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Les glycopeptides du mucus bronchique fibrillaire dans la mucoviscidose
CLINICA CHIMICA ACTA
CGA
329
4642
LES
GLYCOPEPTIDES
DU MUCUS
BRONCHIQUE
FIBRILLAIRE
DANS LA MUCOVISCIDOSE
G. LAMBLIN,
P. DEGAND,
P. ROUSSEL,
R. HAVEZ*,
E. HARTEM.4NN
ET Iif.
FILLAT**
* Unite’ de Recherches No. 16 de I’INSERM
pot&m (Rep
de Sk&ions,
SUYla Biochilnie des Protkes, Groztpe d’Etude des GlycoPlace de Verdun, 59, Lille et * *HFpital Rent% Sabvaa, 83, Giens (France)
le 27 mai 1971)
SUMMARY
Fibrillar mucus extracted from sputum of children with cystic fibrosis is successively hydrolysed by papain and pronase; fractionation of glycopeptides is performed by Rivanol j&o-diamino-z-ethoxy-acridine lactate) at pH 1.5 and preparative liquid film high voltage electrophoresis or DEAE-Sephadex A-25 chromatography with a 0.01 X HCl-sodium chloride gradient. Two major groups of acidic glycopeptides are isolated, the main of which is rich in sialic acid; the other contains sulfate groups with a small amount of sialic acid. These proteoglycans are involved in the structure of bronchial mucins of cystic fibrosis. High amounts of fucose-rich glycopeptides have never been found in 25 fibrillar mucus of children with cystic fibrosis. The purified sialoglycopeptides have an inhibitory effect on bradykinin-induced bronchospasm in guinea-pig. The “kininsialoglycopeptides” complex is identified by electrophoresis.
Au tours de la mucoviscidose,
l’atteinte
broncho-pulmonaire
est frequente
et
se trouve en grande partie responsable de la gravite de l’affection chez l’enfant, Elle se caracterise par une secretion augmentee d’un mucus surinfecte et difficile a eliminer. Certaines etudes biochimiques ont Cte realisees pour essayer de determiner les facteurs responsables des proprietds physicochimiques du mucus bronchique &labor& au tours de cette affection. Elles ont conduit a demontrer l’abondance des acides nuclPiques1~2~ ainsi que l’augmentation de la teneur de l’expectoration en acide sialiquel. Avant d’entreprendre l’isolement et l’etude des mucines bronchiques secret&es par les malades atteints de mucoviscidose, il nous a paru necessaire de preparer les glycopeptides lib&s par proteolyse du mucus bronchique, d’en preciser les caractbres d’acidite et de rechercher d’eventuelles proprietes biologiques qui pourraient leur etre rapportees.
330
LAMBLIN
MATgRIEL
et Cd.
ET MriTHODES
Prdt?venaed et transport des khantillom Des leur emission, les expectorations portees en presence
sont congelees
a -20';
elles sont trans-
de neige carbonique.
Pr@aration des glycopeptides du mucus bronchique jibrillaire Apres d&congelation, on ajoute a chaque volume d’expectoration trois volumes de solution physiologique de ClNa a 9 g p. 1000. L’ensemble est melange, puis abandonne pendant une heure a la temperature du laboratoire. Une centrifugation de 20 min a 6000 tours/min permet de s&parer une phase soluble qui est eliminCe et le mucus bronchique fibrillaire qui est conserve. On ajoute alors au mucus du tampon phosphate de sodium 0.1 ikf de pH 6.5 (I/IO du volume du mucus fibrillaire), du
BAL (ou z,3-dimercaptopropanol) (0.1 ml pour 5 ml de mucus) et de la mercuripapai’ne (Worthington), a raison de I mg pour IO ml de mucus fibrillaire. L’hydrolyse est effectuee pendant 4s h 8.37”. On ajoute alors une solution d’acetate de calcium I n1, pour amener la concentration du milieu & 0.01 &I en acetate de calcium, et de la pronase (Calbiochem), a raison de I mg pour 4 ml de mucus fibrillaire. L’hydrolyse est poursuivie pendant 24 h & 37O. Les produits rest& insolubles sont elimines par centrifugation et les glycopeptides bronchiques contenus dans le surnageant sont alors precipites par addition de 4 volumes d’alcool. Le melange est laisse 24 h a+4’ et le precipite alcoolique est recueilli par une nouvelle centrifugation & 4000 tours/min pendant 20 min, puis il est lyophilise. Fractionnenzent des glycopeptides a-tk?hoxy-acrid&e (Rivanol) Les glycopeptides sont
bromhiques fraction&
par le lactate de h,g-dianzinoselon
leur
caractere
d’acidite
par
la
methode de Whitehouse et aL3. Une grande partie des acides nucleiques qui souillent la preparation est precipitee en abaissant k 1.5 le pH de la solution de glycopeptides (IO mg/ml d’eau distillee), a l’aide de HCl iv. Une centrifugation de IO min B 6000 tours/mm permet de les eliminer. On ajoute ensuite goutte a goutte une solution de Rivanol a IO p. IOO jusqu’a la concentration finale de 3 p. IOOO et le melange est abandonne z h &+4”. Une centrifugation permet de &parer les glycopeptides solubles dans le Rivanol des glycopeptides precipites par le Rivanol. Ces derniers sont debarrasses du Rivanol par mise en solution dans une solution aqueuse de ClNa a 5 p. IOO, puis addition de 4 volumes d’alcool absolu qui precipite de nouveau les glycopeptides et laisse le Rivanol en solution. Les glycopeptides solubles dans le Rivanol sont eux aussi precipitits par l’addition de 4 volumes d’alcool absolu. Etude
dectro~hor~tique en agarosc Les fractions obtenues sont etudiees en electrophorese en agarose avec un tampon veronal sodique dr pH 8.2 et de force ionique 0.1. Trois colorations sont utilisees: l’Amidoschwarz, le reactif de Schiff apres oxydation periodique et le bleu de toluidine4. Clin.
Chim. Acta, 36 (1972)329-340
GLYCOPEPTIDES DU MUCUS FIBRILLAIRE Electrophorkse
en a&ate
Les glycopeptides
331
de cellulose sont etudies
en electrophorese
sur acetate
de cellulose,
sur
bandes seches de Sepraphore III, de 18x2.5 cm, en tampon veronal sodique de pH 8.6, selon la technique de Kohn5. 15 ,IJ de solution contenant 0.3 mg de glycopeptides sont deposes et la sepaIation
est effectuee
pendant
90 min sous une tension
de 140
volts. Pour l’etude
de la combinaison
de la bradykinine
avec les glycopeptides,
0.3
mg de glycopeptides sont incubes I 12 h & la temperature du laboratoire avec 15 ,ul d’une solution contenant 12 pg de bradykinine. On depose le melange sur la bande d’acetate et la separation electrophoretique est effect&e dans les m&mes conditions que pour les glycopeptides et la bradykinine temoins. Les bandes sont color&es par le reactif de Schiff apres oxydation periodique ou par le reactif de Sakaguch? modifie par dissolution de la 8-hydroxyquinoleine dans l’ethanol
absolu.
Electrophordse
en Jilm liquide
Les glycopeptides peuvent etre soumis a un fractionnement par electrophorese preparative Q haut voltage en film liquide dans l’appareil Elphor-Vap. On utilise un tampon Tris 0.8 M-acide citrique 0.008 XI de pH 8.6 pour la chambre d’electrophorese. Une difference fractionnement
de potentiel satisfaisant.
de 1750 volts avec une intensite de 160 mA assure un L’echantillon, qui contient 50 mg de fraction glyco-
peptidique B la concentration de 15 mg/ml, est inject6 a une vitesse de 1.5 ml/h. On recueille 48 fractions dont on mesure la densite optique a 260 nm (ce qui permet de localiser les acides nucleiques), ainsi que la teneur en oses combines, grace a une methode automatique a l’orcino17. Dans les differents tubes, on peut aussi doser l’acide sialique par la methode d’Aminoff* apres hydrolyse sulfurique 0.1 N 8. 80” pendant 30 min. Les groupements l’acriflavine3.
sulfate
peuvent
etre rep&es
par la methode
a
Chromatographie de gel-filtration SW Sephadex G-I o o Les glycopeptides precipites par le Kivanol sont soumis & une chromatographie de gel-filtration sur une colonne (47 x 2.5 cm) de Sephadex G-100 dans l’eau distillee pour Climiner les composes nucleotidiques. 50 mg de glycopeptides dissous dans 3 ml d’eau distillee sont deposes sur une colonne et on recueille des fractions de 5 ml. Les glycopeptides sont rep&& par dosage des oses combines par la methode a l’orcinol, tandis que les composes nucleotidiques sont identifies par leur absorption spectrophotometrique a 260 nm. Chromatographie SW DEAE-Sephadex La chromatographie d’echange ionique est realide sm une colonne de DEAESephadex A-25 (23 x 2 cm) equilibree dans du chlorure de sodium 0.1 hl. L’Clution est conduite a l’aide d’une gradient discontinu de solution d’acide chlorhydrique 0.01 N et de molarite croissante en ClNa. 0.1 M, 0.3 M, 0.5 M et 0.7 Xl. On depose 30 mg de fraction glycopeptidique dans 3 ml de solution de ClNa 0.1 M et on recueille des fractions de 5 ml qui sont soumises B. un dosage des oses combines par la methode a l’orcinol. Clin.
Chim.
Actu,
36 (1972)
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LAMBLIN
332 l?tude du spasme
bronchique
ft a/.
chez le Cobaye
L’injection de bradykinine chez le Cobaye entraine I’apparition d’un spasme bronchique et d’une apnee que l’on peut mettre en evidence par differentes m&odes. Nous utilisons la plethysmographie, methode comparable a celle de KolleP. Pour etudier la ventilation pulmonaire de Cobayes males de 500 g environ anesthesies a l’urethane par voie intraperitoneale (1.5 g/kg), on catheterise une veine jugulaire externe de l’animal et on pratique une tracheotomie. L’animal est enfermi: dans un caisson Ctanche relic a un manometre qui enregistre les variations de pression interieure du caisson, en fonction des mouvements respiratoires de l’animal. L’enregistrement se fait sur un cylindre enduit de noit de fumee dont la surface se d&place a une vitesse de 15 mm/min. L’extremite distale de la canule de trachkotomie est a l’air libre pour que la ventilation de l’animal reste spontanee. On injecte par voie intraveineuse 3 pg de bradykinine synthetique Sandoz (BRS 640) dissous dans 0.5 ml de solute isotonique de chlorure de sodium, pour roe g de poids corporel. RliSULTATS
IXjinition g&de
des caractbres
d’acidite’
Llectrophor&ique
des glycopeptides
de l’ensemble
bronchiques
de mucoviscidose
des glycopeptides.
Un pool de mucus bronchique fibrillaire provenant de 12 enfants atteints de mucoviscidose est soumis a une proteolyse par la papai’ne et le pronase et les glycopeptides lib&s sont precipites par l’alcool absolu. L’electrophorese en agarose a pH 8.2 permet de &parer d’une part une fraction tres acide bien rev&e par le bleu de toluidine et correspondant a des composes nu-
AS
P.A.S.
5.T.
Fig. 1. gtude &ctrophor&que en agarose & pH 8.6 de la fraction du mucus bronchique de mucoviscidose hydrolystk par la papaine et la pronase et pr&ipitCe par 1’6thanol. Les diagrammee sont r&&l& par 1’Amidoschwar.z (AS), le reactif de Schiff aprks oxydation pcriodique (PAS) et lc bleu de toluidine (B’I‘I. Cliu. Chiwz. Acta, 36 (1972) 329-340
GLYCOPEPTIDES
D1? MUCUS FIBRILLAIRE
333
cleotidiques, et d’autre part, un ensemble de composants moins acides dont la partie la plus anodique est bien rPvClCe par le bleu de toluidine, tandis que la partie cathodique est surtout coloree par le reactif de Schiff apres oxydation periodique (Fig. I). L’electrophorese preparative permet de &parer deux fractions glycopeptidiques reperees grace a la courbe de dosage des oses combines par la methode & l’orcinol. Le groupe le plus anodique, tres acide, est riche en groupements sulfate, mais il est souille par des composes nucleotidiques. Le second groupe est moins acide et ne contient pas de groupements sulfate; il est riche en acide sialique. Fractiomemcnt des glyco$c$tides fxar le RivanoL. Pour eliminer les acides nucleiques et pour mieux s&parer les deux groupes de glycopeptides, nous utilisons le fractionnement par le Rivanol a pH 1.5 s. Une grande partie des acides nucleiques precipite B ce pH et peut etre eliminbe par centrifugation. L’addition de Rivanol permet ensuite de precipiter les glycopeptides riches en groupements sulfate. D.O. Orcinol D.O. Sulfate
~j\
Ac.Sialique J47lml I+/
-
Orcinoi
--
-Ac.Sialique
Ac.Sialique
Fig. 2. Fractionnement par &ctrophor&se de mucoviscidose solubles dans le Kivanol
pr8parative en film liquide ii pH S.6 des glycopeptides (A) et pr&zipit& par le Rivanol (B). C&Z. CA&n.
ACta,
36
(1972)
32CJ-340
LAMBLIX
334
et al.
Les glycopeptides prkipitks par le Rivanol sont encore souilk par des composCs nuclkotidiques qui sont kliminks par chromatographie de gel-filtration sur une colonne de Sephadex G-100 dans l’eau distillke. Les glycopeptides sont exclus de la colonne, tandis que les composks nuclkotidiques ont une klution retardee. &de &ctro$aore’tique des fractions glyco~e~tidiques st$arLes par le Ri7janol. En klectrophorkse en agarose, les glycopeptides pr kcipitks par le Rivanol sont color& intens& ment par le bleu de toluidine et sont faiblement r&v&s par le reactif de Schiff aprc’s oxydation periodique. En Clectrophorke en film liquide B pH 8.6, ils ont un comportement trks acide et sont trk fortement r&&As par la r&action k l’acriflavine, tandis que leur teneur en acide sialique parait mod&e (Fig. 2). La majeure partie des glycopeptides bronchiques de mucoviscidose est soluble dans le Rivanol. En 6lectrophorGse en agarose, ces glycopeptides sont un peu moins rapides que les prkkdents. 11s sont t&s bien r&+1& par le rkactif de Schiff aprk oxydation periodique, mais moins bien par le bleu de toluidine. En 6lectrophorPse en film liquide B pH 8.6, leur mobilit est aussi plus faible que celle des glycopeptides DO OK
nol
NaCl
03M
HCI
0.01 N
NaCl 05M HCI 001 N I No.0 HCI
o3
0.7M 001
N
NaCl OIM HCI 001 N
!
100
A
11 , 100
0
_
C
Gp
en
1
t
I
,
200
300
I
400
ml
400
ml
1 400
ml
,n;l,, 200
300
Gp riches en Sulfate
rtches Fucose
I 100
I 200
/ 300
Fig. 3. Chromatographie sur DEU-Sephadcx des glycopeptides solubles dam le Rivanol (.I), tics glycopeptides pr6cipitCs par lc Rivanol (H) et de l’ensentblc des glycopeptides d’un mucus d’cnfant atteint de mucoviscidosc (C).
GLYCOPEPTIDES
DU MUCUS
FIBRILLAIRE
335
precipites par le Rivanol (Fig. 2). 11s sont par contre t&s riches en acide sialique. Ces sialoglycopeptides representent 87 p. IOO de l’ensemble du pool de glycopeptides obtenus par proteolyse du melange des 12 expectorations individuelles de mucoviscidose. Chromatographie insolubles
SW DEAE-Sephadex
des fractions
glycopeptidiques
solubles
et
dans le Rivanol.
Les deux groupes de glycopeptides bronchiques obtenus par fractionnement au Rivanol a pH I .5 sont soumis a une chromatographie d’&hange ionique sur colonne de DEAE-Sephadex A-25 (Fig. 3). Les glycopeptides solubles dans le Rivanol se s&parent en deux fractions. La premiere fraction, elude en presence de ClNa 0.3 M, HClo.01 N, est quantitativement la plus importante. L’Ctude electrophoretique demontre son caractere acide. Elle est r&eke a la fois par le reactif de Schiff apres oxydation periodique et par le bleu de toluidine. Cette derniere coloration r&Ye que la fraction est h&Qo@ne. Le dosage de l’acide sialique et le rep&age des groupements sulfate permettent de montrer que cette fraction possede a la fois des rksidus d’acide sialique et des groupements sulfate. Une seconde fraction, moins importante, est eluee par la solution ClNa 0.5 M, HClo.01 IL'. Les glycopeptides precipites par le Rivanol, fractionnes sur colonne de DEAESephadex dans des conditions identiques, se &parent en deux fractions, eluees par les solutions de ClNa 0.3 M et 0.5 M. Ces glycopeptides sulfates, Ctudies en Clectrophorese en agarose, ne sont rev&% que par le bleu de toluidine et les glycopeptides 61~6s par les solutions salines les plus concentrees ont une mobilitk electrophoretique plus grande. Application directe de la chromatographie lib&e’s par prote’olyse du mucus bronchique
SW DEAE-Sephadex jibrillairc
d des glycopeptides
Les glycopeptides bronchiques sont prepares par proteolyse de 25 expectorations individuelles emises par 17 enfants atteints de mucoviscidose. Chaque mucus est hydrolyse par la papaine et la pronase, et les glycopeptides sont prkipites par l’alcool absolu. 11s sont ensuite directement CtudiCs par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex 6luCe par un gradient discontinu de molarit& croissante en ClNa. On constate, dans les 25 cas etudies, la faible importance ou l’absence presque totale de glycopeptides clues par la solution de ClNa 0.1 M, c’est-a-dire de glycopeptides riches en fucose. La majeure partie des glycopeptides est elude par la solution de ClNa 0.3 M et correspond surtout a des glycopeptides riches en acide sialique. Des glycopeptides riches en sulfate sont 61~6s par la solution de ClNa 0.5 M en quantit6 relativement moins importante (Fig. 3). Nous avons cherche a determiner les proportions relatives des diffkrents groupes de glycopeptides 1ibQPs par proteolyse de ces mucus bronchique individuels. La presence de chlorure de sodium a la concentration de 0.3 M ou de 0.5 M augmente d’environ 4 p. IOO la densite optique obtenue dans la methode de dosage automatique a l’orcinol pour des solutions de galactose. En nCgligeant cette leg&e augmentation, ainsi que l’interference due au fucose qui est peu importante, on peut mesurer la surface des diffkrents pits obtenus par chromatographie des glycopeptides sur DEAESephadex et l’exprimer en milligrammes de galactose. 11 est ainsi possible d’estimer les proportions des diffkrents groupes de glycopeptides. L’application de cette methode B l’etude de 25 expectorations individuelles Cli~z.Chim. Acta, 35 (1972)329-340
336
LAMBLIN
recueillies chez 17 malades permet de montrer l’importance de la fraction peptidique eluee par la solution de ClNa 0.3 M, HCl 0.01 N (Tableau I). TABLEAU
_
DE
glyco-
I
POURCENTAGEDES FRACTIONS GLYCOPEPTIDIQUESLIBfRkES LAIRE
et al.
L’EXPECTORATION
DE
MUCOVISCIDOSE
(17
PAR
PROTItOLYSE
DE
MUCUS
FIBRIL-
OBSERVATIONS)
Pourcentage des fractions glycopeptidiques e’lue’es par les solutions de ClNa-HCl (0.01 N) ClNa 0.1 M Fraction ricke en fucosc
ClNa 0.3 M Fraction rich? en ac. sialiqua
ClNa 0.5 M Fraction riche en sulfate
2”
65 75
‘5 IZ
77 75 46 45 37 50
23 25 34 ID 16
‘3 0 0 20 45 47 40 40 25
10
50
25
20
60
25
hj
IO
30 30 ‘5 15 1.5 16
46
2-l
60
IO
2.5 16 IO
Conzbinaison
10
SO
LO
73
IL
70 .50 7” 60
‘5 15 14 15 3-1-
50 70
20
3 5 6
8.5
I2
80
I.5
85
9
3
80
17
de la bvadykinine
et de la fractio??
majewe
des glyco$e@tides
bronchiques
de mucoviscidose L’Ctude du mucus bronchique de mucoviscidose demontre que les glycopeptides les plus abondants sont eluks par la solution de ClNa 0.3 M, HCl 0.01 i\iet que leur caractere acide se rapporte essentiellement a lem teneur en acide sialique, sensible a l’action de la neuraminidase. Nous avons cherche a determiner si cette fraction possedait, comme certains sialoglycopeptides isoles de l’expectoration d’autres affections bronchiquesl”, un pouvoir de fixation de la bradykinine. I?tude eYectro$hor&ique d’un mYlange de bradykinine et de glycofieptidrs bronchiques de wtucoviscidose. La combinaison bradykinine-glycopeptide peut Ctre mise en evidence par Clectrophorese sur acetate de cellulose a pH 8.2. Cette methode permet de comparer la mobilite electrophoretique de la bradykinine seule (12 ,ug), des glycopeptides bronchiques seuls (300 ,~g) et d’un melange contenant 12 ,MR de bradykinine et 300 ,~g de glycopeptides (Fig. 4). Les glycopeptides bronchiques ont une migration anodique et sont bien rev&% par le reactif de Schiff apres oxydation periodique. La biadykinine seule migre vers Clin. Chim. Acta, 36 (197~) 3~9~340
GLYCOPEPTIDES
Cothodo
DU MUCUS FIBRILLAIRE
337
Anode
GP.
GP. t Bk.
Fig. 1. Electrophor&se sur a&ate de cellulose & pH 8.2 des fractions deglycopeptides (Gp) riches en acide sialique (fractions BluCes par les solutions de ClNa 0.3 M, HCl 0.01 N en chromatographie sur DE,&E-Sephadex) obtenues chez deux enfants atteints de muscoviscidose. Les t5lectrophor&es sont r@alis&s avant (Gp) at apr& combinaison & la bradykinine (Gp+Bk) et colort!es par le rbactif dc Schiff apr& oxydation periodique.
la cathode et elle est revelee par le reactif de Sakaguchi. Le comportement du melange est different: il est possible de mettre en evidence une petite fraction de bradykinine dont la mobilite electrophoretique n’est pas modifiee; au contraire, les glycopeptides qui sont lies & la bradykinine et qui sont bien rev&s par le reactif de Schiff apres oxydation periodique, ont une migration anodique nettement retardee (Fig. 4). EfSet des sialoglyco$eptides bronchiques de muco&dose sw l’action bronchospasmodique de la bmdykinim. Lorsqu’on injecte par voie intra-veineuse a un Cobaye 3,ug de bradykinine pour IOO g de poids corporel, un bronchospasme apparait 7 a IZ set apres la fin de l’injection. L’animal presente d’abord une acceleration du rythme respiratoire et une diminution de l’amplitude ventilatoire. 11 apparaft ensuite une apnee expiratoire qui se prolonge pendant 20 8. 40 set selon les animaux, et qui est suivie d’une phase de reprise de mouvements respiratoires plus amples et plus rapides (Tableau II). On injecte 30 min plus tard, chez le m&me animal, la meme dose de bradykinine melangee a I & 2 mg de sialoglycopeptides purifies par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex. Le bronchospasme disparait totalement (chez 5 animaux) ou presque totalement (chez 2 animaux). On observe dans ces conditions une acceleration passagere du rythme et une augmentation de l’amplitude de ventilation qui persiste pendant I g z min. Une troisierne injection de bradykinine seule, 30 min plus tard, chez les memes animaux, provoque a nouveau l’episode bronchospasmodique et l’apnee (Tableau II). cli>z. Chum.
Acta,
36 (1972) 3~9-340
LAMBLIN
338 TABLEAU
IJ
EFFETS
L’ACTION
SUR
BRONCHOPLASMODIQUE
PvLpavations uti!ise’es (Sialoglycopeptidcs de mucoviscidosrs)
Tmps o Bvadykiniw
+
totale
2-
+
(3 ,uglroo
DE
g)
LA
BRADYKTSISE
Tmps 30 nzirz Bvadykinine et glyco@ptide Poids
Protection
Le diagramme
obtenu
et al.
do Plot&ion
par chromatographie
sur DEAE-Sephadex
des glyco-
peptides du mucus bronchique des enfants atteints de mucoviscidose presente un aspect t&s monomorphe. Ces glycopeptides ont un caractere acide qui est du, comme le montre le fractionnement par le Rivanol, a la presence de groupements sulfate et surtout de residus d’acide sialique. Ce dernier point est parfaitement en accord avec les travaux de Potterl. Cependant, la proportion importante de glycopeptides acides n’est peut-&tre pas une particularite specifique de la secretion bronchique des enfants atteints de mucoviscidose. Les possibilites de synthese des cellules des glandes bronchques semblent varier avec l’age du sujet. Lamb” a ainsi trouve une proportion elevee de cellules contenant et incorporant du sulfate dans les glandes muqueuses des branches de foetus et de nourrissons normaux, ainsi que dans les cellules muqueuses de sujets atteints de mucoviscidose. Chez l’enfant normal, cette proportion diminue avec l’age, en mCme temps qu’augmente la proportion des cellules dont la coloration est sensible a l’action de la neuraminidase. L’abondance des glycopeptides acides dans la s&rCtion bronchique de mucoviscidose semble ainsi s’opposer aux constatations qui ont pu &tre faites dans d’autres secretions. On a mis ainsi en evidence une elevation du rapport fucose/acide sialique dans la salive12913, le liquide duodCnall* et la sueur l5 des sujets atteints de mucoviscidose. Ces discordances sont peut-etre en partie le reflet des differences de structure chimique des glycoproteides normalement elabores par les differentes glandes muqueuses. Le role du systeme des kinines a deja Cte envisage dans la genese de la mucoviscidosele. La kallicreine a pu etre identifiee dans la muqueuse et dans la secretion bronchique humainer7. L’application de bradykinine sur la muqueuse bronchique ne semble produire qu’un Crytheme mineurIs. 11 nous a cependant paru interessant d’etudier, ipz vitro, les relations pouvant s’etablir entre la bradykinine et les structures glycopeptidiques acides du mucus bronchique de mucoviscidose. Comme les sialoglycopeptides isoles au tours d’autres affections lo, les glycopeptides bronchiques de Clin. Cl~inz.Acta,
36 (1972) jrg-310
GLYCOI’EPTIDES
mucoviscidose et inhibent
DU MUCUS FIBRILLAIRE
forment
339
avec la bradykinine
le bronchospasme
provoque
des combinaisons
par la bradykinine
stables en electrophorese chez le Cobaye.
11 est encore trop tot pour savoir si cette activite des sialoglycopeptides de mucine bronchique joue un role dans la physiologie bronchique normale ou pathologique. Des etudes ulterieures seront necessaires pour comparer la repartition et les proprietes des glycopeptides du mucus bronchique secrete au tours d’autres affections broncho-pulmonaires de l’enfant. Elles devraient aussi se prolonger par la mise au point de methodes permettant d’isoler les mucines bronchiques elaborees au tours de la mucoviscidose et d’autres chiectasies, afin d’en determiner
affections bronchiques de l’enfant, comme les bronles particularites structurales et les activites physio-
logiques. REMERCIEMENTS
Ce travail
a et& realis
avec
la collaboration
technique
C. Richet, I. Branquart et M. van Bockstaele. Nous remercions vivement Monsieur le Professeur
de Mesdemoiselles
Guerrin pour l’aide precieuse
qu’il nous a apportee dans l’etude experimentale du bronchospasme chez le Cobaye. Nous exprimons notre reconnaissance a la Fondation pour la Recherche Meditale Francaise pour l’aide materielle sans laquelle nous n’aurions pu poursuivre ces recherches. RkSUMI?
Le mucus fibrillaire
extrait
d’expectorations
d’enfants
atteints
de mucovisci-
dose est successivement hydrolyse par la papa’ine et la pronase. Les glycopeptides lib&es sont fractionnes par le Rivanol (lactate de 6,9-diamino-z-ethoxy-acridine) a pH 1.5 et &par& par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex A-25 ou electrophorese preparative en film liquide. Deux groupes majeurs de glycopeptides acides sont isoles. Le groupe principal est le plus riche en acide sialique, l’autre contient des groupes sulfate et de plus faibles taux d’acide sialique. Ces proteoglycannes participent a la structure des mucines bronchiques de mucoviscidose. Nous ne trouvons jamais de quantite importante de glycopeptides riches en fucose dans l’etude de 25 expectorations individuelles de mucoviscidoses. Les sialoglycopeptides inhibent l’action bronchospasmodique de la bradykinine chez le Cobaye; sialoglycopeptide peut etre caracterise en electrophorese.
le complexe
kinine-
BIRLIOGRAPHIE J.L. POTTER,L.W.MATTHETVS, J.LEMMETS.SPECTOR, Ann.N.Y.~¶cad.Sci., 106 (1963) 692. \v, s. CHERWIC~ ET G. J. BARBERO, Pedi&iCS, 24 (1959) 739. 31. W. WHITEHOUSE ET H. BOSTRBM, Biochem. Phavmczcol., 7 (1961) 135. I<. HAVEZ P. ROUSSEL, P.DECANIJ ET G.BIsERTE,CZ~~. Chim. Acta, 17 (1967) 281. J. KOHP;, Clin. Chim. Acta, 2 (1957) 297. G. RISERTE, J.W.HOLLEMAN, J, HOLLEMAFDEI-IOVE ET P. SAUTIERE,]. Chronzatog., 2 (1959) 225. J. L~MAILLE, M. DAUTREVAUX, R. HAVEZ ET G. BISERTE, Rd. Sot. Chim. France, 12 (1965) 3.506. 11. AMINOFF, Biochrm. J., 81 (1961) 384. E. A. KOLLF.R, Helv. Phvszol. Phavmacol.
Actrc, 20 (1962) 97. Clin. Chinl. Acta,
36 (1972)
329-340
340
LAMBLIN
et al.
10 P. ROUSSEL, P. DEGAKD, A. RANDOUX ET R. HAVEZ, Colloque International de Pathologic Thoraciqne, Lille, Sept. 1966, Medic. Diffuscur, Paris, p. 193. I I D. LAXIB, Colloquc International de Pathologic Thoracique, Lille, Sept. 1968, Medic. Diffuseur, Paris, p. 143. IL W. S. CHERSICK ET G. J. BARBERO, Ann. N.Y. Acad. Sci., 106 (1963) 6gS. 13 R. MEP;GUY, Y. F. MASTERS ET L. DESBAIXETS, Gastrorntcvology, 59 (1070) 207. 14 Z. DISCHE, P. A. DI SAXT’AGNESE, J. C. PALLAVICINI ET J. ~OUSLOS, Pediatrics, 21 (rgjg) 7.+. 15 J. C. PALLAVICINI. 0. GABRIEL, P. A. Dr SANT’XGNESE ET E. BUSKIRK, Alzn. N.Y. Acad. Srz.,
106 (1963) 3.10.
16 G. P. LEWIS, en R. PORTER ET M. O’COKNER (Ed.), Cystic Fibrosis, Ciba Foundation Group hTo. 32, Churchill Ltd, London, 1965, p. 123. 17 1~. HAVEZ, I’. DEGAXU. 1’. ROUSSEL ET G. HISERTE, COW+. Head., 262 (1966) jog. 18 J. MELON ET J. LECOMPTE, Intrvn. Arch. Allevgy, 21 (1962) 89.
Clin. Chivn. Acta, 36 (1972) 329-340
Stlltly
CGA
329
4642
LES
GLYCOPEPTIDES
DU MUCUS
BRONCHIQUE
FIBRILLAIRE
DANS LA MUCOVISCIDOSE
G. LAMBLIN,
P. DEGAND,
P. ROUSSEL,
R. HAVEZ*,
E. HARTEM.4NN
ET Iif.
FILLAT**
* Unite’ de Recherches No. 16 de I’INSERM
pot&m (Rep
de Sk&ions,
SUYla Biochilnie des Protkes, Groztpe d’Etude des GlycoPlace de Verdun, 59, Lille et * *HFpital Rent% Sabvaa, 83, Giens (France)
le 27 mai 1971)
SUMMARY
Fibrillar mucus extracted from sputum of children with cystic fibrosis is successively hydrolysed by papain and pronase; fractionation of glycopeptides is performed by Rivanol j&o-diamino-z-ethoxy-acridine lactate) at pH 1.5 and preparative liquid film high voltage electrophoresis or DEAE-Sephadex A-25 chromatography with a 0.01 X HCl-sodium chloride gradient. Two major groups of acidic glycopeptides are isolated, the main of which is rich in sialic acid; the other contains sulfate groups with a small amount of sialic acid. These proteoglycans are involved in the structure of bronchial mucins of cystic fibrosis. High amounts of fucose-rich glycopeptides have never been found in 25 fibrillar mucus of children with cystic fibrosis. The purified sialoglycopeptides have an inhibitory effect on bradykinin-induced bronchospasm in guinea-pig. The “kininsialoglycopeptides” complex is identified by electrophoresis.
Au tours de la mucoviscidose,
l’atteinte
broncho-pulmonaire
est frequente
et
se trouve en grande partie responsable de la gravite de l’affection chez l’enfant, Elle se caracterise par une secretion augmentee d’un mucus surinfecte et difficile a eliminer. Certaines etudes biochimiques ont Cte realisees pour essayer de determiner les facteurs responsables des proprietds physicochimiques du mucus bronchique &labor& au tours de cette affection. Elles ont conduit a demontrer l’abondance des acides nuclPiques1~2~ ainsi que l’augmentation de la teneur de l’expectoration en acide sialiquel. Avant d’entreprendre l’isolement et l’etude des mucines bronchiques secret&es par les malades atteints de mucoviscidose, il nous a paru necessaire de preparer les glycopeptides lib&s par proteolyse du mucus bronchique, d’en preciser les caractbres d’acidite et de rechercher d’eventuelles proprietes biologiques qui pourraient leur etre rapportees.
330
LAMBLIN
MATgRIEL
et Cd.
ET MriTHODES
Prdt?venaed et transport des khantillom Des leur emission, les expectorations portees en presence
sont congelees
a -20';
elles sont trans-
de neige carbonique.
Pr@aration des glycopeptides du mucus bronchique jibrillaire Apres d&congelation, on ajoute a chaque volume d’expectoration trois volumes de solution physiologique de ClNa a 9 g p. 1000. L’ensemble est melange, puis abandonne pendant une heure a la temperature du laboratoire. Une centrifugation de 20 min a 6000 tours/min permet de s&parer une phase soluble qui est eliminCe et le mucus bronchique fibrillaire qui est conserve. On ajoute alors au mucus du tampon phosphate de sodium 0.1 ikf de pH 6.5 (I/IO du volume du mucus fibrillaire), du
BAL (ou z,3-dimercaptopropanol) (0.1 ml pour 5 ml de mucus) et de la mercuripapai’ne (Worthington), a raison de I mg pour IO ml de mucus fibrillaire. L’hydrolyse est effectuee pendant 4s h 8.37”. On ajoute alors une solution d’acetate de calcium I n1, pour amener la concentration du milieu & 0.01 &I en acetate de calcium, et de la pronase (Calbiochem), a raison de I mg pour 4 ml de mucus fibrillaire. L’hydrolyse est poursuivie pendant 24 h & 37O. Les produits rest& insolubles sont elimines par centrifugation et les glycopeptides bronchiques contenus dans le surnageant sont alors precipites par addition de 4 volumes d’alcool. Le melange est laisse 24 h a+4’ et le precipite alcoolique est recueilli par une nouvelle centrifugation & 4000 tours/min pendant 20 min, puis il est lyophilise. Fractionnenzent des glycopeptides a-tk?hoxy-acrid&e (Rivanol) Les glycopeptides sont
bromhiques fraction&
par le lactate de h,g-dianzinoselon
leur
caractere
d’acidite
par
la
methode de Whitehouse et aL3. Une grande partie des acides nucleiques qui souillent la preparation est precipitee en abaissant k 1.5 le pH de la solution de glycopeptides (IO mg/ml d’eau distillee), a l’aide de HCl iv. Une centrifugation de IO min B 6000 tours/mm permet de les eliminer. On ajoute ensuite goutte a goutte une solution de Rivanol a IO p. IOO jusqu’a la concentration finale de 3 p. IOOO et le melange est abandonne z h &+4”. Une centrifugation permet de &parer les glycopeptides solubles dans le Rivanol des glycopeptides precipites par le Rivanol. Ces derniers sont debarrasses du Rivanol par mise en solution dans une solution aqueuse de ClNa a 5 p. IOO, puis addition de 4 volumes d’alcool absolu qui precipite de nouveau les glycopeptides et laisse le Rivanol en solution. Les glycopeptides solubles dans le Rivanol sont eux aussi precipitits par l’addition de 4 volumes d’alcool absolu. Etude
dectro~hor~tique en agarosc Les fractions obtenues sont etudiees en electrophorese en agarose avec un tampon veronal sodique dr pH 8.2 et de force ionique 0.1. Trois colorations sont utilisees: l’Amidoschwarz, le reactif de Schiff apres oxydation periodique et le bleu de toluidine4. Clin.
Chim. Acta, 36 (1972)329-340
GLYCOPEPTIDES DU MUCUS FIBRILLAIRE Electrophorkse
en a&ate
Les glycopeptides
331
de cellulose sont etudies
en electrophorese
sur acetate
de cellulose,
sur
bandes seches de Sepraphore III, de 18x2.5 cm, en tampon veronal sodique de pH 8.6, selon la technique de Kohn5. 15 ,IJ de solution contenant 0.3 mg de glycopeptides sont deposes et la sepaIation
est effectuee
pendant
90 min sous une tension
de 140
volts. Pour l’etude
de la combinaison
de la bradykinine
avec les glycopeptides,
0.3
mg de glycopeptides sont incubes I 12 h & la temperature du laboratoire avec 15 ,ul d’une solution contenant 12 pg de bradykinine. On depose le melange sur la bande d’acetate et la separation electrophoretique est effect&e dans les m&mes conditions que pour les glycopeptides et la bradykinine temoins. Les bandes sont color&es par le reactif de Schiff apres oxydation periodique ou par le reactif de Sakaguch? modifie par dissolution de la 8-hydroxyquinoleine dans l’ethanol
absolu.
Electrophordse
en Jilm liquide
Les glycopeptides peuvent etre soumis a un fractionnement par electrophorese preparative Q haut voltage en film liquide dans l’appareil Elphor-Vap. On utilise un tampon Tris 0.8 M-acide citrique 0.008 XI de pH 8.6 pour la chambre d’electrophorese. Une difference fractionnement
de potentiel satisfaisant.
de 1750 volts avec une intensite de 160 mA assure un L’echantillon, qui contient 50 mg de fraction glyco-
peptidique B la concentration de 15 mg/ml, est inject6 a une vitesse de 1.5 ml/h. On recueille 48 fractions dont on mesure la densite optique a 260 nm (ce qui permet de localiser les acides nucleiques), ainsi que la teneur en oses combines, grace a une methode automatique a l’orcino17. Dans les differents tubes, on peut aussi doser l’acide sialique par la methode d’Aminoff* apres hydrolyse sulfurique 0.1 N 8. 80” pendant 30 min. Les groupements l’acriflavine3.
sulfate
peuvent
etre rep&es
par la methode
a
Chromatographie de gel-filtration SW Sephadex G-I o o Les glycopeptides precipites par le Kivanol sont soumis & une chromatographie de gel-filtration sur une colonne (47 x 2.5 cm) de Sephadex G-100 dans l’eau distillee pour Climiner les composes nucleotidiques. 50 mg de glycopeptides dissous dans 3 ml d’eau distillee sont deposes sur une colonne et on recueille des fractions de 5 ml. Les glycopeptides sont rep&& par dosage des oses combines par la methode a l’orcinol, tandis que les composes nucleotidiques sont identifies par leur absorption spectrophotometrique a 260 nm. Chromatographie SW DEAE-Sephadex La chromatographie d’echange ionique est realide sm une colonne de DEAESephadex A-25 (23 x 2 cm) equilibree dans du chlorure de sodium 0.1 hl. L’Clution est conduite a l’aide d’une gradient discontinu de solution d’acide chlorhydrique 0.01 N et de molarite croissante en ClNa. 0.1 M, 0.3 M, 0.5 M et 0.7 Xl. On depose 30 mg de fraction glycopeptidique dans 3 ml de solution de ClNa 0.1 M et on recueille des fractions de 5 ml qui sont soumises B. un dosage des oses combines par la methode a l’orcinol. Clin.
Chim.
Actu,
36 (1972)
329-340
LAMBLIN
332 l?tude du spasme
bronchique
ft a/.
chez le Cobaye
L’injection de bradykinine chez le Cobaye entraine I’apparition d’un spasme bronchique et d’une apnee que l’on peut mettre en evidence par differentes m&odes. Nous utilisons la plethysmographie, methode comparable a celle de KolleP. Pour etudier la ventilation pulmonaire de Cobayes males de 500 g environ anesthesies a l’urethane par voie intraperitoneale (1.5 g/kg), on catheterise une veine jugulaire externe de l’animal et on pratique une tracheotomie. L’animal est enfermi: dans un caisson Ctanche relic a un manometre qui enregistre les variations de pression interieure du caisson, en fonction des mouvements respiratoires de l’animal. L’enregistrement se fait sur un cylindre enduit de noit de fumee dont la surface se d&place a une vitesse de 15 mm/min. L’extremite distale de la canule de trachkotomie est a l’air libre pour que la ventilation de l’animal reste spontanee. On injecte par voie intraveineuse 3 pg de bradykinine synthetique Sandoz (BRS 640) dissous dans 0.5 ml de solute isotonique de chlorure de sodium, pour roe g de poids corporel. RliSULTATS
IXjinition g&de
des caractbres
d’acidite’
Llectrophor&ique
des glycopeptides
de l’ensemble
bronchiques
de mucoviscidose
des glycopeptides.
Un pool de mucus bronchique fibrillaire provenant de 12 enfants atteints de mucoviscidose est soumis a une proteolyse par la papai’ne et le pronase et les glycopeptides lib&s sont precipites par l’alcool absolu. L’electrophorese en agarose a pH 8.2 permet de &parer d’une part une fraction tres acide bien rev&e par le bleu de toluidine et correspondant a des composes nu-
AS
P.A.S.
5.T.
Fig. 1. gtude &ctrophor&que en agarose & pH 8.6 de la fraction du mucus bronchique de mucoviscidose hydrolystk par la papaine et la pronase et pr&ipitCe par 1’6thanol. Les diagrammee sont r&&l& par 1’Amidoschwar.z (AS), le reactif de Schiff aprks oxydation pcriodique (PAS) et lc bleu de toluidine (B’I‘I. Cliu. Chiwz. Acta, 36 (1972) 329-340
GLYCOPEPTIDES
D1? MUCUS FIBRILLAIRE
333
cleotidiques, et d’autre part, un ensemble de composants moins acides dont la partie la plus anodique est bien rPvClCe par le bleu de toluidine, tandis que la partie cathodique est surtout coloree par le reactif de Schiff apres oxydation periodique (Fig. I). L’electrophorese preparative permet de &parer deux fractions glycopeptidiques reperees grace a la courbe de dosage des oses combines par la methode & l’orcinol. Le groupe le plus anodique, tres acide, est riche en groupements sulfate, mais il est souille par des composes nucleotidiques. Le second groupe est moins acide et ne contient pas de groupements sulfate; il est riche en acide sialique. Fractiomemcnt des glyco$c$tides fxar le RivanoL. Pour eliminer les acides nucleiques et pour mieux s&parer les deux groupes de glycopeptides, nous utilisons le fractionnement par le Rivanol a pH 1.5 s. Une grande partie des acides nucleiques precipite B ce pH et peut etre eliminbe par centrifugation. L’addition de Rivanol permet ensuite de precipiter les glycopeptides riches en groupements sulfate. D.O. Orcinol D.O. Sulfate
~j\
Ac.Sialique J47lml I+/
-
Orcinoi
--
-Ac.Sialique
Ac.Sialique
Fig. 2. Fractionnement par &ctrophor&se de mucoviscidose solubles dans le Kivanol
pr8parative en film liquide ii pH S.6 des glycopeptides (A) et pr&zipit& par le Rivanol (B). C&Z. CA&n.
ACta,
36
(1972)
32CJ-340
LAMBLIX
334
et al.
Les glycopeptides prkipitks par le Rivanol sont encore souilk par des composCs nuclkotidiques qui sont kliminks par chromatographie de gel-filtration sur une colonne de Sephadex G-100 dans l’eau distillke. Les glycopeptides sont exclus de la colonne, tandis que les composks nuclkotidiques ont une klution retardee. &de &ctro$aore’tique des fractions glyco~e~tidiques st$arLes par le Ri7janol. En klectrophorkse en agarose, les glycopeptides pr kcipitks par le Rivanol sont color& intens& ment par le bleu de toluidine et sont faiblement r&v&s par le reactif de Schiff aprc’s oxydation periodique. En Clectrophorke en film liquide B pH 8.6, ils ont un comportement trks acide et sont trk fortement r&&As par la r&action k l’acriflavine, tandis que leur teneur en acide sialique parait mod&e (Fig. 2). La majeure partie des glycopeptides bronchiques de mucoviscidose est soluble dans le Rivanol. En 6lectrophorGse en agarose, ces glycopeptides sont un peu moins rapides que les prkkdents. 11s sont t&s bien r&+1& par le rkactif de Schiff aprk oxydation periodique, mais moins bien par le bleu de toluidine. En 6lectrophorPse en film liquide B pH 8.6, leur mobilit est aussi plus faible que celle des glycopeptides DO OK
nol
NaCl
03M
HCI
0.01 N
NaCl 05M HCI 001 N I No.0 HCI
o3
0.7M 001
N
NaCl OIM HCI 001 N
!
100
A
11 , 100
0
_
C
Gp
en
1
t
I
,
200
300
I
400
ml
400
ml
1 400
ml
,n;l,, 200
300
Gp riches en Sulfate
rtches Fucose
I 100
I 200
/ 300
Fig. 3. Chromatographie sur DEU-Sephadcx des glycopeptides solubles dam le Rivanol (.I), tics glycopeptides pr6cipitCs par lc Rivanol (H) et de l’ensentblc des glycopeptides d’un mucus d’cnfant atteint de mucoviscidosc (C).
GLYCOPEPTIDES
DU MUCUS
FIBRILLAIRE
335
precipites par le Rivanol (Fig. 2). 11s sont par contre t&s riches en acide sialique. Ces sialoglycopeptides representent 87 p. IOO de l’ensemble du pool de glycopeptides obtenus par proteolyse du melange des 12 expectorations individuelles de mucoviscidose. Chromatographie insolubles
SW DEAE-Sephadex
des fractions
glycopeptidiques
solubles
et
dans le Rivanol.
Les deux groupes de glycopeptides bronchiques obtenus par fractionnement au Rivanol a pH I .5 sont soumis a une chromatographie d’&hange ionique sur colonne de DEAE-Sephadex A-25 (Fig. 3). Les glycopeptides solubles dans le Rivanol se s&parent en deux fractions. La premiere fraction, elude en presence de ClNa 0.3 M, HClo.01 N, est quantitativement la plus importante. L’Ctude electrophoretique demontre son caractere acide. Elle est r&eke a la fois par le reactif de Schiff apres oxydation periodique et par le bleu de toluidine. Cette derniere coloration r&Ye que la fraction est h&Qo@ne. Le dosage de l’acide sialique et le rep&age des groupements sulfate permettent de montrer que cette fraction possede a la fois des rksidus d’acide sialique et des groupements sulfate. Une seconde fraction, moins importante, est eluee par la solution ClNa 0.5 M, HClo.01 IL'. Les glycopeptides precipites par le Rivanol, fractionnes sur colonne de DEAESephadex dans des conditions identiques, se &parent en deux fractions, eluees par les solutions de ClNa 0.3 M et 0.5 M. Ces glycopeptides sulfates, Ctudies en Clectrophorese en agarose, ne sont rev&% que par le bleu de toluidine et les glycopeptides 61~6s par les solutions salines les plus concentrees ont une mobilitk electrophoretique plus grande. Application directe de la chromatographie lib&e’s par prote’olyse du mucus bronchique
SW DEAE-Sephadex jibrillairc
d des glycopeptides
Les glycopeptides bronchiques sont prepares par proteolyse de 25 expectorations individuelles emises par 17 enfants atteints de mucoviscidose. Chaque mucus est hydrolyse par la papaine et la pronase, et les glycopeptides sont prkipites par l’alcool absolu. 11s sont ensuite directement CtudiCs par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex 6luCe par un gradient discontinu de molarit& croissante en ClNa. On constate, dans les 25 cas etudies, la faible importance ou l’absence presque totale de glycopeptides clues par la solution de ClNa 0.1 M, c’est-a-dire de glycopeptides riches en fucose. La majeure partie des glycopeptides est elude par la solution de ClNa 0.3 M et correspond surtout a des glycopeptides riches en acide sialique. Des glycopeptides riches en sulfate sont 61~6s par la solution de ClNa 0.5 M en quantit6 relativement moins importante (Fig. 3). Nous avons cherche a determiner les proportions relatives des diffkrents groupes de glycopeptides 1ibQPs par proteolyse de ces mucus bronchique individuels. La presence de chlorure de sodium a la concentration de 0.3 M ou de 0.5 M augmente d’environ 4 p. IOO la densite optique obtenue dans la methode de dosage automatique a l’orcinol pour des solutions de galactose. En nCgligeant cette leg&e augmentation, ainsi que l’interference due au fucose qui est peu importante, on peut mesurer la surface des diffkrents pits obtenus par chromatographie des glycopeptides sur DEAESephadex et l’exprimer en milligrammes de galactose. 11 est ainsi possible d’estimer les proportions des diffkrents groupes de glycopeptides. L’application de cette methode B l’etude de 25 expectorations individuelles Cli~z.Chim. Acta, 35 (1972)329-340
336
LAMBLIN
recueillies chez 17 malades permet de montrer l’importance de la fraction peptidique eluee par la solution de ClNa 0.3 M, HCl 0.01 N (Tableau I). TABLEAU
_
DE
glyco-
I
POURCENTAGEDES FRACTIONS GLYCOPEPTIDIQUESLIBfRkES LAIRE
et al.
L’EXPECTORATION
DE
MUCOVISCIDOSE
(17
PAR
PROTItOLYSE
DE
MUCUS
FIBRIL-
OBSERVATIONS)
Pourcentage des fractions glycopeptidiques e’lue’es par les solutions de ClNa-HCl (0.01 N) ClNa 0.1 M Fraction ricke en fucosc
ClNa 0.3 M Fraction rich? en ac. sialiqua
ClNa 0.5 M Fraction riche en sulfate
2”
65 75
‘5 IZ
77 75 46 45 37 50
23 25 34 ID 16
‘3 0 0 20 45 47 40 40 25
10
50
25
20
60
25
hj
IO
30 30 ‘5 15 1.5 16
46
2-l
60
IO
2.5 16 IO
Conzbinaison
10
SO
LO
73
IL
70 .50 7” 60
‘5 15 14 15 3-1-
50 70
20
3 5 6
8.5
I2
80
I.5
85
9
3
80
17
de la bvadykinine
et de la fractio??
majewe
des glyco$e@tides
bronchiques
de mucoviscidose L’Ctude du mucus bronchique de mucoviscidose demontre que les glycopeptides les plus abondants sont eluks par la solution de ClNa 0.3 M, HCl 0.01 i\iet que leur caractere acide se rapporte essentiellement a lem teneur en acide sialique, sensible a l’action de la neuraminidase. Nous avons cherche a determiner si cette fraction possedait, comme certains sialoglycopeptides isoles de l’expectoration d’autres affections bronchiquesl”, un pouvoir de fixation de la bradykinine. I?tude eYectro$hor&ique d’un mYlange de bradykinine et de glycofieptidrs bronchiques de wtucoviscidose. La combinaison bradykinine-glycopeptide peut Ctre mise en evidence par Clectrophorese sur acetate de cellulose a pH 8.2. Cette methode permet de comparer la mobilite electrophoretique de la bradykinine seule (12 ,ug), des glycopeptides bronchiques seuls (300 ,~g) et d’un melange contenant 12 ,MR de bradykinine et 300 ,~g de glycopeptides (Fig. 4). Les glycopeptides bronchiques ont une migration anodique et sont bien rev&% par le reactif de Schiff apres oxydation periodique. La biadykinine seule migre vers Clin. Chim. Acta, 36 (197~) 3~9~340
GLYCOPEPTIDES
Cothodo
DU MUCUS FIBRILLAIRE
337
Anode
GP.
GP. t Bk.
Fig. 1. Electrophor&se sur a&ate de cellulose & pH 8.2 des fractions deglycopeptides (Gp) riches en acide sialique (fractions BluCes par les solutions de ClNa 0.3 M, HCl 0.01 N en chromatographie sur DE,&E-Sephadex) obtenues chez deux enfants atteints de muscoviscidose. Les t5lectrophor&es sont r@alis&s avant (Gp) at apr& combinaison & la bradykinine (Gp+Bk) et colort!es par le rbactif dc Schiff apr& oxydation periodique.
la cathode et elle est revelee par le reactif de Sakaguchi. Le comportement du melange est different: il est possible de mettre en evidence une petite fraction de bradykinine dont la mobilite electrophoretique n’est pas modifiee; au contraire, les glycopeptides qui sont lies & la bradykinine et qui sont bien rev&s par le reactif de Schiff apres oxydation periodique, ont une migration anodique nettement retardee (Fig. 4). EfSet des sialoglyco$eptides bronchiques de muco&dose sw l’action bronchospasmodique de la bmdykinim. Lorsqu’on injecte par voie intra-veineuse a un Cobaye 3,ug de bradykinine pour IOO g de poids corporel, un bronchospasme apparait 7 a IZ set apres la fin de l’injection. L’animal presente d’abord une acceleration du rythme respiratoire et une diminution de l’amplitude ventilatoire. 11 apparaft ensuite une apnee expiratoire qui se prolonge pendant 20 8. 40 set selon les animaux, et qui est suivie d’une phase de reprise de mouvements respiratoires plus amples et plus rapides (Tableau II). On injecte 30 min plus tard, chez le m&me animal, la meme dose de bradykinine melangee a I & 2 mg de sialoglycopeptides purifies par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex. Le bronchospasme disparait totalement (chez 5 animaux) ou presque totalement (chez 2 animaux). On observe dans ces conditions une acceleration passagere du rythme et une augmentation de l’amplitude de ventilation qui persiste pendant I g z min. Une troisierne injection de bradykinine seule, 30 min plus tard, chez les memes animaux, provoque a nouveau l’episode bronchospasmodique et l’apnee (Tableau II). cli>z. Chum.
Acta,
36 (1972) 3~9-340
LAMBLIN
338 TABLEAU
IJ
EFFETS
L’ACTION
SUR
BRONCHOPLASMODIQUE
PvLpavations uti!ise’es (Sialoglycopeptidcs de mucoviscidosrs)
Tmps o Bvadykiniw
+
totale
2-
+
(3 ,uglroo
DE
g)
LA
BRADYKTSISE
Tmps 30 nzirz Bvadykinine et glyco@ptide Poids
Protection
Le diagramme
obtenu
et al.
do Plot&ion
par chromatographie
sur DEAE-Sephadex
des glyco-
peptides du mucus bronchique des enfants atteints de mucoviscidose presente un aspect t&s monomorphe. Ces glycopeptides ont un caractere acide qui est du, comme le montre le fractionnement par le Rivanol, a la presence de groupements sulfate et surtout de residus d’acide sialique. Ce dernier point est parfaitement en accord avec les travaux de Potterl. Cependant, la proportion importante de glycopeptides acides n’est peut-&tre pas une particularite specifique de la secretion bronchique des enfants atteints de mucoviscidose. Les possibilites de synthese des cellules des glandes bronchques semblent varier avec l’age du sujet. Lamb” a ainsi trouve une proportion elevee de cellules contenant et incorporant du sulfate dans les glandes muqueuses des branches de foetus et de nourrissons normaux, ainsi que dans les cellules muqueuses de sujets atteints de mucoviscidose. Chez l’enfant normal, cette proportion diminue avec l’age, en mCme temps qu’augmente la proportion des cellules dont la coloration est sensible a l’action de la neuraminidase. L’abondance des glycopeptides acides dans la s&rCtion bronchique de mucoviscidose semble ainsi s’opposer aux constatations qui ont pu &tre faites dans d’autres secretions. On a mis ainsi en evidence une elevation du rapport fucose/acide sialique dans la salive12913, le liquide duodCnall* et la sueur l5 des sujets atteints de mucoviscidose. Ces discordances sont peut-etre en partie le reflet des differences de structure chimique des glycoproteides normalement elabores par les differentes glandes muqueuses. Le role du systeme des kinines a deja Cte envisage dans la genese de la mucoviscidosele. La kallicreine a pu etre identifiee dans la muqueuse et dans la secretion bronchique humainer7. L’application de bradykinine sur la muqueuse bronchique ne semble produire qu’un Crytheme mineurIs. 11 nous a cependant paru interessant d’etudier, ipz vitro, les relations pouvant s’etablir entre la bradykinine et les structures glycopeptidiques acides du mucus bronchique de mucoviscidose. Comme les sialoglycopeptides isoles au tours d’autres affections lo, les glycopeptides bronchiques de Clin. Cl~inz.Acta,
36 (1972) jrg-310
GLYCOI’EPTIDES
mucoviscidose et inhibent
DU MUCUS FIBRILLAIRE
forment
339
avec la bradykinine
le bronchospasme
provoque
des combinaisons
par la bradykinine
stables en electrophorese chez le Cobaye.
11 est encore trop tot pour savoir si cette activite des sialoglycopeptides de mucine bronchique joue un role dans la physiologie bronchique normale ou pathologique. Des etudes ulterieures seront necessaires pour comparer la repartition et les proprietes des glycopeptides du mucus bronchique secrete au tours d’autres affections broncho-pulmonaires de l’enfant. Elles devraient aussi se prolonger par la mise au point de methodes permettant d’isoler les mucines bronchiques elaborees au tours de la mucoviscidose et d’autres chiectasies, afin d’en determiner
affections bronchiques de l’enfant, comme les bronles particularites structurales et les activites physio-
logiques. REMERCIEMENTS
Ce travail
a et& realis
avec
la collaboration
technique
C. Richet, I. Branquart et M. van Bockstaele. Nous remercions vivement Monsieur le Professeur
de Mesdemoiselles
Guerrin pour l’aide precieuse
qu’il nous a apportee dans l’etude experimentale du bronchospasme chez le Cobaye. Nous exprimons notre reconnaissance a la Fondation pour la Recherche Meditale Francaise pour l’aide materielle sans laquelle nous n’aurions pu poursuivre ces recherches. RkSUMI?
Le mucus fibrillaire
extrait
d’expectorations
d’enfants
atteints
de mucovisci-
dose est successivement hydrolyse par la papa’ine et la pronase. Les glycopeptides lib&es sont fractionnes par le Rivanol (lactate de 6,9-diamino-z-ethoxy-acridine) a pH 1.5 et &par& par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex A-25 ou electrophorese preparative en film liquide. Deux groupes majeurs de glycopeptides acides sont isoles. Le groupe principal est le plus riche en acide sialique, l’autre contient des groupes sulfate et de plus faibles taux d’acide sialique. Ces proteoglycannes participent a la structure des mucines bronchiques de mucoviscidose. Nous ne trouvons jamais de quantite importante de glycopeptides riches en fucose dans l’etude de 25 expectorations individuelles de mucoviscidoses. Les sialoglycopeptides inhibent l’action bronchospasmodique de la bradykinine chez le Cobaye; sialoglycopeptide peut etre caracterise en electrophorese.
le complexe
kinine-
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