Particules subcellulaires dans les tumeurs

Europ. ,~. CancerVol. 4, pp. 193-200. Pergamon Press 1968. Printed in Great Britain

Particules Subcellulaires dans les Tumeurs I. Distribution intracellulaire de la cytochrome oxydase, la glucose-6-phosphatase, la catalase et plusieurs hydrolases acides dans un h@atome chimique transplantable (h@atome HW) R. WATTIAUX et S. WATTIAUX-DE CONINCK Laboratoire de Chirnie Physiologique, Facult~s Universitaires Notre Dame de la Paix, 61, rue de BruxeUes Namur, Belgique

INTRODUCTION L'ETUDE de la distribution intracellulaire d'enzymes, par les mfithodes de centrifugation, permet non seulement d'identifier des organites subcellulaires d a m un tissu donn6, mais aussi de caract6riser certaines propri6t6s physicochimiques, et m~me fonctionnelles, de ces entit~s; les travaux de de Duve et son groupe, sur le foie de rat, en sont une illustration [I-4]. Le b u t de nos travaux est prficis~ment d'analyset la distribution intracellulaire de diff~rentes enzymes dans des tumeurs expfrimentales, en mettant ~ profit les techniques de centrifugation diff~rentielle et de centrifugation en gradient de densit6 utilis~es par ces auteurs. De nombreux auteurs ont d6jk 6tudi6 la distribution intracellulaire d'enzymes dans les tissus tumoraux, mais la seule m6thode pratiquement utilis~e est la centrifugation diff~rentielle suivant la technique de Schneider et H o g e b o o m [5, 6]. Les tumeurs auxqueUes nous nous sommes int6ress6s d'abord sont les h6patomes chez le rat. Ces tumeurs sont facilement induites par des moyens chimiques et leur transplantation est d'habitude ais6e. De plus, au tours de ces derni~res ann~es, il a 6t6 possible

d'obtenir des h~patomes transplantables de degr~s divers de diff~renciation [7], aussi ces tumeurs repr6sentent-elles un mat6riel biologique int@essant, non seulement d'un point de vue canc6rologique mais aussi dans l'dtude de la diffdrenciation cellulaire. Les premiers rdsultats que nous pr6sentons ont 6t6 obtenus sur un h~patome chimique transplantable chez le rat, l'h6patome H W . Dans cet article, nous ddcrivons comment la cytochrome oxydase, la glucose-6-phosphatase, la catalase et plusieurs hydrolases acides se distribuent, apr~s centrifugation diff~rentielle d'homog6nats de cette tumeur, suivant le schema de de Duve et al. [1]. Les distributions sont compar6es avec celles 6tablies pour ces enzymes dans le foie de rat. MATERIEL ET M E T H O D E S Tumeur L'h~patome H W est un h~patome induit la nitrosomorphiline chez le rat; il est maintenu en transplantation sur des rats R, depuis de nombreuses g~n~rations, au laboratoire du Dr. G. Deckers (Institut du Cancer de l'Universitd de Louvain). I1 se dfveloppe en 5 ~ 6 semaines et peut atteindre un poids de 40 ~ 50 g; 193

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toutefois, nous avons utilis6 g6n6ralement des tumeurs ne d6passant pas 20 g, ~t un stade off les ph6nom~nes de n6crose sont peu marqu6s.

Centrifugation difflrentieUe Le rat est sacrifi6 par d6capitation, et la tumeur rapidement dissdqude et ddcoup6e en gros fragments qui sont placds dans du saccharose 0,25 M glac6. U n e quantit6 pesde est utilis6e pour l'exp6rience, elle est d'habitude de l'ordre de 10 g. Le tissu est d6coup6 en petits morceaux, ~ l'aide de ciseaux, puis homogdn6is6 dans le saccharose 0,25 M ~t l'aide de l'homog6n6iseur du type de Potter et Elvehjem [8], constitu6 d'un tube en pyrex et d'un piston en Teflon actionnd par un moteur tournant ~t 3.000 tours/min. La suspension est centrifugde pendant 10 m i n k 1.200 tours/min dans une centrifugeuse r6frig6rde International PR 2 (rotor no 253); le sfidiment est pass6 l'homog6n6iseur, puis dilu6 et recentrifug6 dans les m6mes conditions; l'opdration est encore rdp6tde une fois, apr~s cette seconde centrifugation. Finalement, le culot est resuspendu dans un volume de saccharose 0,25 M correspondant, en m l , ~t un poids qui repr6sente 4 ~t 5 fois le poids en g du tissu. Cette supension constitue la fraction N. Les liquides surnageants de chaque centrifugation sont mdlangds, portds h un volume correspondant ~t un poid qui reprdsente 5 fois le poids en g du tissu, pour constituer l'extrait cytoplasmique E. Le fractionnement de cet extrait se fait suivant la technique de de Duve et al. [1, 3], ~ l'aide d'une ultracentrifugeuse pr6parative Spinco L - H V (rotor 40). Une fraction mitochondriale 'lourde' M, une fraction mitochondriale 'Idg~re' L, une fraction microsomiale P, et une fraction soluble S, sont isol6es suivant le schdma de fractionnement dficrit par ces auteurs. Mesures enzymatiques La cytochrome oxydase (E C 1.9.3.1.) a 6t6 mesurfe suivant la m6thode d'Appelmans, Wattiaux et de Duve [9] ; la glucose-6-phosphatase (E C 3.1.3.9.), par la mdthode de de Duve et al. [1]; la phosphatase acide (E C 3.1.3.2.), la ribonuclfase acide (E C 2.7.7.16.), et la cathepsine, suivant les techniques d6crites par Wattiaux et de Duve [10]. Les procddds pr6conisfs par Vaes [11] ont 6t6 suivis pour la mesure de la 13-galactosidase (E C 3.2.1.23.) et de la [3-N-acdtyl-glucosaminidase (E C 3.2.1. 30.) avec, respectivement, de l'0-nitrophdnyl[~-D-galactoside et du p-nitroph6nyl-N-acdtyl[~-9-glucosaminide comme substrats. Comme nous le d6crirons, les hydrolases acides de l'hdpatome H W existent, sous forme latente, dans l'homogdnat; aussi, les mesures de ces

enzymes ont-elles 6t6 faites en pr6sence de Triton X-100 ~t 0,1%, comme il est recommand6 par Wattiaux et de Duve [10]. La mesure de la catalase (E C 1.11.1.6.) a 6t6 rdalis6e suivant la technique de Baudhuin et al. [3]; quant aux prot6ines, nous les avons d6termin6es par la m6thode de Lowry et al. [12], en nous r6f6rant ~t la s6rum albumine bovine, comme 6talon. Les unit6s d'activit6 enzymatique sont d6finies, pour les hydrolases, comme 6tant la quantit6 d'enzyme capable de d6composer une gmole de substrat par min, dans les conditions de l'essai. Une unit6 de cytochrome oxydase correspond ~ la quantit6 d'enzyme qui catalyse en une minute l'oxydation de 90 pour cent du cytochrome c r6duit pr6sent dans 100 ml [9]. Pour la catalase, une unit6 d'activit6 se d6finit 6galement comme la quantit6 d'enzyme qui provoque la destruction de 90 pour cent du substrat en une minute mais dans un volume de 50 ml [3]. L'hydrolyse de I'ARN est 6valu6e en mononucl6otides sur la base d'un coefficient d'extinction ~t 260 m g de 8,5 × 106cm~mole-1 [13]. RESULTATS

Activitgs enzymatiques Le Tableau 1 rapporte les valeurs moyennes d'activit~s enzymatiques que nous avons mesurdes dans les homog6nats d'h6patome. I1 permet aussi de comparer les activit6s sp~cifiques de ces enzymes ~t celles que l'on trouve dans les homog6nats de foie de rat. La cytochrome oxydase, la glucose-6-phosphatase et la catalase sont nettement moins actives dans la tumeur; au contraire, les hydrolases acides manifestent une activitfi plus 61ev~e dans l'h~patome que dans le foie. Distribution des enzymes aprks centrifugation diffgrentielle Les distributions observdes sont signal6es au Tableau 2, et reprdsentfies graphiquement ~ la Fig. 1, suivant la m~thode propos~e par de Duve et al. [1]. Avant d'examiner chaque distribution en particulier, remarquons que la fraction N contient un pourcentage dlev6 des prot6ines totales de l'homog~nat et de toutes les enzymes mesur~es; sauf pour la glucose-6-phosphatase, le taux d'enzyme pr6sent dans cette fraction est semblable, quel que soit l'enzyme considfir6e. La cytochrome oxydase est r6cupdrde principalement dans la fraction mitochondriale 'lourde' M ; n6anmoins une proportion tr~s significative de l'enzyme se retrouve dans la fraction mitochondriale '16g~re' L, fraction

Particules Subcellulaires dans les Tumeurs. Part I Tableau 1.

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Activitgs enzymatiques de L'hepatome H W 3 i

Activit 6s sp~cifiques I-Ifpatome Ribonucl6ase acide Phosphatase aeide 13-Galactosidase Cathepsine I]-N-Ac6tylglueosamlnidase Glueose-6-phosphatase Cytochrome oxydase Catalase

(15) (16) (13) (12) (10) (9) (15) (12)

ActivitEs spEc hepatome ActivitEsspEc. foie

Foie

1,14 -4-0,13 3,09 4-0,43 0,364q-0,034 0,7394-0,062 2,16 4-0,25 1,04 4-0,12 3,80 4-0,78 0,5614-0,049

(10) (I0) (10) (10) (10) (10) (9) (10)

0,46 4-0,05 2,69 4-0,23 0,1764-0,033 0,6894-0,052 1,68 4-0,30 7,85 4-1,63 13,6 i2,1 18,7 ~2,3

2,46 1,15 2,06 1,07 1,28 0,13 0,27 0,03

*Les activitEs sont exprimfes en unit6s/100 mg de protdines. Les rEsultats sont prEsentEs sous forme de moyennes 4-6cart type (SD). Entre parentheses, le nombre de dfterminations individuelles. La quantit6 de protfines, trouv6e dans un g de tissu Dais, est de 91~9q-7,0 nag pour l'hEpatome, et de 227+__9mg pour le foie.

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TOTALES

Fig. I. Profil de distribution des enzymes apr~s centrifugation diff&entielle: (a) cytochrome oxydase; (b) glucose-6-phosphatase; (c) catalase; (d) phosphatase acide; (e) ~-N-ac¢tylglucosaminidase; (f) ribonuclease acide; (g) f~-galactosidase; (h) cathepsine. En ordonn6e: l'activitg sp&ifique relative moyenne desfractions (pourcentage de l'activit~ totale r&upD&/pourcentagedes prot~ines totales r&up3rges). En abscisse: pourcentage des protdines totales ricupe'r[es (cumulativement de gauche ~ droite).

dans laquelle, d'ailleurs, l'oxydase est la plus purifiEe. Le taux de glucose-6-phosphatase associ6 ~ la fraction N exc&de nettement celui que l'on trouve pour les autres ferments; dans l'extrait cytoplasmique, l'enzyme est localisEe surtout dans la fraction P; aussi son profil gEnEral de distribution est-il du type microsomial. Les hydrolases acides se caractErisent par des distributions trEs comparables; c'est dans les fractions mitochondriales M e t L qu'on

les retrouve principalement, leur activit~ spEcifique 6tant de loin la plus ElevEe dans la fraction 16gEre L. O n observe toutefois quelques differences appreciables d'une enzyme ~ l'autre, surtout quant au taux d'enzyme trouv6 dans la fraction soluble S. Q uant ~ la catalase, elle sEdimente tout particuliErement dans la fraction microsomiale P, et il est ~ noter que 10% seulement de l'enzyme sont rEcupErEs dans la fraction soluble.

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Particules Subcellulaires dans les Tumeurs. Part I Latence des enzymes Les hydrolases acides sont prdsentes, sous forme lantente, dans l'extrait cytoplasmique; c'est ce qu'illustre la Fig. 2. Leur activit6 peut ~tre ddmasqu6e par des cong6lations e dfcong61ations r6pdtdes, par la raise en milieu hypotonique, par l'addition de Triton X-100, par un traitement dans un Waring Blendor. La catalase aussi existe sous forme latente (Fig. 2) ; on remarque toutefois que seuls le Triton X-100 et le traitement au Blendor sont efficaces, ni les congdlations et ddcongdlations, ni la mise en milieu hypotonique, ne peuvent d6masquer l'enzyme.

DISCUSSION Les distributions enzymatiques que nous avons observ6es apr~s centrifugation diffdrentielle d'homogdnats d'hdpatome HW, et celles dtablies par de Duve et ses collaborateurs sur le foie de rat [1, 3], different sous plusieurs aspects. Nous les discuterons ici. Tout d'abord, la fraction N de l'h6patome contient une proportion nettement plus 61ev6e des protdines et des enzymes de l'homog6nat. La similitude entre les taux des diff6rentes enzymes (sauf celui de la glucose-6-phosphatase), prdsents dans cette fraction, sugg~re fortement une contamination 61evde, non spdcifique de cette fraction, par du mat6riel cytoplasmique. Celui-ci peut provenir de la pr6sence, dans la fraction N de la tumeur, d ' u n nombre appr6ciable de cellules intactes: le broyage de la tumeur est en effet plus difficile que celui du foie de rat. Remarquons aussi que d'apr~s Dounce [14], lors du broyage mdnag6 d'une tumeur en milieu aqueux, du matdriel cytoplasmique reste toujours 'co116' aux noyaux, ph6nom~ne qui ne se produit pas lors du broyage du foie. De plus, une tumeur contient une trame conjonctive apprdciable, dont les fragments sddimentent certainement avec la fraction N e t peuvent entralner, dans les agglom6rats qu'ils forment, des particules cytoplasmiques. La distribution de la cytochrome oxydase se signale par la prdsence d'une proportion notable de l'enzyme dans la fraction mitochondriale 'ldg~re' L. Cela sugg~re que les mitochondries de la tumeur ont un coefficient de sddimentation moyen dans le saccharose 0,25 r~, plus faible que celui des mitochondries du foie et que, par consdquent, leur taille ou (et) leur densit6 sont en moyenne plus petites que celles des mitochondries h6patiques. Nos rdsultats ne permettent toutelois pas d'exclure la possibilit6 qu'un certain nombre de mitochondries de l'h6patome soient

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lds6es au cours de la prdparation de l'homogdnat et que l'activitd cytochrome oxydasique de la fraction L soit due principalement ~t des fragments mitochondriaux, auxquels l'enzyme reste fermement attach6e. D'autre part, l'activit6 sp6cifique de la cytochrome oxydase dans la fraction M est nettement inf6rieure ~t celle de l'enzyme dans la fraction L, soit que les mitochondries, sddimentant dans M, aient une teneur en prot6ines sup6rieure h celle que l'on trouve dans L, soit qu'il existe une proportion importante d ' d 6 m e n t s prot6iques non mitochondriaux dans M. La seconde hypoth6se est la plus vraisemblable, l'examen de la fraction M au microscope de phase rdv~le la prdsence de noyaux; de plus, comme nous le montrerons [15], il est possible de sdparer les mitochondries d'une fraction M-I-L de certains contaminants prot6iques, non mitochondriaux, par centrifugation isopycnique dans un gradient de saccharose. L'activitd glucose-6-phosphatasique, trouv6e dans la fraction N, laisse supposer une contamination s61ective de cette fraction par l'enzyme. Rappelons toutefois que, dans le foie comme dans le rein, la fraction N contient un taux nettement plus 61ev6 de glucose-6phosphatase que des autres enzymes cytoplasmiques [1, 16]. Ce phdnom6ne est vraisemblablement da ~t la pr6sence, dans cette fraction, de gros fragments du reticulum endoplasmique. L'estimation de l'activit6 glucose-6-phosphatasique de l'h6patome pose, d'autre part, un certain probl~me En effet, elle est nettement plus faible que celle du foie, et m~me que celle de la phosphatase acide non sp6cifique de la tumeur. Or, cette derni6re enzyme est capable d'hydrolyser le glucose-6phosphate et son activit6 peut donc fausser la mesure de l'activitd glucose-6-phosphatasique vraie; ce probl6me est ~t l'~tude actuellement dans notre laboratoire. Dans l'h6patome HW, la distribution de la catalase est nettement diff6rente de celle trouvde dans le foie de rat. Dans cet organe, la catalase est localis6e dans les peroxysomes (microbodies) qui s6dimentent surtout dans les fractions mitochondriales et sont le plus purifi6s dans la fraction 'ldg~re' L [3] ; de plus, dans les homogdnats de foie de rat, 30% de l'activit6 catalasique sont rdcup~rds dans la fraction soluble [3]. Dans l'hdpatome HW, la catalase est avant tout microsomiale et le taux d'activit6 soluble ne d6passe pas 10%. Du point de vue de sa latence dans l'homog6nat, la catalase de l'hdpatome ressemble ~t celle du foie, en ce sens qu'eUe peut atre demasqu6e par le Triton X-100 et par un traitement au Blendor

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Fig. 2. Activation des hydrolases acides et de la catalase de l' extrait cytoplasmique d' un h~patome H W . A . La pr~paration est trait&pendant 16 min dans un Waring Blendor M S E tournant g~vitesse maximale. B. La prgparation subit 5 cong~lations et d&ongdlations successives. C. L'extrait est pr~par~ dans l'eau distillge au lieu de saccharose 0,25 M. Les activitgs libres et totales sont dgtermin~es sur un &hantillon trait~ et sur un &hantiUon tgmoin provenant d'un m~me extrait. L'incubation pour la mesure de l'activitg libre est de 10 min et le milieu contient du saccharose 0,25 M; l'activitg totale correspond ~ l'activitg mesur~e en presence de Triton X-100 ~ 0,1%. Elle est assurn~e comme valant 100% de l'activitg enzymatique (traits pointiUgs). (1)phosphatase acide ; (2) ~-Nacltylglucosaminidase ; (3) ~-galactosidase ; ribonuclgase acide ; (5) catalase. Bloc ouvert avant et bloc bhachure aprks traitement.

mais non par la mise en milieu hypotonique; nEanmoins les congElations et dEcongElations ne peuvent activer la catalase de la tumeur, alors qu'elles ddmasquent la catalase des peroxysomes hEpatiques [17]. Les relations Eventuelles entre les structures porteuses de catalase dans l'hEpatome H W et les peroxysomes seront discutEes plus loin, en fonction des rdsultats obtenus apr6s centrifugation en gradient de densit6. Signalons que nous n'avons pu mettre en Evidence, jusqu'~ present, dans l'hEpatome HW, ni urate oxydase, ni D-amino acide oxydase, deux enzymes localis6es dans les peroxysomes de foie de rat [3, 4, 17]. Le crit~re biochimique fondamental de

l'existence de lysosomes, dans un tissu, est la presence, dans un homogEnat de ce tissu, d'hydrolases acides de spEcificitEs variEes, sEdimentables, et dont l'activitE est latente. Ce crit~re est bien vErifiE dans l'hEpatome H W ; de plus, les distributions des hydrolases acides, observEes apr~s centrifugation diff~rentielle, sont comparables ~t celles que ces enzymes ont dans le foie; dans ces deux tissus, les enzymes sont associEes principalement aux fractions mitochondriales et prEsentent leur activitE spEcifique la plus ElevEe dans la fraction L. Ces consid6rations, jointes au fait que les activitEs totales de ces enzymes sont ElevEes, laissent dfij~ presumer que le syst~me lysosomial est bien dEveloppE dans l'hEpatome HW.

RESUME 1. Les activitgs de la cytochrome oxydase, glucose-6-phosphatase, catalase, et plusieurs hydrolases acides, ont gtg mesurges dans les homoggnats d'un Mpatome transplantable chez le rat (hgpatome H W ) et comparges avec celles trouvges dans le foie de rat. Les trois premikres enzymes sont beaucoup moins actives dans la tumeur, tandis que les hydrolases acides sont plus actives. 2. Les distributions intracellulaires de ces enzymes ont dtg dtudiges suivant un schgma de centrifugation semblable ~ celui d&rit par de Duve et ses collaborateurs [I]. Les homoggnats ont itg fractionngs en une fraction nuclgaire N, des fractions mitochondriales 'lourde' et 'lgg~re', M et L, une fraction microsomiale P, et une fraction soluble S.

Particules Subcellulaires dans les Tumeurs. Part I 3. La cytochrome oxydase et les hydrolases acides sont retrouv&s, en majeure pattie, dans les fractions mitochondriales ; eUes sont le plus purifi&s dans la fraction 'lgg&e' L. La glucose-6-phosphatase et la catalase pr&entent un profil de distribution microsomial. 4. Les hydrolases acides pr&entent le phgnom~ne de latence ; eUes peuvent gtre activges dans l'extrait cytoplasmique par cong~lations et d&ongglations, traitement au Waring Blendor, hypotonicitl, et par le Triton X-IO0, un dgtergent non ionique. La catalase aussi est trouv& sous forme latente dans l'extrait cytoplasmique, mais ne peut gtre dgmasqu& ni par hypotonicitg, ni par congglations et d~cong~lations. 5. Une comparaison est faite entre les distributions enzymatiques dans l'hgpatome H W et dans lefoie de rat. Des diff&ences significatives se sont av&&s, sauf pour les distributions des hydrolases acides. SUMMARY 1. The activity of cytochrome oxidase, glucose-6-phosphatase, catalase and several acid hydrolases has been measured in homogenates of a rat transplantable hepatoma (hepatoma H W ) and compared with that found in rat liver. The first three enzymes are much less active in the tumour ; on the contrary, acid hydrolases are more active in the hepatoma. 2. The intracellular distribution of these enzymes has been investigated according to a centrifugation scheme similar to that described by de Duve and his co-workers [1]. The homogenates were fractionnated in a nuclear fraction N, a 'heavy' and a 'light' mitochondrial fraction, M and L, a microsomal fraction P and a soluble fraction S. 3. Cytochrome oxidase and acid hydrolases are chiefly recovered in the mitochondrial fractions; they are the most purified in the 'light' one L. Glucose-6-phosphatase and catalase exhibit a microsomal distribution pattern. 4. Acid hydrolases display the phenomenon of structure-linked latency; they can be activated in the cytoplasmic extract by freezing and thawing, Blendor treatment, hypotonicity and the non-ionic detergent Triton X-IO0. Catalase is also found in a latent form in the cytoplasmic extract but cannot be unmasked by hypotonicity nor by freezing and thawing. 5. A comparison has been made between the distributions of the enzymes in the hepatoma H W and in the rat liver. Significant differences have been shown to exist except for the acid hydrolases distribution. ZUSAMMENFASSUNG 1. Die Aktivit~t der Zytochromoxydase, der Glukose-6-Phosphatase, der Katalase und mehrerer saurer Hydrolasen wurde in Homogenaten eines bei Ratten transplantablen Hepatoms (H W Hepatom) gemessen und mit derjenigen in der Leber der Ratte verglichen. Wiihrend die drei erstgenannten Enzyme im Tumor viel weniger aktiv sind, entfalteten die sauren Hydrolasen im Hepatom eine griissere Aktivitdt. 2. Die intrazellulgre Verteilung dieser Enzyme wurde--gemdss einem Zentrifugierungs schema, wie es in ;~hnlicher Weise de Duve und seine Mitarbeiter beschrieben haben [1]-festgestellt. Die Homogenate wurden nach diesem Verfahren in folgende Fraktionen ausgeteilt: Kernfraktion (N), schwere und leichte Mitochondrialfraktion (M und L), Mikrosomalfraktion (P) und lgsliche Fraktion (S). 3. Man findet die Zytochromoxydase und die sauren Hydrolasen vorwiegend in den mitochondrialen Fraktionen ; in der reinsten Form erscheinen sie in der leichten Fraktion (L). Die Glukose-6-Phosphatase und die Katalase hingegen sind in der Mikrosomalfraktion zu finden. 4. Die sauren Hydrolasen sind durch eine strukturbedingte Latenz gekennzeichnet; sie kiinnen im Zytoplasmaextrakt dutch folgende Massnahmen aktiviert werden : Gefrieren und Auflauen, Behandlung im Waring Blendor, Herabsetzen der osmotischen Spannung und Zugabe von Triton X-IO0 einem nichtionisierten Detergens. Die Katalase ist ebenfalls latent im Zytoplasmaextrakt enthalten ; sie kann aber weder durch verminderte osmotische Spannung noch durch Gefrieren oder Auftauen aktiviert werden. 5. Man vergleicht die Enzymverteilung im HW-Hepatom und in der Leber der Ratte. Dabei ergeben sich mit Ausnahme der Verteilung der sauren Hydrolasen signifikante Unterschiede.

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