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Le poste de sécurité microbiologique : de la réglementation à l’accréditation
ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE
Le poste de sécurité microbiologique : de la réglementation à l’accréditation Jean-Paul Kleina,*
RÉSUMÉ
SUMMARY
Le poste de sécurité microbiologique joue un rôle majeur dans la prévention du risque infectieux des opérateurs des laboratoires de microbiologie. Des mesures de confinement sont indispensables pour réduire les risques de transmission d’agents pathogènes présents dans les prélèvements cliniques. L’objectif de cet article est double : fournir une synthèse des manipulations à effectuer sous PSM pour se conformer aux exigences réglementaires et normatives, et proposer des modalités de qualification opérationnelle/vérification sur site. Agents pathogènes – microbiologie – poste de sécurité microbiologique – infections acquises au laboratoire – gestion des risques.
1. Introduction La manipulation des prélèvements cliniques expose le personnel des laboratoires de biologie médicale (LBM) aux agents biologiques. Le risque infectieux lié au diagnostic microbiologique concerne la bactériologie, la mycologie, la virologie et la parasitologie. Pour réduire le risque de transmission des agents pathogènes, les mesures de confinement et notamment le poste de sécurité microbiologique (PSM) jouent un rôle central. Cependant, les conditions d’utilisation optimale du PSM sont le plus souvent non seulement mal connues mais aussi mal formalisées. L’utilisation du PSM joue également un rôle majeur dans la préservation des échantillons biologiques des contaminations de l’environnement. L’objectif de cet article est de proposer de faire un bon usage du PSM par la mise en œuvre de dispositions organisationnelles et de dispositions pour les activités techniques. Une analyse des risques fondée sur l’origine des prélèvements (renseignements cliniques) et sur le recrutement des patients (réanimation, neurologie, chirurgie, médecine, long séjour, patient de ville, etc.) est essentielle pour assurer la sécurité microbiologique des opérateurs et une organisation adaptée aux besoins. a Syndibio – Laboratoire Xaille-Klein 98, rue des Capucins 55200 Commercy
* Correspondance [email protected] article reçu le 13 mars, accepté le 9 juillet 2012. © 2012 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.
The microbiological safety cabinet: from regulation to accreditation The microbiological safety cabinet plays a key role in the prevention of infectious risk for the staff working in microbiology laboratories. Containment measures are essential to reduce the risks of transmission of pathogenic agents from clinical specimens. This article seeks to achieve the following two objectives : on one hand to give a synthesis of the manipulations which have to be made under MSC to comply with the statutory and normative requirements and on the other hand to offer methods for operational qualification/on-site verification. Pathogenic agent – microbiology – microbiological safety cabinet – laboratory acquired infections – risk management
Des exemples pratiques seront donnés et discutés sur la base de l’expérience acquise au cours de notre accréditation en bactériologie pour : r satisfaire les exigences réglementaires et normatives, r définir les actes à effectuer sous PSM, r adapter les pratiques professionnelles pour un bon usage du PSM, r proposer des modalités de qualification opérationnelle/ vérification sur site, r assurer la maintenance et le contrôle microbiologique d’un PSM.
2. Cadre réglementaire et normatif r Arrêté du 18 juillet 1994 fixant la liste des agents biologiques pathogènes [1]. r Arrêté du 30 juin 1998 modifiant l’arrêté du 18 juillet 1994 modifié fixant la liste des agents biologiques pathogènes [2]. r Directive 2000/54/CE du 18 septembre 2000 [3]. r Guide de bonne exécution des analyses (GBEA). Arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JO du 11 décembre 1999 modifié par arrêté du 28 avril 2002, (JO du 4 mai 2002) [4]. r Arrêté du 16 juillet 2007 fixant les mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mettre en œuvre dans les laboratoires de recherche, d’enseignement, d’analyses, d’anatomie et cytologie pathologiques,
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les salles d’autopsie et les établissements industriels et agricoles où les travailleurs sont susceptibles d’être exposés à des agents biologiques pathogènes. JO du 4 août 2007 [5]. r Arrêté du 30 juin 2010 fixant la liste des micro-organismes et toxines prévue à l’article L. 5139-1 du Code de la Santé publique [6]. r Instruction n°DGS/RI13/2011/449 du 1er décembre 2011 relative à l’actualisation des recommandations visant à réduire les risques de transmission d’agents transmissibles non conventionnels lors des actes invasifs [7]. r Arrêté du 31 décembre 2011 fixant la liste des centres nationaux de référence pour la lutte contre les maladies transmissibles et des laboratoires associés [8]. r Organisation mondiale de la santé. Manuel de sécurité biologique en laboratoire. 2005, 3e éd. [9]. r Norme NF ISO 22870. Analyses de biologie délocalisées (ADBD). Exigences concernant la qualité et la compétence 2006, AFNOR [10]. r Norme NF ISO 15189. Laboratoires d’analyses de biologie médicale. Exigences particulières concernant la qualité et la compétence 2007, AFNOR [11]. r Document SH REF 02. Recueil des exigences spécifiques pour l’accréditation des laboratoires de biologie médicale. Cofrac, Révision 01, juin 2012 [12]. r Document SH GTA 01. Guide technique d’accréditation en biologie médicale. Cofrac, Révision 00, mai 2011 [13].
3. Matériels et méthodes Une revue de la littérature a mis en évidence l’absence de synthèse portant sur la liste des manipulations à effectuer sous PSM [14-17]. Le Référentiel en microbiologie médicale (Rémic 2010) donne des informations fragmentaires sur les prélèvements à traiter sous PSM [18]. Nous passerons en revue les différents prélèvements nécessitant l’utilisation d’une enceinte de confinement : hémocultures, LCR, selles, ponctions, biopsies, prélèvements ostéo-articulaires, etc. Pour garantir la sécurité microbiologique, il convient d’adapter les moyens aux activités et de prendre des mesures préventives. Rappelons que la sécurité biologique a un double objectif : r d’une part assurer la protection des personnels et de l’environnement face aux risques liés aux agents biologiques pathogènes (micro-organismes et toxines), r d’autre part garantir la qualité et la fiabilité des examens, plus particulièrement pour les prélèvements dits « précieux » tels que les liquides céphalorachidiens (LCR), les biopsies, et les liquides de ponction.
3.1. Dispositions organisationnelles L’arrêté du 16 juillet 2007 fixe les mesures techniques de prévention et de confinement à mettre en œuvre par les LBM pour maîtriser la dissémination des agents pathogènes transmissibles [5]. Pour prévenir les risques de contamination des personnes mais aussi des échantillons biologiques, il est nécessaire de mettre en place une organisation qui réponde aux exigences réglementaires et aux règles de l’art : r assurer la sécurité microbiologique par l’application des précautions standards (hygiène des mains, port de gants,
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port de vêtements de protection, élimination sécurisée du matériel souillé, bionettoyage des surfaces contaminées, sécurisation du transport de prélèvements biologiques, conduite à tenir en cas d’accident d’exposition avec du sang ou des liquides biologiques) et la mise en œuvre de bonnes pratiques de laboratoire ; r faire vacciner le personnel conformément à l’article 3111-4 du Code de Santé publique (CSP) qui mentionne que les personnes qui occupent une activité professionnelle dans un LBM doivent être immunisées contre la fièvre typhoïde. Cette obligation ne concerne que les personnels exposés au risque de contamination, soit en pratique les personnes qui manipulent les selles ; r créer un comité de coordination des vigilances et des risques (réactovigilance, matériovigilance, biovigilance, infectiovigilance, vigilance liée à l’assistance médicale à la procréation) ; r organiser les veilles réglementaires, normatives, sanitaires et scientifiques. Cet accès à l’information médicale et scientifique est essentiel pour se tenir informé des alertes sanitaires : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM), Centre de coordination et de lutte contre les infections nosocomiales (C-CLIN), Institut de veille sanitaire (InVS), etc.).
3.2. Dispositions techniques 3.2.1. Les postes de sécurité microbiologiques Le PSM est une enceinte ventilée qui assure une protection de l’opérateur contre la contamination aéroportée ainsi qu’un confinement dynamique des produits manipulés. Plusieurs types de PSM sont disponibles en fonction de l’activité du laboratoire et du type de prélèvements traités [18-22]. Il est important de choisir un PSM de taille adaptée aux besoins (au minimum 1,20 m de large) pour travailler dans de bonnes conditions. Dans la mesure du possible, il faut éviter d’acheter les appareils « d’entrée de gamme » souvent trop petits avec un accès malaisé. De plus, pour les plateaux techniques des laboratoires multisites, il est souhaitable d’acquérir plusieurs appareils dans la logique de la « marche en avant » en utilisant par exemple une enceinte de confinement pour J0 (ensemencement) et une autre pour J +1 (isolement des souches). Ajoutons encore qu’un certain nombre de laboratoires ont acquis des PSM pour respecter les obligations réglementaires mais ne les utilisent pas ou peu. Le rôle du biologiste consiste aussi à sensibiliser, les technicien(ne)s à utiliser les PSM. Selon l’usage, il existe plusieurs types de PSM : r PSM de type I : protection de l’opérateur et de l’environnement par un écoulement d’air vers l’enceinte, placée en dépression. La protection du produit manipulé n’est pas assurée ; r PSM de type II : une entrée d’air à l’avant du PSM (veine de garde) permet d’assurer la protection de l’opérateur et d’éviter toute sortie accidentelle d’air contaminé vers l’extérieur du poste. La ventilation du volume et du plan de travail est assurée par de l’air filtré protégeant le prélèvement. Ce type de PSM protège l’opérateur, la manipulation et l’environnement. C’est ce modèle de PSM qui doit être retenu pour les laboratoires de biologie médicale ;
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r PSM de type III : l’air entrant dans le PSM est filtré de même que l’air extrait. Un PSM de type III est obligatoire pour les manipulations des agents biologiques du groupe 4. L’accès à la manipulation est assuré par deux manchons souples équipés de gants.
3.2.2. Les différents types de filtres r HEPA : High Efficiency Particulate Air (arrête 99,97 % de particules ≥ 0,3 μm). r ULPA : Ultra Low Particulate Air (arrête 99,99 % de particules ≥ 0,12 μm). Il est souhaitable d’utiliser plutôt des PSM équipés de filtre ULPA en virologie (la taille des virus est en générale inférieure à 0,25 μm, la taille des bactéries varie de 0,1 à 10 μm).
4. Mode de transmission des agents pathogènes Les principaux modes de transmission des agents pathogènes sont consignés dans le tableau I. La connaissance des modes de contaminations liés aux manipulations est bien entendu indispensable pour l’analyse des risques et pour prendre les mesures préventives appropriées.
5. Classification des micro-organismes Les micro-organismes ont été répartis en 4 groupes d’agents pathogènes (voir tableau II) en fonction de leur niveau de
Tableau I – Modes de transmission de certains agents pathogènes. Modes de transmission
Agents pathogènes
Voie respiratoire
Mycobacterium spp., Streptococcus pneumoniae, Brucella spp., Francisella spp., Neisseria meningitidis, Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Coccidioïdes immitis, Parvovirus B 19, virus de la grippe
Voie cutanéomuqueuse
Brucella spp., Francisella spp., Leptospira spp., HIV, virus des hépatites B et C, cytomégalovirus, virus de l’herpès
Voie orale
Salmonella spp., virus de l’hépatite A, Escherichia coli O 157, Shigella spp., Toxoplasma gondii, Clostridium difficile, bactéries multirésistantes telles que : Enterococcus spp. résistant aux glycopeptides, SARM, Klebsiella pneumoniae BLSE, entérobactéries productrices de carbapénèmases
risque (pouvoir pathogène et mode de transmission facile de l’homme à l’homme, etc.) [1-3, 6]. * Escherichia coli O 157 : H7 : souche entéro-hémorragique (ECEH). Le sérotype O 157 responsable de la « maladie du hamburger ». Les ECEH produisent une vérotoxine ou shiga-toxine qui peut entraîner un syndrome hémolytique et urémique (SHU). D’autres sérogroupes entéro-hémorragiques d’Escherichia coli peuvent héberger cette toxine. Présents dans des échantillons alimentaires, fécaux et environnementaux, ils sont susceptibles de provoquer des infections gastro-intestinales ainsi qu’un SHU : O 26 H 11, O 111 H 8, O 103 H 2, O 145 H 28. ** Agent transmissible non conventionnel (ATNC) : nom donné aux agents infectieux qui ne sont ni des bactéries, ni des virus, ni des parasites, ni des champignons. Le prion est le premier des ATNC. Le concept de « prion » repose sur
Tableau II – Classification des micro-organismes. Groupes
Exemples
Définition
Bacillus subtillis, Escherichia coli K12 (souche expérimentale) Groupe 1
Aspergillus niger, Penicillium camenberti Certains virus végétaux Escherichia coli (pathogènes), Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Campylobacter spp., Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium, Mycobacterium marinum, Mycobacterium paratuberculosis, Proteus mirabilis, Salmonella enteritidis, Streptococcus pyogenes
Groupe 2
Candida albicans, Candida tropicalis, Microsporum spp., Aspergillus flavus, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii
Comprend les agents biologiques non susceptibles de provoquer une maladie chez l’homme. Il s’agit par exemple de bactéries utilisées pour la production de denrées alimentaires (Lactobacillus bifidus, Saccharomyces cerevisiae) Comprend les agents biologiques pouvant entraîner une maladie chez l’homme et constituer un danger pour les personnes en contact avec ces agents. Leur propagation à la collectivité est peu probable. Il existe une prophylaxie et/ou un traitement efficace
Virus Epstein-Barr, virus de l’herpès, virus Influenza (A, B), virus de la rougeole, virus des oreillons, Adénovirus, Rotavirus, Cytomégalovirus, Rhinovirus Brucella melitensis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Salmonella typhi, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Escherichia coli O157 : H7 *, E. coli O 103 *, Pseudomonas mallei, Shigella dysenteriae Groupe 3
Histoplasma capsulatum Virus de la dengue, virus de l’hépatite C, VIH
Comprend les agents biologiques pouvant entraîner une maladie grave chez l’homme et constituer un danger sérieux pour les personnes en contact avec ces agents. La propagation de ces agents à la collectivité est possible, mais il existe généralement une prophylaxie ou un traitement efficace
Agents non classiques associés avec les encéphalopathies spongiformes transmissibles**
Groupe 4
Virus Ebola, virus de Lassa, virus Marbourg, virus Congo-Crimée, virus Machupo
Comprend les agents biologiques provoquant des maladies graves chez l’homme et constituant un danger sérieux pour les personnes en contact avec ces agents. Le risque de propagation à la collectivité est élevé et aucun traitement n’existe
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la possibilité pour une protéine naturelle (appelée PrPc pour cellulaire) d’acquérir une conformation structurale anormale lui conférant la propriété de s’accumuler dans le système nerveux central [7]. Ce terme fut introduit pour la première fois en 1982 par Stanley Prusiner et correspond à l’acronyme de PRoteinaceous Infectious ONly particle (particule protéique infectieuse).
6. Les niveaux de sécurité du laboratoire Quatre niveaux de sécurité des laboratoires de microbiologie sont distingués en fonction de contraintes croissantes liées à la manipulation d’agents biologiques pathogènes des groupes 2, 3 et 4 [1, 2, 5, 6]. r Niveau de sécurité 1 ou laboratoire L1 : les microorganismes manipulés ne sont pas pathogènes (risque faible ou modéré). r Niveau de sécurité 2 ou laboratoire L 2 : laboratoire de base (risque modéré). r Niveau de sécurité 3 ou laboratoire L 3 : laboratoire de confinement (risque élevé). r Niveau de sécurité 4 ou laboratoire L 4 : laboratoire de confinement haute sécurité (risque très élevé). Il existe 6 laboratoires P 4 au niveau européen [23].
7. Prescriptions pour les travaux sous PSM
diarrhée infectieuse à Clostridium difficile, Salmonella, etc.) et urinaires (bactéries multirésistantes, Escherichia coli BLSE) et de type respiratoire pour les agents transmissibles par voie aérienne (grippe, tuberculose, pneumonie).
7.3. Application des bonnes pratiques de laboratoire Une bonne utilisation du PSM est nécessaire pour garantir un niveau de protection optimal : r sensibiliser le personnel à l’intérêt de travailler sous PSM, r information et formation adaptée des opérateurs afin de garantir leur sécurité et l’intégrité du prélèvement ou de la culture, r démarrer le PSM 15 à 30 minutes avant de travailler afin de stabiliser les flux dans la chambre de travail, r limiter les déplacements dans la pièce durant les manipulations sous PSM, r fermeture des portes et des fenêtres (travail en niveau 2), r ne pas travailler à deux, r ne pas encombrer inutilement le PSM afin de ne pas perturber les flux (utilisation de dessertes mobiles), r travailler en organisant un zonage du propre vers le sale à l’intérieur de l’enceinte de confinement afin de minimiser les déplacements des produits contaminés, r contrôle microbiologique des surfaces de la chambre de travail, r faire fonctionner la lampe à UV en fin de journée, r audit des bonnes pratiques de laboratoires. NB : si le volume de travail est trop encombré, pour certains PSM, l’alarme de l’appareil se déclenche pour signaler les perturbations des flux d’air.
7.1. Application des précautions standards Les précautions standards sont : r hygiène des mains avant et après les manipulations, r mise à disposition de protection individuelle : blouses, gants, lunettes de protection (si risque d’éclaboussure lors de transvasements), masques (FFP1 ou FFP2, filtering face piece particules : le numéro indique la capacité de filtrage et donc son efficacité), r interdiction de recapuchonner les aiguilles, r interdiction du pipetage à la bouche, r élimination immédiate des objets piquants, coupants et tranchants (OPCT) dans un container adapté (DASRI), r existence d’une procédure en cas d’accident mettant en jeu des agents biologiques.
7.2. Application des précautions complémentaires Les précautions complémentaires ont pour but de maîtriser la dissémination les souches bactériennes au sein du laboratoire : r d’une part à fort pouvoir de diffusion (épidémiogène) comme Clostridium difficile, ERG (entérocoques résistants aux glycopeptides), virus entériques (norovirus, rotavirus, adénovirus), EPC (entérobactéries productrices de carbapénèmases), salmonelles, E. coli O 157 H 7, Vibrio cholerae, Campylobacter spp., etc. r d’autre part à potentiel infectieux tels les SARM et les EBLSE. Les précautions complémentaires sont de type contact pour les infections cutanées (SARM), entériques (gastro-entérite,
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8. Liste des manipulations à effectuer sous PSM 8.1. Le cadre réglementaire La question le plus souvent posée concerne le type de prélèvement qui doit être manipulé sous le PSM. La réponse est univoque : toutes les activités présentant un risque biologique avéré doivent être réalisées sous PSM. Le cas le plus évident est la manipulation des isolats de microorganismes (charge infectieuse liée à l’inoculum qui joue un rôle majeur dans la contamination). L’arrêté du 30 juin 1998 donne la liste des agents pathogènes et celui du 16 juillet 2007 concerne le confinement microbiologique. Il est aussi indispensable de faire une analyse des risques. Pour la tularémie, par exemple, il y a seulement 50 cas déclarés par an en France. Plus loin dans cet exposé, nous donnerons une liste indicative non exhaustive des opérations techniques à réaliser sous PSM pour les différentes familles du domaine de la biologie médicale. Cette liste peut être réactualisée en fonction des alertes sanitaires (rôle de la veille électronique des sites internet). La réalisation des tests de diagnostic rapide (TDR) comme par exemple pour la grippe ou le streptocoque A peut être effectuée par les cliniciens au cabinet médical ou encore dans les établissements de soins. Il est utile de rappeler que les prélèvements de gorge ou les écouvillonnages nasaux sont susceptibles de contenir des agents pathogènes du groupe 2 ou 3. Par conséquent, ces analyses
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devraient être réalisées dans une enceinte de confinement ou au moins par un opérateur équipé d’un masque protecteur et de gants.
Figure 1 – Préparation d’une carte d’identification et d’antibiogramme pour le Vitek 2.
8.2. Bactériologie Si l’analyse des risques permet d’adapter la conduite à tenir à chaque laboratoire, certaines règles générales sont applicables à la majorité des structures. r Le PSM doit être utilisé pour traiter tous les agents biologiques du groupe 2 qui peuvent provoquer des maladies chez l’homme par inhalation (création d’aérosol ou de gouttelettes), inoculation, ingestion ou par voie cutanée. En cas de suspicion d’une bactérie du groupe 3 isolée en culture (Mycobacterium tuberculosis, par exemple), celle-ci doit être immédiatement transférée dans un laboratoire de niveau de sécurité 3 en mesure d’identifier les souches (laboratoire de référence ou de CHU). r Les prélèvements précieux (LCR, biopsie osseuse, liquide de ponction, etc.) sont à manipuler sous PSM autant pour le risque de contamination du préleveur que celui du prélèvement. r Les ensemencements des échantillons biologiques, les isolements, les identifications (tests manuels), les antibiogrammes (préparation des galeries pour Mini-Api®, cartes pour le Vitek®, antibiogrammes en géloses) doivent être réalisés sous PSM (figure 1). r Repiquage des hémocultures. r Repiquage des bouillons de culture (Sélénite, BHI, Todd, Schaedler). r Préparation des lames avec les dépôts bactériens pour l’identification par spectrométrie de masse. La recherche spécifique d’un agent contagieux ou d’un mécanisme de résistance de haut niveau aux antibiotiques doit imposer le travail sous PSM : r recherche des toxines de Clostridium difficile, r les selles liquides de porteurs de Clostridium difficile peuvent être à l’origine de contamination de l’environnement par aérosolisation au moment de la manipulation, r cultures de Legionella spp., r dépose des disques d’antibiotiques pour la recherche de BMR de type BLSE, céphalosporinase ou carbapénèmase, r test d’agglutination au latex pour l’identification de Staphylococcus aureus et de Streptococcus spp, r test d’agglutination de particules de latex (détection de la résistance à la méticilline des souches de Staphylococcus aureus ou sérotypage des salmonelles). En résumé, les opérations techniques produisant des aérosols utilisant de fortes concentrations ou de grands volumes d’agents infectieux sont manipulées sous PSM [24]. Le tableau III présente quelques exemples de manipulations à réaliser sous PSM et les recommandations du Rémic 2010. Le Rémic 2010 ne mentionne pas la nécessité d’utiliser un PSM pour les 27 types de prélèvements décrits dans cet ouvrage [18]. En revanche, le chapitre consacré aux mesures d’hygiène, de sécurité et de sûreté au laboratoire indique : « les prélèvements d’origine humaine ou animale susceptibles de contenir des micro-organismes du groupe 2 ou 3 sont manipulés sous un PSM de type II ». Par ailleurs, il ne signale pas les précautions à prendre pour les agents biologiques non conventionnels du type prions. En revanche, le Rémic 2010 recommande l’utilisation du PSM pour les prélèvements suivants :
Tableau III – Exemples de recommandations du Rémic 2010 pour le traitement des échantillons. Types de prélèvements
Agents pathogènes
Classe de microorganismes
Recommandation du Rémic
Hémoculture
Brucellose
2
Travail sous PSM
LCR
Méningocoque
2
Travail sous PSM
ECBU
Mycobacterium tuberculosis Pseudomonas aeruginosa Cytomégalovirus
3 2 2
Absence de recommandation
ECBC
Legionella spp. Streptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis
2 2 3
Absence de recommandation
Selles
E. coli O 157 Toxine de Clostridium difficile Salmonella typhi
3 2 3
Travail sous PSM
Uro-génitaux
Neisseria gonorrhoeae Herpes simplex
2
Absence de recommandation
IST
VIH, hépatite C Neisseria gonorrhoeae Chlamydiae trachomatis
3 2 2
Absence de recommandation
Sperme
VIH, hépatite C Neisseria gonorrhoeae Chlamydiae trachomatis
3 2 2
Absence de recommandation
Pus
Staphylococcus aureus
2
Absence de recommandation
Lésion cutanée
Francisella tularensis (type A)
3
Travail sous PSM
Prélèvement ostéo-articulaire
S. aureus oxacilline S ou R
2
Travail sous PSM
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r toute culture suspecte de Brucella, qu’il y ait suspicion clinique d’emblée ou qu’il s’agisse d’une observation inattendue, ne doit être examinée que sous un PSM, r diagnostic microbiologique des infections osseuses et articulaires : l’ensemble des opérations de lecture, de repiquage et de manipulation des milieux doit systématiquement être effectué sous PSM afin de préserver l’échantillon biologique des contaminations de l’environnement, r examen bactériologique des collections closes et des séreuses : les mises en culture doivent être effectuées sous PSM. L’observation des cultures et des subcultures se font dans les mêmes conditions.
8.3. Parasitologie L’utilisation du PSM est requise en parasitologie : r pour les techniques de concentration des selles, r lorsque les parasites appartenant au groupe 3 sont suspectés : Taenia solium, Plasmodium falciparum, Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis.
8.4. Mycologie r Ensemencement des produits pathologiques. r Test de filamentation. r Candida albicans, C. tropicalis, Microsporum spp., Trichophyton spp.
8.5. Virologie r Recherche par culture cellulaire des virus des groupes 2, 3 et 4 des agents pathogènes. Il faut signaler que la recherche d’antigènes viraux par immunochromatographie est à effectuer sous PSM. En effet, lors de l’ouverture des flacons contenant des selles pour effectuer les tests immunochrommatographiques rapides pour la détection d’adénovirus et de rotavirus par exemple, il y a un risque de production d’aérosols car la pression interne peut être différente de la pression ambiante.
8.6. Culture cellulaire r Recherche d’effets cytopathogènes sur des cultures cellulaires.
8.7. Procréation médicalement assistée r Préparation du sperme en vue d’une insémination (test de migration survie, insémination avec sperme du conjoint, insémination avec sperme de donneur). r Insémination avec du sperme du conjoint.
9. Quelles sont les manipulations que l’on peut réaliser hors PSM Certaines manipulations restent possibles sur la paillasse à condition de respecter strictement les bonnes pratiques de laboratoire. Il est alors nécessaire de faire une analyse des risques dans le cadre du document unique d’évaluation des risques professionnels. À titre d’exemple, les activités suivantes peuvent être réalisées sur la paillasse. r Réalisation des colorations de Gram. r Examens directs. r Recherche d’antigène soluble urinaire de Legionella spp. r Recherche de sang dans les selles.
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Il faut encore noter que le dépistage d’albumine-sucre réalisé par bandelettes n’est jamais réalisé sous PSM alors que les échantillons d’urine sont susceptibles de contenir du CMV (infection virale congénitale la plus fréquente). Chez le sujet infecté, le virus est présent dans les leucocytes. Lors des réactivations, il peut être excrété dans de nombreux liquides biologiques : urines, larmes, salive, sperme, sécrétions cervico-vaginales, lait, etc. [25]. Le CMV peut se transmettre par contact des muqueuses avec des mains souillées par de l’urine par exemple. Mais ce n’est pas pour autant qu’il est nécessaire de faire le dépistage de l’albuminurie et de la glycosurie sous PSM. Au préalable, il convient de respecter les précautions standards ainsi que les précautions complémentaires. La prise en compte des renseignements cliniques pertinents montre alors toute son importance. Il ressort de ce qui précède que dans la pratique, c’est au responsable du laboratoire de juger de la sécurité des manipulations et des bonnes pratiques du laboratoire pour éviter les risques d’infection du personnel, ainsi que la contamination des échantillons. Il est clair que tous les échantillons sont potentiellement infectieux notamment en sérologie infectieuse, mais toutes les activités techniques du laboratoire ne peuvent pas être effectuées sous PSM.
10. Qualification opérationnelle/ vérification sur site d’un PSM 10.1. Méthodologie Nous avons abordé l’utilisation du PSM selon les obligations réglementaires, le type de germe recherché. Le PSM étant un matériel, il doit selon la norme 15189 être qualifié, vérifié pour prouver sa conformité aux spécifications. L’article 5.3.2 de la norme d’accréditation 15189 indique « il doit être démontré (lors de l’installation et au cours de l’utilisation courante) que le matériel est capable d’atteindre les performances requises et qu’il est conforme aux spécifications se rapportant aux analyses concernées » [10]. Les postes de sécurité sont normalement testés en usine avant livraison (il est utile de vérifier cette information avant la livraison auprès du fabriquant ou du distributeur). La qualification d’installation encore dénommée qualification opérationnelle a pour but de vérifier que l’appareillage est installé correctement par rapport aux spécifications requises. Il appartient au laboratoire d’être en mesure de démontrer que la qualification opérationnelle ainsi que la vérification des performances sont conformes aux spécifications du fabriquant. Le but est de vérifier la bonne installation de l’appareil, afin de pouvoir garantir des résultats fiables ainsi que de bonnes conditions de travail pour le technicien. La méthodologie pourra être décrite dans le cadre de la procédure générale de vérification/validation des méthodes. Une traçabilité doit être conservée avec les renseignements suivants : date d’installation, n° de série, installation proprement dite, adresse de la société, nom des personnes ayant participé à la mise en service. Lors de la livraison, le PSM doit être accompagné d’un dossier de contrôle qui comporte :
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ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE
r un contrôle de la vitesse des flux entrant et laminaire, r un test de vérification des filtres, r un contrôle des vibrations, de l’intensité lumineuse et du niveau sonore, r un test de visualisation des flux, r un test de confinement, r des tests microbiologiques.
10.2. Validation microbiologique du confinement et contrôle périodique Dans le cadre du plan de maintenance d’une installation de type enceinte de confinement, il est nécessaire de réaliser des contrôles microbiologiques de l’environnement qui doivent reposer sur une analyse des risques [26-30]. L’objectif est de valider (vérifier) la mise en application sur site par rapport à des spécifications techniques de décontamination. En interne, un suivi microbiologique mensuel doit être réalisé [28]. Ces tests sont réalisés car le PSM ne permet pas une filtration absolue, l’air n’est pas stérile mais propre (< 10 particules de 0,3 μ/50 L minute) pour le PSM de type II. Les prélèvements microbiologiques permettent de vérifier l’observance des protocoles de nettoyage et de désinfection. Au sein de notre laboratoire, la vérification microbiologique du confinement a été évaluée par méthode de cartographie statique avec géloses au sang (contamination aéroportée) ainsi que par contrôle de surface par empreintes de géloses Count-tact®. Le protocole d’échantillonnage est effectué en disposant les géloses aux deux extrémités, droite et gauche et au centre de la surface de travail du PSM. Il est intéressant de relever que certains PSM (Labculture® de classe II, type A2) possèdent un revêtement antimicrobien validé pour : Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Salmonella enteridis, Aspergillus niger. Les surfaces peintes sont recouvertes d’un revêtement antimicrobien Isocide™ de la société ESCO pour minimiser la contamination de la surface et inhiber la croissance bactérienne. Isocide élimine 99,9 % des bactéries. r Méthode par empreinte de géloses À la fin de l’activité technique, le PSM est nettoyé et décontaminé par le détergent désinfectant en vigueur dans le laboratoire. Le matin, placer des géloses Counttact® stériles de 25 cm2, par méthode d’empreinte en contact du plan du travail du PSM selon la cartographie précédente en appliquant une pression de 500 g ± 10 g pendant 10 secondes (il existe des dispositifs permettant d’obtenir ces caractéristiques de temps et de pression). r Méthode statique par géloses au sang Selon la norme NF ISO EN 7218, il est recommandé de procéder à une vérification périodique du taux de micro-organismes présents dans l’air pendant le fonctionnement des filtres en utilisant l’équipement habituel. Par exemple, exposer plusieurs boîtes de Pétri ouvertes contenant un milieu gélosé non sélectif (par exemple Plate Count Agar) pendant 30 minutes [31]. On peut placer des géloses au sang ouvertes dans le PSM en suivant la cartographie précédente durant une
Tableau IV – Critères de surveillance microbiologique. Zones protégées
PSM
Résultats en unités formant colonies/boîte (25 cm²) Aspergillus ou champignon filamenteux
Germes totaux
Cible : < 1 Alerte : 1 Action : 1
r Cible ≤ 5 et absence de germes pathogènes r Action > 5 ou présence de germes pathogènes
journée, lors du travail du technicien de 9 à 18 heures par exemple. La réalisation de la mesure de l’aérocontamination permet de constater que l’air délivré par le PSM est propre mais non stérile. Les résultats des contrôles microbiologiques réalisés au sein de notre laboratoire ont permis d’identifier les souches suivantes : Staphylococcus epidermidis, Micrococcus sp., Penicillum sp., etc. r Interprétation Pour les PSM, le tableau IV propose les critères de la Direction générale de la Santé, Direction de l’hospitalisation et de l’organisation des soins, Comité technique national des infections nosocomiales – DGS/DHOS, CTIN (2002) – pour les prélèvements de surfaces [29]. En externe, une maintenance annuelle avec un prestataire spécialisé.
11. Maintenance/vérification continue des performances d’un PSM 11.1. Maintenance quotidienne en interne La maintenance doit être assurée de façon quotidienne en réalisant un bionettoyage et la mise en route de la lampe UV après la journée de travail.
11.2. Maintenance annuelle en externe La maintenance annuelle sera effectuée par un prestataire de service externe au laboratoire. La société retenue devra utiliser des appareils raccordés au Cofrac (anémomètre et compteur de particules). Classiquement, la révision annuelle est réalisée avec remise d’un constat de vérification. Il s’agit d’une vérification des performances encore appelée qualification des performances (le PSM doit répondre aux spécifications techniques). La prestation de vérification des performances d’un PSM doit satisfaire pleinement les exigences des normes NF EN 12 469 [32] et NF EN 14 644 [33] : r vérification de la vitesse d’écoulement d’air descendant et entrant, r contrôle de la vitesse d’écoulement d’air entrant, r contrôle des organes de sécurité (essentiellement la vitre de protection), r contrôles des alarmes (elles sont liées à des problèmes de flux), r contrôle des filtres : ils sont à changer classiquement tous les 4/5 ans ou dès lors qu’ils ralentissent trop les flux (alarmes sur certains PSM),
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Figure 2 – Visualisation des flux par un test avec générateur de fumigène.
13. L’audit : un outil d’évaluation des pratiques professionnelles On veillera à évaluer les risques et les niveaux d’exposition aux agents pathogènes lors des audits internes. Cette évaluation doit être réalisée pour vérifier l’application des précautions standards, des précautions complémentaires ainsi que les bonnes pratiques de laboratoires. En résumé, l’audit est un outil très important pour s’assurer que les dispositions prises dans les procédures sont bien appliquées [34]. Le tableau V propose à titre d’exemple un questionnaire d’audit pour évaluer les pratiques professionnelles. Il appartient en effet au laboratoire de vérifier la compétence des personnels et de s’assurer en particulier de leur connaissance des procédures applicables au laboratoire.
14. Perspectives r visualisation des flux par un test avec générateur de fumées (figure 2), r recherche de fuite et classification de la propreté de l’air (classe ISO), r vérification des fonctions : éclairage, UV, prise de courant.
12. Procédure dégradée en cas de panne Dans l’éventualité d’une panne du PSM, il y a lieu d’évaluer les risques en fonction des prélèvements et du statut clinique du patient mais aussi de procéder à une décontamination de l’appareil [30]. Pour les échantillons biologiques suivants, ECBU, prélèvements vaginaux, coprocultures et les pus, on considère que l’on peut les manipuler hors PSM (en respectant les précautions standards : ports de gants, masque, lunettes de protection, tenue vestimentaire adaptée) dans l’attente de l’intervention du service après vente, car il n’y a pas de production d’aérosol susceptible de contaminer l’opérateur. En cas de panne du PSM, il peut être fait le choix d’utiliser un bec Bunsen (Securos) de sécurité programmable à technologie digitale, bien que l’utilisation d’un bec Bunsen (méthode pasteurienne) fasse l’objet de débats. Pour les prélèvements susceptibles de contenir des bactéries de classe 3 (BK) tels que les expectorations ou les lavages broncho-alvéolaires, les centrifugations sont effectuées avec des plots équipés de nacelles étanches. De surcroît, on attendra 10 minutes avant d’ouvrir le couvercle afin de maîtriser les risques de contamination par les aérosols. En cas de renversement d’un échantillon à l’intérieur du PSM, on essuie l’écoulement puis on vaporise un produit détergent désinfectant du type Amphomousse® (actif sur Mycobacterium tuberculosis, HIV-I, HBV et rotavirus, du laboratoire Stéridines).
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La robotisation du processus analytique en bactériologie risque de réduire à terme l’utilisation du PSM. Certaines chaînes d’automatisation en bactériologie sont équipées d’un traitement d’air comme, par exemple, le PREVI Isola™ de bioMérieux. L’air est filtré par un filtre HEPA qui arrête les aérosols. On se trouve dans la configuration d’un PSM de type I sans laminarité. Dans le cas de la biologie médicale délocalisée, il se pose encore la question de la réalisation des tests de dépistage rapide comme pour la grippe qui seront réalisés sans enceinte de confinement. Une réflexion sur ce sujet doit être développée au niveau des autorités sanitaires. Pour les laboratoires multisites, les sites de prélèvement qui ne réalisent pas d’ensemencement n’ont pas besoin d’être équipés d’un PSM.
15. Conclusion Le personnel susceptible d’être exposé à des risques de contamination doit faire l’objet de mesures de protection contre le risque infectieux. Aussi, les manipulations de prélèvements cliniques et tout particulièrement ceux qui peuvent générer des aérosols doivent être réalisées avec des mesures de confinement appropriées. Le travail sous PSM permet de protéger l’opérateur des pathologies infectieuses bactériennes, virales, ou fongiques et de préserver l’échantillon biologique des contaminations de l’environnement. Rappelons que le PSM garantit un air propre mais non stérile. De plus, la sécurité du personnel du laboratoire doit être assurée par la connaissance et l’application des précautions standards, des précautions complémentaires et des bonnes pratiques de laboratoire. L’évaluation des pratiques professionnelles par des audits internes est particulièrement bien adaptée dans ce cadre. On veillera donc à sensibiliser mais aussi à faire adhérer le personnel au travail sous une enceinte de confinement. Finalement, le biologiste doit juger de la sécurité des
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ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE
Tableau V – Audit des prescriptions pour les travaux sous PSM. Questions
Vérification et commentaires
Application des précautions standards Hygiène des mains avant et après manipulation Mise à disposition de protection individuelle : blouses, gants, lunettes de protection, chaussures, masques Interdiction de recapuchonner les aiguilles Elimination immédiate des objets piquants, coupants et tranchants (OPCT) dans un container adapté Existence d’une procédure en cas d’accidents mettant en jeu des agents biologiques Application des précautions complémentaires Précautions contact pour les infections cutanées (SARM), infections entériques (gastro-entérite, diarrhée infectieuse à Clostridium difficile, Salmonella, etc.) et urinaires (bactéries multirésistantes, Escherichia coli BLSE) Précautions respiratoires (grippe, tuberculose, pneumonie) Application des bonnes pratiques de laboratoires Démarrer le PSM 15 minutes avant de travailler afin de stabiliser les flux Ne pas travailler à deux Ne pas encombrer inutilement la zone de travail Travailler en organisant un zonage du propre vers le sale à l’intérieur de l’enceinte de confinement afin de minimiser les déplacements des produits contaminés Faire fonctionner la lampe à UV en fin de journée Contrôler et changer régulièrement les tubes Nettoyer et dépoussiérer tout objet introduit dans le PSM Maintenir la zone de travail propre Ne pas introduire dans le PSM de matériels réputés polluants tels que bois, liège, papier, crayon, gomme Information et formation du personnel Fermeture des portes et des fenêtres
examens biologiques en respectant les bonnes pratiques de laboratoire. Il est clair que si certaines manipulations hors PSM peuvent être discutées en fonction d’une analyse des risques pertinente, en revanche ensemencer un prélèvement ostéo-articulaire sur une simple paillasse est une faute. Enfin, il revient au laboratoire de mettre en œuvre des moyens internes fiables et performants et de faire appel à une expertise externe et complémentaire pour
Références [1] Arrêté du 18 juillet 1994 fixant la liste des agents biologiques pathogènes. [2] Arrêté du 30 juin 1998 modifiant l’arrêté du 18 juillet 1994 modifié fixant la liste des agents biologiques pathogènes. [3] Directive 2000/54/CE du 18 septembre 2000 concernant la protection des travailleurs contre les risques liés à l’exposition à des agents biologiques au travail. [4] Guide de bonne exécution des analyses (GBEA). Arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JO du 11 décembre 1999 modifié par arrêté du 28 avril 2002 (JO du 4 mai 2002). [5] Arrêté du 16 juillet 2007 fixant les mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mettre en œuvre dans les laboratoires de
la maintenance ainsi que la vérification des performances du PSM. Remerciements : l’auteur remercie Mme Nathalie Rouppert (CH de Bar-Le-Duc) et M. Mouloud Hammad (Tourcoing) pour la relecture de cet article et leurs conseils qui ont contribué à son amélioration.
Déclaration d’intérêts : l’auteur déclare ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.
recherche, d’enseignement, d’analyses, d’anatomie et cytologie pathologiques, les salles d’autopsie et les établissements industriels et agricoles où les travailleurs sont susceptibles d’être exposés à des agents biologiques pathogènes. JO du 4 août 2007. [6] Arrêté du 30 juin 2010 fixant la liste des micro-organismes et toxines prévue à l’article L. 5139-1 du Code de la Santé publique. [7] Instruction n°DGS/RI13/2011/449 du 1er décembre 2011 relative à l’actualisation des recommandations visant à réduire les risques de transmission d’agents transmissible non conventionnels lors des actes invasifs. [8] Arrêté du 31 décembre 2011 fixant la liste des centres nationaux de référence pour la lutte contre les maladies transmissibles et des laboratoires associés. [9] Organisation mondiale de la Santé. Manuel de sécurité biologique en laboratoire. 3e éd. 2005.
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[10] Norme NF ISO 22870, Analyses de biologie délocalisées (ADBD). Exigences concernant la qualité et la compétence, AFNOR, 2006. [11] Norme NF ISO 15189, Laboratoires d’analyses de biologie médicale. Exigences particulières concernant la qualité et la compétence, AFNOR, 2007. [12] Document SH REF 02, Recueil des exigences spécifiques pour l’accréditation des laboratoires de biologie médicale. Cofrac, Révision 01, juin 2012. [13] Document SH GTA 01, Guide technique d’accréditation en biologie médicale. Cofrac, Révision 00, mai 2011. [14] Hammad M, Paris L. Accréditation en bactériologie. Retour d’expérience. Feuill Biol 2011;LII( 300): 39-48. [15] Touche S, Bajolet O. Risques infectieux au laboratoire. Rev Fr Lab 2010;429:65-70. [16] Suiro A. Les mesures de confinements. Option Bio 2008; 9/405:22-3. [17] Klein JP. L’accréditation en bactériologie. Rev Fr Lab 2011; 436:39-50. [18] Référentiel en microbiologie médicale (bactériologie et mycologie), Société française de microbiologie, 4e édition. Vivactis Plus Ed., 2010. [19] Mounier M, Hidri N, Ploy MC, Denis F. Sécurité biologique au laboratoire de bactériologie. In: Bactériologie médicale, 2e édition, Elsevier Masson, 2011. [20] Balty I, Belhanini B, et al. Postes de sécurité microbiologique. Postes de sécurité cytotoxique. Choix et utilisation. INRS. Cahiers de notes documentaires 2003;193:37-52. [21] Delarras C. Microbiologie pratique pour le laboratoire d’analyses ou de contrôle sanitaire. Lavoisier édit. 2007:476p.
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[22] Andrieu JL, Jacquet MA, Moncoq D, Risques biologiques. Les cahiers de prévention. CNRS, 1re édition, 2002. [23] Morin H. Le laboratoire P4, ménagerie virale. Le Monde 2009; samedi 6 juin:17. [24] Programme 116/2. Essais et analyses en bactériologie animale. Cofrac 2003:38. 25] Vabret A, Verdon R, Brouard J. Vademecum des maladies virales. Masson Edit. 2003:318p. [26] Hartmann P, Blech MF, Simon L. Les contrôles microbiologiques de l’environnement hospitalier. Rev Fr Lab 1997;291:43-7. [27] Horn C. Les contrôles microbiologiques de surfaces. Bulletin de coordination de la lutte contre les infections nosocomiales de l’Est 1999;14:13-6. [28] Klein JP. Utilisation et exploitation des contrôles de qualité en bactériologie. Spectra Biol 2011;190:54-64. [29] DGS/DHOS, CTIN 2002, Surveillance microbiologique de l’environnement dans les établissements de santé. Air, eaux et surfaces. Ministère chargé de la santé 2002. [30] Cariou S, Gauthier M, Glénat MH. Décontamination, bionettoyage, désinfection, stérilisation. Guide pratique. 4e éd. Masson 2000:257p. [31] Norme NF ISO 7218. Microbiologie des aliments. Exigences générales et recommandations, AFNOR 2007. [32] Norme NF ISO 12469. Critères de performance pour les postes de sécurité microbiologique, AFNOR 2005. [33] Norme NF ISO 14644-1. Salles propres et environnements maîtrisés apparentés, AFNOR 1999. [34] Collectif d’auteurs. European manual of clinical microbiology. 1er éd. Société française de microbiologie. ESCMID. 2012:469p.
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Le poste de sécurité microbiologique : de la réglementation à l’accréditation Jean-Paul Kleina,*
RÉSUMÉ
SUMMARY
Le poste de sécurité microbiologique joue un rôle majeur dans la prévention du risque infectieux des opérateurs des laboratoires de microbiologie. Des mesures de confinement sont indispensables pour réduire les risques de transmission d’agents pathogènes présents dans les prélèvements cliniques. L’objectif de cet article est double : fournir une synthèse des manipulations à effectuer sous PSM pour se conformer aux exigences réglementaires et normatives, et proposer des modalités de qualification opérationnelle/vérification sur site. Agents pathogènes – microbiologie – poste de sécurité microbiologique – infections acquises au laboratoire – gestion des risques.
1. Introduction La manipulation des prélèvements cliniques expose le personnel des laboratoires de biologie médicale (LBM) aux agents biologiques. Le risque infectieux lié au diagnostic microbiologique concerne la bactériologie, la mycologie, la virologie et la parasitologie. Pour réduire le risque de transmission des agents pathogènes, les mesures de confinement et notamment le poste de sécurité microbiologique (PSM) jouent un rôle central. Cependant, les conditions d’utilisation optimale du PSM sont le plus souvent non seulement mal connues mais aussi mal formalisées. L’utilisation du PSM joue également un rôle majeur dans la préservation des échantillons biologiques des contaminations de l’environnement. L’objectif de cet article est de proposer de faire un bon usage du PSM par la mise en œuvre de dispositions organisationnelles et de dispositions pour les activités techniques. Une analyse des risques fondée sur l’origine des prélèvements (renseignements cliniques) et sur le recrutement des patients (réanimation, neurologie, chirurgie, médecine, long séjour, patient de ville, etc.) est essentielle pour assurer la sécurité microbiologique des opérateurs et une organisation adaptée aux besoins. a Syndibio – Laboratoire Xaille-Klein 98, rue des Capucins 55200 Commercy
* Correspondance [email protected] article reçu le 13 mars, accepté le 9 juillet 2012. © 2012 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.
The microbiological safety cabinet: from regulation to accreditation The microbiological safety cabinet plays a key role in the prevention of infectious risk for the staff working in microbiology laboratories. Containment measures are essential to reduce the risks of transmission of pathogenic agents from clinical specimens. This article seeks to achieve the following two objectives : on one hand to give a synthesis of the manipulations which have to be made under MSC to comply with the statutory and normative requirements and on the other hand to offer methods for operational qualification/on-site verification. Pathogenic agent – microbiology – microbiological safety cabinet – laboratory acquired infections – risk management
Des exemples pratiques seront donnés et discutés sur la base de l’expérience acquise au cours de notre accréditation en bactériologie pour : r satisfaire les exigences réglementaires et normatives, r définir les actes à effectuer sous PSM, r adapter les pratiques professionnelles pour un bon usage du PSM, r proposer des modalités de qualification opérationnelle/ vérification sur site, r assurer la maintenance et le contrôle microbiologique d’un PSM.
2. Cadre réglementaire et normatif r Arrêté du 18 juillet 1994 fixant la liste des agents biologiques pathogènes [1]. r Arrêté du 30 juin 1998 modifiant l’arrêté du 18 juillet 1994 modifié fixant la liste des agents biologiques pathogènes [2]. r Directive 2000/54/CE du 18 septembre 2000 [3]. r Guide de bonne exécution des analyses (GBEA). Arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JO du 11 décembre 1999 modifié par arrêté du 28 avril 2002, (JO du 4 mai 2002) [4]. r Arrêté du 16 juillet 2007 fixant les mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mettre en œuvre dans les laboratoires de recherche, d’enseignement, d’analyses, d’anatomie et cytologie pathologiques,
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les salles d’autopsie et les établissements industriels et agricoles où les travailleurs sont susceptibles d’être exposés à des agents biologiques pathogènes. JO du 4 août 2007 [5]. r Arrêté du 30 juin 2010 fixant la liste des micro-organismes et toxines prévue à l’article L. 5139-1 du Code de la Santé publique [6]. r Instruction n°DGS/RI13/2011/449 du 1er décembre 2011 relative à l’actualisation des recommandations visant à réduire les risques de transmission d’agents transmissibles non conventionnels lors des actes invasifs [7]. r Arrêté du 31 décembre 2011 fixant la liste des centres nationaux de référence pour la lutte contre les maladies transmissibles et des laboratoires associés [8]. r Organisation mondiale de la santé. Manuel de sécurité biologique en laboratoire. 2005, 3e éd. [9]. r Norme NF ISO 22870. Analyses de biologie délocalisées (ADBD). Exigences concernant la qualité et la compétence 2006, AFNOR [10]. r Norme NF ISO 15189. Laboratoires d’analyses de biologie médicale. Exigences particulières concernant la qualité et la compétence 2007, AFNOR [11]. r Document SH REF 02. Recueil des exigences spécifiques pour l’accréditation des laboratoires de biologie médicale. Cofrac, Révision 01, juin 2012 [12]. r Document SH GTA 01. Guide technique d’accréditation en biologie médicale. Cofrac, Révision 00, mai 2011 [13].
3. Matériels et méthodes Une revue de la littérature a mis en évidence l’absence de synthèse portant sur la liste des manipulations à effectuer sous PSM [14-17]. Le Référentiel en microbiologie médicale (Rémic 2010) donne des informations fragmentaires sur les prélèvements à traiter sous PSM [18]. Nous passerons en revue les différents prélèvements nécessitant l’utilisation d’une enceinte de confinement : hémocultures, LCR, selles, ponctions, biopsies, prélèvements ostéo-articulaires, etc. Pour garantir la sécurité microbiologique, il convient d’adapter les moyens aux activités et de prendre des mesures préventives. Rappelons que la sécurité biologique a un double objectif : r d’une part assurer la protection des personnels et de l’environnement face aux risques liés aux agents biologiques pathogènes (micro-organismes et toxines), r d’autre part garantir la qualité et la fiabilité des examens, plus particulièrement pour les prélèvements dits « précieux » tels que les liquides céphalorachidiens (LCR), les biopsies, et les liquides de ponction.
3.1. Dispositions organisationnelles L’arrêté du 16 juillet 2007 fixe les mesures techniques de prévention et de confinement à mettre en œuvre par les LBM pour maîtriser la dissémination des agents pathogènes transmissibles [5]. Pour prévenir les risques de contamination des personnes mais aussi des échantillons biologiques, il est nécessaire de mettre en place une organisation qui réponde aux exigences réglementaires et aux règles de l’art : r assurer la sécurité microbiologique par l’application des précautions standards (hygiène des mains, port de gants,
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port de vêtements de protection, élimination sécurisée du matériel souillé, bionettoyage des surfaces contaminées, sécurisation du transport de prélèvements biologiques, conduite à tenir en cas d’accident d’exposition avec du sang ou des liquides biologiques) et la mise en œuvre de bonnes pratiques de laboratoire ; r faire vacciner le personnel conformément à l’article 3111-4 du Code de Santé publique (CSP) qui mentionne que les personnes qui occupent une activité professionnelle dans un LBM doivent être immunisées contre la fièvre typhoïde. Cette obligation ne concerne que les personnels exposés au risque de contamination, soit en pratique les personnes qui manipulent les selles ; r créer un comité de coordination des vigilances et des risques (réactovigilance, matériovigilance, biovigilance, infectiovigilance, vigilance liée à l’assistance médicale à la procréation) ; r organiser les veilles réglementaires, normatives, sanitaires et scientifiques. Cet accès à l’information médicale et scientifique est essentiel pour se tenir informé des alertes sanitaires : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM), Centre de coordination et de lutte contre les infections nosocomiales (C-CLIN), Institut de veille sanitaire (InVS), etc.).
3.2. Dispositions techniques 3.2.1. Les postes de sécurité microbiologiques Le PSM est une enceinte ventilée qui assure une protection de l’opérateur contre la contamination aéroportée ainsi qu’un confinement dynamique des produits manipulés. Plusieurs types de PSM sont disponibles en fonction de l’activité du laboratoire et du type de prélèvements traités [18-22]. Il est important de choisir un PSM de taille adaptée aux besoins (au minimum 1,20 m de large) pour travailler dans de bonnes conditions. Dans la mesure du possible, il faut éviter d’acheter les appareils « d’entrée de gamme » souvent trop petits avec un accès malaisé. De plus, pour les plateaux techniques des laboratoires multisites, il est souhaitable d’acquérir plusieurs appareils dans la logique de la « marche en avant » en utilisant par exemple une enceinte de confinement pour J0 (ensemencement) et une autre pour J +1 (isolement des souches). Ajoutons encore qu’un certain nombre de laboratoires ont acquis des PSM pour respecter les obligations réglementaires mais ne les utilisent pas ou peu. Le rôle du biologiste consiste aussi à sensibiliser, les technicien(ne)s à utiliser les PSM. Selon l’usage, il existe plusieurs types de PSM : r PSM de type I : protection de l’opérateur et de l’environnement par un écoulement d’air vers l’enceinte, placée en dépression. La protection du produit manipulé n’est pas assurée ; r PSM de type II : une entrée d’air à l’avant du PSM (veine de garde) permet d’assurer la protection de l’opérateur et d’éviter toute sortie accidentelle d’air contaminé vers l’extérieur du poste. La ventilation du volume et du plan de travail est assurée par de l’air filtré protégeant le prélèvement. Ce type de PSM protège l’opérateur, la manipulation et l’environnement. C’est ce modèle de PSM qui doit être retenu pour les laboratoires de biologie médicale ;
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ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE
r PSM de type III : l’air entrant dans le PSM est filtré de même que l’air extrait. Un PSM de type III est obligatoire pour les manipulations des agents biologiques du groupe 4. L’accès à la manipulation est assuré par deux manchons souples équipés de gants.
3.2.2. Les différents types de filtres r HEPA : High Efficiency Particulate Air (arrête 99,97 % de particules ≥ 0,3 μm). r ULPA : Ultra Low Particulate Air (arrête 99,99 % de particules ≥ 0,12 μm). Il est souhaitable d’utiliser plutôt des PSM équipés de filtre ULPA en virologie (la taille des virus est en générale inférieure à 0,25 μm, la taille des bactéries varie de 0,1 à 10 μm).
4. Mode de transmission des agents pathogènes Les principaux modes de transmission des agents pathogènes sont consignés dans le tableau I. La connaissance des modes de contaminations liés aux manipulations est bien entendu indispensable pour l’analyse des risques et pour prendre les mesures préventives appropriées.
5. Classification des micro-organismes Les micro-organismes ont été répartis en 4 groupes d’agents pathogènes (voir tableau II) en fonction de leur niveau de
Tableau I – Modes de transmission de certains agents pathogènes. Modes de transmission
Agents pathogènes
Voie respiratoire
Mycobacterium spp., Streptococcus pneumoniae, Brucella spp., Francisella spp., Neisseria meningitidis, Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Coccidioïdes immitis, Parvovirus B 19, virus de la grippe
Voie cutanéomuqueuse
Brucella spp., Francisella spp., Leptospira spp., HIV, virus des hépatites B et C, cytomégalovirus, virus de l’herpès
Voie orale
Salmonella spp., virus de l’hépatite A, Escherichia coli O 157, Shigella spp., Toxoplasma gondii, Clostridium difficile, bactéries multirésistantes telles que : Enterococcus spp. résistant aux glycopeptides, SARM, Klebsiella pneumoniae BLSE, entérobactéries productrices de carbapénèmases
risque (pouvoir pathogène et mode de transmission facile de l’homme à l’homme, etc.) [1-3, 6]. * Escherichia coli O 157 : H7 : souche entéro-hémorragique (ECEH). Le sérotype O 157 responsable de la « maladie du hamburger ». Les ECEH produisent une vérotoxine ou shiga-toxine qui peut entraîner un syndrome hémolytique et urémique (SHU). D’autres sérogroupes entéro-hémorragiques d’Escherichia coli peuvent héberger cette toxine. Présents dans des échantillons alimentaires, fécaux et environnementaux, ils sont susceptibles de provoquer des infections gastro-intestinales ainsi qu’un SHU : O 26 H 11, O 111 H 8, O 103 H 2, O 145 H 28. ** Agent transmissible non conventionnel (ATNC) : nom donné aux agents infectieux qui ne sont ni des bactéries, ni des virus, ni des parasites, ni des champignons. Le prion est le premier des ATNC. Le concept de « prion » repose sur
Tableau II – Classification des micro-organismes. Groupes
Exemples
Définition
Bacillus subtillis, Escherichia coli K12 (souche expérimentale) Groupe 1
Aspergillus niger, Penicillium camenberti Certains virus végétaux Escherichia coli (pathogènes), Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Campylobacter spp., Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium, Mycobacterium marinum, Mycobacterium paratuberculosis, Proteus mirabilis, Salmonella enteritidis, Streptococcus pyogenes
Groupe 2
Candida albicans, Candida tropicalis, Microsporum spp., Aspergillus flavus, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii
Comprend les agents biologiques non susceptibles de provoquer une maladie chez l’homme. Il s’agit par exemple de bactéries utilisées pour la production de denrées alimentaires (Lactobacillus bifidus, Saccharomyces cerevisiae) Comprend les agents biologiques pouvant entraîner une maladie chez l’homme et constituer un danger pour les personnes en contact avec ces agents. Leur propagation à la collectivité est peu probable. Il existe une prophylaxie et/ou un traitement efficace
Virus Epstein-Barr, virus de l’herpès, virus Influenza (A, B), virus de la rougeole, virus des oreillons, Adénovirus, Rotavirus, Cytomégalovirus, Rhinovirus Brucella melitensis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Salmonella typhi, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Escherichia coli O157 : H7 *, E. coli O 103 *, Pseudomonas mallei, Shigella dysenteriae Groupe 3
Histoplasma capsulatum Virus de la dengue, virus de l’hépatite C, VIH
Comprend les agents biologiques pouvant entraîner une maladie grave chez l’homme et constituer un danger sérieux pour les personnes en contact avec ces agents. La propagation de ces agents à la collectivité est possible, mais il existe généralement une prophylaxie ou un traitement efficace
Agents non classiques associés avec les encéphalopathies spongiformes transmissibles**
Groupe 4
Virus Ebola, virus de Lassa, virus Marbourg, virus Congo-Crimée, virus Machupo
Comprend les agents biologiques provoquant des maladies graves chez l’homme et constituant un danger sérieux pour les personnes en contact avec ces agents. Le risque de propagation à la collectivité est élevé et aucun traitement n’existe
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la possibilité pour une protéine naturelle (appelée PrPc pour cellulaire) d’acquérir une conformation structurale anormale lui conférant la propriété de s’accumuler dans le système nerveux central [7]. Ce terme fut introduit pour la première fois en 1982 par Stanley Prusiner et correspond à l’acronyme de PRoteinaceous Infectious ONly particle (particule protéique infectieuse).
6. Les niveaux de sécurité du laboratoire Quatre niveaux de sécurité des laboratoires de microbiologie sont distingués en fonction de contraintes croissantes liées à la manipulation d’agents biologiques pathogènes des groupes 2, 3 et 4 [1, 2, 5, 6]. r Niveau de sécurité 1 ou laboratoire L1 : les microorganismes manipulés ne sont pas pathogènes (risque faible ou modéré). r Niveau de sécurité 2 ou laboratoire L 2 : laboratoire de base (risque modéré). r Niveau de sécurité 3 ou laboratoire L 3 : laboratoire de confinement (risque élevé). r Niveau de sécurité 4 ou laboratoire L 4 : laboratoire de confinement haute sécurité (risque très élevé). Il existe 6 laboratoires P 4 au niveau européen [23].
7. Prescriptions pour les travaux sous PSM
diarrhée infectieuse à Clostridium difficile, Salmonella, etc.) et urinaires (bactéries multirésistantes, Escherichia coli BLSE) et de type respiratoire pour les agents transmissibles par voie aérienne (grippe, tuberculose, pneumonie).
7.3. Application des bonnes pratiques de laboratoire Une bonne utilisation du PSM est nécessaire pour garantir un niveau de protection optimal : r sensibiliser le personnel à l’intérêt de travailler sous PSM, r information et formation adaptée des opérateurs afin de garantir leur sécurité et l’intégrité du prélèvement ou de la culture, r démarrer le PSM 15 à 30 minutes avant de travailler afin de stabiliser les flux dans la chambre de travail, r limiter les déplacements dans la pièce durant les manipulations sous PSM, r fermeture des portes et des fenêtres (travail en niveau 2), r ne pas travailler à deux, r ne pas encombrer inutilement le PSM afin de ne pas perturber les flux (utilisation de dessertes mobiles), r travailler en organisant un zonage du propre vers le sale à l’intérieur de l’enceinte de confinement afin de minimiser les déplacements des produits contaminés, r contrôle microbiologique des surfaces de la chambre de travail, r faire fonctionner la lampe à UV en fin de journée, r audit des bonnes pratiques de laboratoires. NB : si le volume de travail est trop encombré, pour certains PSM, l’alarme de l’appareil se déclenche pour signaler les perturbations des flux d’air.
7.1. Application des précautions standards Les précautions standards sont : r hygiène des mains avant et après les manipulations, r mise à disposition de protection individuelle : blouses, gants, lunettes de protection (si risque d’éclaboussure lors de transvasements), masques (FFP1 ou FFP2, filtering face piece particules : le numéro indique la capacité de filtrage et donc son efficacité), r interdiction de recapuchonner les aiguilles, r interdiction du pipetage à la bouche, r élimination immédiate des objets piquants, coupants et tranchants (OPCT) dans un container adapté (DASRI), r existence d’une procédure en cas d’accident mettant en jeu des agents biologiques.
7.2. Application des précautions complémentaires Les précautions complémentaires ont pour but de maîtriser la dissémination les souches bactériennes au sein du laboratoire : r d’une part à fort pouvoir de diffusion (épidémiogène) comme Clostridium difficile, ERG (entérocoques résistants aux glycopeptides), virus entériques (norovirus, rotavirus, adénovirus), EPC (entérobactéries productrices de carbapénèmases), salmonelles, E. coli O 157 H 7, Vibrio cholerae, Campylobacter spp., etc. r d’autre part à potentiel infectieux tels les SARM et les EBLSE. Les précautions complémentaires sont de type contact pour les infections cutanées (SARM), entériques (gastro-entérite,
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8. Liste des manipulations à effectuer sous PSM 8.1. Le cadre réglementaire La question le plus souvent posée concerne le type de prélèvement qui doit être manipulé sous le PSM. La réponse est univoque : toutes les activités présentant un risque biologique avéré doivent être réalisées sous PSM. Le cas le plus évident est la manipulation des isolats de microorganismes (charge infectieuse liée à l’inoculum qui joue un rôle majeur dans la contamination). L’arrêté du 30 juin 1998 donne la liste des agents pathogènes et celui du 16 juillet 2007 concerne le confinement microbiologique. Il est aussi indispensable de faire une analyse des risques. Pour la tularémie, par exemple, il y a seulement 50 cas déclarés par an en France. Plus loin dans cet exposé, nous donnerons une liste indicative non exhaustive des opérations techniques à réaliser sous PSM pour les différentes familles du domaine de la biologie médicale. Cette liste peut être réactualisée en fonction des alertes sanitaires (rôle de la veille électronique des sites internet). La réalisation des tests de diagnostic rapide (TDR) comme par exemple pour la grippe ou le streptocoque A peut être effectuée par les cliniciens au cabinet médical ou encore dans les établissements de soins. Il est utile de rappeler que les prélèvements de gorge ou les écouvillonnages nasaux sont susceptibles de contenir des agents pathogènes du groupe 2 ou 3. Par conséquent, ces analyses
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devraient être réalisées dans une enceinte de confinement ou au moins par un opérateur équipé d’un masque protecteur et de gants.
Figure 1 – Préparation d’une carte d’identification et d’antibiogramme pour le Vitek 2.
8.2. Bactériologie Si l’analyse des risques permet d’adapter la conduite à tenir à chaque laboratoire, certaines règles générales sont applicables à la majorité des structures. r Le PSM doit être utilisé pour traiter tous les agents biologiques du groupe 2 qui peuvent provoquer des maladies chez l’homme par inhalation (création d’aérosol ou de gouttelettes), inoculation, ingestion ou par voie cutanée. En cas de suspicion d’une bactérie du groupe 3 isolée en culture (Mycobacterium tuberculosis, par exemple), celle-ci doit être immédiatement transférée dans un laboratoire de niveau de sécurité 3 en mesure d’identifier les souches (laboratoire de référence ou de CHU). r Les prélèvements précieux (LCR, biopsie osseuse, liquide de ponction, etc.) sont à manipuler sous PSM autant pour le risque de contamination du préleveur que celui du prélèvement. r Les ensemencements des échantillons biologiques, les isolements, les identifications (tests manuels), les antibiogrammes (préparation des galeries pour Mini-Api®, cartes pour le Vitek®, antibiogrammes en géloses) doivent être réalisés sous PSM (figure 1). r Repiquage des hémocultures. r Repiquage des bouillons de culture (Sélénite, BHI, Todd, Schaedler). r Préparation des lames avec les dépôts bactériens pour l’identification par spectrométrie de masse. La recherche spécifique d’un agent contagieux ou d’un mécanisme de résistance de haut niveau aux antibiotiques doit imposer le travail sous PSM : r recherche des toxines de Clostridium difficile, r les selles liquides de porteurs de Clostridium difficile peuvent être à l’origine de contamination de l’environnement par aérosolisation au moment de la manipulation, r cultures de Legionella spp., r dépose des disques d’antibiotiques pour la recherche de BMR de type BLSE, céphalosporinase ou carbapénèmase, r test d’agglutination au latex pour l’identification de Staphylococcus aureus et de Streptococcus spp, r test d’agglutination de particules de latex (détection de la résistance à la méticilline des souches de Staphylococcus aureus ou sérotypage des salmonelles). En résumé, les opérations techniques produisant des aérosols utilisant de fortes concentrations ou de grands volumes d’agents infectieux sont manipulées sous PSM [24]. Le tableau III présente quelques exemples de manipulations à réaliser sous PSM et les recommandations du Rémic 2010. Le Rémic 2010 ne mentionne pas la nécessité d’utiliser un PSM pour les 27 types de prélèvements décrits dans cet ouvrage [18]. En revanche, le chapitre consacré aux mesures d’hygiène, de sécurité et de sûreté au laboratoire indique : « les prélèvements d’origine humaine ou animale susceptibles de contenir des micro-organismes du groupe 2 ou 3 sont manipulés sous un PSM de type II ». Par ailleurs, il ne signale pas les précautions à prendre pour les agents biologiques non conventionnels du type prions. En revanche, le Rémic 2010 recommande l’utilisation du PSM pour les prélèvements suivants :
Tableau III – Exemples de recommandations du Rémic 2010 pour le traitement des échantillons. Types de prélèvements
Agents pathogènes
Classe de microorganismes
Recommandation du Rémic
Hémoculture
Brucellose
2
Travail sous PSM
LCR
Méningocoque
2
Travail sous PSM
ECBU
Mycobacterium tuberculosis Pseudomonas aeruginosa Cytomégalovirus
3 2 2
Absence de recommandation
ECBC
Legionella spp. Streptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis
2 2 3
Absence de recommandation
Selles
E. coli O 157 Toxine de Clostridium difficile Salmonella typhi
3 2 3
Travail sous PSM
Uro-génitaux
Neisseria gonorrhoeae Herpes simplex
2
Absence de recommandation
IST
VIH, hépatite C Neisseria gonorrhoeae Chlamydiae trachomatis
3 2 2
Absence de recommandation
Sperme
VIH, hépatite C Neisseria gonorrhoeae Chlamydiae trachomatis
3 2 2
Absence de recommandation
Pus
Staphylococcus aureus
2
Absence de recommandation
Lésion cutanée
Francisella tularensis (type A)
3
Travail sous PSM
Prélèvement ostéo-articulaire
S. aureus oxacilline S ou R
2
Travail sous PSM
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r toute culture suspecte de Brucella, qu’il y ait suspicion clinique d’emblée ou qu’il s’agisse d’une observation inattendue, ne doit être examinée que sous un PSM, r diagnostic microbiologique des infections osseuses et articulaires : l’ensemble des opérations de lecture, de repiquage et de manipulation des milieux doit systématiquement être effectué sous PSM afin de préserver l’échantillon biologique des contaminations de l’environnement, r examen bactériologique des collections closes et des séreuses : les mises en culture doivent être effectuées sous PSM. L’observation des cultures et des subcultures se font dans les mêmes conditions.
8.3. Parasitologie L’utilisation du PSM est requise en parasitologie : r pour les techniques de concentration des selles, r lorsque les parasites appartenant au groupe 3 sont suspectés : Taenia solium, Plasmodium falciparum, Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis.
8.4. Mycologie r Ensemencement des produits pathologiques. r Test de filamentation. r Candida albicans, C. tropicalis, Microsporum spp., Trichophyton spp.
8.5. Virologie r Recherche par culture cellulaire des virus des groupes 2, 3 et 4 des agents pathogènes. Il faut signaler que la recherche d’antigènes viraux par immunochromatographie est à effectuer sous PSM. En effet, lors de l’ouverture des flacons contenant des selles pour effectuer les tests immunochrommatographiques rapides pour la détection d’adénovirus et de rotavirus par exemple, il y a un risque de production d’aérosols car la pression interne peut être différente de la pression ambiante.
8.6. Culture cellulaire r Recherche d’effets cytopathogènes sur des cultures cellulaires.
8.7. Procréation médicalement assistée r Préparation du sperme en vue d’une insémination (test de migration survie, insémination avec sperme du conjoint, insémination avec sperme de donneur). r Insémination avec du sperme du conjoint.
9. Quelles sont les manipulations que l’on peut réaliser hors PSM Certaines manipulations restent possibles sur la paillasse à condition de respecter strictement les bonnes pratiques de laboratoire. Il est alors nécessaire de faire une analyse des risques dans le cadre du document unique d’évaluation des risques professionnels. À titre d’exemple, les activités suivantes peuvent être réalisées sur la paillasse. r Réalisation des colorations de Gram. r Examens directs. r Recherche d’antigène soluble urinaire de Legionella spp. r Recherche de sang dans les selles.
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Il faut encore noter que le dépistage d’albumine-sucre réalisé par bandelettes n’est jamais réalisé sous PSM alors que les échantillons d’urine sont susceptibles de contenir du CMV (infection virale congénitale la plus fréquente). Chez le sujet infecté, le virus est présent dans les leucocytes. Lors des réactivations, il peut être excrété dans de nombreux liquides biologiques : urines, larmes, salive, sperme, sécrétions cervico-vaginales, lait, etc. [25]. Le CMV peut se transmettre par contact des muqueuses avec des mains souillées par de l’urine par exemple. Mais ce n’est pas pour autant qu’il est nécessaire de faire le dépistage de l’albuminurie et de la glycosurie sous PSM. Au préalable, il convient de respecter les précautions standards ainsi que les précautions complémentaires. La prise en compte des renseignements cliniques pertinents montre alors toute son importance. Il ressort de ce qui précède que dans la pratique, c’est au responsable du laboratoire de juger de la sécurité des manipulations et des bonnes pratiques du laboratoire pour éviter les risques d’infection du personnel, ainsi que la contamination des échantillons. Il est clair que tous les échantillons sont potentiellement infectieux notamment en sérologie infectieuse, mais toutes les activités techniques du laboratoire ne peuvent pas être effectuées sous PSM.
10. Qualification opérationnelle/ vérification sur site d’un PSM 10.1. Méthodologie Nous avons abordé l’utilisation du PSM selon les obligations réglementaires, le type de germe recherché. Le PSM étant un matériel, il doit selon la norme 15189 être qualifié, vérifié pour prouver sa conformité aux spécifications. L’article 5.3.2 de la norme d’accréditation 15189 indique « il doit être démontré (lors de l’installation et au cours de l’utilisation courante) que le matériel est capable d’atteindre les performances requises et qu’il est conforme aux spécifications se rapportant aux analyses concernées » [10]. Les postes de sécurité sont normalement testés en usine avant livraison (il est utile de vérifier cette information avant la livraison auprès du fabriquant ou du distributeur). La qualification d’installation encore dénommée qualification opérationnelle a pour but de vérifier que l’appareillage est installé correctement par rapport aux spécifications requises. Il appartient au laboratoire d’être en mesure de démontrer que la qualification opérationnelle ainsi que la vérification des performances sont conformes aux spécifications du fabriquant. Le but est de vérifier la bonne installation de l’appareil, afin de pouvoir garantir des résultats fiables ainsi que de bonnes conditions de travail pour le technicien. La méthodologie pourra être décrite dans le cadre de la procédure générale de vérification/validation des méthodes. Une traçabilité doit être conservée avec les renseignements suivants : date d’installation, n° de série, installation proprement dite, adresse de la société, nom des personnes ayant participé à la mise en service. Lors de la livraison, le PSM doit être accompagné d’un dossier de contrôle qui comporte :
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r un contrôle de la vitesse des flux entrant et laminaire, r un test de vérification des filtres, r un contrôle des vibrations, de l’intensité lumineuse et du niveau sonore, r un test de visualisation des flux, r un test de confinement, r des tests microbiologiques.
10.2. Validation microbiologique du confinement et contrôle périodique Dans le cadre du plan de maintenance d’une installation de type enceinte de confinement, il est nécessaire de réaliser des contrôles microbiologiques de l’environnement qui doivent reposer sur une analyse des risques [26-30]. L’objectif est de valider (vérifier) la mise en application sur site par rapport à des spécifications techniques de décontamination. En interne, un suivi microbiologique mensuel doit être réalisé [28]. Ces tests sont réalisés car le PSM ne permet pas une filtration absolue, l’air n’est pas stérile mais propre (< 10 particules de 0,3 μ/50 L minute) pour le PSM de type II. Les prélèvements microbiologiques permettent de vérifier l’observance des protocoles de nettoyage et de désinfection. Au sein de notre laboratoire, la vérification microbiologique du confinement a été évaluée par méthode de cartographie statique avec géloses au sang (contamination aéroportée) ainsi que par contrôle de surface par empreintes de géloses Count-tact®. Le protocole d’échantillonnage est effectué en disposant les géloses aux deux extrémités, droite et gauche et au centre de la surface de travail du PSM. Il est intéressant de relever que certains PSM (Labculture® de classe II, type A2) possèdent un revêtement antimicrobien validé pour : Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Salmonella enteridis, Aspergillus niger. Les surfaces peintes sont recouvertes d’un revêtement antimicrobien Isocide™ de la société ESCO pour minimiser la contamination de la surface et inhiber la croissance bactérienne. Isocide élimine 99,9 % des bactéries. r Méthode par empreinte de géloses À la fin de l’activité technique, le PSM est nettoyé et décontaminé par le détergent désinfectant en vigueur dans le laboratoire. Le matin, placer des géloses Counttact® stériles de 25 cm2, par méthode d’empreinte en contact du plan du travail du PSM selon la cartographie précédente en appliquant une pression de 500 g ± 10 g pendant 10 secondes (il existe des dispositifs permettant d’obtenir ces caractéristiques de temps et de pression). r Méthode statique par géloses au sang Selon la norme NF ISO EN 7218, il est recommandé de procéder à une vérification périodique du taux de micro-organismes présents dans l’air pendant le fonctionnement des filtres en utilisant l’équipement habituel. Par exemple, exposer plusieurs boîtes de Pétri ouvertes contenant un milieu gélosé non sélectif (par exemple Plate Count Agar) pendant 30 minutes [31]. On peut placer des géloses au sang ouvertes dans le PSM en suivant la cartographie précédente durant une
Tableau IV – Critères de surveillance microbiologique. Zones protégées
PSM
Résultats en unités formant colonies/boîte (25 cm²) Aspergillus ou champignon filamenteux
Germes totaux
Cible : < 1 Alerte : 1 Action : 1
r Cible ≤ 5 et absence de germes pathogènes r Action > 5 ou présence de germes pathogènes
journée, lors du travail du technicien de 9 à 18 heures par exemple. La réalisation de la mesure de l’aérocontamination permet de constater que l’air délivré par le PSM est propre mais non stérile. Les résultats des contrôles microbiologiques réalisés au sein de notre laboratoire ont permis d’identifier les souches suivantes : Staphylococcus epidermidis, Micrococcus sp., Penicillum sp., etc. r Interprétation Pour les PSM, le tableau IV propose les critères de la Direction générale de la Santé, Direction de l’hospitalisation et de l’organisation des soins, Comité technique national des infections nosocomiales – DGS/DHOS, CTIN (2002) – pour les prélèvements de surfaces [29]. En externe, une maintenance annuelle avec un prestataire spécialisé.
11. Maintenance/vérification continue des performances d’un PSM 11.1. Maintenance quotidienne en interne La maintenance doit être assurée de façon quotidienne en réalisant un bionettoyage et la mise en route de la lampe UV après la journée de travail.
11.2. Maintenance annuelle en externe La maintenance annuelle sera effectuée par un prestataire de service externe au laboratoire. La société retenue devra utiliser des appareils raccordés au Cofrac (anémomètre et compteur de particules). Classiquement, la révision annuelle est réalisée avec remise d’un constat de vérification. Il s’agit d’une vérification des performances encore appelée qualification des performances (le PSM doit répondre aux spécifications techniques). La prestation de vérification des performances d’un PSM doit satisfaire pleinement les exigences des normes NF EN 12 469 [32] et NF EN 14 644 [33] : r vérification de la vitesse d’écoulement d’air descendant et entrant, r contrôle de la vitesse d’écoulement d’air entrant, r contrôle des organes de sécurité (essentiellement la vitre de protection), r contrôles des alarmes (elles sont liées à des problèmes de flux), r contrôle des filtres : ils sont à changer classiquement tous les 4/5 ans ou dès lors qu’ils ralentissent trop les flux (alarmes sur certains PSM),
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Figure 2 – Visualisation des flux par un test avec générateur de fumigène.
13. L’audit : un outil d’évaluation des pratiques professionnelles On veillera à évaluer les risques et les niveaux d’exposition aux agents pathogènes lors des audits internes. Cette évaluation doit être réalisée pour vérifier l’application des précautions standards, des précautions complémentaires ainsi que les bonnes pratiques de laboratoires. En résumé, l’audit est un outil très important pour s’assurer que les dispositions prises dans les procédures sont bien appliquées [34]. Le tableau V propose à titre d’exemple un questionnaire d’audit pour évaluer les pratiques professionnelles. Il appartient en effet au laboratoire de vérifier la compétence des personnels et de s’assurer en particulier de leur connaissance des procédures applicables au laboratoire.
14. Perspectives r visualisation des flux par un test avec générateur de fumées (figure 2), r recherche de fuite et classification de la propreté de l’air (classe ISO), r vérification des fonctions : éclairage, UV, prise de courant.
12. Procédure dégradée en cas de panne Dans l’éventualité d’une panne du PSM, il y a lieu d’évaluer les risques en fonction des prélèvements et du statut clinique du patient mais aussi de procéder à une décontamination de l’appareil [30]. Pour les échantillons biologiques suivants, ECBU, prélèvements vaginaux, coprocultures et les pus, on considère que l’on peut les manipuler hors PSM (en respectant les précautions standards : ports de gants, masque, lunettes de protection, tenue vestimentaire adaptée) dans l’attente de l’intervention du service après vente, car il n’y a pas de production d’aérosol susceptible de contaminer l’opérateur. En cas de panne du PSM, il peut être fait le choix d’utiliser un bec Bunsen (Securos) de sécurité programmable à technologie digitale, bien que l’utilisation d’un bec Bunsen (méthode pasteurienne) fasse l’objet de débats. Pour les prélèvements susceptibles de contenir des bactéries de classe 3 (BK) tels que les expectorations ou les lavages broncho-alvéolaires, les centrifugations sont effectuées avec des plots équipés de nacelles étanches. De surcroît, on attendra 10 minutes avant d’ouvrir le couvercle afin de maîtriser les risques de contamination par les aérosols. En cas de renversement d’un échantillon à l’intérieur du PSM, on essuie l’écoulement puis on vaporise un produit détergent désinfectant du type Amphomousse® (actif sur Mycobacterium tuberculosis, HIV-I, HBV et rotavirus, du laboratoire Stéridines).
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La robotisation du processus analytique en bactériologie risque de réduire à terme l’utilisation du PSM. Certaines chaînes d’automatisation en bactériologie sont équipées d’un traitement d’air comme, par exemple, le PREVI Isola™ de bioMérieux. L’air est filtré par un filtre HEPA qui arrête les aérosols. On se trouve dans la configuration d’un PSM de type I sans laminarité. Dans le cas de la biologie médicale délocalisée, il se pose encore la question de la réalisation des tests de dépistage rapide comme pour la grippe qui seront réalisés sans enceinte de confinement. Une réflexion sur ce sujet doit être développée au niveau des autorités sanitaires. Pour les laboratoires multisites, les sites de prélèvement qui ne réalisent pas d’ensemencement n’ont pas besoin d’être équipés d’un PSM.
15. Conclusion Le personnel susceptible d’être exposé à des risques de contamination doit faire l’objet de mesures de protection contre le risque infectieux. Aussi, les manipulations de prélèvements cliniques et tout particulièrement ceux qui peuvent générer des aérosols doivent être réalisées avec des mesures de confinement appropriées. Le travail sous PSM permet de protéger l’opérateur des pathologies infectieuses bactériennes, virales, ou fongiques et de préserver l’échantillon biologique des contaminations de l’environnement. Rappelons que le PSM garantit un air propre mais non stérile. De plus, la sécurité du personnel du laboratoire doit être assurée par la connaissance et l’application des précautions standards, des précautions complémentaires et des bonnes pratiques de laboratoire. L’évaluation des pratiques professionnelles par des audits internes est particulièrement bien adaptée dans ce cadre. On veillera donc à sensibiliser mais aussi à faire adhérer le personnel au travail sous une enceinte de confinement. Finalement, le biologiste doit juger de la sécurité des
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Tableau V – Audit des prescriptions pour les travaux sous PSM. Questions
Vérification et commentaires
Application des précautions standards Hygiène des mains avant et après manipulation Mise à disposition de protection individuelle : blouses, gants, lunettes de protection, chaussures, masques Interdiction de recapuchonner les aiguilles Elimination immédiate des objets piquants, coupants et tranchants (OPCT) dans un container adapté Existence d’une procédure en cas d’accidents mettant en jeu des agents biologiques Application des précautions complémentaires Précautions contact pour les infections cutanées (SARM), infections entériques (gastro-entérite, diarrhée infectieuse à Clostridium difficile, Salmonella, etc.) et urinaires (bactéries multirésistantes, Escherichia coli BLSE) Précautions respiratoires (grippe, tuberculose, pneumonie) Application des bonnes pratiques de laboratoires Démarrer le PSM 15 minutes avant de travailler afin de stabiliser les flux Ne pas travailler à deux Ne pas encombrer inutilement la zone de travail Travailler en organisant un zonage du propre vers le sale à l’intérieur de l’enceinte de confinement afin de minimiser les déplacements des produits contaminés Faire fonctionner la lampe à UV en fin de journée Contrôler et changer régulièrement les tubes Nettoyer et dépoussiérer tout objet introduit dans le PSM Maintenir la zone de travail propre Ne pas introduire dans le PSM de matériels réputés polluants tels que bois, liège, papier, crayon, gomme Information et formation du personnel Fermeture des portes et des fenêtres
examens biologiques en respectant les bonnes pratiques de laboratoire. Il est clair que si certaines manipulations hors PSM peuvent être discutées en fonction d’une analyse des risques pertinente, en revanche ensemencer un prélèvement ostéo-articulaire sur une simple paillasse est une faute. Enfin, il revient au laboratoire de mettre en œuvre des moyens internes fiables et performants et de faire appel à une expertise externe et complémentaire pour
Références [1] Arrêté du 18 juillet 1994 fixant la liste des agents biologiques pathogènes. [2] Arrêté du 30 juin 1998 modifiant l’arrêté du 18 juillet 1994 modifié fixant la liste des agents biologiques pathogènes. [3] Directive 2000/54/CE du 18 septembre 2000 concernant la protection des travailleurs contre les risques liés à l’exposition à des agents biologiques au travail. [4] Guide de bonne exécution des analyses (GBEA). Arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JO du 11 décembre 1999 modifié par arrêté du 28 avril 2002 (JO du 4 mai 2002). [5] Arrêté du 16 juillet 2007 fixant les mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mettre en œuvre dans les laboratoires de
la maintenance ainsi que la vérification des performances du PSM. Remerciements : l’auteur remercie Mme Nathalie Rouppert (CH de Bar-Le-Duc) et M. Mouloud Hammad (Tourcoing) pour la relecture de cet article et leurs conseils qui ont contribué à son amélioration.
Déclaration d’intérêts : l’auteur déclare ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.
recherche, d’enseignement, d’analyses, d’anatomie et cytologie pathologiques, les salles d’autopsie et les établissements industriels et agricoles où les travailleurs sont susceptibles d’être exposés à des agents biologiques pathogènes. JO du 4 août 2007. [6] Arrêté du 30 juin 2010 fixant la liste des micro-organismes et toxines prévue à l’article L. 5139-1 du Code de la Santé publique. [7] Instruction n°DGS/RI13/2011/449 du 1er décembre 2011 relative à l’actualisation des recommandations visant à réduire les risques de transmission d’agents transmissible non conventionnels lors des actes invasifs. [8] Arrêté du 31 décembre 2011 fixant la liste des centres nationaux de référence pour la lutte contre les maladies transmissibles et des laboratoires associés. [9] Organisation mondiale de la Santé. Manuel de sécurité biologique en laboratoire. 3e éd. 2005.
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[10] Norme NF ISO 22870, Analyses de biologie délocalisées (ADBD). Exigences concernant la qualité et la compétence, AFNOR, 2006. [11] Norme NF ISO 15189, Laboratoires d’analyses de biologie médicale. Exigences particulières concernant la qualité et la compétence, AFNOR, 2007. [12] Document SH REF 02, Recueil des exigences spécifiques pour l’accréditation des laboratoires de biologie médicale. Cofrac, Révision 01, juin 2012. [13] Document SH GTA 01, Guide technique d’accréditation en biologie médicale. Cofrac, Révision 00, mai 2011. [14] Hammad M, Paris L. Accréditation en bactériologie. Retour d’expérience. Feuill Biol 2011;LII( 300): 39-48. [15] Touche S, Bajolet O. Risques infectieux au laboratoire. Rev Fr Lab 2010;429:65-70. [16] Suiro A. Les mesures de confinements. Option Bio 2008; 9/405:22-3. [17] Klein JP. L’accréditation en bactériologie. Rev Fr Lab 2011; 436:39-50. [18] Référentiel en microbiologie médicale (bactériologie et mycologie), Société française de microbiologie, 4e édition. Vivactis Plus Ed., 2010. [19] Mounier M, Hidri N, Ploy MC, Denis F. Sécurité biologique au laboratoire de bactériologie. In: Bactériologie médicale, 2e édition, Elsevier Masson, 2011. [20] Balty I, Belhanini B, et al. Postes de sécurité microbiologique. Postes de sécurité cytotoxique. Choix et utilisation. INRS. Cahiers de notes documentaires 2003;193:37-52. [21] Delarras C. Microbiologie pratique pour le laboratoire d’analyses ou de contrôle sanitaire. Lavoisier édit. 2007:476p.
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// REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - SEPTEMBRE-OCTOBRE 2012 - N° 445