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Purification et étude de la phosphatase acide lutoïdique du latex d'Hevea brasiliensis
Purification et dtude de la phosphatase acidc lutoidique du latex d'He ,ea brasiliensis. Jean-Louis JACOB and Nicole SONTAG. Laboratoire de B i o c h i m i e de l'Institut Francais du Caoutchouc, 42, rue Scheffer, 75016 Paris. (25-7-197~). Summary. - - The lutoidic serum of Hevea brasiliensis latex contains an acid phosphatase (EC 3.1.3.2), very stable. It was important to kno'w the characteristics of the enzyme which can be implied with other phosphatases in the regulation of rubber synthesis. Next we isolated and completely purified it. Its molecular weight is estimated to he about 90 000-100 000. The utilisation of para-nitrophenylphosphate and phosphoenolpyruvate by this phosphatase which hydrolyses only phosphate monoesters, is particularly good. The optimum pH of this enzyme is around 5,5. Its Km value for para-nitropenylphosphate at lhis pH is 0,11 raM, but increases to 1 mM at pH 7,0. Ca2+, Na +, K+, sodium tartrate, dinitro-2,4-phenol, iodoacetamide and sodium citrate have no influence on the enzyme reaction. Orthophosphate, at physiological concentration, and inorganic pyrophosphate are competitive inhibitors. Zn2+, FNa, sodium arseniate, Cu2., lIg'-'~, but chiefly Mo4+ and W6+, are incompetitive inhibitors. The Ki value of these effectors has been mesured. Mg2÷ which has no effect on para-nitrophenylphosphate or NADP hydrolysis, acts as an inhibitor to'wards ATP hydrolysis. This ATP protection seems to be efficient since the cofactor is always found in the cytoplasmic serum of latex which contains in any case some free lutoi'dic acid phosphatase.
INTRODUCTION. La pr6sence d'activit6s p h o s p h a t a s e s dans le latex d'Hevea brasilie~tsis est c o n n u e depuis longtemps [1]. Leur r61e n6gatif sur l ' a n a b o l i s m e isop r 6 n i q u e a pu 6tre montr6 [2, 3, 4]. P o u r p r 6 c i s e r ce ph6nom6ne, il 6tait i m p o r t a n t de c o n n a i t r e plus p a r t i c u l i 6 r e m e n t ces enzymes, et p o u r cela de les isoler, afin d'6viter toute i n t e r f 6 r e n c e p o u v a n t fausser les r6sultats c o n c e r n a n t leurs caract6ristiques. U n e de ces hydrolases, la 2'-nucl6otidase a 6t6 mise en 6vidence [4, 5] dans le s6rum cytoplasmique, puts purifi6e [6] ; une autre p h o s p h a t a s e acide, p e u sp6cifique (E.G. 3.1.3.2) existe dans les lutoides [7], p a r t i c u l e s m o n o m e m b r a n a i r e s assimil6es h des l y s o s o m e s v6g6taux [81 ; il 6tait d o n c n6cessaire de i ' 6 t u d i e r arian de c e r n e r 6galement son influence m6taboliqne au sein du latex.
MATI~RIEL E T MI~THODES. Matdriel vdgdtal. Le latex d'h6v6a est r6colt6 en C6te d ' I v o i r e p a r saign6e de l'arbre, dans des flacons de poly6thy16n.e en,tour6s de glace et exp6di6s le j o u r m6me, p a r avion, dans un r 6 c i p i e n t i s o t h e r m e h 0°C. Le latex est r6ceptionn6 v i n g - q u a t r e heures plus tard
au l a b o r a t o i r e de P a r i s ; il est alors centrifug6 d u r a n t 90 minutes, h 38 000 × g. Les lutoides sont lav6s avec une solution de m a n n i t o l 0,3 M, puts lys6s darts une solution fi 0,2 p. cent de T r i t o n Xl14. Apr6s c e n t r i f u g a t i o n (30 mn h 20 000 × g, le s6rum l u t o i d i q u e est pr61ev6. It peut 6tre utilis6, soit i m m 6 d i a t e m e n t , soit lyophilis6 et conserv6 h - - 30°C. Produits ulilisds. Le S e p h a d e x G200 et le D E A E S e p h a d e x A 50 ont 6t6 pr6par6s selon les t e c h n i q u e s [9, 10] propos@s p a r le f a b r i q u a n t : P h a r m a c i a F i n e Chemicals (Uppsala, Suede). Le p a r a - n i t r o p h 6 n y l p h o s p h a t e et le b i s - p a r a n i t r o p h ~ n y l p h o s p h a t e ont 6t6 f o u r n i s p a r T o u z a r d et Matignon, t o u s l e s autres substrats p h o s p h o r y l 6 s , le c y t o c h r o m e C et les enzymes, p a r B o e h r i n g e r M a n n h e i m GmbH (Mannfeim, Allemagne) ; le bleu dextran, le sulfate d'amm o n i u m purifi~ grade 1 et le diazo bleu B, p a r Sigma C h e m i c a l C o m p a g n y (St-Louis, Mo., U.S.A.), le d i m 6 t h y l p r o p i o n i t r i l e , p a r Koch Light Laborat o r i e s (Colnbrook, Bucks, Angleterre), l ' a c r y l a m i d e et le ~ - N ' - m 6 t h y l 6 n e b i s - a c r y l a m i d e , p a r E a s t m a n ' s O r g a n i c C h e m i c a l s (Rochester, N.Y., U.S.A.), le naphtal6ne n o i r dix B, p a r Curr Ltd (Londres, Angleterre) et l ' a - n a p h t y l p h o s p h a t e acide, p a r C a l h i o c h e m (Los Angeles, U.S.A.).
1316
J.-L. Jacob a n d N. Sontag.
Matdriel utilis& Les c e n t r i f u g a t i o n s ont 6t6 r6alis6es sur u n e u l t r a c e n t r i f u g e u s e Spinco L 50 ou Sorvall RC2B. Les dosages e n z y m a t i q u e s et colorim6triques ont 6t6 effeetu6s avec u n spectrophotom6tre J o b i n et Yvon, type Maroc I,I coupl6 h u n e n r e g i s t r e u r B e c k m a n 10 pouces. Les colonnes utilis6es pour les s6parations sur gel et l ' a p p a r e i l h g r a d i e n t Mixer GM-1 sont fabriqu6s p a r P h a r m a c i a F i n e Chemicals. Les fractions d'~lution ont 6t6 r6cup6r6es p a r u n collecteur LKB Radirac. Les 61ectrophor6ses ont 6t6 faites ~ l'aide d ' u n appareil <
> Buehler.
Contr6le de la purification. A chaque 6tape de la purification, l'activit6 phosphatasique a 6t6 mesur6e de la m a n i b r e suivante : Dans une cure de spectrophotombtre de 3 m l e t de 1 cm d'6paisseur, on i n t r o d u i t , p o u r u n volume r 6 a c t i o n n e l de 1 ml, 100 !M de t a m p o n ac6tate 1 M pH 5,5, et u n e aliquote de s6rum c o n t e n a n t de 0,004 ~ 0,015 unit6 de phosphatase acide. La r6action .est d6marr6e p a r l ' a d d i t i o n de 20 ~moles. de p a r a n i t r o p h 6 n y l p h o s p h a t e , puts bloqu6e p a r 2 ml de KOH 1N aprbs 2 m n d ' i n c u b a t i o n ; la f o r m a t i o n du p a r a - n i t r o p h 6 n o l est mesur6e ~ 400 n m [11]. Les prot6ines sont dos6es p a r mesure de l'absorb a n c e ~ 260 et h 280 nm, e n u t i l i s a n t les coeffici.ents d6finis p a r W a r b u r g et Christian [12]. L'unit6 d'aetivit6 est la quantit6 d ' e n z y m e qui h y d r o l y s e 1 ~mole de p a r a - n i t r o p h 6 n y l p h o s p h a t e p a r m i n u t e darts les c o n d i t i o n s d6crites. L'activit6 sp6cifique est exprim6e p a r m i l l i g r a m m e de prot6ines. Les 61ectrophorbses sur gel de p o l y a c r y l a m i d e ont 6t6 r6alis6es selon des m6thodes d6]~ d6crites
[6, 13]. METHODES UTILISEES LORS DE L'ETUDE DES CARACTERISTIQUES DE LA PHOSPHATASEACIDE.
Incubation. L'6tude de ]a phosphatase acide a 6t6 r6alis6e p a r i n c u b a t i o n h 28°C dans des pitluliers bouch6s, c o n t e n a n t 0,2 M de t a m p o n en p r e s e n c e de paran i t r o p h 6 n y l p h o s p h a t e ou d ' u n autre substrat phosphoryt6. Des pr616vements ~ 30 secondes, 6, 12 et 18 m i n u t e s sont effectu6s sur chaque 6chantillon ; les r6actions sont bloqu6es p a r KOH 1 N dans le seul cas du dosage du p a r a - n i t r o p h 6 n o l [11] ou p a r a d d i t i o n de 0,2 ml de CIO~H 6 M, p a r millilitre dans tes autres cas ; la solution est alors neutralis6e p a r KOH 6 M ; le perchlorate de potassium form6 est 61imin6 p a r c e n t r i f u g a t i o n ; les diff6rents dosages sont effectu6s sur le surnageant.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.
Dosage du para-nitrophdnol. E s t i m a t i o n directe en m i l i e u basique h 400 n m Nil.
Dosage du phosphate fibre. La m6thode de Chen et al [14] a 6t6 utilis6e. Dosage enzymatique. Le NAD a 6t6 dos6 selon la m6thode de Klingenberg [I5], I'ADP et I'AMP selon la m6thode de Adams [16] et I'ATP selon la m6thode de Lamp r e c h t et T:rantschold [17].
DHermination du poids moldcu[aire. Le poids mo16culaire a 0 6 estim6 p a r filtration sur colonne de Sephadex G 200 [6, 18].
RI~SULTATS EXP]~RIMENTAUX.
1. Purification de la phosphatase acide. Le t a m p o n utilis6 au cours de la purit~cation c o n t i e n t : t r i 6 t h a n o l a m i n e 100 mM, EDTA 10 mM, mercaprto6thanol 10 mM ; il est ajust6 h pH 7,0.
Etape 1 : 70 g de s6rum l u t o i d i q u e lyophilis6 sont dissous dans du t a m p o n /t 4°C. Le volume est ajust6 h 700 ml, puts compl6t6 p a r 14 ml d ' u n e solution de (NH4)2 SO 4 satur6e. Au m61ange refroidi dans u n b a i n glace-sel et agit6 6nergiquement, on ajoute 1,65 fois le volume i n i t i a l de m 6 t h a n o l h - - 3 0 ° C . La s u s p e n s i o n est centrifug6e p e n d a n t 10 m n h 10000 × g. Le s u r n a g e a n t est 6cart6, le pr6cipit6 est lyophilis6 puts mis en s u s p e n s i o n h l'aide d ' u n Potter dans e n v i r o n 350 ml d'eau. La s u s p e n s i o n .est centrifug6e h 0°C p e n d a n t 10 m n h 15 000 × g. Le pr6cipitfi est 6cart& Etape 2 : aux 350 ml du surnageant, on ajoute 6,1 ml de CI2Mn 1M, puts du (NH~) 2 SO4, jusqu'h 35 p. cent de saturation. La s u s p e n s i o n est centrifug6e h 0°C, 15 m n h 15 000 × g. Le pr6cipit6 est 6cart6, du (NH4)2 SO4 est ajout6 au s u r n a g e a n t jusqu'~ 57 p. cent de saturation. La s u s p e n s i o n est Iaiss6e en repos 30 mn, puts centrifug6e ~ 0°C, 15 m n h 15 000 × g. Le s u r n a g e a n t est 6cart6, le pr6cipit6 est dissous avec de l'.eau et le volume ajust6 de manibr.e "~ ohtenir 7,5 mg de prot6ines p a r millilitre. Etape 3 : la solution de prot6ines est t r a i t & avec 50 p. cent de son volmne par u n e s u s p e n s i o n de b e n t o n i t e dans de l'eau (36 m g / m l ) . Le m61ange est agit6 v i g o u r e u s e m e n t p e n d a n t 10 mn, puts centrifug$ ~ 0°C, p e n d a n t 15 inn ~ 15 000 × g, le pr6cipit6 est 6cart& Etape 4 : les prot6ines du s u r n a g e a n t sont pr6cipit6.es par a d d i t i o n de (NH)_~SO,~ jusqu'h 45 p.
1317
L a p h o s p h a t a s e acide d u l a t e x d'hdvda.
cent de saturation. La s u s p e n s i o n est centrifug6e /i 0°C, 15 ran, h 15 000 × g, le pr6eipit6 est 6cart6. Du (NH4)eSO 4 est dissous darts le s u r n a g e a n t jusqu'h 57 p. eent de saturation. La s u s p e n s i o n est laiss6e au repos 60 ran, puis centrifug6e h 0°C, 15 mn, h 15 000 × g ; le s u r n a g e a n t est 6cart6, le pr6cipit6 est dissous avec un m i n i m m n de volume de t a m p o n c o n t e n a n t 50 mM de G1Na ; la solution est dialys6e h 4°C contre ce t a m p o n p e n d a n t 15 heures. Etape 5 : les prot6ines du dialysat sont fix6es sur une colonne (2,5 × 40 cm) de DEAE Sephadex A 50, 6quilibr6 avec du t a m p o n de dialyse.
I
Froct ~ lon5r~cuper~es ~
~o
~] '.~-
==
lin6aire de 50 h 150 mM de C1Na. Les fractions les plus actives sont rassembl6es. Etape 8 : les prot6ines sont pr6cipit6es p a r addition de (NH4)~SO 4 jusqu'h 80 p. cent de saturation, le pH est stabilis6 h 7,0 p a r a d d i t i o n de HC1 2N. La s u s p e n s i o n est laiss6e au repos p e n d a n t 3 heures, puis centrifug6e 15 m n h 15 000 × g, 0°C. Le s u r n a g e a n t est 6cart6, le pr6cipit6 est dissous avec 400 ,d de t a m p o n c o n t e n a n t 200 mM de C1Na. La solution est filtr6e sur u n e colonne (1,5 × 90 cm) de Sephadex G 200 6quilibr6 puis ,$1u6 avec du t a m p o n de dissolution. Les 5 fractions les plus actives sont rassembl6es. Les prot6ines sont pr6cipit6es p a r a d d i t i o n de (NH4)eSO 4 jusqu'h 80 p. cent de saturation, le p H e s t stabilis6 h 7,0 par a d d i t i o n de HCI 2N. La s u s p e n s i o n est laiss6e au repos 12 heures, h 0°C, puis eentrifug6e, 15 m n h 15 000 × g. Le s u r n a g e a n t est 6cart6, le pr6cipit6 est dissous clans 3 ml d'eau.
Le tableau I r6sume l'ensemble des r6sultats obtenus. Les 61ectrophor6ses (fig. 2) r~alis6es avec
'~1(
0,10 ÷
50
100 150 VOLUME 200 13"ELUTI 250 ON{300 rnl)
0
Fz6. 1. - - Purification de la phosphatase acide par chromatographie sur gel de DEAE-Sephadex A-50.
Elles sont ensuite 61u6es avec u n gradient c o n t i n u et lin6aire de 50 h 200 mM de C1Na (fig. 1). Les fractions c o n t e n a n t l'activit6 e n z y m a t i q u e sont rassembl6es. Etape 6 : les prot6ines sont pr6cipit6es p a r addition de (NH4)eSO 4 jusqu'h 80 p. cent de saturation, le pH est stabilis6 h %0 p a r a d d i t i o n de HCI 2N. La s u s p e n s i o n est centrifug6e /~ 0°C, 15 m n h 15 000 × 9, apr6s u n repos de 3 heures. Le s u r n a g e a n t est 6cart6, le pr6cipit6 est dissous avec 500 ~1 de t a m p o n c o n t e n a n t 200 mM de CINa. La solution est filtr6e sur u n e colonne (1,5 × 90 cm) de Sephadex G 200 6quilibr6 p u i s 61u6 avec du t a m p o n compl6t6 avec 200 mM de C1Na. Les f r a c t i o n s les plus actives sont rassembl6es, puis dialys6es ~ 4°C p e n d a n t 15 heures, contre ce t a m p o n c o n t e n a n t 50 mM de G1Na. Etape 7 : les prot6ines du dialysat sont fix6es sur u n e c o l o n n e (1,0 × 10 cm) de DEAE Sephadex A 50, 6quilibr6 avec du t a m p o n de dialyse. Elles sont e n s u i t e 61u6es avec u n g r a d i e n t c o n t i n u et BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.
A
B
FI•. 2. - - Mise en ~oidence par dlectrophorbse sar gel de polyacr!llamide de la phosphatase acide purifide. (AI R6v61ation de l'activit6 enzyrnatique (substrat : tt naphtylphosphate). (B) R6v61ation des prot6ines (m6thode utilisant le naphtal6ne noir dix B).
la solution e n z y m a t i q u e purifi6e m o n t r e n t une seule b a n d e d'activit6 et u n e seule b a n d e de prot6ine c o r r e s p o n d a n t e , c o n f i r m a n t la puret6 de la phosphatase acide obtenue p a r eette m6thode.
J . - L . J a c o b a n d N. S o n t a g .
1318
TABLEAU I.
P u r i f i c a t i o n de la phosphatase acide du latex d ' H e v e a b r a s i l i e n s i s les di[[~rentes ~tapes de l'op~ration. Prot6ineSmg
~tapes
Non trait6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. M6thanol V X 1,65 . . . . . . . . . . . . . . 2.
(NH4),,SO,
3. 4. 5. 6. 7. 8.
Bentonitei'.... ................... (NH 4) .,SO 4 45 Yoo - 65 % . . . . . . . . . . DEAE Sephadex A 50 . . . . . . . . . . . . . Sephadex G 200 . . . . . . . . . . . . . . . . . . D E A E Sephadex A 50 . . . . . . . . . . . . . Sephadex G 200 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35 % - 5 7
% ..........
50 120 7 625 3 575 667 439
Activit~ to~le
Activit6 r6cup6r6e p. cent
Purilication
87 62 43 31 14 9
5,7 8,7 32,4 36,1 239,3 470,9 589,7 627,2
16 14 10 I 7 I 5
29,51 9,9 7,2 3,2
2. ETUDE DE QUELQUESPROPRII~TI~SDE LA PHOSPHATASEACIDE.
492 371 237 125 225 ~ 325 1 551 1 398 65g
:
Activit6 sp6cifique U/mg 0,329 1,884 2,863 10,682 11,892 78,730 155,400 194,160 205,700
LOG V
Stabilit~ de l'enzyme. La phosphatase acide purifi6e, dissoute dans de l ' e a u e t c o n s e r v 6 e h 4°C, n e p r 6 s e n t e p a s d e p e r t e d ' a c t i v i t 6 a p r b s 3 m o i s d.e s t o c k a g e . L e c h a u f f a g e 31
32
33
34
TABLEAU II.
T
Stabilit6 thermique de la phosphatase acide. Temp6rature °C
Vitesse (Unit6s arbitrairesl
Inactivation %
30 39 51 60 69 78 88 94
0,57 0,57 0,57 o ,57
0 0 0 0
35 10 -4
36
Fro. 3. - - Log de la vitesse e n fonction de l'inoerse de la lemp6ratnre absolue (T) pour d~lerminer l'6nergie d'actioation. 1,9
U ,53
11
0,18 0,03 0,03
70 95 95
Ve/Vo 1,8
~me
C
1,7 1,E 1,5
~-
No[ate
d~shydrog~nose
\ 3,4
Les solutions e n z y m a t i q u e s sont plongdes dans u n b a i n - m a r i e , h la t e m p 6 r a t u r e indiqu6e, p e n d a n t 3 minutes, puis refroidies d a n s la glace a v a n t dosage de l'activit6 p a r i n c u b a t i o n h 28°C.
-Phosphotose
1,3
~ ~ - Aldotose
d~shydrog~nase
d~shydrog~nese 1,; 1,1
Energie d' activation. D e s i n c u b a t i o n s o n t 6t6 e f f e c t u b e s h d i f f 6 r e n t e s t e m p 6 r a t u r e s e n t r e 1,5 e t 5 0 ° C ; les v i t e s s e s c o r r e s pondantes nous ont permis de d6terminer une 6 n e r g i e d ' a c . t i v ~ t i o n d.e 12,26 K c a t mot-~ (fig. 3).
Poids moldculaire. Sa v a l e u r a 6t6 e s t i m 6 e e n t r e 90 000 et I 0 0 000, p a r f l t r a t i o n s u r gel d e S e p h a d e x G 200 (fig. 4).
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.
dextran
1
pendant 3 mn ne p rovoque pas d'inactivation jusqu'h 60°C (tableau H).
1 lo 4
~1os
1.1o6 POIDS
~
[40L ECULAIRE
FIe. 4. - - Ddtermination du poids mol6culaire de la hosphatase acide par [illration sur gel de Sephadex 200.
Analgse des produits de la r6action. Le para-nitroph6nylphosphate hydrolys6 lib~re d u p a r a n i t r o p h ~ n o l ,et d u p h o s p h a t e e n q u a n t i t ~ 6 q u i v a l e n t e ; n o u s a v o n s 6 g a l e m e n t v6rifi~ l a sto6c h i o m 6 t r i e d e la r 6 a c t i o n a v e e le N A D ~ ( t a b l e a u
1319
L a p h o s p h a t a s e acide d u l a t e x d'h~vda.
I I I ) ; les r6sultats obtenus p r 6 s e n t e n t une b o n n e c o n c o r d a n c e . I1 faut r e m a r q u e r que, daBs ces conditions d'exp6r~ence off la quantit6 de p r o d u i t s form6s est tr6s faible p a r r a p p o r t h la c o n c e n t r a tion de substrat, la vitesse es.t lin6aire en f o n c t i o n du temps.
p h o 6 n o l p y r u v a t e est p a r t i c u l i b r e m e n t bien utilis6. Le NADP, dont l ' h y d r o l y s e en NAD est souvent le fait de phosphatases basiques [193, peut 6tre consid6r6 comme u n substrat assez r6actif de cette phosph.atase acide. Le coenzyme A lui-m6me est attaqu6, ce qui peut avoir, daBs certaines condi-
TABLEAU III. Influence du temps d'incnbation sur la formation des produits d'hydrolyse du para-nitrophdnylphosphate et du NADP.
Substrats Dur6e de la r6daction mn
PNPP : 3 mM
NADP : 3 mM
PNP form6
Pi form6
mM
mM
NAD [orm~ mM
Pi form6 mM
6
0,160
0,154
0,065
0,059
12 18
0,335 0,485
0,301 0,459
0,131 0,179
0,114 0,187
Incubation en tampon ac6tate 0,2 M pH 5,5. I n f l u e n c e du pH.
C.ett.e phosphatase pr6sente u n m a x i m u m d'activit6 & pH 5,5 (fig. 5) : elle est donc de type aeide.
i Tampon
Tampon
tions, u n e grande i m p o r t a n c e dans la synth6se du caoutchouc [20]. Affinit~ pour diff~rents substrats. Les valeurs du K m de la phosphatase acide ~t pH 5,5 : p o u r le p a r a - n i t r o p h 6 n y l p h o s p h a t e 0,11 mM .(fig. 6), I'ATP 0,13 mM et le N,ADP 0,20 raM, n e sont pas tr6s diff6rentes ; p a r contre, le Km du p a r a - n i t r o p h 6 n y l p h o s p h a t e h pH 7,0 att.eint une valeur de 1 mM. cn 6
+ O,25mM
de
/ Pyrophosphote z ~3
Q]
2
/A de sodium /
5
/
,
•~ l
e
3
~
4
/+ /
•
5
6
7
pH
/~ //
2
8
0,25 mM dedePhosphote sodium
oin
Fro. 5. - - Actit~itd de la phosphatase acide en fonction du pH. -5
Sp~eificitd de £enz!tme.
La phosphatase acide lib6re le phosphate d ' u n e grande vari6t6 d'esters monophosphoriques (tableau IV), mats ne pr6sente pas d'activit6 diesterase. L'ATP est attaqu6 plus r a p i d e m e n t que I'ADP et I'AMP et, d ' u n e m a n i 6 r e @n6rale, les nucl6otides m o n o p h o s p h a t e s sont plus f a i b l e m e n t hydrolys6s que les di ou triphosphates. Le phosBIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.
5
,/[P.PP] C,/n~.I
Fro. 6. - - Activitd de la phosphatase acide en [auction de la concentration en para-nitrophdnylphosphate, en prdsence ou non de pyrophosphate on de phospbate de sodium. Influence de quelques effecteurs sur l'activit~ phosphatasique. Le phosphate et le p y r o p h o s p h a t e sont des i n h i biteurs comp6titifs (fig. 6).
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J.-L. Jacob a n d N. Sontag.
C o m m e l es p h o s p h a t a s e s e n g 6 n 6 r a l [21], l ' e n z y m e 6 t u d i b e est t r b s i n h i b 6 e p a r d e f a i b l e s c o n c e n . t r a t i o n s d e t u n g s t a t e o u d e m o l y b d a t e ( t a b l e a u V). L e m e r c u r e , le f l u o r u r e e t l ' a r s e n i a t e d e s o d i u m , le c u i v r e et le z i n c , s o n t 6 g a l e m e n t i n h i b i t e u r s . P a r c o n t r e , le s o d i u m , le p o t a s s i u m , le c a l c i u m et le m a g n 6 s i u m , r e s t e n t s a n s e i f e t s u r le f o n c t i o n n e m e n t d e l ' e n z y m e , d e m 6 m e q u e le t a r : r a t e et le
citrate de s o d i u m , ac6tamide.
le 2 - 4 , d i n i t r o p h 6 n o l
et l ' i o d o -
Cas particulier de l'hydrolyse de I'ATP en prdsence de magnesium. En 6tudiant l'influence du magn6sium, nous avons remarqu6 qu'en pr6sence d u c a t i o n , la vitesse d ' h y d r o l y s e de I ' A T P 6tait p l u s faible que
TABLEAU IV.
Vitesse d'hydrolyse relative par la phosphatase acide de diff~rents substrats. Substrats 3 mM Para-nitrophdnylphosphate ............... Fruetose-t,6-diphosphate ................. Fructose-6-phosphate .................... Glueose-6-phosphate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 phosphogluconate ..................... Ribose-5-phosphate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Erythrose-4-phosphate .................... Acide 2-phosphogiyc6rique . . . . . . . . . . . . . . . Acide 3-phosphoglyc~rique . . . . . . . . . . . . . . . Phospho~nolpyruvat e ................... DL glye6rald6hyde p h o s p h a t e . . . . . . . . . . . . 3-glye6rophosphat e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aeide 2,3-diphosphoglycdriqu e . . . . . . . . . . . . Aeide phosphoglyeolique . . . . . . . . . . . . . . . . . Phosphos6rine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Thiamine pyrophosphate . . . . . . . . . . . . . . . . . Uridine diphosphoglucose . . . . . . . . . . . . . . . . P y r i d o x a l - 5 ' - m o n o p h o s p h ate . . . . . . . . . . . . . Bis-para-nitrophdnylphosphate ...........
:
Vilesse relative
Substrals 3 mM
Vitesse relative
100 12 2 5 27 10,5 o 27 38 81 15,5 11,5 25 8,5 15,5 0 0 19 0
Ad6nosine-2'-monophosphate ............. Ad~nosine-3'-monophosphate ............. A d 6 n o s i n e - 5 ' - m o n o p h o s p h a te . . . . . . . . . . . . . Addnosine-5'-diphosphate . . . . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-5'triphosphate . . . . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-2', 5 ' - d i p h o s p h a t e . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-3', 5 ' - d i p h o s p h a t e . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-3', 5 ' - m o n o p h o s p h a t e . . . . . . . . . . Nicotinamide ad6nine dinuch!otide p h o s p h a t e Nicotinamide ad6nine dinuel~!otide phosp h a t e r6duit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Coenzyme A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Guanosine-3'-monophosphate............. Guanosine-5'-monophosphate ............. Guanosine-2', 5 ' - d i p h o s p h a t e . . . . . . . . . . . . . Guanosine-3', 5 ' - d i p h o s p h a t e . . . . . . . . . . . . . Gu anosine_5'-triphosphate . . . . . . . . . . . . . . . . Cytidine-3'-monophosphate . . . . . . . . . . . . . . . Uridine-5'-monophosphate ............... U r i d i n e - 5 ' - t r i p h o s p h at e . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 7 7 15,5 42 19 14 0 39 18 40 4 0 17 21 46 18,5 2 20
Les i n c u b a t i o n s s o n t r~alis~es h 28°C, en t a m p o n ac6tate 0,2 M, h pH 5,5. TABLEAU V.
Influence de quelqnes effecteurs sur le fonctionnement de la phosphatase acide. Para-nitroph6nylphos phate mM 0,14 h 20 0,14 h 20
lnhibiteurs
Pyrophosphate sodium . . . . . . . . Phosphate sodium . . . . . . . . . . . .
Coneen tration de l'inhibileur
Ki fi pH 5,5
Type de l'inhibltion
2 , 5 10 -4 M 2 , 5 10 -4 M
6 , 9 10 -'~ M 1 , 8 10 -~ M
Comp~!titive Comp6titive
2O 2O 20 2O 2O 2O 20
W 6~ ( T u n g s t a t e de s o d i u m ) . . . . Mo ~+ (Molybdate d ' a m m o n i u m ) . H g ~+ (Chlorure m e r c u r i q d e ) . . . . Cu ~÷ (Sulfate de cuivre) . . . . . . . Zn ~-+ (Chlorure de zinc) . . . . . . . F l u o r u r e de s o d i u m . . . . . . . . . . . Ars6niate de s o d i u m . . . . . . . . . .
0hi 0 h 7 • fi 1 0hl 0 h3 0 h 5 0 h 1
2O 2O 2O 20 20 2O
Ca ~+ (Chlorure de calcium) . . . . . Mg ~ (Chlorure de m a g n e s i u m ) . . Citrate de s o d i u m . , . . . . . . . . . . . T a r t r a t e de s o d i u m . . . . . . . . . . . Dinitro-2,4-phdnol ............ Iodoac6tamide . . . . . . . . . . . . . . . .
0h3 10-aM 0hl 10-~M 0 h 5 10-u M 0 h 5 10-~ M 0hl 10-~M 0hl 10-~M
10-6M 10 -7 M 10 -4 M 10-:~ M 10-3 M 10 -~ M 10 -'2 M
1,8 2,1 9,0 4,5 6,2 4,0 1,0
10 -7 10-7 10 -6 10 -~ 10 -4 10 -~ 10 -3
M M M M M M M Sans Sans Sans Sans Sans Sans
Non Non Non Non Non Non Non influence influence influence influence influence influence
Les i n c u b a t i o n s o n t 6t6 r6alis6es h 28°C en p r 6 s e n c e de 0,2 M de t a m p o n acdtate h p H 5,5. BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.
eomp6titive comp6titive eompdtitive compdtilive eomp6titive comp6titive comp6titive
L a p h o s p h a t a s e acide d u l a t e x d'hdvda. celle du t6moin sans m a g n 6 s i u m (tableau VI). Le p h 6 n o m b n e ne se p r o d u i t ni avec 1.e p a r a n i t r o p h 6 TABLEAU VI.
Influence de la concentration du magnesium sur la vitesse d'hydrolyse de r A T P . Substrat
ATP 0,5 mM
Maga6sium mM
Vitesse A D0/t0 mn
Inhibition p. cent
0,168 0,144 0,085 0,020
14,3 49,5 88,1
0 0,1 1 10
Irmubation h 28°C en pr6sence de 0,2 M de tampon ae6tate h pH 5,5.
n y l p h o s p h at e, ni avec le NADP. La cause exacte de cette action est c e r t a i n e m e n t tr~s complexe. Nous pouvons, c e p e n d a n t i n d i q u e r que le m a g n 6 si u m sembl.e, dans ce cas, se c o m p o r t e r c o m m e un inhiTABLEAU VII.
Influence de 1 mM de magnesium sur la vilesse d'hydrolyse de I'ATP. Vitesse ATP mM
0,2 0,5
1,0
T6moin A DO/t0 mn
+ t raM Mg
0,125 0,190 0,240
0,042 0,100 o,150
Inhibition p. cent
A DO/t0 mn 66,4
47,4 37,5
Incubation h 28°C en tampon acetate 0,2 M h pH 5,5.
b i l e u r comp6titif (tableau VII) ; cette influence peut 6tre due h une c a r e n c e en ATP p r o v e n a n t de la f o r m a t i o n du chelat ATP-Mg, lui-m6me, moths bien utilis6 que I'ATP. DISCUSSION. La p u r t ~ c a t i o n c o m p l e t e 4e la p h o s p h a t a s e acide n6cessite un n o m b r e i m p o r t a n t d'6tapes que seuls une enzyme p.eu labite p o u v a i t p e r m e t t r e . La sp6cificit6 de ce t y p e d ' e n z y m e est trbs v a r i a b l e [22~ et assez v a s t e ; elle diff~re b e a u c o u p selon la source dont p r o v i e n t l'hydrolase, m6me au sein du r6gne v6g6tal [23, 2~, 25, 26]. La p h o s p h a tase acide l u t o i d i q u e utilise p a r t i c u l i ~ r e m e n t bien le p h o s p h o 6 n o l p y r u v a t e . I1 faut r e m a r q u e r qu'elle n'a aucune activit6 diest6rase associ6e, c o n t r a i r e -
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m e n t ~ cer t ai n es h y d r o l a s e s vdg6t.ales [24, 25]. Co m m e la 3-phospho-glyc6rate p h o s p h a t a s e des feuilles de cannes h sucre [25], l'.enzyme du latex h y d r o l y s e un c e r t a i n n o m b r e de nuc16otides, mats m o i n s efficacement que la p h o s p h a t a s e acide de feuilles de pots [26]. De m6me que la p l u p a r t des enzymes de ce groupe, elle ne n6cessite pas de cations a c t i v a t e u r s et est inhib6e f o r t e m e n t p a r de faibles doses de tungstate et de m o l y b d a t e [21]. L ' i n f l u e n c e du magn6sium sur l ' h y d r o l y s e de I'ATP p ar la p h o s p h a t a s e a c i d e n'a 6t6 m e n t i o n n 6 e que r a r e m e n t ; il est possible q u e c e p h 6 n o m 6 n e qui fair i n t e r v e n i r le r a p p o r t de c o n c e n t r a t i o n A T P / M g soit p ar f o i s pass6 inaper~u ; toutefois, c e r t a i n s auteurs notent un.e i n h i b i t i o n en pr6sence de ce cation [27, 28], qui, p a r contre, n'a e f f e c t i v e m e n t aucun effet sur l'enzyrne de la feuille de pots l o r sq u 'el l e utilise I'ATP [26]. I] est trbs i m p o r t a n t de r e p l a c e r cette e n z y m e drans son cad r e biologique ; sa localisation est i n t r a p a r t i c u l a i r e , mats le c y t o p l a s m e en c o n t i e n t t o u j o u r s un peu du fait, n o t a m m e n t , des stress cons6cutifs h la saign6e de l'arrbre ]ors de la r6colte du latex [29]. Darts ce cas, la p h o s p h a t a s e aci d e a une influence n6faste p u i s q u ' e l l e tend h c a r e n c e r le mili.eu en mol6cul.es i n d i s p e n s a b l e s ~ la synthbse du c a o u t c h o u c ( o h o s p h o 6 n o l p y r u v a t e , c o e n z y m e A, NADP...). Cependant, un cer t ai n h o m b r e de facteurs sont capables de f r e i n e r son activit6 ; si le s6rum i n t r a p a r t i c u l a i r e a u n pH p r o c h e de l'optim u m de f o n c t i o n n e m e n t de la p h o s p h a t a s e acide [29, 30], celui du s6rum c y t o p l a s m i q u e , voisin de la neutralit6 [29, 30], e n t r a l n e r a une d i m i n u t i o n de l'activit6, mats aussi de l'affinit6 enzymatique. D ' a u t r e part, le phosphate, dont la c o n c e n t r a t i o n est de l ' o r d r e de 10 mM darts le s@um cyto~lasm i q u e [31], est un i n h i b i t e u r efficace, c o m p t e tenu de la faible c o n c e n t r a t i o n des p r o d n i t s p h o s p h o ryl6s susceDtibles d'6tre h y d r o l y s 6 s F32]. L'A TP est, p a r ailleurs, prot6g6 p a r ]e magn6sium, dont la c o n c e n t r a t i o n est d ' e n v i r o n 10 mM I32]. Cette protection semble p a r t i c u l i b r e m e n t efficace, p u i sq u e l'on r e t r o u v e toujours ce c o f a c t e u r dans le s6rum c y t o p l a s m i q u e du latex [32], alors oue la p l u p a r t du temps des p r o d u i t s tels que le NA,DP ou 1,e coenzyme A sont trbs difficileme~t d6celables.
Remerciements. Nous tenons h remercier Mademoiselle B. Velasquez, dont la collaboration technique au cours de ce travail nous a ~t~ d'un grand secours. R~SUM~. La phosphatase aeide (EC 3.I.3.2) contenue dans le s~rum lutoidique du latex d'Hevea brasiliensis a ~t~
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eomplbtement purifi6e. Elle est pcu labile. Son poids mol6culairc a ~t~ estim6 entre 90 000 et 100 000. Cette p h o s p h a t a s e qui h y d r o l y s e u n i q u e m e n t tes p h o s p h o m o n o e s t e r s h des vitesses variables, utilise particuliSrement bieu le p a r a - n i t r o p h d n y l p h o s p h a t e et ]e phospho4nolpyruvate. Son pH o p t i m u m de f o n c t i o n n e m e n t est sitn6 aux environs de pH 5,5 ; le K m pour le para-nitro.ph6nylphosphate h cc pH est de 0,11 raM, mais atteint 1 mM h pH 7,0. Les ions Ca2+, Na ÷, K ÷, le t a r t r a t e de sodium, le 2,4-dinitroph~nol, l'iodoac~tamide et le citrate de sod i u m sont sans i n f u e n c e sur la rdaction e n z y m a t i q u e ; le p h o s p h a t e inorganique, h des concentrations physiologiques, et le p y r o p h o s p h a t e sont des i n h i b i t e u r s eomp~titifs ; le tungstate, le molybdate, le mercure, le cuiw-e, le zinc, l'ars6niate et le fluo.rure de sodium, sont des i n h i b i t e u r s ineomp4titifs. La valeur du Ki de ces effeeteurs a 6t~ mesur6e. Le magnesium, qui n'est pas n6cessaire au f o n c t i o n n e m e n t de l ' e n z y m e et reste sans effet sur l ' u t i l i s a t i o n du para-Bitroph6nylphosphate ou du NADP, se comporte comme un i n h i b i t e u r de l ' h y d r o l y s e de I'ATP. Cette protection de I'ATP semble efficace, puisque l'on retrouve t o u j o u r s ce cofacteur dans le s6rum cytoplasmique du latex malgr6 la presence constante d'ufle quantit~ plus ou moins i m p o r t a n t e de p ~ o s p h a t a s e acide lutoidique. BIBLIOGRAPHIE. 1. Archer, B. L., Audley, B. G., Cockbain, E. G. ,~ Mc Swenney, B. P. (1963) Biochem. J., 89, 565-574. 2. Pujarniscle, S. & Ribaillicr, D. (1966) Rev. Gdn. Caout., 43, 226-228. 3. Ribaillier, D. (1968) Rev. G~n. Caout., 45, 13951398. 4. Jacoh, J. L., Ribaillier, D. & d'Auzac, J. (1970) P h y siol. Vdg., 8, 247-262. 5. Jacob, J. L. (1969) C. R. Hebd. Sdances Acad. Sci. Set. D (Paris), 269, 1573-1576. 6. Jacob) J. L. ,& Sontag, N. (1973) Eur. J. Biochem., 40, 207-214. 7. Ribaillier, D., Jacob, J. L. ~ d'Auzac, J. (1971) P h y siol. Vdg., 9, 423-437. 8. Pujarniscle, S. (1968) Physiol. Vdg., 6, 27-46. 9. P h a r m a c i a Fine Chemicals (1966) Sepbadex, Thdorie et pratique de la f i l t r a t i o n sur gel, pp. 1-56, Beckman Hanson A B / E k l u n d s ~ Vasatryek, Uppsala. 10. P h a r m a c i a Fine Chemicals (1970) Echangeurs d'ions S e p h a d e x : Manuel de travail pour la chromatographie d'dchangeurs d'ions, pp. 1-47, Uppsala.
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