La synthèse des acides aminés de la chaine nerveuse ventrale du homard

518

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA BBA 4 2 7 5

LA SYNTHI~SE

DES

ACIDES

AMINES

VENTRALE

DE

LA CHAINE

NERVEUSE

DU HOMARD

R. GII.I~ES* ET E. SCHOFFENIELS Laboratoire de 13iochimze, Universild de Liege, Li@e (Belgiq~e)

(Re~u le 4 juillet, 1903)

S[IMMARY A m i n o acid synthesis i~ the ventral nerve cord of the lobster

Our results suggest the existence of various m e t a b o l i c p a t h w a y s leading to the synthesis of a m i n o acids. P y r u v a t e seems to follow four different directions. Besides the e n t r y into the K r e b s cycle as a c t i v a t e d acetate, it would a p p e a r t h a t an i m p o r t a n t a m o u n t of p y r u v a t e enters the K r e b s cycle either d i r e c t l y or t h r o u g h phosphoenolp y r u v a t e . A t h i r d p a t h w a y leads to alanine synthesis. F i n a l l y since t h e r e is a difference in the labelling of alanine according to the localization of ~4C in p y r u v a t e , we have p o s t u l a t e d the existence of an indirect p a t h w a y , involving the d e c a r b o x y l a t i o n in C-I of p y r u v a t e a n d bringing a b o u t d i r e c t l y the synthesis of atanine. As far as glucose is concerned, our results suggest the existence of a shunt leading d i r e c t l y to the synthesis of d i c a r b o x y l i c acids, w i t h o u t going t h r o u g h the K r e b s cycle. The h y d r o x y p y r u v a t e s h u n t seems to be a possil)le road.

INTRO1)UCTION

ELORKIN et ses collaboratenrs I 3 ont montr6 depnis plusieurs ann6es d6j~t que les acides amin6s remplissaient chez les inver%br6s a q u a t i q u e s un r61e o s m o r 6 g u l a t e n r tr~s i m p o r t a n t . C'est ainsi qu'il a 6t6 possible de m e t t r e en relation la forte t e n e u r en acides amin6s des tissus des invert6b%s marins avec le fait qu'ils vivent dans tin milieu d o n t la pression osmotique est 61ev6e"L Toutefois on ne sail rien des m~canismes r6gulateurs mis en jeu p a r la cellule p o u r d6finir la concentration t o t a l e e t l a composition du pool des acides amin6s libres. Mais pnisque l'excr6tion azot6e d ' u n e esphce e u r y h a l i n e a u g m e n t e lors du passage dans tm milieu dilu6 alors que l'inverse s'observe si l ' a n i m a l est plac6 dans tin milieu concentr44, on p e u t penser que l'osmor6gulation d n liquide intracelhflaire est assur('e grftce A l'aequisition de m6canismes p e r r n e t t a n t de contr61er les vitesses relatives de l ' a n a b o l i s m e et du c a t a b o l i s m e des acides amin6~ consid6r6s. D a n s le b u t d ' a p p o r t e r des 616ments d ' o r d r e e x p d r i m e n t a l h la solution de ce probl6me nous avons 6tudi6 les relations e x i s t a n t entre le m 6 t a b o l i s m e des oses et des d6riv6s d'oses e t l a synth~se des acides amin6s. Ce p r e m i e r t r a v a i l sera consacr6 "~ l'ex pos6 des r6sultats obtenus avec la chalne nerveuse v e n t r a l e du h o m a r d et qui p e r m e t t e n t de d6finir les w)ies m6taboliques a b o u t i s s a n t A la synth6se de certains acides amin6s A p a r t i r de la glycolyse. * Stagiaire du Fonds National de la Recherche Scientifiquc. Biochin~. Bioph)'s. =Iota, $2 0904) SIS .524

SYNTHI~SE DES ACIDES AMINI~S DU NERF DE HOMARD

519

MATI~RIEL ET MI~THODES

La chalne nerveuse ventrale du homard Homarus vulgaris L. est pr61ev6e par dissection apr~s enl6vement de la portion ventrale des anneaux de l'abdomen. Elle est ligatur~e aux deux extr6mit6s pour faciliter les manipulations ult6rieures et plac~e dans une solution physiologique pr6par6e selon COLE5. Les mol6cules marqu6es utilis6es sont le I14C61glucose, le EI-14Clpyruvate et le ~2-14Clpyruvate. L'activit6 des solutions physiologiques est de io/zC/ml; la concentration en glucose est de 27.75 mM et celle du pyruvate de 29.63 mM. L'6tat fonctionnel de la prdparation biologique est v6rifi6 ~ des intervalles de temps r6guliers par mesure de l'activit6 61ectrique. Isolement des acides aminds Apr6s une p6riode de 1- 4 h d'incubation, la chaine nerveuse est lav6e rapidement dans un peu de solution physiologique stable, pes6e et plac6e pendant 5 min dans 2 ml d'eau distill6e bouillante. Le cordon nerveux est ensuite homog6n6is6 dans un tube de Potter-Elvehjem et l'homog6nat est dialys6 pendant 24 h h 4 ° contre IOO ml d'eau distill6e. Le dialysat est alors concentr6 40 fois. Les acides amin6s sont s~par6s par la technique d'61ectrophor~se sur papier. L'appareillage utilis6 comprend 3 cuves pouvant contenir chacune 4 bandes de papier de 4 ° × 41o m m sur lesquelles nous 6talons en une ligne de d6part 0.2 ml du dialysat concentr6 40 fois. La s6paration des acides amin6s se fair en deux 6tapes. Au cours d'une premi&re 61ectrophor&se, nous s6parons l'alanine, le glycocolle, l'arginine, la lysine et un m61ange form6 des autres acides amin6s. Le milieu tampon est constitu6 par un m61ange d'une solution d'acide ac6tique 2 N e t d'une solution d'acide formique o.6N, I : i (v/v) (pH 1.9)6. Pour ces 61ectrophor~ses chaque bande de papier est soumise ~ un gradient de potentiel de 34 ° V pendant 4.5 h. Le courant est d6bit6 ~t raison de 2 mA par bande. Une seconde 61ectrophor~se, effectu6e dans un milieu tampon constitu6 d'un m61ange de pyridine ~t 4,5 % et d'acide ac6tique ~t IO %, I :I (v/v) ~ p H 4.25 (MIcHLT), permet de s6parer l'acide glutamique et l'acide aspartique des autres acides amin6s. La diff6rence de potentiel utilis6e est de 340 V, le courant de 6 mA par bande est d6bit6 pour une p6riode de 3.5 h. Elution et comptage des acides aminds Apr~s 61ectrophor~se nous proc6dons sur l'une des quatre bandes de papier d'une m~me cure ~t la raise en ~vidence du spectre 61ectrophor6tique par vaporisation d'une solution ~ 0.25 To de ninhydrine dans le propanol. Une fois les acides amin6s localis6s leur emplacement pr6cis est report6 sur deux autres bandes par juxtaposition de celles-ci avec la bande tdmoin. Les parties de bandes non r6v616es reconnues comme portant un acide amin6 sont alors d6coup6es et 61u6es. Les produits de l'61ution sont 6wtpor6s ~t sec, sous vide, sur P205. Les mesures de radioactivit6 des 6chantillons ainsi pr6par6s sont effectu6es au moyen d'un scintillateur liquide "Tri-Carb" P a c k a r d ' . * Nous remercions le docteur W. G. VERLY d'avoir bien voulu effectuer les mesures au scintillateur liquide.

Biochim. Biophys. Acta, 82 (1964) 518-524

520

R. GILLlgS, E. S C H O F t r E N I E L .c,

Nous avons d6termin6 l ' i m p o r t a n c e des pertes en acides amines marquds r6sultant des m a n i p u l a t i o n s effectu6es entre l'~51ution des b a n d e s de m61ange d'acides antin6s des dlectrophor6ses ~t p H 1. 9 et les ~lectrophor~ses ~t p H 4.2. P o u r ee faire nous avons & a b l i des bilans en m e s u r a n t la radioactivitfi t o t a l e de la solution soumise ~t l'61ectrophor~se et la r a d i o a c t i v i t 6 r~cupdrde p a r l'61ution des diff6rentes p o r t i o n s de la b a n d e de papier. Les rdsultats m o n t r e n t que les pertes varient entre 4.71 et I 1.75 °i~. R 1~S U L T A T S

Dans une sdrie d'expdriences pr~liminaires nous avons d6termin6 la t e n e u r t o t a l e ell azote amin~ ainsi que la r a d i o a c t i v i t d des acides amin6s isol6s apr¢~s incubation dans une solution physiologique c o n t e n a n t du glucose on du p y r u v a t e marqu(,. La durde de ht pdriode d ' i n c u b a t i o n a vari~ de i ~l 4 h. ].es rdsultats de e i d & e r m i n a t i o n s m o n t r e n t que la t e n e u r en azote amin~ totale, exprim('e en t,g de leucine p a r mg de poids frais, est tr~s v a r i a b l e d ' u n e chaine nerveuse t~ l ' a n t r e (de I3.1 tt 26.22 tzg lem-inc p a r mg poids frais). Cette variabilit6 individuelle se r e t r o u v e lorsqu'on mesure la radioaetivitd des acides amines isolds et ce quel que soit le t e m p s d ' i n c u b a t i o n . C'est ainsi clue la radioactivit~ de l'alanine aprbs I h d ' i n c u b a t i o n dans tree solution t)hysiologique c o n t e n a n t du ~tlC s]glucose wtrie e n t r e 50.8 4 et I 5 5 . o I coups /ntin p a r mg de poids frais. Ces r f s u l t a t s nous ont incites il e o m p a r c r l'incorporation de ~(" dans les acides aminfis isolds it p a r t i r d,.'s deux moitids d ' u n e m6me chaine nerveuse. Le T a b l e a u I donne les rdsultats obtenus. On peut voir que la radioactivit6 exprimde en eoups/min p a r m g de poids frais est, dans les limites des erreurs expdrimentales, i d e n t i q u e pour les acides aminfis isol~s ~ p a r t i r des deux moitifis d ' u n e m~:me chaine v e n t r a l e bien qu'incubdes s @ a r 6 m e n t . Ces r~sultats d ~ m o n t r e n t done qu'il est possible d ' u t i l i s e r une demi chaine v e n t r a l e comme t&noin d ' u n e expdrienee. On r e m a r q u e 6galement que e'est l'alanine q u i a la radioactivity5 la plus imp o r t a n t e . Q u a n t aux wtriations observ&~s pour le mdlange d'acides alninfis r d s u l t a n t d? l'61ectrophorbse "t p H 4.2, il nous est a c t u e l l e m e n t impossible d ' e n expliquer la C~ttlSe.

T:\13LEAI:

1

I N C O R P O R A T I O N D E 14(" .'k P A R T I R 1)I¢ i l l ( ' 6 ( i L I ' C O S E I)AN.~ L E S A C I D E N A,MINI~'S 1SOLI'~ ]\ I~ARTIR I)E D E U X MOITI}];S I ) ' U N E MEMI,; ( ' H A I N F N E R V E U S E VI,;NTR&LE DE H O M A R D

i.cs d e u x p r 6 p a r a t i o n s s~mt incubfies s d p a r 6 n l e n t d a n s u n e s o l u t i o n p h y s i o l o g i q u v o ~ y g d n d e c o n t e n a n t d u g l u c o s e /t la c o n c e n t r a t i o n de 27.75 m M . D u r d e d ' i n c u b a t i o n ~ h, l.~s r(~sultat~ s m t e x p r i m 6 ~ en ~ : o u p s / m i n p a r m g d e p o i d s frais. 1,2~p d r . ' n c c ~

li ~pdrlencc ~,

Acides amim's

M ~ l a n g e p H 1.9 Alanine Glycocolle Arginine Lvsine M d l a n g c p H 4.-' Acide glutamique Acidc aspartique

:~lotltd I

3lodid 2

Moltd I

M o i t i d ::

23o.08 2 (~()~30 3 o, 94 2.5o 2.5o 94. i5 43.75 30.o 4

234.~t, 2 (~4.25 3 TM 04 2.37 2.34 38.99 43.34 36.88

t i7.4 i

I t~.oq ~(~. 3 ° t ~.o 5 3-53 l.,q5 74-~5 2 i. 28 t o.50

80.52 I (7.8 e 3.o5 2.oo 55-30 2 v. 37 t ~. n~)

Biochim. H~ophys..4eta, 82 (10~o4) 5I H 5z

t

521

SYNTHESE DES ACIDES AMINI~S DU NERF DE HOMARD

incorporation de 14C dans les acides aminds ~ partir de [14C6]glucose [I-14Clpyruvate et [2-14C]pyruvate Dans ces exp6riences une moiti~ de chalne ventrale est incub6e dans une solution contenant du [14C6~glucose alors que l'autre moiti~ est plac6e dans une solution physiologique contenant soit du [I-14C]pyruvate soit de I2-14Clpyruvate. Apr+s 2 h de contact au cours desquelles l'activit6 61ectrique des pr@arations a 6t6 v~rifi6e, les acides amin~s sont isol~s selon la m6thode d6crite. Le Tableau I I donne les r~sultats de quelques exp6riences. I1 ne nous a pas paru int6ressant de faire une moyenne de tous les r6sultats obtenus 6tant donn~ les variations individuelles importantes observ6es. D'autre part, les r6sultats exposes plus haut et concernant les diff~rences observfies entre les moiti6s d'une m~me chalne incubdes dans des conditions identiques pr~sentent tellement peu de variations qu'il est justifi~ de considdrer comme t~moin valable une portion de la chaine ventrale. Le Tableau I I montre que 1'incorporation de TABLEAU II INCORPORATION DE 14C DANS LES ACIDES NMINt~S A PARTIR DE ~14C6!GLLICONE , DE [I-14C~PYRUVATI~ •T D]~ [2-14C]PYRUVATE

Les a e t i v i t 6 s mesur6es s o n t e x p r i m 6 e s en c o u p s / m i n p a r nag de poi ds frais de c h a i n e v e n t r a l e . Acides aminds

PremiOre demi chalne [liCe]glucose

Seconde demi cha~ne [x-t4CJpyruvate

Premiere demi ¢halne [x-14C]pyruvate

Seconde demi chalne [2-14C]pyruvate

Alanine Glycoeolle Arginine Lysine Glutamate Aspartate

70.28 i o. 52 o. 80 I. 15 5 I. 55 46 .o 2

287.41 44.32 I.OO i.oo 5 o. 06 46. 71

178.84 43.93 o. 89 o.oi 88.38 I 1o. 16

387.93 80. o i 2.05 1.42 189 . i o 236.46

Alanine Glycocolle Arginine Lysine Glutamate Aspartate

81.61 9.61 1.5 ° I.OO 48 .5 ° 34.04

388.64 35.88 1.41 o.86 48 . 16 41.08

2oo.i 2 i 17. oo 1.52 1.52 73.3 o 80.19

479.o0 179- 04 1.23 1.56 17 ° . 14 194. i z

Alanine Glycocolle Arginine Lysine Glutamate Aspartate

57.05 4.3 ° 1.24 1.62 49- 63 52.31

234.82 16.05 1.6o 1.33 46. 54 52.94

579.03 7 ° .65 1.59 1.21 57.78 76.9o

118o.45 152.86. 1.33 1.67 105 . 03 143.5o

Alanine Glycocolle Arginine Lysine Glutamate Aspartate

126.7 ° 36.52 1.6o o.93 46.96 35.99

I ooo. 23 288.42 1.92 o.83 87.8 o 72.16

Alanine Glycocolle Arginine Lysine Glutamate Aspartate

196.79 4.79 o. 78 0.66 67 . 12 72 . 02

1547.43 3o.48 2. oo 2.45 142 . 49 144. o5

Biochim. Biophys. Acta, 82 (i964) 518-524

522

R. G I L L E S ,

E. S C H O F F E N I E L S

14C dans les acides amin6s 6tudi6s se fait dans des proportions relatives identiques, quel que soit le substrat utilis6. II est pourtant clair qu'il y a des diff6rences quantitafives importantes. Dans le cas de l'utilisation du [l~C61glueose et du [ I - u C ! p y r u v a t e comme substrat nous w)yons que l'activit4 de l'alanine et du glycocolle est environ 4 fois plus 61evde dans le cas du p y r u v a t e ators qu'en ce qui concerne les acides dicarboxyliques, l'activii6 est pratiquement la m~me, Dans le cas du i14C,]glucose et du [2-HC p y r u v a t e , l'activit6 de l'alanine et du glycocolle est environ huit lois plus importante lorsque lc substrat est du p y r u v a t e alors qu'elle est le double pour les acides dicarboxyliques dans les m6mes conditions. Si nous examinons cette partie dn tableau relative aux rfsultats obtenus avec le EI-14C p y r u v a t e et le i2-HC ipyruvate, il apparalt que la radioactivit6 mesur6e, lorsque le [2-t4C!pyruvate est lc substrat, est double de celle mesurde lorsque le [ > 1 4 ( - p y r u v a t c est utilis6. Dans tons les cas, la radioactivit6 de l'arginine et de la lvsine est tr6s peu importantc. I)ISCtTSS~OX Les rdsultats qui viennent d'&tre prdsent6s montrent qu'il y a incorporation de t4C dans les acides amin6s libres d'une chaine nerveuse ventrale de h o m a r d isol6e et incubde dans une solution physiologique contenant du glucose ou du p y r u v a t e radioactif. Parmi les acides amin6s 6tudids la lysine et l'arginine ont la radioactivit6 la plus basse, les valeurs obtenues n'6tant pas toujours signifieativement diffdrentes de celles enregistr6es pour le background, Nous ne consid6rerons donc pas ces acides aminds dans la discussion qui suit. Pour faciliter l'examen des r6sultats, nous pouvons utilement les rdsumer sous forme d ' u n tableau dans lequel nous considdrons que l'activit6 des acides amin6s est 6gale 5, I lorsque le i~'*C~]glucose est le substrat. "I'ABI.EAU

III

R AD IO AC T IV IT E R E L A T I V E DES ACIDES AMINt~S O B T E N U F AVEC TROIS SUBSTRATS D [ F F E R E N T S

L'activit6

o b t e n u e I o r s q u e le s u b s t r a t A ci tes aminds

Alaninc Glycocolle Glutamate Aspartate

e s t le g l u c o s e e s t a r b i t r a i r e m e n t

/ uC, ]Glucosc

l i i l

choisie 6gale k l'unit4.

/ t -*~C] Pyrv~vate

[z-* 4C] Pyruvate

4 4 l r

8 8 " 2

Comparons maintenant les r4sultats obtenus avec le [14C6]glucose et le [ I - 1 4 C ! pyruvate. Puisque I'activit4 spficifique des deux substrats est la mfime dans nos solutions &incubations, il est fivident que le p y r u v a t e provenant du catabolisme du glucose radioactif aura une activitd spdcifique moitid moindre de celle obtenue lorsque le p y r u v a t e est le substrat. On devrait donc s'attendre g c e que la radioactivit6 des acides amin4s soit moiti6 moindre lorsque le glucose est le substrat exog~ne. Or nous eonstatons que l'activit6 du glutamate et de l'aspartate est la m6me quel que soit le substrat utilis6. I1 est aussi important de remarquer que l'entr6e du p y r u v a t e dans le cycle de Biochim. Biophys. Acla, 8z U 9 6 4 ) 5 1 8 5 2 4

SYNTHI~SE DES ACIDES AMINI~S DU NERF DE HOMARD

523

Krebs s'accompagne d'une dfcarboxylation portant sur le C-I, c'est-~-dire le carbone du pyruvate qui dans le cas qui nous occupe est radioactif. Pourtant les acides dicarboxyliques d6rivant directement du cycle de Krebs sont radioactifs ce qui indique donc que le pyruvate pourrait entrer dans le cycle de Krebs par une autre voie que celle de l'ac6tate activ6. Cette entr6e dans le cycle de Krebs pourrait se faire sous forme de phospho~nolpyruvate. Comme l'activit6 du glutamate et de l'aspartate est la mfime dans le cas de l'utilisation des deux substrats bien que les activit6s sp6cifiques des substrats soient diff~rentes, il semble qu'une moiti6 du pyruvate entre dans le cycle de Krebs sous forme d'ac6tate activ6 alors que l'autre moiti6 entre par la voie du phosphodnolpyruvate. Cette interpr6tation trouve un support expdrimental dans la comparaison des r6sultats obtenus avec le [2-1*Clpyruvate. En effet l'activit6 des acides dicarboxyliques, lorsque le [2-14C~pyruvate est le substrat, est toujours double de celle obtenue lorsque le [14Celglucose ou le [I-14C~pyruvate est le substrat exog~ne. Dans le cas du glycocolle et de l'alanine, on peut voir que l'activit6 est environ quatre fois plus importante lorsque le pyruvate est le substrat, alors que, en se basant sur les activitfs sp6cifiques, le rapport aurait dfi 8tre de deux. Pour expliquer la diff6rence observ6e, on peut penser qu'une partie du glucose ddgrad6 par la voie du cycle d'Embden-Meyerhof emprunte un shunt n'aboutissant pas ~ la formation de pyruvate. On sait en effet qu'une partie du 3-phospho-D-glyc6rate peut ~tre transform~e en hydroxypyruvate. Par transamination, ~ partir d'alanine, il y a formation de s6rine. Par transamination de la phosphos6rine sur l'a-c6toglutarate, il y a production de glutamate. Nous avons donc ici une voie possible de formation de glutamate sans passer par le pyruvate, avec en derni~re analyse transamination A partir d'alanine. Le r~sultat net est donc la d6gradation de glucose sans production de pyruvate. On pourrait aussi sugg~rer que la p~n~tration du glucose exog~ne dans le liquide intracellulaire de la chaine nerveuse est plus lente que celle du pyruvate, ce qui permettrait d'expliquer partiellement certains r6sultats. N6anmoins si on consid~re les r6sultats obtenus avec le [2-1aClpyruvate, il est clair que l'alanine ne provient pas uniquement d'une transamination sur le pyruvate, et nous devons consid~rer la possibilit6 d'une synth~se de l'alanine ~ partir du pyruvate par une voie indirecte impliquant une d6carboxylation du C-I du pyruvate. REMERCIEMENTS

Nous remercions Monsieur le Professeur MARCEL FLORKIN des encouragements qu'il n ' a cess6 de nous prodiguer au cours de la rdalisation de ce travail. Ce travail a 6td effectu~ grgtce ~ l'attribution ~t l'un de nous (E. S.) d'un "credit aux chercheurs" du Fonds National de la Recherche Scientifique et d'un subside de l'Agence Internationale de l'Energie Atomique (Res/i62/i4). RtSUM~ Nos r¢sultats nous permettent de sugg6rer l'existence d'un certain nombre de voies m6taboliques aboutissant ~ la synth~se des acides amin6s. Le pyruvate semble emprunter 4 voles diff6rentes. Outre l'entr6e dans le cycle de Krebs sous forme d'acCtate Biochim. Biophys. Acta, 82 (1964) 518-524

524

R. C-IIA.ES, E. SCHOFFEN1KI~;

a c t i v e , il s e m b l e q u ' u n e p a r t i e i m p o r t a n t e du p y r u v a t e p6n~tre d a n s le cycle de K r e b s d i r e c t e m e n t ou p a r l ' i n t e r m d d i a i r e du p h o s p h o 6 n o l p y r u v a t e . U n e troisi+me vole s u i v i e est celle q u i c o n d u i t d i r e c t e m e n t ~ la synth(?se d ' a l a n i n e . Enfin p u i s q u ' i l y a tree diffdrence d a n s le m a r q u a g e de l ' a l a n i n e selon la l o c a l i s a t i o n du H(- d a n s le p y r u v a t e , nous p o u v o n s p o s t u l e r l ' e x i s t e n c c d ' t m e voic m 6 t a b o l i q u e i n d i r c c t e i m p l i q t t a n t la d 6 c a r b o x v l a t i o n du (;-I du p y r u v a t e ct a b o u t i s s a n t 5 la s y n t h b s c d ' a l a n i n e . E n ce q u i c o n c e r n e le glucose, nos r(}sultats s u g g b r e n t l ' e x i s t e n c e d ' u n s h u n t a b o u t i s s a n t ~ la s y n t h b s e des acides d i c a r b o x y l i q u e s s a n s passer par le cycle de Krebs. L a voie de l ' h y d r o x y p y r u v a t e n o u s p a r a i t une voic p(~ssiblc. P;I P,IA( )(;RAt'} l i e 1 M. N. CAMIEN, H. SARLF'I', (~. I)UCHATEAUET M. IgLORK1N,,/. t¢iol. Chem., 19 (I951) 8~I. 2 G. I)UCHF~TEAUET M. FLORKIN, ,4rC/t. [*~[er*z. ]~]t).',';io[. Biochim.. 03 (I955) 249 3 M. FLORKIN, [31II[. ~4Ca([. ]~OV. M e d . Bell,., Classe des Sci., tS (i962) 687. 4 ('. JEUNIAUX ET M . I;LORKIN, :lrch. l~tteml. Physiol. t3iochi.~.. 69 (196I) 3~75. 5 \V. H. COLE, .[. (;en. Physiol., 25 (194 I) 1. 6 B . I'2IC'bZHOFFF~NET (). \VI,2STPHAL,Z..'X:atzt~j}n'.~ch., 71) (1(~52) *)51~. 7 H. MICHL, 3lonalstt. ('he~Jl.. 82 (IO5 l) 4S9. 13i,)chb~. l~;iophys. .tc/c~, S_, (1()04) 518 524