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Quelques données sur la composition chimique des parois de Candida utilis
797
PRELIMINARY NOTES
tive action of sulfhydryl compounds such as cysteine and glutathione on the autoxidation of ascorbic acid is well known 3. A simple lowering by ascorbic acid of the oxidation-reduction potential of the medium enough to initiate growth appears unlikely due to the inability of cysteine to replace ascorbic acid. The greater than catalytic amounts of ascorbic acid required and the activity of the d-isomer rules out a growth-factor effect. The significance of the present findings with respect to the induction of hepatomas in the rat by the feeding of azo-dye carcinogens is uncertain. However, DAB and other carcinogens are known to increase the ascorbic acid level in the liver of rats 4. Furthermore, rats deficient in riboflavin have a reduced content of ascorbic acid in the tissues 5, and the induction of hepatomas by DAB is favored in riboflavin-deficient rats e. Also, it should be noted that certain carcinogenic hydrocarbons are potent in stimulating ascorbic acid biosynthesis as well as inducing the synthesis of several liver-microsomal enzymes (e.g., azo-dye demethylase) which metabolize foreign compounds 7 implying that vitamin-C deficiency may decrease the activity of such enzymes. This investigation was supported in part by Public Health Service Research Grant C-2869 from the National Cancer Institute to Dr. D. A. SALZBERGand in part by the Max Fleishmann Fund of the Palo Alto Medical Research Foundation. The technical assistance of Mrs. D. LIEBES is gratefully acknowledged. Palo Allo Medical Research Foundation,
DOLORES BOBB
Palo Alto, Calif. (U.S.A.) D. BOBB, D. LIEBES AND D. A. SALZBERG,J. Bacteriol., 84 (1962) 242. z H. J. VOGEL, Microbial Genet. Bull., 13 (z956) 42. s W. E. KNOX, in P. D. BOYER, H. LARDY AND K. MYRBACK, The Enzymes, Vol. 2, A c a d e m i c Press, N e w York, 196o, p. 253. 4 j . p. GREENSTEIN, Biochemistry of Cancer, 2nd edition, A c a d e m i c Press, N e w York, 1954, P. 335. 5 B. SURE, R. M. THEIS AND R. T. HARRELSON', J. Biol. Chem., 129 (1939) 245. 6 C. J. KENSLEI~, K. SUGIURA, N. F. YOUNG, C. R. HALTER AND C. P. RHOADS, Science, 93 (1941) 3o8. 7 A. S . CONNEY, G. A. BRAY, C. EVANS AND J. J. BURNS, Ann. N . Y . Acad. Sci., 92 (1961) 115. z
Received July 29th, 1963 Biochim. Biophys. Acta, 78 (1963) 795-797
PN
1317
Quelques donn~es sur la composition chimique des parois de Candida utilis Des 6tudes r6centes z ont permis d'obtenir des protoplastes de Candida utilis en faisant agir sur ces levures un syst~me enzymatique, appel6 "strepzyme" lib6r6 dans le milieu de culture par le Streptomyces GM, en phase avanc6e de croissance. Le pr6sent travail a pour but de connattre la composition chimique des parois de Candida utilis, premier pas dans la d~termination de l'activit6 enzymatique de ces streptomyces. Biochim. Biophys. Acta, 78 (1963) 797-799
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PRELIMINARY NOTES
On utilise pour la rupture des cellules de levure l'appareil de MICKLE dans les conditions d6jit publi6es pr6c6demment z. Les parois sont purifi6es par centrifugations diff6rentielles (saccharose 60 % ; saccharose IO % ; NaG1 1 % ; H 2 0 distilld). Une modification p e r m e t t a n t d'obtenir des parois libres de tout mat6riel cytoplasmique, est apport6e it la m6thode primitive: apr6s rupture et lavages des parois, celles-ci sont soumises une nouvelle fois, mais seulement pendant un temps tr+s court, it l'action des Ballotini; les lavages sont ensuite effectu6s c o m m e pr6c~demnment. Ruptures et purifications sont suivies tout au cours des op6rations par des observations au microscope de phase. Azote total. Un 6chantillon de parois, s6ch6 sous vide it 56°, est utilis6 pour la d6termination de N (dosage de Microkjeldahl). L'azote total trouv6 est de 1. 4 %. Acides aminds. Environ IO ing (poids sec) de parois sont soumis it une hydrolyse de 18 h it i i o ° avec 6 N HC1. L ' h y d r o l y s a t amend ~ sec servira pour les diff6rentes analyses. La composition qualitative en acides amin6s a 6t6 6tablie p a r chromatographie bidimensionnelle sur papier W h a t m a n No. I, d ' a b o r d dans le solvant p h 6 n o l - e a u (8o:2o, v/v) en pr6sence de cyanure de potassium et d'ammoniac, ensuite dans le solvant n - b u t a n o l - a c i d e f o r m i q u e - e a u (75:15:1o, v/v). On rdv61e le chromatog r a m m e avec une solution de ninhydrine & 0.2 % (w/v) dans l'ac6tone. La proline, la m6thionine, l'arginine, l'histidine et la tyrosine sont r6v616es par leurs r6actifs sp6cifiques 3~. Une ionophor~se sur papier it p H 2.25 et sous 75 ° V, permet de caract6riser l'acide 7-aminobutyrique 7. La cystine et la cyst6ine sont recherch6es apr6s oxydation sous forme d'acide cystdique. La composition semiquantitative en acides amin6s a 6t~ dtablie par chromatographies monodimensionnelles sur papier dans diff6rents solvants, en prdsence d'acides amin6s t6Inoins en quantit~s croissantes (gamme POLSON) 9, 9. On a pu ainsi d6terminer la composition suivante en acides amines*: Gly(2 ), Ala(3_4) , Thr(2), Val~2), Leu-Ileu(2), Phe~l), Asp(2) , Glul4), Lys(1), Argll), acide 7-aminobutyrique¢3/, CySO3H~x). La tyrosine, la s~rine et l'histidine sont pr6sents dans les parois en faible quantit6. Sucres rdducteurs. Les sucres r6ducteurs totaux ont 6td dos6s sur les parois non hydrolysdes par la mdthode it l'anthrone de CHUNG ET NICKERSON 1°. Les sucres rdducteurs repr6sentent les 7 6 % du poids sec des parois. L'6tude qualitative des sucres est effectu6e apr~s une hydrolyse de 6 h /~ IiO ° avec I N HC1. On chromatographie l'hydrolysat sur du papier W h a t m a n No. I t a m p o n n 6 it p H 5, dans le solvant b u t a n o l - a c 6 t o n e - e a u (4:5:1, v/v). On r6v+le le chromatogramrne avec le rdactif des sucres au phtalate d'aniline n. On a pu ainsi d6terminer la pr6sence de glucose et de mannose dans les proportions relatives de 3 it 2. Sucres aminds. Les sucres amines ont ~t~ doses globalement par la m~thode de MORGAN ET ELSON modifi6e par RONDLE ET MORGAN12 apr~s une hydrolyse de 4 h it i i 0 ° avec 2 N HC1. Les sucres alnin6s repr~sentent environ i o/ /o du poids sec des parois (en supposant * Les chiffres entre parentheses repr6sentent les quantit6s relatives de chaque acide amin6.
Biochim. Biophys. Ac/a, 78 (1963) 797-799
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que les sucres amines presents dans les parois de la levure donnent pour une certaine quantit6 de substance, des colorations 6gales £ une m~me quantit6 de glucosamine). L'6tude qualitative des sucres amin6s est effectu6e apr6s une hydrolyse de 4 h /~ IiO ° avec 2 N HC1. On chromatographie l'hydrolysat sur papier W h a t m a n No. I dans le solvant (a) n - b u t a n o l - a c i d e f o r m i q u e - e a u (75 : 15 : IO, v/v) ou d~ns le solvant (b) n - b u t a n o l - p y r i d i n e - o . I N HC1 (50:30: 20, v/v) 13. On r6v61e le c h r o m a t o g r a m m e avec le r~actif d'ELsoN El" MORGAN au p-dim~thylbenzald~hyde 14. La mobilit6 des sucres amines est 6tudi~e par ionophor~se sur papier W h a t m a n No. I A p H 6. 5 sous 75oV en pr6sence de t6moins arginine-glucose-CySO3H (I ; o; - - I). L'~tude qualitative r6vfile la presence d'une faible quantit6 de glucosamine; en chromatographiant un hydrolysat de 6 h, 6 N HC1, on obtient une quantit~ nettement plus importante de ce sucre amin6, ce qui fait penser que la glucosamine pourrait se trouver dans les parois sous forme de chitine. Un autre sucre amin6, non encore d6termin6, a dt6 d~tectd par chromatographie des diff6rents hydrolysats. On a pu calculer son RF par rapport ~t la glucosamine dans les solvants (a) et (b); ils sont respectivement de 1.6 et de 1. 5. Par ionophor~se sur papier on obtient avee le r~actif d'ELsoN El" MORGAN une tfiche faible rose-mauve migrant 16g~rement vers la cathode. Phosphore. Le phosphore total est d~termin~ par la m6thode colorim6trique de FISKE ET SUBBAROwis d6crite par UMBREIT et al. TM apr~s digestion des parois avec H2SO 4. On obtient pour le phosphore total une valeur de o.15 %. Ces premieres ~tudes nous ont permis d'obtenir quelques donn6es sur la composition des parois de Candida utilis: on peut noter en particulier la tr~s grande proportion de sucres r~ducteurs et la forte representation des acides amines acides face aux acides amin6s basiques; de plus on a pu mettre en 6vidence la pr6sence d ' u n acide anain~ peu courant dans les parois des levures: l'acide y-aminobutyrique. I1 serait int~ressant ultdrieurement de caract~riser la nature du sucre amind que nous avons d~tect~ et d'~tudier les lipides de la parois.
Instituto Jaime Ferrdn de Microbiologia, Madrid (Spain)
M. NOVAES J. R. VILLANUEVA
1 C. GARCIA MENDOZA ET J. R. VILLANUEVA, Nature, 196 (1962) 1326. 2 C. GARCIA MENDOZA ET J. R. VILLANUEVA, Can. J. Microbiol., 9 (1962) 142. 3 R. ACHER ETC. CROCKER, Biochim. Biophys. Acta, 9 (1952) 7o4 • 4 R. ACHER, C. FROMAGEOT ET M. JuTIsz, Biochim. Biophys. Aeta, 5 (195 o) 81. 5 F. SANGER ET H. TUPP,', Biochem. J., 62 (1952) 8. e G. TOENNIES ET J. J. KOLB, Anal. Chem., 23 (1951) 823. 7 j. K. VISAKORPI ETA. L. PURANEN, Scand. J. Clin. Lab. Invest., IO (1958) 196. 8 E. F. MCFARREN, Anal. Chem., 23 (1951) 168. 9 A. POLSON, V. H, MOSLEY ET R. W. G. WYCKOFF, Science, lO5 (1957) 603. 10 C. W. CHUNG ET W. J. NICKERSON, J. Biol. Chem., 2o8 (1954) 395. 11 S. M. PARTRIDGE, Nature, lO 4 (1949) 44312 C. M. J. RONDLE ET W. I. J. MORGAN', Biochem. J., 61 (1955) 586. 13 R. BOURRILLON ET J. MICHON, Bull. Soc. Chim. Biol., 41 (1959) 267. 14 S. M. PARTRIDGE, Biochem. J., 42 (1948) 238. 15 C. H. FISKE ET Y. SUBBAROw, J. Biol. Chem., 66 (1925) 735. 16 W. W. UMBREIT, R. H. BURRIS ET F. F. STAUFFER, Manometric Techniques, Burgess Publishing Co., Minneapolis, 3rd ed., 1957, p. 272.
Re~u le 2 aofit, 1963 Biochim. Biophys. Acta, 78 (I963) 797-799
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tive action of sulfhydryl compounds such as cysteine and glutathione on the autoxidation of ascorbic acid is well known 3. A simple lowering by ascorbic acid of the oxidation-reduction potential of the medium enough to initiate growth appears unlikely due to the inability of cysteine to replace ascorbic acid. The greater than catalytic amounts of ascorbic acid required and the activity of the d-isomer rules out a growth-factor effect. The significance of the present findings with respect to the induction of hepatomas in the rat by the feeding of azo-dye carcinogens is uncertain. However, DAB and other carcinogens are known to increase the ascorbic acid level in the liver of rats 4. Furthermore, rats deficient in riboflavin have a reduced content of ascorbic acid in the tissues 5, and the induction of hepatomas by DAB is favored in riboflavin-deficient rats e. Also, it should be noted that certain carcinogenic hydrocarbons are potent in stimulating ascorbic acid biosynthesis as well as inducing the synthesis of several liver-microsomal enzymes (e.g., azo-dye demethylase) which metabolize foreign compounds 7 implying that vitamin-C deficiency may decrease the activity of such enzymes. This investigation was supported in part by Public Health Service Research Grant C-2869 from the National Cancer Institute to Dr. D. A. SALZBERGand in part by the Max Fleishmann Fund of the Palo Alto Medical Research Foundation. The technical assistance of Mrs. D. LIEBES is gratefully acknowledged. Palo Allo Medical Research Foundation,
DOLORES BOBB
Palo Alto, Calif. (U.S.A.) D. BOBB, D. LIEBES AND D. A. SALZBERG,J. Bacteriol., 84 (1962) 242. z H. J. VOGEL, Microbial Genet. Bull., 13 (z956) 42. s W. E. KNOX, in P. D. BOYER, H. LARDY AND K. MYRBACK, The Enzymes, Vol. 2, A c a d e m i c Press, N e w York, 196o, p. 253. 4 j . p. GREENSTEIN, Biochemistry of Cancer, 2nd edition, A c a d e m i c Press, N e w York, 1954, P. 335. 5 B. SURE, R. M. THEIS AND R. T. HARRELSON', J. Biol. Chem., 129 (1939) 245. 6 C. J. KENSLEI~, K. SUGIURA, N. F. YOUNG, C. R. HALTER AND C. P. RHOADS, Science, 93 (1941) 3o8. 7 A. S . CONNEY, G. A. BRAY, C. EVANS AND J. J. BURNS, Ann. N . Y . Acad. Sci., 92 (1961) 115. z
Received July 29th, 1963 Biochim. Biophys. Acta, 78 (1963) 795-797
PN
1317
Quelques donn~es sur la composition chimique des parois de Candida utilis Des 6tudes r6centes z ont permis d'obtenir des protoplastes de Candida utilis en faisant agir sur ces levures un syst~me enzymatique, appel6 "strepzyme" lib6r6 dans le milieu de culture par le Streptomyces GM, en phase avanc6e de croissance. Le pr6sent travail a pour but de connattre la composition chimique des parois de Candida utilis, premier pas dans la d~termination de l'activit6 enzymatique de ces streptomyces. Biochim. Biophys. Acta, 78 (1963) 797-799
798
PRELIMINARY NOTES
On utilise pour la rupture des cellules de levure l'appareil de MICKLE dans les conditions d6jit publi6es pr6c6demment z. Les parois sont purifi6es par centrifugations diff6rentielles (saccharose 60 % ; saccharose IO % ; NaG1 1 % ; H 2 0 distilld). Une modification p e r m e t t a n t d'obtenir des parois libres de tout mat6riel cytoplasmique, est apport6e it la m6thode primitive: apr6s rupture et lavages des parois, celles-ci sont soumises une nouvelle fois, mais seulement pendant un temps tr+s court, it l'action des Ballotini; les lavages sont ensuite effectu6s c o m m e pr6c~demnment. Ruptures et purifications sont suivies tout au cours des op6rations par des observations au microscope de phase. Azote total. Un 6chantillon de parois, s6ch6 sous vide it 56°, est utilis6 pour la d6termination de N (dosage de Microkjeldahl). L'azote total trouv6 est de 1. 4 %. Acides aminds. Environ IO ing (poids sec) de parois sont soumis it une hydrolyse de 18 h it i i o ° avec 6 N HC1. L ' h y d r o l y s a t amend ~ sec servira pour les diff6rentes analyses. La composition qualitative en acides amin6s a 6t6 6tablie p a r chromatographie bidimensionnelle sur papier W h a t m a n No. I, d ' a b o r d dans le solvant p h 6 n o l - e a u (8o:2o, v/v) en pr6sence de cyanure de potassium et d'ammoniac, ensuite dans le solvant n - b u t a n o l - a c i d e f o r m i q u e - e a u (75:15:1o, v/v). On rdv61e le chromatog r a m m e avec une solution de ninhydrine & 0.2 % (w/v) dans l'ac6tone. La proline, la m6thionine, l'arginine, l'histidine et la tyrosine sont r6v616es par leurs r6actifs sp6cifiques 3~. Une ionophor~se sur papier it p H 2.25 et sous 75 ° V, permet de caract6riser l'acide 7-aminobutyrique 7. La cystine et la cyst6ine sont recherch6es apr6s oxydation sous forme d'acide cystdique. La composition semiquantitative en acides amin6s a 6t~ dtablie par chromatographies monodimensionnelles sur papier dans diff6rents solvants, en prdsence d'acides amin6s t6Inoins en quantit~s croissantes (gamme POLSON) 9, 9. On a pu ainsi d6terminer la composition suivante en acides amines*: Gly(2 ), Ala(3_4) , Thr(2), Val~2), Leu-Ileu(2), Phe~l), Asp(2) , Glul4), Lys(1), Argll), acide 7-aminobutyrique¢3/, CySO3H~x). La tyrosine, la s~rine et l'histidine sont pr6sents dans les parois en faible quantit6. Sucres rdducteurs. Les sucres r6ducteurs totaux ont 6td dos6s sur les parois non hydrolysdes par la mdthode it l'anthrone de CHUNG ET NICKERSON 1°. Les sucres rdducteurs repr6sentent les 7 6 % du poids sec des parois. L'6tude qualitative des sucres est effectu6e apr~s une hydrolyse de 6 h /~ IiO ° avec I N HC1. On chromatographie l'hydrolysat sur du papier W h a t m a n No. I t a m p o n n 6 it p H 5, dans le solvant b u t a n o l - a c 6 t o n e - e a u (4:5:1, v/v). On r6v+le le chromatogramrne avec le rdactif des sucres au phtalate d'aniline n. On a pu ainsi d6terminer la pr6sence de glucose et de mannose dans les proportions relatives de 3 it 2. Sucres aminds. Les sucres amines ont ~t~ doses globalement par la m~thode de MORGAN ET ELSON modifi6e par RONDLE ET MORGAN12 apr~s une hydrolyse de 4 h it i i 0 ° avec 2 N HC1. Les sucres alnin6s repr~sentent environ i o/ /o du poids sec des parois (en supposant * Les chiffres entre parentheses repr6sentent les quantit6s relatives de chaque acide amin6.
Biochim. Biophys. Ac/a, 78 (1963) 797-799
PRELIMINARY NOTES
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que les sucres amines presents dans les parois de la levure donnent pour une certaine quantit6 de substance, des colorations 6gales £ une m~me quantit6 de glucosamine). L'6tude qualitative des sucres amin6s est effectu6e apr6s une hydrolyse de 4 h /~ IiO ° avec 2 N HC1. On chromatographie l'hydrolysat sur papier W h a t m a n No. I dans le solvant (a) n - b u t a n o l - a c i d e f o r m i q u e - e a u (75 : 15 : IO, v/v) ou d~ns le solvant (b) n - b u t a n o l - p y r i d i n e - o . I N HC1 (50:30: 20, v/v) 13. On r6v61e le c h r o m a t o g r a m m e avec le r~actif d'ELsoN El" MORGAN au p-dim~thylbenzald~hyde 14. La mobilit6 des sucres amines est 6tudi~e par ionophor~se sur papier W h a t m a n No. I A p H 6. 5 sous 75oV en pr6sence de t6moins arginine-glucose-CySO3H (I ; o; - - I). L'~tude qualitative r6vfile la presence d'une faible quantit6 de glucosamine; en chromatographiant un hydrolysat de 6 h, 6 N HC1, on obtient une quantit~ nettement plus importante de ce sucre amin6, ce qui fait penser que la glucosamine pourrait se trouver dans les parois sous forme de chitine. Un autre sucre amin6, non encore d6termin6, a dt6 d~tectd par chromatographie des diff6rents hydrolysats. On a pu calculer son RF par rapport ~t la glucosamine dans les solvants (a) et (b); ils sont respectivement de 1.6 et de 1. 5. Par ionophor~se sur papier on obtient avee le r~actif d'ELsoN El" MORGAN une tfiche faible rose-mauve migrant 16g~rement vers la cathode. Phosphore. Le phosphore total est d~termin~ par la m6thode colorim6trique de FISKE ET SUBBAROwis d6crite par UMBREIT et al. TM apr~s digestion des parois avec H2SO 4. On obtient pour le phosphore total une valeur de o.15 %. Ces premieres ~tudes nous ont permis d'obtenir quelques donn6es sur la composition des parois de Candida utilis: on peut noter en particulier la tr~s grande proportion de sucres r~ducteurs et la forte representation des acides amines acides face aux acides amin6s basiques; de plus on a pu mettre en 6vidence la pr6sence d ' u n acide anain~ peu courant dans les parois des levures: l'acide y-aminobutyrique. I1 serait int~ressant ultdrieurement de caract~riser la nature du sucre amind que nous avons d~tect~ et d'~tudier les lipides de la parois.
Instituto Jaime Ferrdn de Microbiologia, Madrid (Spain)
M. NOVAES J. R. VILLANUEVA
1 C. GARCIA MENDOZA ET J. R. VILLANUEVA, Nature, 196 (1962) 1326. 2 C. GARCIA MENDOZA ET J. R. VILLANUEVA, Can. J. Microbiol., 9 (1962) 142. 3 R. ACHER ETC. CROCKER, Biochim. Biophys. Acta, 9 (1952) 7o4 • 4 R. ACHER, C. FROMAGEOT ET M. JuTIsz, Biochim. Biophys. Aeta, 5 (195 o) 81. 5 F. SANGER ET H. TUPP,', Biochem. J., 62 (1952) 8. e G. TOENNIES ET J. J. KOLB, Anal. Chem., 23 (1951) 823. 7 j. K. VISAKORPI ETA. L. PURANEN, Scand. J. Clin. Lab. Invest., IO (1958) 196. 8 E. F. MCFARREN, Anal. Chem., 23 (1951) 168. 9 A. POLSON, V. H, MOSLEY ET R. W. G. WYCKOFF, Science, lO5 (1957) 603. 10 C. W. CHUNG ET W. J. NICKERSON, J. Biol. Chem., 2o8 (1954) 395. 11 S. M. PARTRIDGE, Nature, lO 4 (1949) 44312 C. M. J. RONDLE ET W. I. J. MORGAN', Biochem. J., 61 (1955) 586. 13 R. BOURRILLON ET J. MICHON, Bull. Soc. Chim. Biol., 41 (1959) 267. 14 S. M. PARTRIDGE, Biochem. J., 42 (1948) 238. 15 C. H. FISKE ET Y. SUBBAROw, J. Biol. Chem., 66 (1925) 735. 16 W. W. UMBREIT, R. H. BURRIS ET F. F. STAUFFER, Manometric Techniques, Burgess Publishing Co., Minneapolis, 3rd ed., 1957, p. 272.
Re~u le 2 aofit, 1963 Biochim. Biophys. Acta, 78 (I963) 797-799