 59046 Lille Cedex, France

Rdsumd m L'Enzymun-test Prolactine Boehringer-Mannheim permet une mesure tout ~, fait satisfaisante de la prolacti-

ndmie. II s'agit d'une mdthode immuno-enzymatique de type sandwich en une ~tape, utilisant des tubes rev~tus d'un anticorps anti-PRL monoclonal. La prdcision est satisfaisante (CV de 5,1 ~. 11,2%), la lin(mdt~ excellente; la limite de d~tection est infdrieure & 1 /Jg/I; la praticabilit~ ne pose aucun probl~me, surtout sur automate. La correlation avec d'autres m~thodes immuno-enzymatiques ou radio-immunologiques est tr~s bonne, m~me si Enzymun-test donne des rdsultats souvent un peu sup~rieurs aux autres techniques. Le dosage de ia prolactine pose beaucoup moins de problames que son interpretation, compte tenu de la grande variabilit~ des concentrations s~riques de I'hormone sous I'effet de facteurs externes ou internes. prolactine - dosage immuno-enzymatique - variations physiologiques

Summary - - Enzyme immuno-assay for serum prolactin (PRL). Some physiological variations of prolactinemia.

Enzymun-test Prolactine Boehringer-Mannheim offers a reliable measurement of prolactinemia. It is a "sandwich" enzyme immuno-assay using monoclonal antibody anti-PRL coated tubes. Analytical performances are satisfactory : intraassay and interassay precision (CV from 5.1 to 11.2°/o), good linearity, lower detection limit at 0,83 ~g/I. Correlations with 2 other EIA as well as RIA are good, although Enzymun-test generally gives slightly higher values than the other methods. More problems arise from wide spontaneous or pharmacological variations in PRL plasma levels than from technical determination. prolactin - enzyme immuno-assay- physiological variations

Introduction

Techniques

Plusieurs m~thodes immuno-enzymatiques sont disponibles aujourd'hui pour le dosage de la prolactine (PRL) dans le plasma ou le s~rum. Nous rapportons ici les r~sultats de I'~valuation de la technique propos6e par la soci~t~ BoehringerMannheim sous le nom d'Enzymun-test Prolactine. Tous nos essais ont ~t~ effectu~s entre f~vrier et avril 1988; 4 autres laboratoires europ~ens ont particip~ avec nous & cette ~valuation. Nous ferons 6tat, le cas ~ch6ant, de leurs conclusions.

L'Enzymun-test Prolactine est une m~thode ,,sandwich,, en une 6tape. U~chantillon & doser (50/JI) est mis dans un tube rev~tu d'un anticorps monoclonal anti-PRL. On y ajoute un deuxi~me anticorps anti-PRL reconnaissant un autre ~pitope de la molecule et marqu~ par la peroxydase. Apr~s incubation de 30 min ~. la temperature ambiante, un lavage ~limine I'exc~s d'anticorps marqu~ et le s~rum. Une deuxi~me incubation de 30 min avec le chromog~ne induit une coloration

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directement proportionnelle & la concentration de la prolactine. Une gamme de 7 standards (0 & 402 pg/I) permet la construction de la courbe de calibration. Tousles prel~vements initiaux ont ete effectues au moyen d'un pipetteur-diluteur programmable Gilson, dont les ringages ont ~t~ particuli~rement soign6s. La methodologie generale de nos essais a ete celle que recommande la section de standardisation de la Societe frangaise de biologie clinique

Tableau II. Reproductibilit~ interessais.

PN (N=17) PP (N--17) Pool 4 (N=10) Pool 5 Pool 6

m +_.sm ~g/I

CV %

10,13 + 0,20 35,77 + 0,37 7,11 + 0,25

8,3 4,3 11,2

36,46 + 0,91 98,92 + 2,78

7,9 8,9

[1]. Limite de d#tection Etude de la precision Reproductibilit# intra-essais (r#p#tabilit#) Elle a ~te mesuree sur 2 serums de contr61e, fournis par le fabricant, dits Precinorm (PN) et Precipath (PP) et sur 3 pools de serums toutvenant, dont les concentrations en prolactine avaient ete estimees au prealable. Vingt mesures ont ete effectuees sur chaque echantillon. Le Tableau I indique les valeurs trouvees et leurs coefficients de variation calcules sur les concentrations - ils sont un peu plus faibles si on les calcule sur les densites optiques (l'autre laboratoire utilisant ES 22 affiche des CV de 5,1 & 5,5%, pour des valeurs de prolactine de 12,68 & 69,30 pg/I). Reproductibilit# interessais Elle a ete determinee sur les m~mes serums de contr61e (PN et PP) d'une part, (17 determinations du 8 fevrier au 15 mars 1988) et sur 3 pools de serums tout-venant d'autre part, differents de ceux utilises dans I'essai precedent (10 determinations, du 22 fevrier au ler mars 1988). Tous les dosages sont faits en triple exemplaire. Les resultats figurent dans le Tableau II (le laboratoire italien obtient des CV de 4,7 & 6,2% pour PN et PP et de 5,8 & 9,6% pour les pools de s~rums de 12,5 & 75 pg/I).

Elle a ete determinee par 2 methodes differentes. Vingt mesures en triplets du standard zero dans des series de dosages donnent des densites optiques leg~rement sup~rieures ~. celles du blanc-reactif de la m6me serie, correspondant une concentration fictive en prolactine de 0,157 /zg/I (ET = 0,1667). En se referant au protocole precite de la SFBC, la limite de detection calculee avec un risque d'erreur de 5% s'~tablit & 0,78 pg/l. Reprenant les calculs sur 30 essais successifs par la methode proposee recemment ici m~me par Baud et al. [2], cette limite s'etablit ~. 0,83 pg/I pour un risque d'erreur de 1%. Lin~arit6

La solution standard la plus concentree (402 pg/I) a ete diluee 6 fois successivement du 1/2 au 1/64 dans la solution standard de concentration nulle. Le dosage en triple exemplaire montre (Fig. 1) une superposition parfaite des valeurs observees et des valeurs theoriques entre 0 et 50 pg/I. Au-

pg/l

200

Tableau I. Reproductibilit~ intra-essais.

PN PP Pool 1 Pool 2 Pool 3

100

m +_sm I~g/I

CV %

9,70 + 0,11 37,34 + 0,70 6,76 + 0,10 59,44 -+0,87 222,68 + 3,33

5,1 8,6 6,8 6,6 6,7

IO0

200

pg/!

Fig. I. Lin~arit~.Valeurs th~oriques et r~ellesde 7 concentrations obtenues par dilutiondu standard ~ 402 ~ug/l.

Evaluation d'unetechniqueimmuno-enzymatiquede dosagede la prolactine del&, de 100 & 402 pg/I, les valeurs mesurees sont superieures de 3 & 11% aux valeurs theoriques. Ce phenom~ne, dont rexplication nous echappe, a ete verifi& son incidence sur la signification des resultats est faible; aux taux eleves de prolactinemie, une erreur de 10% est tolerable, meme si elle est regrettable.

s6rums construes au laboratoire et 74 serums de patients tout-venant. Deux constatations peuvent etre tirees de ces comparaisons : 1) la correlation entre les 3 methodes immunoenzymatiques est satisfaisante. Les coefficients de correlation entre Enzymun-Test d'une part, Enzelsa Cis-Oris et Prolactine EIA bioMerieux d'autre part sont respectivement de 0,96 et 0,97; 2) rexamen des valeurs comparees et leur representation graphique (Fig. 2) montrent clairement qu'Enzymun-test donne des valeurs presque toujours plus elevees que les 2 autres methodes, Iorsqu'elles sont exprimees en concentrations ponderales. Ces divergences s'expliquent au moins en partie par le fait que les facteurs de conversion des standards par rapport & I'etalon de reference, le meme dans les 3 cas, different d'un reactif & rautre : pour Enzymun-test, la correspondance est de 1 #g pour 17 mU; pour Enzelsa Cis-Oris, elle est de 1 pg pour 30 mU; pour Prolactine EIA bioMerieux, elle est de 1 #g pour 32 mU. Effectivement, comme on peut le voir sur la Figure 3, la correspondance est meilleure entre les 3 methodes apr~s conversion des concentrations ponderales en unites. II persiste neanmoins une legOre difference, plutSt inverse de la precedente. II faut ajouter que nous avons observe quelques distorsions tr~s importantes et pouvant avoir des consequences cliniques entre les techniques Enzymun-test Prolactine et Enzelsa CisOtis d'une part et Prolactine EIA bioMerieux d'autre part, cette derni~re donnant des chiffres franchement anormaux (61 et 40,5 ng/ml) alors que les premieres sont dans la fourchette normale. Ces resultats, dOment verifies, doivent s'expliquer par des differences dans la nature des anticorps utilises dans les reactions, face & des formes moleculaires variables de prolactine [4].

Recherche de la contamination La pratique des dosages en triple exemplaire, systematique au cours de cette etude, met facilement en evidence une contamination eventuelle d'un tube par celui qui le precede. L'effet contaminant, calcule selon la formule de la commission Instrumentation de la section Standardisation de la SFBC [3] est de 0,5%. C'est un pourcentage negligeable dans la quasi-totalite des cas. II ne semble donc pas utile de modifier le protocole du dosage pour s'en premunir, vu la rarete des prolactinemies egales ou superieures & 400 #g/I.

Comparaison de m#thodes Plus de 100 dosages ont ete pratiques par 3 methodes immuno-enzymatiques : - Enzymun-test Prolactine Boehringer-Mannhelm; Enzelsa-Prolactine Cis-Oris; Prolactine-EIA bioMerieux.

-

-

Tous ont ete effectues en doublets ou triplets et selon le protocole recommande par le fabricant. Les dosages ont porte sur les serums de contrSle Ciba Coming et Lyphocheck & 3 niveaux de concentration, les serums de contr(~le Boehringer-Mannheim Precinorm et Precipath, 3 pools de

100:

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55

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BioM6rieux

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I I I~L le0

Fig. 2. Valeurs compar0esde 74 prolactin6miesdos~es par les r~actifs Enzymun-test(en abscisse) et Enzelsa Cis-Orisou EIA bioM(}rieux(en ordonn~e)en #g/I.

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2500

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Enze]sa Cis Otis m U/L

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2500

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2500

Fig. 3. Valeurs compar~esde 74 prolactin~miesdos(~espar les r6actifs Enzymun-test(en abscisse) et EnzelsaCis-Oris ou EIA bioM6rieux (en ordonn6e)en mU/l.

Au total, la comparaison de ces 3 m~thodes immuno-enzymatiques qui utilisent le m~me principe, permet d'esquisser comme suit leurs avantages et inconv~nients respectifs : au plan de la sensibilit6, la limite de d~tection est proche de 0 pour Enzymun-test et Enzelsa Cis-Oris, elle est voisine de 5 pour EIA bioM~fieux - mais cette precision est rarement n~cessaire; - au plan de I'exactitude, et en I'absence de m~thode de r~f~rence, il est difficile de conclure. Les 2 premieres sont assez concordantes, la troisi~me a donn~ & 3 reprises des valeurs franchement discordantes, et par 2 fois anormalement ~lev~es; au plan de la r~p~tabilit~, Prolactine EIA bioM~rieux montre souvent, dans ses triplets, des valeurs plus rapproch~es que les autres; au plan de la r~alisation technique, I'avantage principal du r6actif de Boehringer r~side dans I'automatisation de la plus grande partie de la technique, conduisant & un gain de temps, un moindre risque d'erreur et sans doute une precision plus grande. En I'absence d'automate, la technique Boehringer serait sans doute en concurrence ~quilibr~e avec les 2 autres techniques que nous avons test~es. D'autres laboratoires ont pu comparer Enzymun-test Prolactine et diverses trousses de radioimmunologie. La correspondance est excellente avec les trousses Amersham et Serono, un peu moins avec les r~actifs Hybritech et Becton Dickinson. Au plan pratique, on ne peut que rappeler, une fois encore, qu'il est essentiel pour un laboratoire -

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de pr~ciser ses valeurs de r~f~rence, li~es & la technique qu'il utilise.

Influence des conditions de pr&l~vement II est reconnu que le ,,stress,, de la ponction veineuse provoque une d~charge de prolactine. II est souvent conseill~ de n'effectuer le pr61~vement sanguin pour le dosage qu'une vingtaine de minutes apr~s la mise en place de I'aiguilie dans la veine. Nous avons voulu v~rifier le bien-fond~ de cette pratique en effectuant chez 40 sujets une s~rie de dosages espac~s de 10 & 20 min apr~s mise en place d'un cath6ter veineux souple. Les constatations que nous avons faites ne sont pas univoques. Dans 40% des cas environ, la prolactin~mie reste stable durant les 20 ou 30 min qui suivent la pose du catheter. Autant de fois, la prolactin~mie diminue de plus de 2 fois I'~cart type par rapport & sa valeur initiale (de pros des 4/5 de cette valeur chez un sujet : 32,9 & 7,3 /~g/I en 30 min); la stabilit~ ~tant presque toujours atteinte en 20 & 30 min. Chez 20% de nos sujets enfin, le taux observ~ & 15 ou 20 min est significativement plus ~iev~ que le taux de d~part (jusqu'& 150% d'augmentation dans un cas). Ce pic est toujours r~sorb~ & 30 ou 40 minutes de la ponction initiale. Si le ,,stress,, de la phl~bocent~se peut expliquer cette d6charge de la premiOre heure, il ne peut ~videmment ~tre tenu pour responsable des valeurs ~lev6es observ~es au moment m~me de la ponction; celles-ci ne peuvent relever que du

Evaluation d'une technique immuno-enzymatique de dosage de la prolactine

Sur ces variations assez amples, se greffent de fagon tr~s nette chez certains sujets des oscillations plus br~ves, de p6riode 1 h 30 ~. 2 h 30, ~voquant clairement une s~cr~tion ~. caract~re pulsatile. Cette pulsatilit~ nous est apparue plus nette chez les sujets f~minins que chez les hommes.

stress de I'anxidtd pr~alable au pr~l~vement. Ces d~charges de prolactine li~es au stress sont-elles suffisamment importantes pour induire en erreur le clinicien et lui faire suspecter & tort une hyperprolactin~mie pathologique ? Tout d~pend des limites que I'on assigne aux valeurs <>. Si I'on se rdf~re aux donn~es classiques pour I'adulte, avec limite sup~rieure de la normale & 20 /Jg/I, 8 de nos sujets d~passent cette valeur (un seul atteint 32/xg/I). Ceci nous para~t justifier une remise en question de cette limite sup~rieure.

Va/eurs de r6f6rence

Compte tenu des influences que nous venons de signaler et en fonction de notre experience actuelle portant sur plusieurs centaines de dosages, nous proposons les valeurs de r~f6rence ci-dessous pour la prolactin6mie basale mesur~e par Enzymun-test Prolactine BoehringerMannheim, sur un pr~l~vement effectu~ & jeOn, au moins une heure apr~s le r~veil [5] : • hornmes normaux : 3 ~. 25/Jg/I; • femmes normales : en p6riode d'activit~ g~nitale : 5 & 30 /xg/I, m~nopaus~es : 5 ~. 30 IJg/I, enceintes : la prolactin~mie augmente progressivement avec I'&ge de la grossesse, jusqu'& 400 pg/I dan s nos essais. Mais la dispersion des taux observes est telle qu'on ne peut en tirer aucun enseignement utile, dans I'~tat actuel de nos connaissances (nous n'avons pas I'exp~rience de ce dosage chez I'enfant). Enfin, il n'est pas inutile de rappeler qu'un nombre considerable de molecules utilis~es en th~rapeutique sont susceptibles d'61ever la prolactin~mie (psychotropes, antihistaminiques, hypotenseurs, anti~m6tiques, isoniazide, amphetamines, antimitotiques, stup~fiants, etc.). Une enqu~te insistante sur les m6dications prises par les malades chez lesquels est demand~ un dosage de prolactine devrait Otre syst~matique de la part du biologiste.

Variations nycth~m&rales de la prolactin~mie

Bien classiques elles aussi, nous les avons retrouv~es dans une ~tude syst~matique effectu~e chez 10 sujets normaux, porteurs d'un cath6ter veineux & demeure. Des pr~16vements sanguins r~alis~s toutes les 20 min pendant 24 h ont permis de tracer la courbe des variations spontan6es de la prolactin~mie (Fig. 4). Outre les effets d~j& signal,s du stress, on y observe une hypers~cr~tion nocturne, survenant le plus souvent en fin de nuit et li~e davantage au sommeil lui-m~me qu'au d~cubitus ou ~. I'obscurit~. Cette pouss~e atteint 4 ~ 16 fois la valeur basale enregistr~e en soiree. Elle aussi peut d~passer largement les 20/Jg/I, consid~r~s comme limite sup~rieure de la normalit~ (jusqu'& 55 /Jg/I dans un cas). Deux fois, la sieste de I'apr~s-midi, avec endormissement, s'est accompagn~e ~galement d'une ~l~vation de la prolactin~mie de 7 & 20 IJg/I dans un cas, de 6 & 24 /Jg/I dans I'autre. Au r6veil, la prolactin~mie descend en 1 h environ son niveau le plus bas du nycth~m~re; un autre minimum s'observe le soir entre 18 et 20 h. On rencontre parfois aussi une discrete augmentation postprandiale de la prolactin~mie.

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Fig, 4. Courbe type des variations de la prolactin~mie au cours du nycth~m~re.

1 10

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a 16 heures

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Conclusions

Refdrences

Le dosage de la Prolactine par Enzymun-test Prolactine Boehringer-Mannheim nous a paru simple & r6aliser, surtout quand on dispose d'un automate (ES 22, par exemple) qui assure des dur~es d'incubation parfaitement constantes. La repmductibilit~, la limite de d~tection et la lin~arit~ sont satisfaisantes. Un risque faible de contamination existe ~ partir des concentrations de I'ordre de 400 pg/litre. La correlation avec d'autres m6thodes immuno-enzymatiques est bonne, bien que I'Enzymun-test tende & donner des valeurs un peu sup~rieures aux autres (problame d'~talonnage). L'interpr~tation d'une hyperprolactin~mie, surtout si elle est mod~r6e, pose plus de problOmes que la technique elle-m~me, tant sont nombreuses les influences qui peuvent perturber ce param~tre et labiles les taux s~riques de I'hormone.

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