- Email: [email protected]
Etude des parois d'une souche de Micromonospora
BIOCHIMIE, 1973, 55, 605-611.
Etude des parois d'une souche de
Micromonospora.
II. (*) Les polysaccharides (**). H. TABAUD, J.-C. MASSOT et E. VILKAS.
Institut de Chimie des Substances Naturelles. CNRS, 91190 Gi[-sur-Yvette.
Summary. -- The cell walls of Micromonospora have been shown to contain an important polysaecharide fraction. This component obtained by gel filtration of a trichloroacetic acid extrait contains mannose, D-xylose, N-acetylglueosamine and phosphoric acid. The that : 1 -2 -3 --
results of partial hydr~l'ysis, methylation and periodic oxidation studies suggest the polysaccharide is branched the glycosidic linkages occur mostly in 1.-3 phosphoric acid esterifies N-acetylglucnsamine on the 6-position.
INTRODUCTION. Les Micromonospora font partie, de l ' o r d r e des Actinomycdtales [1]. Les Actinomyc6tes o c c u p e n t u n e p o s i t i o n i n t e r m 6 d i a i r e entre les bact6ries dont ils se r a p p r o c h e n t p a r certaines de leurs formes (bacilles, coques) et p a r la l a r g e u r de leurs filam e n t s (1 ~), et les c h a m p i g n o n s , dont ils pr6sentent le thalle ramifi6. Le fait que leurs parois ne c o n t i e n n e n t n i chitine, ni cellulose les situe plut6t p a r m i les bact6ries. L'absence des st6rols dans les lipides de Micromonospora [2] est 6galement en faveur de cette classification. Dans le cadre d ' u n e 6rude t a x o n o m i q u e , Cumm i n s et Harris [3] 6tudient les c o n s t i t u a n t s des parois de cinq souches de Micromonospora. Yamaguehi [4] publie ensuite une dtude c o m p a r a t i v e de la composition des parois des Actinomyc6tales off, il i n c l u t deux souches de Micromonospora. D'apr6s ces auteurs, les parois de Micromonospora ne cont i e n d r a i e n t pas de sucres caract6ristiques. Or, l'6tude des parois d ' u n e souche de Micromonospora que nous avons e n t r e p r i s e m o n t r e q u ' e n plus du p e p t i d o g l y c a n e compos6 d ' a l a n i n e , d ' a c i d e glutamique, d'acide diaminopim61ique, de glyeine, de glueosamine et d'acide m u r a m i q u e , ces p a t o i s cont i e n n e n t u n e i m p o r t a n t e partie p o l y s a c c h a r i d i q u e phosphorylde. Les deux fractions ont p u 6tre sdpar6es p a r extraction des parois au m o y e n de l'acide trichloroac6tique [5, 6]. (*) I. voir r~f. [5]. (**) Ce travail fail partie de la Th6se de 3" Cycle soutenue par Mne H. Tabaud h l?Universitd de ParisSud, Centre d'Orsay, le 19. mrai 1972. Dddid a u Professeur E. Lederer en l'honnenr de son 65' anniversaire.
L'analyse de la partie p o l y s a c c h a r i d i q u e obtenue h p a r t i r de eet extrait fait l'objet de la pr6sente note.
MATERIEL ET MIETHODES. La souche de Micromonospora Sp F3 utilisde dans ce travail a 6t6 a i m a b l e m e n t raise h notre disposition p a r le Dr. H. A. Lechevalier (Rutgers University, New B r u n s w i c k ) . Le mode de c u l t u r e e t l a p r 6 p a r a t i o n des parois purifi6es ont 6t6 d6crits r 6 c e m m e n t [5, 2] ( ' ) . Les analyses qualitatives et quantitatives d'acides et de sucres amin6s sont effectu6es sur les hydrolysats des parois ou des p r o d u i t s de leur d6gradalton partielle h l'aide de l ' a u t o a n a l y s e u r de Beckman, Model 120 B. Les sucres amin6s sont dosds selon la m6lhode d'Elson-Morgan modifide p a r B i m i n g t o n [7]. Le dosage de p h o s p h o r e est fait selon King [8]. Les sucres neutres sont dos6s soit p a r la m6thode au phdnol-aeide s u l f u r i q u e [9], soil p a r l ' a n t h r o n e [10], soit p a r la t e c h n i q u e de WiIson aprbs leur s6paration c h r o m a t o g r a p h i q u e [11]. ,Les h y d r o l y s e s acides sont effectu6es dans l'acide c h l o r h y d r i q u e : a) 0,1 N ; b) 1,5 N ; c) 6 N •~ 1(~0° p e n d a n t des dur6es variables. (*) Nous avons utilisd les patois du myedlium et des spores ayan,t vdrifid au prda~lable que leur composition qualitative est identique. Nous remercions MTM E. Zissmann (Service de Microbiologie, ICSN) pour les cultures de Micromonospora.
H. Tabaud, J.-C. Massot el E. Vilkas.
606
Les h y d r o l y s e s alcalines sont faites p a r chauffage du p r o d u i t dans NaOH N fi 60 ° p e n d a n t 6 heures. Les c h r o m a t o g r a p h i e s sur p a p i e r W h a t m a n N ° 1 ou N ° 3 et sur c o u c h e m i n c e de silicagel Merck (F 254) sont effectu6es dans les m61anges de solvants suivants : A. B. C. D. E. F. G. H.
n - b u t a n o l - a c i d e ac6tique-eau (4:1:5) n - b u t a n o l - p y r i d i n e - e a u (fi:4:3) ac6tone-eau (9:1) a c 6 t o n e - e a u - a m m o n i a q u e (250.3:1,5) n - b u t a n o l - 6 t h a n o l - e a u - a n l m o n i a q u e (40:10:49:1) n - p r o p a n o l - a m m o n i a q u e - e a u (6:3:1) n - p r o p a n o l - e a u (70:10) m 6 t h a n o l - a c i d e f o r m i q u e - e a u (85:15:5) ascendante.
traits h l'6ther, et concentr6s p a r l y o p h i l i s a t i o n . A un v o l u m e de la solution acide on ajoute 5 volumes d'6thanol glac6, il se f o r m e un pr6cipit6 b l a n c qui est s6par6 p a r c e n t r i f u g a t i o n (320 rag). I1 est ensuite lay6 p a r l'ac6tone, puis p a r l'6ther p o u r 61iminer l ' a c i d e t r i c h l o r a c 6 t i q u e r6siduel. Ce pr6cipit6 est ensuite soumis aux analyses qualitatives et q u a n t i t a t i v e s de ses constituants et c h r o m a t o g r a p h i 6 sur S e p h a d e x G 50 (fig. 1).
Oxydation periodique de la fraction C (fig. 1). 7,2 mg de la f r a c t i o n C sont oxyd6s p a r 4 ml de p e r i o d a t e de s o d i u m 0,05 M h la t e m p 6 r a t u r e ambiante p e n d a n t 5 jours h l'obscurit6. L'exc6s de o.s.
o,7.
Les r6v61ations utilis6es sont : - - le phtalate d ' a n i l i n e p o u r les sucres r6ducteurs et leurs d6riv6s m6thyl6s [12] ; --le n i t r a t e d ' a r g e n t alcalin [13] et l ' a c i d e p e r i o d i q u e - b e n z i d i n e [14~ p o u r les p o l y o l s ; - - le r6actif m o l y b d i q u e p o u r les esters phosp h o r i q u e s [15] ; - - la n i n h y d r i n e p o u r les compos6s amin6s ; --le r6actif d'Elson-Morgan p o u r les sucres amin6s [16] ; - - le r6actif de S h a r o n p o u r les sucres amin6s N-ac6tyl6s [17] ; --- le r6actif fi la d i p h 6 n y l a m i n e , aniline, a c i d e o r t h o p h o s p h o r i q u e p o u r les sucres r 6 d u c t e u r s et leurs d6riv6s m6thyl6s [18]. P o u r les c h r o u m t o g r a p h i e s sur gel, les S e p h a d e x G 50 (fine) et G 100 (fine) ( P h a r m a c i a Uppsala) sont employ6s. Toutes les c h r o m a t o g r a p h i e s des sucres m~thy16s en phase gazeuse sont faites h l ' a i d e d ' u n appareil (< Chromagaz CG 1 Pro.fit m u n i d'un d6tecteur i o n i s a t i o n de flamme, le gaz v e c t e u r 6tant r a z o te ; c o l o n n e (2 m X 4 ram) de p o l y s u c c i n a t e de b u t a n e d i o l fi 15 p. cent.
Extraction des parois par racide trichlorac~tique [5, 19]. Les p a r o i s d61ipid6es (1 g) sont homog6n6is6es dans 100 ml d ' a c i d e t r i c h l o r o a c 6 t i q u e ~ 10 p. cent et laiss6es en c o n t a c t p e n d a n t 24 h ~ 4 ° sous agitation m 6 c a n i q u e . Le s u r n a g e a n t (~) est s6par6 p a r c e n t r i f u g a t i o n et on r e c o m m e n c e l ' e x t r a c t i o n dans les m~mes c o n d i t i o n s p e n d a n t 72 h. Apr6s centrifugation, les deux s u r n a g e a n t s sont r6unis, ex(*) La fraction insol.ublc darts l'acide trichloroac~tique eM: constitute par le peptidogtycane pratiquemerit d~pourvu de sucres r~ducteurs.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 5.
o.6.
---.
~,~o~
B
~o,s. ®
i
~.4
A
D
0.2.
O,I.
do
"
~o
~oo
~.a
4o
FIG. 1. - - Filtration de la fraction po,lysaecharidique (120 mg) sur eol,onne de Sephadex G 50 (2,5 cm X 70 em). Elution par l'eau ; fractions de 1 ml Vo -=139 ml ; V° + V~ = 1181) ml.
r6actif est d6truit p a r l ' a d d i t i o n d'6thyl6ne-glycol. Le m61ange r 6 a c t i o n n e l est ensuite r e f r o i d i fi 0 ° et additionn6 d'6thanol. L ' i o d a t e de s o d i u m form6 est filtr6. La solution aqueuse est c o n c e n t r 6 e et le p r o d u i t h y d r o l y s 6 p a r l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e 2N p e n d a n t 3 h e u r e s fi 1(~0°. L ' h y d r o l y s a t est chrom a t o g r a p h i 6 dans les solvants A et B : il c o n t i e n t du m a n n o s e (Rf dans A = 0,2~)), du xylose (Rf dans A = 0,28) et de la g l u c o s a m i n e (Rf dans A = 0,13). Une o x y d a t i o n p e r i o d i q u e p e n d a n t un t e m p s plus court (68 h) d o n n e des r6sultats similaires.
D~gradation de Smith [20]. Le p r o d u i t oxyd6 c o m m e ci-dessus est a d d i t i o n n6 de 10 m g de NaBH 4. Apr6s 18 h de c o n t a c t h la t e m p 6 r a t u r e anabiante, la solution est trait6e p a r le Do-,vex 50 H + (~00-400 mesh) et d6barrass6e du b o r a t e p a r 6 v a p o r a t i o n r6p6t6e sous v i d e avee du m6thanol. Le p r o d u i t de r 6 d u e t i o n est h y d r o l y s 6 c o m m e ci-dessus et c h r o m a t o g r a p h i 6 sur p l a q u e
Patois de M i c r o m o n o s p o r a .
607
de cellulose et sur p a p i e r W h a t m a n N ° 1 dans les solvants A, B e t C. La r6v61ation p a r le nitrate d ' a r g e n t i n d i q u e la pr6sence de glyc6rol (Rf = 0,46 dans A, et 0,55 dans C), de traces d ' 6 r y t h r i t o l et d ' u n e tache au n i v e a u de la giucosamine (Rf 0,13 dans A, Rgzu = 0,8,1 dans B). Cette d e r n i 6 r e se r6vble 6galement p a r la n i n h y d r i n e . La r6v61ation p a r le r6actif de P a r t r i d g e m o n t r e des taches au n i v e a u du m a n n o s e et du xylose.
La composition des parois purifi6es de Micromonospora SpF3 est i n d i q u 6 e dans le tableau I.
M~thylation de la [raction C selon Hakomori [21].
Extrait trichloracdtique.
20 mg du p o l y s a e c h a r i d e dissous dans 1 ml de dim6thyl sulfoxide sont a d d i t i o n n 6 s d ' u n e solution de m6thyl sulfinyl c a r b a n i o n [22] et d ' u n exc6s d ' i o d u r e de m6thyle. La r6action se p o u r s u i t 18 heures h la t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e sous agitation, Le p r o d u i t r 6 a c t i o n n e l est ensuite extrait au chloroforme. Son spectre IR m o n t r e la d i s p a r i t i o n de la b a n d e h 3 3~)0 cm-1 due aux hydroxyles.
lls sont identifi6s p a r c o m p a r a i s o n de leur comp o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e avec celui des t6m o i n s a u t h e n l i q u e s (*).
R]~SULTATS ET DISCUSSION.
L ' e x t r a c t i o n p a r l ' a c i d e t r i c h l o r a c 6 t i q u e h 10 p. cent [5, 19] des p a r o i s de Micromonospora suivie de la p r 6 c i p i t a t i o n de la solution acide au m o y e n de l'6thanol fournit, avec u n r e n d e m e n t de 32 p. cent, u n e f r a c t i o n p o l y s a c c h a r i d i q u e dont la composition figure darts le tableau II. Les parties aliquotes de cette f r a c t i o n sont soumises ~ diff6rentes c o n d i t i o n s d ' h y d r o l y s e acide.
TABLEAU I.
Composition des patois de Micromonospora SpF3. Acides amin6s I glycine [ ac, glutamique 4Sucres amin6s (') Sucres neutres {'~) ac. diaminopim6lique, alanine 26 p. cent
[
20 p. cent
16 p. cent
Phosphore
Glyc6rol
Galactitol
R6sidu minfiral
1,3 p. cent
÷
+
8 p. cent
(*) Calcul,6 en glucosamine. C*)Calcul6 en xylose. TABLEAU ]L
Composition de la [raction polysaccbaridique brute. Acides amin6s
Sucres amin6s (')
Sucres neutres (")
Phosphore
[
7 p. cent
25 p. cent
25 p. ccnt
2,2 p. cent
i
Glyc6rol
-I-
Galactitol
+
(*) Calcul6 en glucosami.ne. (**)Calcul6 en xylose.
La substance perm6thyl6e est soumise soit fi la m6thanolyse (dans le m 6 t h a n o l absolu c o n t e n a n t 4 p. cent de HCl gazeux), soit h l ' h y d r o l y s e p a r HCI 2N ; les p r o d u i t s obtenus sont chromatographi6s : 1) en phase gazeuse ; le temps de r 6 t e n t i o n (TG) est exprim6 p a r r a p p o r t h celui du m6thyl-2, 3, 4, 6-t6tra O-m6thyl aD glucoside ; 2) sur la plaque de Silicagel G dans le solrant D ; 3) s u r p a p i e r dans le solvant E.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 5.
L ' h y d r o l y s e p a r l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e 1,5 N fi 100 ° p e n d a n t 4 heures lib6re comme sucres r6ducteurs du m a n n o s e , du xylose, du glucose (Rf respectifs dans le solvant A : 0,20 ; 0,28 ; 0,18) et des traces d ' a r a b i n o s e et de galactose et, comme sucre amin6, de la glucosamine (Rf : 0,13) (identifi6s p a r c h r o m a t o g r a p h i e s sur p a p i e r dans les sol(*). N.ous remereions le Professeur A. M. Stephen (University of Cap Town), le Professeur E. Percival (Royal Halloway College) et ~l~eDooteuv P. A. J. Gorin (Prairie Regional Laboratory, Saskatoon), pour les ~ehan.ti.llons de d~riv~s m~thyl~s de xyl.ose et de mannose.
40
H. Tabaud, J.-C. Massot el E. Vilkas.
608
v a n t s A e t B). Le m a n n o s e , le x y l o s e et le g l u c o s e se t r o u v e n t d a n s u n r a p p o r t m o l a i r e a p p r o x i m a t i f d e 3:2:0,75.
v a n t H, W h a t m a n N ° 1 ; v o l u m e d ' 6 1 u t i o n 45 m l s u r l a r G s i n e B e c k m a n P A 28, t a m p o n c i t r a t e d e s o d i u m 0,20 N p H = 3,20).
TABLEAU III.
Composition de ~ pics obtenus par filtration sur Sephadex G 50. Pie
A B(')
Mannose
Xylose
÷ ÷
÷ + ÷
D
Glucose I Atabinose Galactose
÷ ÷
+
I
÷
Glucosa-~iPhosphore mine
÷ +
÷ ÷ ÷ ÷
GlycGrol
Galactitol
÷
(*) Le pic B r e e h r o m a t o g r a p h i 6 sur Sephadex G 100 f o u r n i t deux f r a c t i o n s d o n t la seconde, l a p;ius i m p o r t a n t e (80 p. c e n t ) c o n t i e n t u n i q n e m e n t du m a n n o s e et d u xylose. La 1 r° f r a c t i o n c o n t i e n t 6galement du glucose. Les pics C et D s e m b l c n t homog~nes darts les m~mes conditions. Le pi'c A n'a pas 6t6 6tudi6 en dGtail.
L'hydrolyse par l'acide chlorhydrique 0.1 N h 100 .° p e n d a n l 10 m i n l i b ~ r e d e l a N - a c 6 t y l g l u c o samine, identifi6e par chromatoga-aphie sur papier d a n s le s o l v a n t F et s u r t o u c h e m i n c e d a n s le solr a n t G ( R f = 0 , 6 6 - F ; 0,56-G).
L'hydrolyse totale par l'acide chlorhydrique 6 N p e n d a n t 24 h e u r e s h 105 ° l i b b r e les c o m p o s G s a m i nGs s u i v a n t s : a c i d e g l u t a m i q u e , g l y c i n e , a l a n i n e , a c i d e d i a m i n o p i m G l i q u e et g l u c o s a m i n e e n p r o p o r tions suivantes : 4,5:10:4:4:53.
FIG. 2 : a) D i a g r a m m e d ' u l t r a c e n t r i fugafion du polysaccharide C en sol.ution d a n s C1Na 0,1 M, c o n c e n t r a t i o n 5 m g / m l . Glich~ pris 98 m i n u t e s apr~s avoir a t t e i n t la pl'eine vitesse - - 67 77.0 t o u r s / m i n u t e (inclinaison de la b a r r e 500). b) D i a g r a m m e de la solu.tion prGcGdente en fronti/~re pr~for~n~e, apr~s dialyse contre G1,Na 0,1 M e t ~limination. des p r o d u i t s plus lour&s ; vitesse du r o t o r de 19 160 t o u r s / m i n u t e .
L'hydrolyse partielle par l'acide chlorhydrique 6 N p e n d a n t 20 r a i n h 100 ° p e r m e t d ' o b t e n i r l a g l u c o s a m i n e 6 - p h o s p h a t e (Rf = 0,78 d a n s le sol-
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 5.
La fraction polysaccharidique intacte chromat o g r a p h i G e s u r le S e p h a d e x G 50 d o n n e 4 p i e s ( v o i r f i g u r e 1) d o n t l a c o m p o s i t i o n est i n d i q u G e
Patois de Mieromonospora. dans le tableau III. (Les dosages quantitatifs et qualitatifs des eonstituants ont p e r m i s la caractdrisafion des diff6rents pies). Seuls les r6sultats c o n c e r n a n t la substance qui c o r r e s p o n d au p i e C sont r a p p o r t d s ei-dessous (*L
Polysaccharide C. D'apr~s son c o r n p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e sur gel ( S e p h a d e x G 50 et G 160) il p e u t O r e consid6r6 cornrne homogbne. L ' u l t r a c e n t r i f u g a t i o n analytique confirme l'hornogdn6itd du p r o d u i t : le diag r a m m e de sddirnentation m o n t r e l ' e x i s t e n c e d ' u n pie p r i n c i p a l dont le coefficient de s 6 d i m e n t a t i o n est $2o~ ~ 1,05. On o b s e r v e c e p e n d a n t les c o m p o s6s plus lourds ( e n v i r o n l 0 p. cent) qui sddirnentent tr~s r a p i d e m e n t clans le fond de la c u r e .
609
P a r h y d r o l y s e partielle, la glucosamine-6-phosp h a t e a pu 6tre isolde /t p a r t i r de la substance C, comrne prdeddernrnent h p a r t i r de l ' e x t r a i t tric h l o r o a c d t i q u e intact. Toutefois, le r a p p o r t a e i d e p h o s p h o r i q u e : g l u e o s a m i n e sugg~re que seule une mole de sucre arnin6 p o u r r a i t 6tre est6rifi6e. Afin de vdrifier si le p r o d u i t c o n t i e n t les phosp h o d i e s t e r s labiles en m i l i e u alcalin nous l ' a v o n s sournis h u n e h y d r o l y s e alcaline rnais il ne sernble pas lib6rer de f r a g m e n t s p h o s p h o r y l 6 s de faible p o i d s rnol6culaire. P o u r d 6 t e r m i n e r l ' e n c h a i n e m e n t des oses, trois types d ' e x p 6 r i e n c e s ont 6td effeetudes : 1) o x y d a t i o n p e r i o d i q u e , Smith, 3) perrn6thylation.
2)
ddgradation
de
TABLEAU IV,
R~sultats de l'oxydation periodique et de la d~gradation de Smith e[fectudes sur le pic C. Mannose RI daas A : 0,20
+ --i
lO~Na BH~,
.
.
.
+
.
.
Xylose Glye6rol Erythr~tol Glucosamine Rf dabs A : 0,28 RI duns A : 0,t3 RI dabs A : 0,~6 RI duns A : 0,37
+
+
+
+
.
Le p o i d s m o l 6 c u l a i r e a 6td d6terrnin6 p a r 6quifibre de s 6 d i m e n t a t i o n en utilisant la rndthode de Ia courte c o l o n n e (Van H o l d e et Baldwin) [23~ ; p o u r une h a u t e u r de 0,15 cm l ' 6 q u i l i b r e est atteint au bout de 30,0 rnin, la vilesse de r o t a t i o n 6tant 19 160 t / m i n . Nous avons adopt6 p o u r le v o l u m e p a r t i e l spdcifique une v a l e u r 6tablie d'aprbs la c o m p o s i t i o n du p o l y s a c c h a r i d e . P o u r v = 0,7, le p o i d s rnol6culaire serait 10 000, si v = 0,6, M = 7 500 (*). La substance C c o n t i e n t 3 m o l e s de m a n n o s e , 2 moles de xylose, 4 moles de N-acdtylglucosarnine, 1 mole d ' a c i d e p h o s p h o r i q u e et une faible p r o p o r tion de glycine ( e n v i r o n 0,2 mole). (*) Les rdsultats prdliminaires concernant le pie D ont fair ]'objet d'une communication aux Xo J.olarndes de Chimie Biologique h Santa Marherita Ligure, 1971 [6~. II s'agit apparemrnent d'un nouveau type d'aeide teiehoique. (*), Ces ddterrni.nations du poids mol~eulaire ont dtd effectudes par Mal~ S. G~linand, Maitre de recherche au C.N.R.S., au laboratoire d,e Biologic Physieo-Chimique, Universitd de Paris-Sud (Centre d'Orsay). Nous la rernereions tr6s sine6rement pour ces essais et pour les fruetueuses di'seussions.
BIOCHIM1E, 1973, 55, n ° 5.
+
+
Les rdsultats de deux p r e m i e r e s m a n i p u l a t i o n s figurent dans le tableau IV. Le tableau V rnontre les d6rivds m6thylds identifids. TABLEAU V.
Les produits de la m~thanolyse el de l'hydrolyse du pic C perm~thyl& Temps de rdtention (T6) de mdthylglyeosides
R[ solvant D
0,42
0,78
1,5
0,63
3.1
0,37
0,78
0,73
2,55
0,54
3,3
0,54
O-mdthyl sucre identifid
2, 3, 4-tri-O-mdthyl-D-xylopyrannose 2, 4-di-O-mdthyl-D-xylopyrannose mono-O-mdthvl-x yl opyrannose
2, 3, 4, 6-tdtra-O-mdthyl-~-Dmannopyrannose 2, 4. 6-tri-O-mdtbyl-D-mannopyrannose 2, 3, 6-tri-O-mdthyl-D-mannopyrannose
610
H. T a b a u d , J.-C. M a s s o t et E. V i l k a s .
L ' o b t e n t i o n d ' u n d 6 r i v 6 t r i m 6 t h y l 6 d u x y l o s e et d ' u n d6riv6 t 6 t r a m 6 t h y l 6 d u m a n n o s e i n d i q u e q u e ces d e u x s u c r e s s e n t en p o s i t i o n t e r m i n a l e et q u ' i l s ne s e n t p a s r 6 d u c t e u r s . L a p r 6 s e n c e de d e u x sucres terminaux non r6ducteurs implique l'exisfence d'une ramification. Le g l y c 6 r o l o b t e n u p a r la d 6 g r a d a t i o n de S m i t h p r o v i e n t du m a n n o s e . L ' o b t e n f i o n d u 2, 4, 6 t r i O - m 6 t h y l m a n n o s e est en a c c o r d a v e c la p r 6 s e n c e , p a r r o t les p r o d u i t s d ' o x y d a t i o n p e r i o d i q u e , d ' u n m a n n o s e i n t a c t . E n effet, u n a l d o p y r a n n o s e e n g a g 6 darts u n e l i a i s o n g l y c o s i d i q u e en p o s i t i o n 3 n ' e s l pas o x y d 6 . L ' i d e n t i f i c a t i o n d ' u n 2, 4 - d i - O - m 6 t h y l x y l o s e i n d i q u e q u e le x y I o s e est 6 g a l e m e n t substitu6 en 3. P a r r o t les p r o d u i t s d ' o x y d a t i o n p e r i o d i q u e du p o l y s a c c h a r i d e , le x y l o s e i n t a c t a p u ~.tre c a r a c t 6 ris6. La p r 4 s e n c e de 2,3,6 t r i - O - m 4 t h y l m a n n o s e sugg6re u n e s u b s t i t u t i o n du m a n n o s e en 4. Q u a n t h la g l u c o s a m i n e , l ' i d e n t i f i c a t i o n d ' u n e f o r t e p r o p o r t i o n de ce s u c r e a m i n 6 i n t a c t apr~s l ' o x y d a t i o n p e r i o d i q u e s e m b l e e x c l u r e la l i a i s o n en p o s i t i o n 6. Au c o u r s d e la c h r o m a t o g r a p h i c en p h a s e g a z e u s e a u c u n d 6 r i v 6 m 6 t h y l 6 de la N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n e n ' a pu 6fre i d e n t i f i 6 . E n effet, ces d6riv6s s e n t r e t e n u s s u r la c o l o n n e utilis6e ( D . D ' a p r 6 s l ' e n s e m b l e de ces r6sultats, la s u b s t a n c e c o r r e s p o n d a n t au p i c .G s e r a i t u n p o l y s a c c h a r i d e r a m i f i 6 c o n t e n a n t e n t r e 12' h 1:5 r 6 s i d u s de m a n nose, 8 a 10 de x y l o s e , 16 /~ 20 de N - a c 6 t y l g l y c o s a m i n e , 4 "~ 5 d ' a c i d e p h o s p h o r i q u e et 1 de g l y c i n e . L a p l u p a r t des l i a i s o n s g l y c o s i d i q u e s s e m b l e n t 4tre en p o s i t i o n 3. La d 6 t e c t i o n d ' u n d6riv6 m o n o m 6 thyl6 du x y l o s e i n d i q u e r a i t ce s u c r e c o m m e p o r t e u r de la r a m i f i c a t i o n . E n c o n c l u s i o n , les p a r o i s de Micromonospora S P - F 3 s e n t c o m p o s 6 e s de d e u x c o n s t i t u a n t s p r i n c i p a u x : un p e p t i d o g l y c a n e [3, 5] et u n e f r a c t i o n p o l y s a c c h a r i d i q u e . R a p p e l o n s q u e C u m m i n s et H a r r i s [3~ en e x a m i n a n t la c o m p o s i t i o n de p a t o i s de c i n q s o u c h e s de Micromonospora c o n c l u e n t q u ' e l l e s n e c o n i i e n n e n t p a s de s u c r e s c a r a c t 6 r i s t i ques. Or, n o t r e t r a v a i l m e t en 6 v i d e n c e des quart(*). Nous naus proposons par la suite de m~thyl.er la fraction C par la m6thode de Kuhia et Trisehman [24]. Au eours de cette r~aetion, le groupement N--COGHa I
H reste intact ee qui permet de transformer les d6rivds m6t.hyl6s de ta N-ac6tylgltteosamine (apr6s d6sae~tylation et d~gradation par la ninhydrine) en d6ri~c~s m6~hyl6s de Uarabinose plus faeilement identifiables.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ~ 5.
tit6s i m p o r t a n t e s de m a n n o s e , de x y l o s e , de glucos a m i n e (qui ne dolt p a s 6tre c o n f o n d u e a v e c celle f a i s a n t p a t t i e du p e p l i d o g l y c a n e ) et de glucose. Ce d e r n i e r h e x o s e a ~t6 i d e n t i f i 6 d a n s la subs t a n c e c o r r e s p o n d a n t au p i c D off il s e m b l e li~ h u n a c i d e p o l y g l y c 6 r o p h o s p h o r i q u e [6]. L % t u d e des p a r o i s de d e u x a u t r e s s o u c h e s de Micromonospora (M. echinospora et M. pallida) p r o d u c t e u r s de la g e n t a m y c i n e , e n t r e p r i s e au l a b o r a t o i r e d o n n e des r~sultats s e m b l a b l e s (M. Yrib a r r e n , essais n o n publi6s). La f r a c t i o n p o l y s a c c h a r i d i q u e assez c o m p l e x e a p p a r a i t d o n e e o m m e s p 6 c i f i q u e de ces m i c r o o r g a n i s m e s .
Remerciements. N~tts remercions t.r~s ~'ivement Monsieur le Professeur E. 'Lederer pour l'iut~rbt port~ h e e travail. Ces reeherehes ont b~n~fici~ de subven,tious de la Ligue Nationale Fran~aise centre le Cancer et de la Fondation pour la Recherche M~dieale Franqaise.
Les parois de Mieromonospora sent form~es d'un peptidoglycane et d'une fraction polysaccharidique. Cette derni~re obtenue darts les condition.s d~erites pour l'i,solement de l'aeide teiehoique fourni,t par filtration sur gel quatre eompos~s dent un est analys6. I1 s'agit d'un polysaceharide de poids mol~cu.laire approximatif de 1,0 000 contenant du mannose, dtt D-xylose, de la 1~-ac6tyl.glueosamine et de ]'acide phosphorique en proportions mol~eulai.res 3:2:4:1. Les r~sultats des hydroiyses partiettes, de la perm~thylation, et de l'oxydation peri.od:iqtte indiquent : 1 - - 1 " e x i s t e n c e d'ttne ramification fie xylose et le mannose se trouvent t o u s l e s deux en position terminal e, non r6ducteurs) ; 2 - - que la plupart des liaisons glycesidiques sent en 1'-3 ; 3 - - qu'une mo.l~e de N-ae~tylglucosamine sur quatre est est6rifi~e par l'aeide phosphorique en position 6.
BIBLIOGBAPHIE. 1. Waksman, S. A. a Henriei, A. T. (1943) d. Baeferiol., 46, 337-341. 2. Tahaud, H., Tisnovska, H. & Vilkas, E. (1971) Bioehimie, 53, 55-61. 3. Cummins, C. S~ • Harris, H. (1958) J. Gen. Microbiol., 18, 173-189. 4. Yamaguehi, T. (1965) J. Basteriol., 89, 444-453. 5. Vilkas, E., Massot, J. C. & Zissmann, E. (1970) FEBS Letters, 7, 77-79. 6. Vilkas, E., Tabaud, H. ~ Massot, J. C. X" Journ6es Bioehimiqttes Latines Sta Margherita, Ligttre, Mat 1971. 7. Rimington, C. (1955) Methods Bioehem. Anal., 2, 292. 8. King, E. J. (1932) Biochem. J., 26, 292. 9. Dubois, M., Gilles, M., Hamilton, K. A., Rebers, P. A. & Smith, F. (1956) Anal. Chem., 28, 350-356. 10. Johansou, R. (1954) Anal. Chem., 26, 1331-1333. 11. Wilson, C. M. (1959) Anal. Chem., 31, 1199-1201. 12. Partridge, S. M. (1948) Nature, 164, 443-444.
Parois de
Micromonospora.
13. Trevelyan, W. E., Procter, D. P. & Harrison, J. S. (1950) Nature, 166, 444-445. 14. Gordon, H. T., Thornhurg, W. ~ Werum, L. N. (1956) Anal. Chem., 28, 849-855. 15. Bandurski, R. S. & Axelrod, B. (1951) J. Biol. Chem., 193, 405-410. 16. Gal, A. E. (1968) Anal. Biochem., 24, 452-461. 17. Sharon, N. Proceeding of the 3rd S y m p o s i u m on Fleming's Lysozyme, Milan (1964). 18. Bailey, R. W. • Bourne, E. J. (1960) J. Chromatogr., 4, 206-213.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 5.
611
19. Wicken, A. J. (1966) Bioehem. J., 99, 108-116. 20. Hamilton, J. K., Hoffmann, G. W. ~ Smith, F. (I959) J. Amer. Chem. Soc., 81, 2176-2178. 21. Hakomori, S. J. (1964) J. Bioehem., 55, 205-208. 22. Corey, E. J. ,¢ Chaykovsky, M. (1962) J. Amer. Chem. Soc., 84, 866-867. 23. Van Holde, K. E. • Baldwin, R. L. (1968) J. Phys. Chem., 62, 734. 24. Kuhn, R. ~ Trischmann, H. (1963) Chem. Bet., 96, 284-287.
Etude des parois d'une souche de
Micromonospora.
II. (*) Les polysaccharides (**). H. TABAUD, J.-C. MASSOT et E. VILKAS.
Institut de Chimie des Substances Naturelles. CNRS, 91190 Gi[-sur-Yvette.
Summary. -- The cell walls of Micromonospora have been shown to contain an important polysaecharide fraction. This component obtained by gel filtration of a trichloroacetic acid extrait contains mannose, D-xylose, N-acetylglueosamine and phosphoric acid. The that : 1 -2 -3 --
results of partial hydr~l'ysis, methylation and periodic oxidation studies suggest the polysaccharide is branched the glycosidic linkages occur mostly in 1.-3 phosphoric acid esterifies N-acetylglucnsamine on the 6-position.
INTRODUCTION. Les Micromonospora font partie, de l ' o r d r e des Actinomycdtales [1]. Les Actinomyc6tes o c c u p e n t u n e p o s i t i o n i n t e r m 6 d i a i r e entre les bact6ries dont ils se r a p p r o c h e n t p a r certaines de leurs formes (bacilles, coques) et p a r la l a r g e u r de leurs filam e n t s (1 ~), et les c h a m p i g n o n s , dont ils pr6sentent le thalle ramifi6. Le fait que leurs parois ne c o n t i e n n e n t n i chitine, ni cellulose les situe plut6t p a r m i les bact6ries. L'absence des st6rols dans les lipides de Micromonospora [2] est 6galement en faveur de cette classification. Dans le cadre d ' u n e 6rude t a x o n o m i q u e , Cumm i n s et Harris [3] 6tudient les c o n s t i t u a n t s des parois de cinq souches de Micromonospora. Yamaguehi [4] publie ensuite une dtude c o m p a r a t i v e de la composition des parois des Actinomyc6tales off, il i n c l u t deux souches de Micromonospora. D'apr6s ces auteurs, les parois de Micromonospora ne cont i e n d r a i e n t pas de sucres caract6ristiques. Or, l'6tude des parois d ' u n e souche de Micromonospora que nous avons e n t r e p r i s e m o n t r e q u ' e n plus du p e p t i d o g l y c a n e compos6 d ' a l a n i n e , d ' a c i d e glutamique, d'acide diaminopim61ique, de glyeine, de glueosamine et d'acide m u r a m i q u e , ces p a t o i s cont i e n n e n t u n e i m p o r t a n t e partie p o l y s a c c h a r i d i q u e phosphorylde. Les deux fractions ont p u 6tre sdpar6es p a r extraction des parois au m o y e n de l'acide trichloroac6tique [5, 6]. (*) I. voir r~f. [5]. (**) Ce travail fail partie de la Th6se de 3" Cycle soutenue par Mne H. Tabaud h l?Universitd de ParisSud, Centre d'Orsay, le 19. mrai 1972. Dddid a u Professeur E. Lederer en l'honnenr de son 65' anniversaire.
L'analyse de la partie p o l y s a c c h a r i d i q u e obtenue h p a r t i r de eet extrait fait l'objet de la pr6sente note.
MATERIEL ET MIETHODES. La souche de Micromonospora Sp F3 utilisde dans ce travail a 6t6 a i m a b l e m e n t raise h notre disposition p a r le Dr. H. A. Lechevalier (Rutgers University, New B r u n s w i c k ) . Le mode de c u l t u r e e t l a p r 6 p a r a t i o n des parois purifi6es ont 6t6 d6crits r 6 c e m m e n t [5, 2] ( ' ) . Les analyses qualitatives et quantitatives d'acides et de sucres amin6s sont effectu6es sur les hydrolysats des parois ou des p r o d u i t s de leur d6gradalton partielle h l'aide de l ' a u t o a n a l y s e u r de Beckman, Model 120 B. Les sucres amin6s sont dosds selon la m6lhode d'Elson-Morgan modifide p a r B i m i n g t o n [7]. Le dosage de p h o s p h o r e est fait selon King [8]. Les sucres neutres sont dos6s soit p a r la m6thode au phdnol-aeide s u l f u r i q u e [9], soil p a r l ' a n t h r o n e [10], soit p a r la t e c h n i q u e de WiIson aprbs leur s6paration c h r o m a t o g r a p h i q u e [11]. ,Les h y d r o l y s e s acides sont effectu6es dans l'acide c h l o r h y d r i q u e : a) 0,1 N ; b) 1,5 N ; c) 6 N •~ 1(~0° p e n d a n t des dur6es variables. (*) Nous avons utilisd les patois du myedlium et des spores ayan,t vdrifid au prda~lable que leur composition qualitative est identique. Nous remercions MTM E. Zissmann (Service de Microbiologie, ICSN) pour les cultures de Micromonospora.
H. Tabaud, J.-C. Massot el E. Vilkas.
606
Les h y d r o l y s e s alcalines sont faites p a r chauffage du p r o d u i t dans NaOH N fi 60 ° p e n d a n t 6 heures. Les c h r o m a t o g r a p h i e s sur p a p i e r W h a t m a n N ° 1 ou N ° 3 et sur c o u c h e m i n c e de silicagel Merck (F 254) sont effectu6es dans les m61anges de solvants suivants : A. B. C. D. E. F. G. H.
n - b u t a n o l - a c i d e ac6tique-eau (4:1:5) n - b u t a n o l - p y r i d i n e - e a u (fi:4:3) ac6tone-eau (9:1) a c 6 t o n e - e a u - a m m o n i a q u e (250.3:1,5) n - b u t a n o l - 6 t h a n o l - e a u - a n l m o n i a q u e (40:10:49:1) n - p r o p a n o l - a m m o n i a q u e - e a u (6:3:1) n - p r o p a n o l - e a u (70:10) m 6 t h a n o l - a c i d e f o r m i q u e - e a u (85:15:5) ascendante.
traits h l'6ther, et concentr6s p a r l y o p h i l i s a t i o n . A un v o l u m e de la solution acide on ajoute 5 volumes d'6thanol glac6, il se f o r m e un pr6cipit6 b l a n c qui est s6par6 p a r c e n t r i f u g a t i o n (320 rag). I1 est ensuite lay6 p a r l'ac6tone, puis p a r l'6ther p o u r 61iminer l ' a c i d e t r i c h l o r a c 6 t i q u e r6siduel. Ce pr6cipit6 est ensuite soumis aux analyses qualitatives et q u a n t i t a t i v e s de ses constituants et c h r o m a t o g r a p h i 6 sur S e p h a d e x G 50 (fig. 1).
Oxydation periodique de la fraction C (fig. 1). 7,2 mg de la f r a c t i o n C sont oxyd6s p a r 4 ml de p e r i o d a t e de s o d i u m 0,05 M h la t e m p 6 r a t u r e ambiante p e n d a n t 5 jours h l'obscurit6. L'exc6s de o.s.
o,7.
Les r6v61ations utilis6es sont : - - le phtalate d ' a n i l i n e p o u r les sucres r6ducteurs et leurs d6riv6s m6thyl6s [12] ; --le n i t r a t e d ' a r g e n t alcalin [13] et l ' a c i d e p e r i o d i q u e - b e n z i d i n e [14~ p o u r les p o l y o l s ; - - le r6actif m o l y b d i q u e p o u r les esters phosp h o r i q u e s [15] ; - - la n i n h y d r i n e p o u r les compos6s amin6s ; --le r6actif d'Elson-Morgan p o u r les sucres amin6s [16] ; - - le r6actif de S h a r o n p o u r les sucres amin6s N-ac6tyl6s [17] ; --- le r6actif fi la d i p h 6 n y l a m i n e , aniline, a c i d e o r t h o p h o s p h o r i q u e p o u r les sucres r 6 d u c t e u r s et leurs d6riv6s m6thyl6s [18]. P o u r les c h r o u m t o g r a p h i e s sur gel, les S e p h a d e x G 50 (fine) et G 100 (fine) ( P h a r m a c i a Uppsala) sont employ6s. Toutes les c h r o m a t o g r a p h i e s des sucres m~thy16s en phase gazeuse sont faites h l ' a i d e d ' u n appareil (< Chromagaz CG 1 Pro.fit m u n i d'un d6tecteur i o n i s a t i o n de flamme, le gaz v e c t e u r 6tant r a z o te ; c o l o n n e (2 m X 4 ram) de p o l y s u c c i n a t e de b u t a n e d i o l fi 15 p. cent.
Extraction des parois par racide trichlorac~tique [5, 19]. Les p a r o i s d61ipid6es (1 g) sont homog6n6is6es dans 100 ml d ' a c i d e t r i c h l o r o a c 6 t i q u e ~ 10 p. cent et laiss6es en c o n t a c t p e n d a n t 24 h ~ 4 ° sous agitation m 6 c a n i q u e . Le s u r n a g e a n t (~) est s6par6 p a r c e n t r i f u g a t i o n et on r e c o m m e n c e l ' e x t r a c t i o n dans les m~mes c o n d i t i o n s p e n d a n t 72 h. Apr6s centrifugation, les deux s u r n a g e a n t s sont r6unis, ex(*) La fraction insol.ublc darts l'acide trichloroac~tique eM: constitute par le peptidogtycane pratiquemerit d~pourvu de sucres r~ducteurs.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 5.
o.6.
---.
~,~o~
B
~o,s. ®
i
~.4
A
D
0.2.
O,I.
do
"
~o
~oo
~.a
4o
FIG. 1. - - Filtration de la fraction po,lysaecharidique (120 mg) sur eol,onne de Sephadex G 50 (2,5 cm X 70 em). Elution par l'eau ; fractions de 1 ml Vo -=139 ml ; V° + V~ = 1181) ml.
r6actif est d6truit p a r l ' a d d i t i o n d'6thyl6ne-glycol. Le m61ange r 6 a c t i o n n e l est ensuite r e f r o i d i fi 0 ° et additionn6 d'6thanol. L ' i o d a t e de s o d i u m form6 est filtr6. La solution aqueuse est c o n c e n t r 6 e et le p r o d u i t h y d r o l y s 6 p a r l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e 2N p e n d a n t 3 h e u r e s fi 1(~0°. L ' h y d r o l y s a t est chrom a t o g r a p h i 6 dans les solvants A et B : il c o n t i e n t du m a n n o s e (Rf dans A = 0,2~)), du xylose (Rf dans A = 0,28) et de la g l u c o s a m i n e (Rf dans A = 0,13). Une o x y d a t i o n p e r i o d i q u e p e n d a n t un t e m p s plus court (68 h) d o n n e des r6sultats similaires.
D~gradation de Smith [20]. Le p r o d u i t oxyd6 c o m m e ci-dessus est a d d i t i o n n6 de 10 m g de NaBH 4. Apr6s 18 h de c o n t a c t h la t e m p 6 r a t u r e anabiante, la solution est trait6e p a r le Do-,vex 50 H + (~00-400 mesh) et d6barrass6e du b o r a t e p a r 6 v a p o r a t i o n r6p6t6e sous v i d e avee du m6thanol. Le p r o d u i t de r 6 d u e t i o n est h y d r o l y s 6 c o m m e ci-dessus et c h r o m a t o g r a p h i 6 sur p l a q u e
Patois de M i c r o m o n o s p o r a .
607
de cellulose et sur p a p i e r W h a t m a n N ° 1 dans les solvants A, B e t C. La r6v61ation p a r le nitrate d ' a r g e n t i n d i q u e la pr6sence de glyc6rol (Rf = 0,46 dans A, et 0,55 dans C), de traces d ' 6 r y t h r i t o l et d ' u n e tache au n i v e a u de la giucosamine (Rf 0,13 dans A, Rgzu = 0,8,1 dans B). Cette d e r n i 6 r e se r6vble 6galement p a r la n i n h y d r i n e . La r6v61ation p a r le r6actif de P a r t r i d g e m o n t r e des taches au n i v e a u du m a n n o s e et du xylose.
La composition des parois purifi6es de Micromonospora SpF3 est i n d i q u 6 e dans le tableau I.
M~thylation de la [raction C selon Hakomori [21].
Extrait trichloracdtique.
20 mg du p o l y s a e c h a r i d e dissous dans 1 ml de dim6thyl sulfoxide sont a d d i t i o n n 6 s d ' u n e solution de m6thyl sulfinyl c a r b a n i o n [22] et d ' u n exc6s d ' i o d u r e de m6thyle. La r6action se p o u r s u i t 18 heures h la t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e sous agitation, Le p r o d u i t r 6 a c t i o n n e l est ensuite extrait au chloroforme. Son spectre IR m o n t r e la d i s p a r i t i o n de la b a n d e h 3 3~)0 cm-1 due aux hydroxyles.
lls sont identifi6s p a r c o m p a r a i s o n de leur comp o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e avec celui des t6m o i n s a u t h e n l i q u e s (*).
R]~SULTATS ET DISCUSSION.
L ' e x t r a c t i o n p a r l ' a c i d e t r i c h l o r a c 6 t i q u e h 10 p. cent [5, 19] des p a r o i s de Micromonospora suivie de la p r 6 c i p i t a t i o n de la solution acide au m o y e n de l'6thanol fournit, avec u n r e n d e m e n t de 32 p. cent, u n e f r a c t i o n p o l y s a c c h a r i d i q u e dont la composition figure darts le tableau II. Les parties aliquotes de cette f r a c t i o n sont soumises ~ diff6rentes c o n d i t i o n s d ' h y d r o l y s e acide.
TABLEAU I.
Composition des patois de Micromonospora SpF3. Acides amin6s I glycine [ ac, glutamique 4Sucres amin6s (') Sucres neutres {'~) ac. diaminopim6lique, alanine 26 p. cent
[
20 p. cent
16 p. cent
Phosphore
Glyc6rol
Galactitol
R6sidu minfiral
1,3 p. cent
÷
+
8 p. cent
(*) Calcul,6 en glucosamine. C*)Calcul6 en xylose. TABLEAU ]L
Composition de la [raction polysaccbaridique brute. Acides amin6s
Sucres amin6s (')
Sucres neutres (")
Phosphore
[
7 p. cent
25 p. cent
25 p. ccnt
2,2 p. cent
i
Glyc6rol
-I-
Galactitol
+
(*) Calcul6 en glucosami.ne. (**)Calcul6 en xylose.
La substance perm6thyl6e est soumise soit fi la m6thanolyse (dans le m 6 t h a n o l absolu c o n t e n a n t 4 p. cent de HCl gazeux), soit h l ' h y d r o l y s e p a r HCI 2N ; les p r o d u i t s obtenus sont chromatographi6s : 1) en phase gazeuse ; le temps de r 6 t e n t i o n (TG) est exprim6 p a r r a p p o r t h celui du m6thyl-2, 3, 4, 6-t6tra O-m6thyl aD glucoside ; 2) sur la plaque de Silicagel G dans le solrant D ; 3) s u r p a p i e r dans le solvant E.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 5.
L ' h y d r o l y s e p a r l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e 1,5 N fi 100 ° p e n d a n t 4 heures lib6re comme sucres r6ducteurs du m a n n o s e , du xylose, du glucose (Rf respectifs dans le solvant A : 0,20 ; 0,28 ; 0,18) et des traces d ' a r a b i n o s e et de galactose et, comme sucre amin6, de la glucosamine (Rf : 0,13) (identifi6s p a r c h r o m a t o g r a p h i e s sur p a p i e r dans les sol(*). N.ous remereions le Professeur A. M. Stephen (University of Cap Town), le Professeur E. Percival (Royal Halloway College) et ~l~eDooteuv P. A. J. Gorin (Prairie Regional Laboratory, Saskatoon), pour les ~ehan.ti.llons de d~riv~s m~thyl~s de xyl.ose et de mannose.
40
H. Tabaud, J.-C. Massot el E. Vilkas.
608
v a n t s A e t B). Le m a n n o s e , le x y l o s e et le g l u c o s e se t r o u v e n t d a n s u n r a p p o r t m o l a i r e a p p r o x i m a t i f d e 3:2:0,75.
v a n t H, W h a t m a n N ° 1 ; v o l u m e d ' 6 1 u t i o n 45 m l s u r l a r G s i n e B e c k m a n P A 28, t a m p o n c i t r a t e d e s o d i u m 0,20 N p H = 3,20).
TABLEAU III.
Composition de ~ pics obtenus par filtration sur Sephadex G 50. Pie
A B(')
Mannose
Xylose
÷ ÷
÷ + ÷
D
Glucose I Atabinose Galactose
÷ ÷
+
I
÷
Glucosa-~iPhosphore mine
÷ +
÷ ÷ ÷ ÷
GlycGrol
Galactitol
÷
(*) Le pic B r e e h r o m a t o g r a p h i 6 sur Sephadex G 100 f o u r n i t deux f r a c t i o n s d o n t la seconde, l a p;ius i m p o r t a n t e (80 p. c e n t ) c o n t i e n t u n i q n e m e n t du m a n n o s e et d u xylose. La 1 r° f r a c t i o n c o n t i e n t 6galement du glucose. Les pics C et D s e m b l c n t homog~nes darts les m~mes conditions. Le pi'c A n'a pas 6t6 6tudi6 en dGtail.
L'hydrolyse par l'acide chlorhydrique 0.1 N h 100 .° p e n d a n l 10 m i n l i b ~ r e d e l a N - a c 6 t y l g l u c o samine, identifi6e par chromatoga-aphie sur papier d a n s le s o l v a n t F et s u r t o u c h e m i n c e d a n s le solr a n t G ( R f = 0 , 6 6 - F ; 0,56-G).
L'hydrolyse totale par l'acide chlorhydrique 6 N p e n d a n t 24 h e u r e s h 105 ° l i b b r e les c o m p o s G s a m i nGs s u i v a n t s : a c i d e g l u t a m i q u e , g l y c i n e , a l a n i n e , a c i d e d i a m i n o p i m G l i q u e et g l u c o s a m i n e e n p r o p o r tions suivantes : 4,5:10:4:4:53.
FIG. 2 : a) D i a g r a m m e d ' u l t r a c e n t r i fugafion du polysaccharide C en sol.ution d a n s C1Na 0,1 M, c o n c e n t r a t i o n 5 m g / m l . Glich~ pris 98 m i n u t e s apr~s avoir a t t e i n t la pl'eine vitesse - - 67 77.0 t o u r s / m i n u t e (inclinaison de la b a r r e 500). b) D i a g r a m m e de la solu.tion prGcGdente en fronti/~re pr~for~n~e, apr~s dialyse contre G1,Na 0,1 M e t ~limination. des p r o d u i t s plus lour&s ; vitesse du r o t o r de 19 160 t o u r s / m i n u t e .
L'hydrolyse partielle par l'acide chlorhydrique 6 N p e n d a n t 20 r a i n h 100 ° p e r m e t d ' o b t e n i r l a g l u c o s a m i n e 6 - p h o s p h a t e (Rf = 0,78 d a n s le sol-
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 5.
La fraction polysaccharidique intacte chromat o g r a p h i G e s u r le S e p h a d e x G 50 d o n n e 4 p i e s ( v o i r f i g u r e 1) d o n t l a c o m p o s i t i o n est i n d i q u G e
Patois de Mieromonospora. dans le tableau III. (Les dosages quantitatifs et qualitatifs des eonstituants ont p e r m i s la caractdrisafion des diff6rents pies). Seuls les r6sultats c o n c e r n a n t la substance qui c o r r e s p o n d au p i e C sont r a p p o r t d s ei-dessous (*L
Polysaccharide C. D'apr~s son c o r n p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e sur gel ( S e p h a d e x G 50 et G 160) il p e u t O r e consid6r6 cornrne homogbne. L ' u l t r a c e n t r i f u g a t i o n analytique confirme l'hornogdn6itd du p r o d u i t : le diag r a m m e de sddirnentation m o n t r e l ' e x i s t e n c e d ' u n pie p r i n c i p a l dont le coefficient de s 6 d i m e n t a t i o n est $2o~ ~ 1,05. On o b s e r v e c e p e n d a n t les c o m p o s6s plus lourds ( e n v i r o n l 0 p. cent) qui sddirnentent tr~s r a p i d e m e n t clans le fond de la c u r e .
609
P a r h y d r o l y s e partielle, la glucosamine-6-phosp h a t e a pu 6tre isolde /t p a r t i r de la substance C, comrne prdeddernrnent h p a r t i r de l ' e x t r a i t tric h l o r o a c d t i q u e intact. Toutefois, le r a p p o r t a e i d e p h o s p h o r i q u e : g l u e o s a m i n e sugg~re que seule une mole de sucre arnin6 p o u r r a i t 6tre est6rifi6e. Afin de vdrifier si le p r o d u i t c o n t i e n t les phosp h o d i e s t e r s labiles en m i l i e u alcalin nous l ' a v o n s sournis h u n e h y d r o l y s e alcaline rnais il ne sernble pas lib6rer de f r a g m e n t s p h o s p h o r y l 6 s de faible p o i d s rnol6culaire. P o u r d 6 t e r m i n e r l ' e n c h a i n e m e n t des oses, trois types d ' e x p 6 r i e n c e s ont 6td effeetudes : 1) o x y d a t i o n p e r i o d i q u e , Smith, 3) perrn6thylation.
2)
ddgradation
de
TABLEAU IV,
R~sultats de l'oxydation periodique et de la d~gradation de Smith e[fectudes sur le pic C. Mannose RI daas A : 0,20
+ --i
lO~Na BH~,
.
.
.
+
.
.
Xylose Glye6rol Erythr~tol Glucosamine Rf dabs A : 0,28 RI duns A : 0,t3 RI dabs A : 0,~6 RI duns A : 0,37
+
+
+
+
.
Le p o i d s m o l 6 c u l a i r e a 6td d6terrnin6 p a r 6quifibre de s 6 d i m e n t a t i o n en utilisant la rndthode de Ia courte c o l o n n e (Van H o l d e et Baldwin) [23~ ; p o u r une h a u t e u r de 0,15 cm l ' 6 q u i l i b r e est atteint au bout de 30,0 rnin, la vilesse de r o t a t i o n 6tant 19 160 t / m i n . Nous avons adopt6 p o u r le v o l u m e p a r t i e l spdcifique une v a l e u r 6tablie d'aprbs la c o m p o s i t i o n du p o l y s a c c h a r i d e . P o u r v = 0,7, le p o i d s rnol6culaire serait 10 000, si v = 0,6, M = 7 500 (*). La substance C c o n t i e n t 3 m o l e s de m a n n o s e , 2 moles de xylose, 4 moles de N-acdtylglucosarnine, 1 mole d ' a c i d e p h o s p h o r i q u e et une faible p r o p o r tion de glycine ( e n v i r o n 0,2 mole). (*) Les rdsultats prdliminaires concernant le pie D ont fair ]'objet d'une communication aux Xo J.olarndes de Chimie Biologique h Santa Marherita Ligure, 1971 [6~. II s'agit apparemrnent d'un nouveau type d'aeide teiehoique. (*), Ces ddterrni.nations du poids mol~eulaire ont dtd effectudes par Mal~ S. G~linand, Maitre de recherche au C.N.R.S., au laboratoire d,e Biologic Physieo-Chimique, Universitd de Paris-Sud (Centre d'Orsay). Nous la rernereions tr6s sine6rement pour ces essais et pour les fruetueuses di'seussions.
BIOCHIM1E, 1973, 55, n ° 5.
+
+
Les rdsultats de deux p r e m i e r e s m a n i p u l a t i o n s figurent dans le tableau IV. Le tableau V rnontre les d6rivds m6thylds identifids. TABLEAU V.
Les produits de la m~thanolyse el de l'hydrolyse du pic C perm~thyl& Temps de rdtention (T6) de mdthylglyeosides
R[ solvant D
0,42
0,78
1,5
0,63
3.1
0,37
0,78
0,73
2,55
0,54
3,3
0,54
O-mdthyl sucre identifid
2, 3, 4-tri-O-mdthyl-D-xylopyrannose 2, 4-di-O-mdthyl-D-xylopyrannose mono-O-mdthvl-x yl opyrannose
2, 3, 4, 6-tdtra-O-mdthyl-~-Dmannopyrannose 2, 4. 6-tri-O-mdtbyl-D-mannopyrannose 2, 3, 6-tri-O-mdthyl-D-mannopyrannose
610
H. T a b a u d , J.-C. M a s s o t et E. V i l k a s .
L ' o b t e n t i o n d ' u n d 6 r i v 6 t r i m 6 t h y l 6 d u x y l o s e et d ' u n d6riv6 t 6 t r a m 6 t h y l 6 d u m a n n o s e i n d i q u e q u e ces d e u x s u c r e s s e n t en p o s i t i o n t e r m i n a l e et q u ' i l s ne s e n t p a s r 6 d u c t e u r s . L a p r 6 s e n c e de d e u x sucres terminaux non r6ducteurs implique l'exisfence d'une ramification. Le g l y c 6 r o l o b t e n u p a r la d 6 g r a d a t i o n de S m i t h p r o v i e n t du m a n n o s e . L ' o b t e n f i o n d u 2, 4, 6 t r i O - m 6 t h y l m a n n o s e est en a c c o r d a v e c la p r 6 s e n c e , p a r r o t les p r o d u i t s d ' o x y d a t i o n p e r i o d i q u e , d ' u n m a n n o s e i n t a c t . E n effet, u n a l d o p y r a n n o s e e n g a g 6 darts u n e l i a i s o n g l y c o s i d i q u e en p o s i t i o n 3 n ' e s l pas o x y d 6 . L ' i d e n t i f i c a t i o n d ' u n 2, 4 - d i - O - m 6 t h y l x y l o s e i n d i q u e q u e le x y I o s e est 6 g a l e m e n t substitu6 en 3. P a r r o t les p r o d u i t s d ' o x y d a t i o n p e r i o d i q u e du p o l y s a c c h a r i d e , le x y l o s e i n t a c t a p u ~.tre c a r a c t 6 ris6. La p r 4 s e n c e de 2,3,6 t r i - O - m 4 t h y l m a n n o s e sugg6re u n e s u b s t i t u t i o n du m a n n o s e en 4. Q u a n t h la g l u c o s a m i n e , l ' i d e n t i f i c a t i o n d ' u n e f o r t e p r o p o r t i o n de ce s u c r e a m i n 6 i n t a c t apr~s l ' o x y d a t i o n p e r i o d i q u e s e m b l e e x c l u r e la l i a i s o n en p o s i t i o n 6. Au c o u r s d e la c h r o m a t o g r a p h i c en p h a s e g a z e u s e a u c u n d 6 r i v 6 m 6 t h y l 6 de la N - a c 6 t y l g l u c o s a m i n e n ' a pu 6fre i d e n t i f i 6 . E n effet, ces d6riv6s s e n t r e t e n u s s u r la c o l o n n e utilis6e ( D . D ' a p r 6 s l ' e n s e m b l e de ces r6sultats, la s u b s t a n c e c o r r e s p o n d a n t au p i c .G s e r a i t u n p o l y s a c c h a r i d e r a m i f i 6 c o n t e n a n t e n t r e 12' h 1:5 r 6 s i d u s de m a n nose, 8 a 10 de x y l o s e , 16 /~ 20 de N - a c 6 t y l g l y c o s a m i n e , 4 "~ 5 d ' a c i d e p h o s p h o r i q u e et 1 de g l y c i n e . L a p l u p a r t des l i a i s o n s g l y c o s i d i q u e s s e m b l e n t 4tre en p o s i t i o n 3. La d 6 t e c t i o n d ' u n d6riv6 m o n o m 6 thyl6 du x y l o s e i n d i q u e r a i t ce s u c r e c o m m e p o r t e u r de la r a m i f i c a t i o n . E n c o n c l u s i o n , les p a r o i s de Micromonospora S P - F 3 s e n t c o m p o s 6 e s de d e u x c o n s t i t u a n t s p r i n c i p a u x : un p e p t i d o g l y c a n e [3, 5] et u n e f r a c t i o n p o l y s a c c h a r i d i q u e . R a p p e l o n s q u e C u m m i n s et H a r r i s [3~ en e x a m i n a n t la c o m p o s i t i o n de p a t o i s de c i n q s o u c h e s de Micromonospora c o n c l u e n t q u ' e l l e s n e c o n i i e n n e n t p a s de s u c r e s c a r a c t 6 r i s t i ques. Or, n o t r e t r a v a i l m e t en 6 v i d e n c e des quart(*). Nous naus proposons par la suite de m~thyl.er la fraction C par la m6thode de Kuhia et Trisehman [24]. Au eours de cette r~aetion, le groupement N--COGHa I
H reste intact ee qui permet de transformer les d6rivds m6t.hyl6s de ta N-ac6tylgltteosamine (apr6s d6sae~tylation et d~gradation par la ninhydrine) en d6ri~c~s m6~hyl6s de Uarabinose plus faeilement identifiables.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ~ 5.
tit6s i m p o r t a n t e s de m a n n o s e , de x y l o s e , de glucos a m i n e (qui ne dolt p a s 6tre c o n f o n d u e a v e c celle f a i s a n t p a t t i e du p e p l i d o g l y c a n e ) et de glucose. Ce d e r n i e r h e x o s e a ~t6 i d e n t i f i 6 d a n s la subs t a n c e c o r r e s p o n d a n t au p i c D off il s e m b l e li~ h u n a c i d e p o l y g l y c 6 r o p h o s p h o r i q u e [6]. L % t u d e des p a r o i s de d e u x a u t r e s s o u c h e s de Micromonospora (M. echinospora et M. pallida) p r o d u c t e u r s de la g e n t a m y c i n e , e n t r e p r i s e au l a b o r a t o i r e d o n n e des r~sultats s e m b l a b l e s (M. Yrib a r r e n , essais n o n publi6s). La f r a c t i o n p o l y s a c c h a r i d i q u e assez c o m p l e x e a p p a r a i t d o n e e o m m e s p 6 c i f i q u e de ces m i c r o o r g a n i s m e s .
Remerciements. N~tts remercions t.r~s ~'ivement Monsieur le Professeur E. 'Lederer pour l'iut~rbt port~ h e e travail. Ces reeherehes ont b~n~fici~ de subven,tious de la Ligue Nationale Fran~aise centre le Cancer et de la Fondation pour la Recherche M~dieale Franqaise.
Les parois de Mieromonospora sent form~es d'un peptidoglycane et d'une fraction polysaccharidique. Cette derni~re obtenue darts les condition.s d~erites pour l'i,solement de l'aeide teiehoique fourni,t par filtration sur gel quatre eompos~s dent un est analys6. I1 s'agit d'un polysaceharide de poids mol~cu.laire approximatif de 1,0 000 contenant du mannose, dtt D-xylose, de la 1~-ac6tyl.glueosamine et de ]'acide phosphorique en proportions mol~eulai.res 3:2:4:1. Les r~sultats des hydroiyses partiettes, de la perm~thylation, et de l'oxydation peri.od:iqtte indiquent : 1 - - 1 " e x i s t e n c e d'ttne ramification fie xylose et le mannose se trouvent t o u s l e s deux en position terminal e, non r6ducteurs) ; 2 - - que la plupart des liaisons glycesidiques sent en 1'-3 ; 3 - - qu'une mo.l~e de N-ae~tylglucosamine sur quatre est est6rifi~e par l'aeide phosphorique en position 6.
BIBLIOGBAPHIE. 1. Waksman, S. A. a Henriei, A. T. (1943) d. Baeferiol., 46, 337-341. 2. Tahaud, H., Tisnovska, H. & Vilkas, E. (1971) Bioehimie, 53, 55-61. 3. Cummins, C. S~ • Harris, H. (1958) J. Gen. Microbiol., 18, 173-189. 4. Yamaguehi, T. (1965) J. Basteriol., 89, 444-453. 5. Vilkas, E., Massot, J. C. & Zissmann, E. (1970) FEBS Letters, 7, 77-79. 6. Vilkas, E., Tabaud, H. ~ Massot, J. C. X" Journ6es Bioehimiqttes Latines Sta Margherita, Ligttre, Mat 1971. 7. Rimington, C. (1955) Methods Bioehem. Anal., 2, 292. 8. King, E. J. (1932) Biochem. J., 26, 292. 9. Dubois, M., Gilles, M., Hamilton, K. A., Rebers, P. A. & Smith, F. (1956) Anal. Chem., 28, 350-356. 10. Johansou, R. (1954) Anal. Chem., 26, 1331-1333. 11. Wilson, C. M. (1959) Anal. Chem., 31, 1199-1201. 12. Partridge, S. M. (1948) Nature, 164, 443-444.
Parois de
Micromonospora.
13. Trevelyan, W. E., Procter, D. P. & Harrison, J. S. (1950) Nature, 166, 444-445. 14. Gordon, H. T., Thornhurg, W. ~ Werum, L. N. (1956) Anal. Chem., 28, 849-855. 15. Bandurski, R. S. & Axelrod, B. (1951) J. Biol. Chem., 193, 405-410. 16. Gal, A. E. (1968) Anal. Biochem., 24, 452-461. 17. Sharon, N. Proceeding of the 3rd S y m p o s i u m on Fleming's Lysozyme, Milan (1964). 18. Bailey, R. W. • Bourne, E. J. (1960) J. Chromatogr., 4, 206-213.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 5.
611
19. Wicken, A. J. (1966) Bioehem. J., 99, 108-116. 20. Hamilton, J. K., Hoffmann, G. W. ~ Smith, F. (I959) J. Amer. Chem. Soc., 81, 2176-2178. 21. Hakomori, S. J. (1964) J. Bioehem., 55, 205-208. 22. Corey, E. J. ,¢ Chaykovsky, M. (1962) J. Amer. Chem. Soc., 84, 866-867. 23. Van Holde, K. E. • Baldwin, R. L. (1968) J. Phys. Chem., 62, 734. 24. Kuhn, R. ~ Trischmann, H. (1963) Chem. Bet., 96, 284-287.