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Rôle mineur de la voie de novo dans la biosynthèse du RNA au cours du développement fœtal et néoplasique du foie chez le rat
B I O C H I M I E , 1972, 54, 471-481.
all
R61e mineur de la vole d e novo dans la biosynth6se du RNA cours du ddveloppement foetal et ndoplasique du foie chez le rat. C. LAFARGE et C. FRAYSSINET (*). Institut
d e R e c h e r c h e s S c i e n t i f i q u e s s u r le C a n c e r , B . P . n ° 8, 94 - V i l l e i u i [ , F r a n c e . (12/1/1972).
S u m m a r y . - - Studies on the incorporation of orotic acid in the RNA of foetal and neonatal rat liver and in the RNA of hepatomas of various origin (hepatomas induced with DAB or aflatoxine and transplantable hepatomas LF) have shown that : 1 ° ) O r o t i e acid injected intraperitoneally in a pregnant female, is incorporated to a lesser extent in foetal hepatic RNA than in the hepatic RNA of adult rats. The placenta does not block the orotic acid because the same phenomenon is observed when the precursor is injected directly into the peritoneal cavity of the foetus. Other precursors less specific such as 32p are incorporated very well in foetal hepatic RNA. There is a good incorporation of orotic acid at the second day after birth ; the specific activity of the weanling rat hepatic RNA attains a superior value to that found in the adult rat. 2 °) For the three types of hepatomas examined, orotic acid is incorporated to a lesser extent in tumoral RNA than in hepatic RNA. W i t h 32p, the results are exactly reversed as the incorporation of the precursor is better in tumoral RNA than in hepatic RNA. The results suggest that the enzymatic systems of the de n o v o pathway are not very active in foetal liver and in the hepatomas studied. With our experimental conditions, these enzymatic systems are not induced by glueagon nor by cyclic AMP.
D a n s le foie de rat c o m m e d a n s la p l u p a r t des tissus d ' e u c a r y o t e s , la s y n t h ~ s e des n u c l 6 o t i d e s p y r i m i d i q u e s est e s s e n t i e l l e m e n t assur6e p a r la vole m6tabolique de novo dans laquelle l'aspartate p r o v e n a n t du c y c l e de K r e b s est t r a n s f o r m 6 en a c i d e o r o t i q u e p u i s en UMP. A c6t6 de c e t t e v o l e m a j e u r e il e x i s t e u n e v o l e de s y n t h b s e parall61e ( s a l v a g e p a t h w a y ) q u i fait i n t e r v e n i r l ' u r a c i l e p u i s l ' u r i d i n e c o m m e p r 6 c u r s e u r s de I'UMP. D a n s le foie, cette s e c o n d e v o l e est assez p e u f o n c t i o n n e l l e et h q u a n t i t 6 6gale de p r 6 c u r s e u r inject6, l ' a c i d e o r o t i q u e est b i e n m i e u x utilis6 q u e l ' u r a c i l e et l'uridine. T o u t c e c i c o n f b r e un rSle p r i v i l 6 g i 6 h l ' a c i d e o r o t i q u e darts la b i o s y n t h 6 s e d u R N A et e x p l i q u e q u e ce soit le p r 6 c u r s e u r le p l u s c o u r a m m e n t utilis6 p o u r 6 t u d i e r les s y n t h 6 s e s de R N A h 6 p a t i q u e . D a n s u n f o i e n o r m a l l ' e s s e n t i e l de la s y n t h b s e dn R N A 6taut assur6 p a r la v o l e d e n o v o , on s'att e n d fi t r o u v e r u n e m e i l l e u r e i n c o r p o r a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e darts un foie en c r o i s s a n c e q u e d a n s u n foie a d u l t e au r e p o s . Ce fair a 6t6 v6rifi6 exp6rimentalement pour rhypertrophie compen(*) A v e c l a collaboration technique de S. Mousset.
s a t r i c e q u i suit u n e h 6 p a t e c t o m i e p a r t i e l l e , m a i s les r6sultats s o n t c o n t r o v e r s 6 s darts d ' a u t r e s cas de c r o i s s a n c e h 6 p a t i q u e , en p a r t i c u l i e r l o r s du d 6 v e l o p p e m e n t foetal et au c o u r s de la t r a n s f o r m a t i o n c a n c 6 r e u s e du foie. E n ce q u i c o n c e r n e le f o i e foetal alors q u e Minguell et coll. [1] s i g n a l e n t u n e m a u v a i s e i n c o r p o r a t i o n d e l ' a c i d e o r o t i q u e darts le R N A l o r s q u e le p r 6 c u r s e u r est i n j e c t 6 p a r v o l e i n t r a p 6 r i t o n 6 a l e la m b r e ; H a y a s h i , S w i n et W i a n d [2~ r a p p o r t e n t au c o n t r a i r e u n e tr6s b o n n e i n c o r p o r a t i o n d u pr~c u r s e u r d a n s le foie de foetus de 20 jours. P o u r B r e s n i c k et coll. [3] l ' a c i d e o r o t i q u e s ' i n c o r p o r e real l o r s q u e le p r 6 c u r s e u r est i n j e c t 6 h la m b r e , m i e u x l o r s q u ' i l est i n j e c t 6 d i r e c t e m e n t a u x foetus. C e p e n d a n t si n o u s r a p p o r t o n s les c h i f f r e s d ' a c t i vit6 s p 6 c i f i q u e p r 6 s e n t 6 s p a r ces a u t e u r s ~ u n e m 6 m e q u a n t i t 6 de p r 6 c u r s e u r a d m i n i s t r 6 p a r u n i t 6 de p o i d s , n o u s n o u s a p e r c e v o n s que l ' a c t i v i t 6 sp6c i f i q u e q u ' i l s o b t i e n n e n t p o u r le R N A h 6 p a t i q u e foetal r e s t e t o u j o u r s i n f 6 r i e u r e h l ' a c t i v i t 6 sp6cifique du R N A h 6 p a t i q u e m a t e r n e l . P o u r le foie n 6 o p l a s i q u e les r6sultats s o n t p l u s nets : W e b e r et coll. [4], p l u s r 6 c e m m e n t Matsu-
472
C. L a f a r g e el C. F r a y s s i n e t .
d a i r a et coll. [5] et nous-m6mes [6] avons m o n t r 6 que l ' a c i d e orotique s ' i n c o r p o r e b e a u c o u p m o i n s bien dans le RNA d'h6patomes de diverses origines que dans le RNA de foie t6moin. Les exp6riences que nous r a p p o r t o n s ici ont p o u r but de pr6ciser l ' i m p o r t a n c e de la vote de synth6se de novo dans le foie au cours du d6vel o p p e m e n t f~etal et n6onatal et de c o m p a r e r h cet 6gard le foie foetal et n6oplasique.
--
- - les jeunes rats. Nous consid6rons que le lend e m a i n de la n a i s s a n c e est le p r e m i e r jour de la vie postnatale. Les rats au sevrage sont sacrifi6s au 20 e jour apr6s la naissance.
2 °) Rats porteurs de tumeurs. Nous nous sommes adress6s h deux types de tumeurs : - - des tumeurs induiles chez le rat p a r ingestion d ' u n r6gime c o n t e n a n t soit de l'aflatoxine, soit du p a r a d i m 6 t h y l a m i n o - a z o b e n z 6 n e (DAB).
MATERIEL E T METHODES. I
p e n d a n t la dur6e de F i n c o r p o r a t i o n du pr6eurseur.
ANIMAUX.
Nous utilisons des rats W i s t a r C o m m e n t r y 61ev6s au laboratoire et m a i n t e n u s depuis leur
- - une t u m e u r greffde que nous appelons h6patome LF et qui a p o u r origine u n h6patome i n d u i t au DAB. Elle est e n t r e t e n u e au l a b o r a t o i r e p a r
TABLEAU I. Activit~ sp~cifique du R N A h~patique total apr~s injection d'acide orotique v,C.
Temps d'ineorporation
hnimaux inject6s
A. S. du RNA h6patique total
(6)
2 heures
Foie maternel Foie foetal
510 50
(3)
24 heures
Foie maternel Foie foetal
750 120
Foetus injeetds individuellement (46)
2 heures
200
(26)
2 heures
1880
(8)
2 heures
525
Femelles gestantes
J e u n e s rats au s e v r a g e R a t s adultes tomes
Tous les animaux reqoivent 10O ,~Ci/kg d'aeide o.rotiqne 14C, soit 2 heures, soit 24 heures avant le saerifiee. Nos ehiffres exp6rimentaux sont les moyennes de plusieurs exp6riences. Nous donnons entre-parenth6ses le nombre d'anlmaux utilis6s.
sevrage h u n r6gime s t a n d a r d semi-synth6tique 6quilibr6 leur a s s u r a n t u n e b o n n e croissance. 1 °) Foetus et jeunes rats. - - les foetus sont dat6s et pr61ev6s au 20e on 21 ~ jour de la vie foetale. (Nous consid6rons cornme p r e m i e r jour de la vie foetale le jour qui suit la fdcondation).
Les p r 6 c u r s e u r s sont inject6s soit p a r vote i n t r a p6riton6ale h la m6re, soit d i r e c t e m e n t dans la cavit6 p6riton6ale des foetus. Dans ce d e r n i e r cas la femelle gestante est anesth6si6e h l'6ther, u n e l a p a r o t o m i e est faite le long de la ligne b l a n c h e et les cornes ut6rines sont ext6rioris6es le temps m i n i m u m n6cessaire h l ' i n j e c t i o n de c h a c u n des foetus. La p a r o i a b d o m i n a l e est ensuite referm6e BIOCHIMIE, 1972, 54, n ~ 4-.
repiquage d ' u n b r o y a t de t u m e u r dans la cavit6 p6riton6ale de jeunes rats. C'est u n e t u m e u r h croissance r a p i d e a y a n t c e p e n d a n t gard6 des caract6res histologiques de tissu h6patique. Elle pousse en grappes de nodules suffisamment petits p o u r ne pas 6tre n6eros6s, on obtient ainsi envir o n 5,0.0 mg de t u m e u r p a r rat. II --- PR~CURS~EURS UTILIS~S. L'acide orotique 1~C (CMM 26) p r o v i e n t du CEA de Saclay. La t h y m i d i n e tritide est m a r q u 6 e soit sur Ie groupe m~thyle (TMM 79 du CEA), soit sur le cycle ( t h y m i d i n e triti6e p r o v e n a n t du Radiochem i c a l Center d'Amersham).
473
Vote de s y n t h ~ s e d u R N A d a n s le foie foetal et n d o p l a s i q u e . Le Pbosphore 32 p r o v i e n t du CEA de Saclay ( 3 2 p - s 2). I1 est sous forme de phosphate de s o d i u m en solution injectable. If[ - - T E C H N I Q U E S BIOCHIMIQUES.
- - Les n o y a u x sont prdpards selou la t e c h n i q u e de Chauveau el coll. [7~.
total des foetus est bien infdrieure "A celle du RNA hdpatique m a t e r n e l aussi bien p o u r u n temps court d ' i n c o r p o r a t i o n (2 heures) que p o u r u n temps long (24 henres), ce d e r n i e r temps c o r r e s p o n d a n t au m a x i m m n de la courbe d ' i n c o r p o r a t i o n de l'acide orotique dans le RNA hdpatique total. II - - Absence de barribre placentaire pour l'acide
- - Les acides nucldiqnes sont fractionnds puis dosds p a r la t e c h n i q u e de S c h m i d t et T h a n n h a u s e r modifide p a r Mould [81.
--Les mesures de radioactivit~ se font au spectromdtre ~ s c i n t i l l a t i o n T r i c a r b de P a c k a r d ou m u l t i m a t I n t e r t e c h n i q u e p o u r les doubles comptages 82p. 14C. Les quantitds de p r d c u r s e u r s inject6s sont rapportdes au poids des a n i m a u x de facon h p o u v o i r c o m p a r e r entre elles les diff6rentes activitds sp6cifiques.
orotique. La mauvaise i n c o r p o r a t i o n de l'acide orotique duns le RNA hdpatique foetal p o u r r a i t s ' e x p l i q u e r par l'existence d ' u n e b a r r i d r e p l a c e n t a i r e empdc h a n t le passage du p r d c u r s e u r de la mdre vers les foetus. P o u r 6carter cette 6ventualit6 nous avons procdd6 h deux sdries d'expdrienees. 1 ") Injection directe anx [cetus. Nous voyons tableau I que :
TABI.EAU II.
ActivitY, sp~cifique des acides nucldiques ~ t a u x et maternels aprbs 2 heures d'incorporation de diff~rents pr~curseurs.
Pr6eurseurs administr6s
Animaux traitds
Femelles gestantes
(3)
Sdrum dpm 1~C dpm 3H par ml
Mdlange d'aeide orotique t~C et de thymidine 3H (')
Foetus (24)
Phosphore 32 (")
Homogenat de foie A.S.
A.S.
RNA
DNA
Femelle
14
510 ] 200
Foetus
15
10 I 1050
Femelle
710
65
Foetus
6110
5690
(') Les femelles gestantes reqoivent en une injection mixte 1O0 ~xCi/kg d'acide orotique 14C et 200 i~Ci/kg de thymidine ~H. ('*) Chaque foetus d'environ 5 g reqoit 200 ,~,Ci de phosphore 32. A c6t6 de ehaque ehiffre expdrimental qui est une moyenne d'expdriences, figure entre parenthdses le nombre de points expdrimentaux. Les activitds spdcifiques (AS) sont exprimdes en ddsintdgrations p a r m i n u t e et p a r m i c r o g r a m m e de p h o s p h o r e RNA ou DNA. R,GSULTATS. A. FOlE
F(ETAL .ET NI~ONATAL.
I - - Mise en ~vidence d'une mauvaise incorporation de l'acide orotique dans le RNA hdpatique foetal aprbs injection du prdcurseur it la m~re. Les chiffres rapportds au tableau I nous mont r e n t que : l'aetivit6 sp6cifique du RNA hdpatique
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
a) L'aeide orotique s ' i n e o r p o r e mieux dans le RNA hdpatique foetal aprds i n j e c t i o n direete aux foetus, ceei du simple f a r que la c o n c e n t r a t i o n en p r d c u r s e u r rdalisde au n i v e a u d u foie foetal est plus i m p o r t a n t e p a r i n j e c t i o n i n t r a p d r i t o n d a l e direete que p a r i n j e c t i o n via la femelle gestante. b) Cependant, aprds i n j e c t i o n directe aux foetus, p o u r une m~me quantit6 de p r d c u r s e u r inject6 p a r unit6 de poids et p o u r u n mdme temps d ' i n c o r p o ration, l'aetivitd spdeifique du RNA hdpatique total reste bien i n f d r i e u r e ehez les foetus, n o n seulement h celle trouvde p o u r de jeunes rats au sevrage (done en phase de croissanee hdpatique aussi r a p i d e que celle des foetus) mats encore h eelle
C. Lafarge et C. Frayssinet.
474
TABLEAU IlI.
Evolution de l'incorporation des prdcurseurs dons les aeides nucl~iques hdpatiques au cours de la croissance foetale et postnatale du rat. A. S. du RNA Age des animaux
Ac. orotique
A.S. du DNA 14¢ Thymidine 3-----3--~-r r 3,,
32r
t4c
32r
! (46)
200
(24)
6110
0,03
(7)
1580
(24)
5690
~ (40)
130
(18)
6785
0,02
(19)
1625
(18)
3940
1 jour apr~s la naissance.. :i (14)
260
(7)
7125
(8)
2670
(7)
7150
2 jours . . . . . . . . . . . . . . . . .
805
(4)
1810
Foetus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J o u r de la naissance . . . . . . .
.
(8)
--
!.__
(8)
1810 1310 1530
3 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . .
i (13)
835
(8)
4 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . .
(8)
730
(8)
6 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . .
(4)
2070
(5)
1600
(26)
1880
(9)
865
--
(6)
510
(3)
200
--
(13)
525
15 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . R a t s au sevrage (20 j) . . . . . . Femelles gestantes . . . . . . . . Rats mfiles adultes . . . . . . . . .
(5)
(10)
5400
4000
--
(10)
600
T o u s l e s pr6curseurs sont a d m i n i s t r 6 s p a r voie i n t r a p 6 r i t o n 6 a l e 2 h e u r e s a v a n t le sacrilice des a n i m a u x : - - l'acide orotique est a d m i n i s t r 6 ~ r a i s o n de 1O0 :t,Ci/kg, la t h y m i d i n e ~H h r a i s o n de 200 ~t~Ci/kg. Les a n i m a u x de certaines s6ries reqoivent les deux pr6curseurs simultan6ment ; - - nous a d m i n i s t r o n s 200 uCi de ~32p aux foetus et p o u r les j e u u e s rats la q u a n t i t 6 de p r 6 c u r s e u r inject6 est ajust6e /~ leur poids. Les rats adultes regoivent 1 mCi de 32p. P o u r pouvoir c o m p a r e r r i g o u r e u s e m e n t les r6sultats nous r a p p o r t o u s tontes Ies activitds spdcifiques ~ une m~me q u a n t i t 6 de prdcurseur injectd p a r kg ; -- les r a t s de certaines s6ries recoivent s i m u l t a n 6 m e n t l'acide orotique 14C et lc ~2P ; - - les chiffres entre p a r e n t h b s e s r e p r 6 s e n t e n t le n o m b r e de points e x p 6 r i m e n t a u x pour lesquels nons d o n n o n s la m o y e n n e des rdsultats. m e s u r 6 e d a n s le f o i e d e f e m e l l e s g e s t a n t e et d e r a t s a d u l t e s rn~les. 2 °) Injection d'un m~lange d'acide orotique 1~C et de thymidine 3H aux [emelles gestantes. Cette exp6ricnce a pour but de contrSter la pr6s e n c e d e s d e u x p r 6 c u r s e u r s d a n s le s a n g d e s f o e t u s ' et d e c o m p a r e r le r a p p o r t ~C/-3H m e s u r 6 d a n s le s a n g foetal ~ c e l u i r e t r o u v 6 d a n s le s a n g m a t e r n e l . L e s r 6 s u l t a t s r 6 u n i s d a n s le t a b l e a u I I n o u s p e r mettent de voir que : a) d a n s le s 6 r u m les r a p p o r t s d e s d p m p a r m l e n 1~C et ~H s o n t les m 6 m c s p o u r les f e m e l l e s gest a n t e s et l e u r s ~oetus. Ceci m o n t r e q u e l o r s d u sacrifice des animaux, un m6me 6quilibre entre p r 6 c u r s e u r s est a t t e i n t d a n s le s a n g d e l a m b r e et d e s foetus. Ce r 6 s u l t a t v a ~ l ' e n c o n t r e d e l ' e x i s t e n c e d'une barri6re placentaire sp6cifique pour l'acide orotique.
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
b) L ' i n c o r p o r a t i o n d e t h y m i d i n e t r i t i 6 e e s t t r b s i m p o r t a n t e d a n s le D N A foetal et f a i b l e darts le D N A d u f o i c d e s f e m e l l e s : les s y n t h 6 s e s d e D N A s o n t e n effct t r 6 s p e u a c t i v e s d a n s u n o r g a n e adulte quiescent. c) A u c o n t r a i r e , l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e d u R N A h 6 p a t i q u e foetal e s t b i e n i n f d r i e u r e h c e l l e d u R N A h 6 p a t i q u e m a t e r n e l , ce q u i r e n d d v i d e n t e l a m a n valse utilisation de l'acide orotique. ]II --
Bonne incorporation du phosphore 32 dans le RNA hdpatique foetal.
P o u r v 6 r i f i e r q u e les s y n t h b s c s d e R N A s o n t a c t i v e s c h e z n o s ~cetus et q u e d ' a u t r e s p r 6 c u r s e u r s peuvent 6tre incorpor6s, nous leur avons administ r 6 d u 32p, p a r v o l e i n t r a p 6 r i t o n 6 a l e . S u r le t a b l e a u I I n o u s v o y o n s q u e : a) le p h o s p h o r e 32 s ' i n c o r p o r e t r 6 s b i e n d a n s le R N A foetal, a u s s i b i e n si ce n ' e s t m i e u x q u e d a n s le DNA.
Voie de synth~se du RNA dans le foie foetal et ndoplasique.
475
TABEAU IV.
Incorporation d'acide orotiqne ~',C dans du RNA d'h~patome. RNA total
H6patomes grefffis (') H6patomes induits h l'aflatoxine C')
(7) (12)
Incorporation (4) 30' Incorporation (4) 1 h 30' (5)
H ~ p a t o m e s
induits au DAB (**)
T6moins Porteurs de greffe
(5)
Foie Foie Tumeur
Activit6 sp6cifique
Activit6 sp6cifique
P. RNA P. DNA
770 920 85
15 675 22 340 1 190
0.21 0.15 0.33
4 650 600 6 550 755
0.20 0.48 0.16 0.37
550 700
10 150 7 720
0.20 0.21
230 300 205 345 135 85
1 800 730 400
0.45
Foie Tumeur Foie Tumeur
T6moins
Foie Foie Nodules -50 mg Porteurs - 100 mg d'hdpatome I - - 100-500 mg - - 500 mg --2g --4g
RNA nucl6aire
(*) Les animaux greffds et leurs t6moins reqoivent 25 tLCi d'acide orotique 14C, 45' avant ]cur sacrifice. (**) Les animaux porteurs d'h6patomes induits h l'aflatoxine reqoivent 100 uCi/kg d'aeide orotique 14C soit 30' soit 1 h 30 avant leur sacrifice. (***) Nous injectons 100 i~Ci/kg d'aeide orotique 14C 2 heures avant le sacrifice des animaux porteurs d'h6patomes induits au DAB et de leurs t6moins. Les r6sultats sont les moyennes d'un nombre de points expdrimentaux que nous indiquons entre parenth6ses.
b) la p e t i t e q u a n t i t 6 de p r 6 c u r s e u r q u i p 6 n 6 t r e et s ' i n e o r p o r e d a n s le foie m a t e r n e l n o u s p e r m e t de c o n s t a t e r c o m m e clans la s6rie p r 6 c 6 d e n t e q u e le R N A h 6 p a t i q u e des f e m e l l e s est d i x l o i s p l u s m a r q u 6 q u e l e u r DNA.
des foetus, c ' e s t - h - d i r e b i e n i n f 6 r i e u r e h celle du R N A h 6 p a t i q u e de l ' a d u l t e et h f o r t i o r i de j e u n e s rats d ' u n e s e m a i n e . Ce n ' e s t q u e d e u x j o u r s apr6s la n a i s s a n c e q u e les a e t i v i t 6 s s p 6 c i f i q u e s d u R,NA d e v i e n n e n t s u p 6 r i e u r e s h eelles t r o u v 6 e s e h e z l'adulte.
Evolution de l'incorporation des prdcurseurs darts les acides nucl~iques h~patiques au coars du d ~ v e l o p p e m e n t [cetal et postnatal.
- - Apr6s m a r q u a g e au 32p au c o n t r a i r e l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e du RNA h 6 p a t i q u e est p l u s 61ev6e p e n d a n t la vie foetale et le d 6 b u t de la v i e p o s t n a t a l e q u e p l u s tard.
IV-
N o u s m e s u r o n s apr6s i n j e c t i o n des d i f f 6 r e n t s p r 6 c u r s e u r s les a c t i v i t 6 s s p 6 c i f i q u e s du R N A h6pat i q u e t o t a l et du D N A de foetus de 2:1 j o u r s et n o u s les c o m p a r o n s "h celles de n o u v e a u - n 6 s , de j e u n e s rats au s e v r a g e , de f e m e l l e s g e s t a n t e s et de r a t s a d u l t e s tomes. Les r6sultats s o n t r 6 u n i s s u r le t a b l e a u III, n o u s v o y o n s q u e :
a) Pour le RNA. -- Apr6s marquage h l'acide orotique l'activit6 s p 6 c i f i q u e du R N A h 6 p a t i q u e des r a t s sacrifi6s le j o u r de la n a i s s a n e e r e s t e tr~s c o m p a r a b l e fi celle
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
Cette d i l f 6 r e n c e e n t r e l ' i n e o r p o r a t i o n des d e u x p r 6 c u r s e u r s d a n s le R N A est m a t 6 r i a l i s 6 e p a r le r a p p o r t AS ~4C/AS 32p q u i e h e z les foetus et les n o u v e a u - n 6 s est b e a u e o u p p l u s f a i b l e q u e e h e z les a d u l t e s et que c h e z les ]eunes rats.
b) Pour le DNA. Les i n c o r p o r a t i o n s de t h y m i d i n e 3H et de 32p s o n t tr6s i m p o r t a n t e s d a n s le f o i e p e n d a n t t o u t e la vie f ~ t a l e et p o s t n a t a l e . Les aetivit6s s p 6 e i f i q u e s du DNA s o n t p l u s 61ev6es e h e z les foetus et les n o u v e a u - n 6 s q u e e h e z les j e u n e s rats et e h e z les adultes.
C. Lafarge et C. Frayssinet.
476
TABLEAU V.
Incorporations cornpar~es de dif[~rents pr~curseurs des acides nuclkiques dans l'h6patome gre[f~ LF. Pr6cursenrs admiaistr6s Thymidine 3H (1 h) (6) Ae. orotique 14C (45 ') (12) Phosphore 32 (45 ') (6)
A,S.
A,S.
RNA aucl~aire
DNA
P. RNA nuel~aire DNA
50
0.21
_ 765
0.55
Foie Tumeur Foie Tumeur
6600
0.19
70
0.58
Foie
1500
130
0.23
Tumeur
1600
140
0.62
La thymidine est administr~e aux animaux h raison de 40 a c t pendant 1 heure. L'aeide orotique h la dose de 12 ~Ci pendant 45 minutes. Le z2p h la dose de 100 lxCi, 45 minutes avant le sacrifice. Pour ehaque s~rie expdrimentale nous donnons la moyenne des r~sultats et entre-parentheses le hombre de points exp6rimentaux. B. HEPATOME GnEFFI~ ET INDUIT.
I - - Mise en ~vidence d'une mauvaise incorporation de l'acide orotique dans le RATA d'h~patome. Dans les s6ries expdrirnentales suivantes nous dtudions d ' u n e p a r t les turneurs h c r o i s s a n c e tr~s r a p i d e que sont les h6patomes greffds LF, d ' a u t r e p a r t les turneurs h c r o i s s a n c e lente que sont ]es h6patomes i n d u i t s h l'aflatoxine et au DAB. 1 °) Tumenrs gre[f~es. Sur le tableau IV nous v o y o n s que : les aetivit~s sp6cifiques de RNA total et nuel6aire sont toujours plus 61ev~es dans le foie (que ee soit le foie t6moin ou le foie de l ' a n i m a l p o r t e u r de greffe) que darts la lurneur. Les r a p p o r t s P. R N A / P . DNA qui d o n n e n t une i d l e de la quantit6 de RNA p a r n o y a u sont deux fois plus 61ev6s dans l'h6patorne que dans le foie des anirnaux t6rnoins ou p o r t e u r s de greffe. Ce r6sultat va dans le sens d ' u n e a b o n d a n t e synth6se de RNA dans les h~patornes et r e n d plus 6vidente la m a u v a i s e utilisation de l ' a e i d e o r o t i q u e p o u r la biosynth6se du RNA.
9_,0) Tumeurs induites. a) Hdpatomes induits par l'aflatoxine. Les r6sultats sont report6s sur le tableau IV : --les activit6s sp~cifiques du RNA nuel6aire mesur6es dans le foie p 6 r i t u m o r a l sont bien sup6r i e n r e s h celles trouv6es dans les tumeurs.
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
- - les r a p p o r t s P. R N A / P . DNA qui refl~tent les quantit6s de RNA p a r n o y a u sont lh e n c o r e trbs 61ev6es dans l'h6patorne. Du fait que les a n i m a u x p o r t e u r s d'h6patornes greff6s sont plus jeunes que eeux p o r t e n t s d'h6patome induit, l'activit6 sp6cifiqne du RNA nuel6aire est plus 61ev6e dans le foie des p o r t e u r s d'h6patomes greff6s.
b) Hdpatomes induits au DAB. Nous pr61evons d ' u n e p a r t le foie des a n i m a u x tbrnoins et d ' a u t r e p a r t le foie p6riturnoral et les diff6rents nodules des rats p o r t e u r s d'h6patomes. Lors du pr616vement des nodules nous 6cartons les masses t u m o r a l e s trop v o l u m i n e u s e s qui p o u r r a i e n t 6tre en grande p a r t i e n6eros6es et nous retenons des t u m e u r s d ' u n 6ventail de poids allant de 50 m g h 4 g. P o u r les trbs petits nodules nous nous effor$ons d'61irniner autant que faire se peut le tissu h6patique p 6 r i t u m o r a l de m6me que nous d6barrassons les plus gros nodules des zones 6ventuellernent n6eros6es. Les exarnens h i s t o l o g i q u e s pratiqu6s sur un c e r t a i n n o m b r e de nodules ont confirm6 leur earaetbre n6oplasique. Les r6snltats tableau IV.
obtenus
sont
r6unis
dans
le
- cornme dans les s6ries p r ( c 6 d e n t e s , les aetivit6s sp6eifiques des RNA total et nuel6aire obtenues aussi bien p o u r le foie de rat t6rnoin que p o u r le foie p 6 r i t u m o r a l sont sup6rieures h eelles trouv6es dans les diff6rentes nodules.
Vole de synthbse du RNA dans le foie foetal el ndoplasique. - - 1~ e n c o r e les r a p p o r t s RNA n u c l 6 a i r e / D N A sont plus 61ev6s p o u r les h6patomes que p o u r le tissu h6patique. En ce qui c o n c e r n e l'activit6 sp6cifique du RNA total des diff6rents nodules, les r6sultats sont homogbnes p o u r les t u m e u r s de petite taille et de taille m o y e n n e p a r c o n t r e ]es activit6s sp6cifiques TABLEAU VI.
Incorporations simultan~es d'acide orotique ~-',C et de Phosphore 32 dans le RNA total de l'h~patome greff~ LF. A. S. l~C
A.S. t~C
A.S. a~p
3 180
11 000
i
0,28
260
36 000
i
0,01
I Foie
(a) Tumeur
Les animaux reqoivent 2 heures avant leur sacrifice un m61ange d'acide orotique 14C (100 i~Ci/kg) et de :~:2p (1 mCi/kg). Nous rapportons les activit6s sp6cifiques en $2p h la m~me quantit6 de pr6eurseur inject6 par unit6 de poids que dans les s6ries pr6c6dentes aria de rendre tous les r6sultats imm~diatement comparables. Nous indiquons entre parentheses le nombre de s6ries exp6rimentales.
477
a) l'activit6 sp6cifique du RNA nucl6aire h6patique est bien s u p 6 r i e u r e h celle du RNA t u m o r a l apr6s m a r q u a g e h l ' a c i d e o r o t i q u e 14C, alors qu'apr6s m a r q u a g e au sap, les r6sultats obtenus sont du m&ne o r d r e p o u r le foie et la tumeur. b) l'activit6 sp6cifique du DNA est au c o n t r a i r e plus 61ev6e dans le cas de la t u m e u r que dans le cas du foie aussi bien aprbs m a r q u a g e h la t h y m i d i n e triti6e qu'aprbs m a r q u a g e au 32p. c) les r a p p o r t s R.NA/DNA sont c o m m e nous l ' a v o n s vu dans les s6ries pr6c6dentes plus 61ev6es dans l ' h 6 p a t o m e que dans le foie. 2 °) L o r s q u e les a n i m a u x r e c o i v e n t des injections mixtes d ' a e i d e o r o t i q u e et de 32p, nous v o y o n s (tableau VI) que les r6sultats obtenus p o u r le RNA total sont e n c o r e plus d6monstratifs : le r a p p o r t AS en 14C/AS en 3zp passe de 0,28 p o u r le foie & 0,01 p o u r la tumeur. C. SIMILITUDE DE COMPORTEMENT DU FOIE F(ETAL ET NEOPLASIQUE VIS-A-VIS DE L'ACIDE 0ROTIQUE.
Nous avons report~ sur la m~me figure les activit6s sp6cifiques du RNA total (apr~s m a r q u a g e l ' a c i d e orotique) et du DNA (apr~s m a r q u a g e ~ la t h y m i d i n e ) de foie foetal et n6onatal afin de les c o m p a r e r d ' u n e p a r t au foie de jeunes rats et d'adultes, d ' a u t r e p a r t au foie n6oplasique. AS
sont plus faibles p o u r les plus gros n o d u l e s de 2 4 g, ceci est peut-6tre dfi h la p r 6 s e n c e de tissu en vole de n6crose, difficile h r e p 6 r e r m a c r o s c o p i q u e m e n t et p a r cons6quent i m p o s s i b l e & 61iminer lors du pr61~vement. Les r6sultats obtenus avec les t u m e u r s i n d u i t e s (tumeurs "h c r o i s s a n c e lente) c o n f i r m e n t ceux obtenus avec les t u m e u r s greff6es (tumeurs h croissance r a p i d e ) et m o n t r e n t qu'il n ' y a pas de corr61ation entre l ' a p t i t u d e h i n c o r p o r e r l ' a c i d e orotique dans le RNA et le taux de c r o i s s a n c e de l'h6patomes. D ' a u t r e p a r t l ' a n a l y s e b i o c h i m i q u e des nodules de diff6rentes tailles m o n t r e que le p h 6 n o m b n e est 6tabli p o u r les plus petites t u m e u r s p e r c e p t i b l e s et isolables et qu'il est p a r cons6quent acquit tr~s tSt au cours de la t r a n s f o r m a t i o n eanc6reuse. II --- Incorporations
compar~es des di[[~rents pr~curseurs des acides nucl~iques dans I'hdpatome greff&
1 °) Les a n i m a u x r e ~ o i v e n t soit de l ' a e i d e orot i q u e a'C, soit de la t h y m i d i n e 3H, soit du 32p. Nous voyons sur le tableau V que :
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2500]
~]AS RNA NAS DNA
2.000 1500
IOOO
500 400 300 200 }O0 F£fTU5 N
1j. 2j. 3j.
4j. 5EVRAGAEoUtT E~UMEUR
F1c,. l. - - Variations de l'ineorporation de l'acide orotique et de la thymidine dans le RNA h~patique au cours du d6veloppement et dans l'h6patome greff6. i//// Aetivit6 sp6cifique du RNA h6patique total ..... apr6s 2 heures d'incorporation de 100 uCi/kg d'aeidc orotique 14C. i_/i_.__1 Activit6 sp6eifique du DNA h6patique apr6s 2 heures d'incorporation de 200 ~Ci/kg de thymidine 3H.
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C. Lafarge et C. Frayssinet.
L a f i g u r e 1 m e t e n 6 v i d e n c e les d i f f 6 r e n c e s d ' a c t i v i t 6 s p ~ c i f i q u e q u i e x i s t e n t e n t r e le R N A h 6 p a t i q u e d e foetus e t d ' a d u l t e et p l u s e n c o r e e n t r e le R N A d e foetus et d e j e u n e s r a t s : l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i fique du RNA h6patique total, faible pendant la v i e fcetale et i m m 6 d i a t e m e n t a p r 6 s l a n a i s s a n e e , s'616~e j u s q u ' a u s e v r a g e p u t s d i m i n u e c h e z l ' a d u l t e t o u t e n se s t a b i l i s a n t h d e s v a l e u r s p l u s 61ev6es q u e c e l l e s r e n c o n t r 6 e s c h e z le foetus.
D. E F F E T DU GLUCAGON ET DE L'AMP CYCLIQUE S~UR L ' U T I L I S A T I O N DE. L ' A C I D E OROTIQ.UE P O U R LA B I O SYNT'HI~SE DES P Y R I M I D I N E S DANS LE F O I E F ( ~ T A L , NEONATAL ET NEOPLASIQ.UE.
Le fait que l'acide orotique s'incorpore peu dans le R N A d e foie foetal m a i s b i e n d a n s le foie d u r a t fig6 d ' u n e s e m a i n e s u g g 6 r e q u e les s y s t 6 m e s e n z y matiques impliqu6s ne sont induits qu'apr6s la
TABLEAU VII.
E[fets du glucagon et de I'AMP cycliql~e sur l'incorporation de l'acide orotique *~C dans le RNA total au cours du d~veloppement foetal, ndonatal et n~oplasique du [oie. Conditions exp6rimentales
A.S. du RNA total Femelle
650
Foetus
130
Femelle
5O5
(3) T~moins Femelles gestantes (3) Glueagon 4 heures 500 pg
Nouveau-n6s de 3 jours
Foetus
6
(3) T4moins
1 470
(6) Glueagon 6 heures p.g
1 525 Foie
2 150
(2} T6moins
Rats porteurs de t u m e u r greff4e
Rats de 1 jour
470
Tumenr (5) Glucagon 4 heures 100 p.g
(6) (5) (4) (6)
Foie
2 420
Tumeur
T4moins AMP cyclique 2 heures AMP cyclique 4 heures AMP cyelique 24 heures
42O 476 525 585 300
___~ 73 ~ 34 ~___53 ~___25
T o u s l e s a n i m a u x re~oivent 100 uCi/kg d'acide orotique 14C, 2 h e u r e s a v a n t l e u r sacrifice : - - les femelles gestantes reqoivent 500 ~g de glucagon p e n d a n t 4 h e u r c s ; - - les nouveau-n6s de 3 j o u r s 100 i~g de glucagon p e n d a n t 6 h e u r e s ; - - les rats p o r t e u r s d ' h 6 p a t o m e s greff6s 100 r~g de glucagon p e n d a n t 4 h e u r e s ; - - les rats de 1 j o u r re~oivent 250 Jag de d i b u t y r y l AMP cyclique 2 heures, 4 h e u r e s ou 24 h e u r e s a v a n t leur sacrifice. Chaque r 6 s n l t a t est la m o y e n n e d ' u n n o m b r e de points e x p 6 r i m e n t a u x que nous pr6cisons e n t r e parenth6ses. Darts la s~rie de rats trait4s h I'AMP cyclique et leurs t6moins, h chaque m o y e n n e est assoei6e l ' e r r e u r s t a n d a r d h la lnoyenne.
P o u r le D N A les r 6 s u l t a t s s o n t e x a e t e m e n t i n v e r s6s : l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e 61ev6e p e n d a n t r o u t e la v i e foetale et n 6 o n a t a l e d i m i n u e h p a r t i r d u s e v r a g e p o u r a t t e i n d r e les f a i b l e s v a l e u r s t r o u v 6 e s c h e z radulte.
n a i s s a n c e . D ' a u t r e p a r t , l a d 6 d i f f 6 r e n c i a t i o n eellulaire qui accompagne toujours la transformation m a l i g n e d e s c e l l u l e s p e u t e x p l i q u e r q u e c e s syst 6 m e s s o i e n t p e u f o n c t i o n n e l s d a n s les h 6 p a t o m e s que nous avons 6tudi6s.
D ' a u t r e p a r t le p a r a l 1 6 1 i s m e e n t r e f o i e ~oetal et h6patome tant pour l'aetivit6 sp6eifique du RNA q u e p o u r c e l l e d u D N A est f r a p p a n t e .
Nous avons donc tent6 de stimuler l'incorporat i o n d e l ' a c i d e o r o t i q u e d a n s le R N A p a r d e s a g e n t s tels q u e le g l u c a g o n et I ' A M P c y c l i q u e q u i
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Vote de s y n t h b s e d u R N A d a n s le foie [oetal el n d o p l a s i q u e .
sont r e s p o n s a b l e s de l ' i n d u e t i o n ou de la d6r6p r e s s i o n de bon n o m b r e d ' e n z y m e s darts le foie adulte. Nous avons adopt6 des c o n d i t i o n s exp6rim e n t a l e s p r o c h e s de celles p o u r lesquelles J. P. Jost et coll. [9] ont p u o b t e n i r in vivo l ' i n d u c t i o n de s6rine d6shydratase. 1 °) Action du gIucagon. Le glucagon agit p a r l ' i n t e r m 6 d i a i r e de r A M P cyclique. Son effet est m a x i m u m 4 ~ 6 h e u r e s aprbs l'administration. Nous v o y o n s sur le t a b l e a u VII qu'il n ' y a p a s de diff6rence d ' i n c o r p o r a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e dans le RNA e n t r e les a n i m a u x trait6s et leurs t6moins aussi b i e n p o u r le foie que p o u r la t u m e u r ( d a n s le cas des a n i m a u x p o r t e u r s d ' h 6 p a t o m e s ) . 2 °) Action de I'AMP cyclique. L'AMP c y c l i q u e est a d m i n i s t r 6 sous f o r m e dibutyryl. Nous v o y o n s (tableau VII) que l ' i n c o r p o r a tion d ' a c i d e orotique ~4C n'est p a s significativem e n t p l u s i m p o r t a n t e dans le RNA h 6 p a t i q u e des nouveau-n6s trait6s h 1'AMP c y c l i q u e que dans celui des t6moins du m6me hge. Le glucagon et I'AMP c y c l i q u e sont donc in vivo dans nos c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s sans effet sur la vote de synthbse de novo. DISCUSSION DES I~ESU~,TATS. I - - Foie fcetal et n~onatal.
L ' a c i d e orotique s ' i n c o r p o r e real dans le RNA h6patique foetal, c e p e n d a n t cette i n c o r p o r a t i o n n'est p a s nulle et ceci e x p l i q u e les r6sultats cont r a d i c t o i r e s obtenus p a r diff6rents auteurs qui n ' o n t p a s mesur6 dans des c o n d i t i o n s c o m p a r a b l e s l ' i n c o r p o r a t i o n chez l ' a d u l t e et chez les foetus. 1 °) I1 r e s s o r t de nos r6sultats que l ' a c i d e orotique p6n~tre dans les foetus aprbs i n j e c t i o n i n t r a p6riton6ale h la mbre. Le m a u v a i s m a r q u a g e de leur RNA h 6 p a t i q u e se r e t r o u v e aprbs i n j e c t i o n d i r e c t e de ce p r 6 c u r s e u r h c h a c u n d ' e n t r e eux, il n'est donc p a s le fair d ' u n e b a r r i ~ r e p l a c e n t a i r e colnme Font sugg6r6 Minguell et co11. [13 d ' u n e p a r t , B r e s n i c k et coll. (3] d ' a u t r e p a r t . 2 °) Le m a u v a i s m a r q u a g e du RNA h 6 p a t i q u e foetal p a r l ' a c i d e o r o t i q u e ne p e n t 6tre le fait de la p r 6 s e n c e d a n s cet organe, des cellules h6matopoi6tiques qui existent en g r a n d h o m b r e ~ eSt6 des h6patohlastes et ne d i s p a r a i s s e n t que quelques jours aprbs la naissance. En effet, si on en juge p a r les r6sultats obtenus en culture de cellules [103 la lign6e rouge (du m o i n s chez l ' h o m m e ) i n c o r p o r e BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
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trbs b i e n l ' a c i d e orotique. La p e r t e de cette facult6 qui se r e n c o n t r e dans une an6mie m6galoblastique cong6nitale c o r r e s p o n d dans ces cellules h la p e r t e d'activit6 de la p y r o p h o s p h o r y l a s e et de la d6carb o x y l a s e qui i n t e r v i e n n e n t d a n s la t r a n s f o r m a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e en UMP. 3 °) Le fair que ce soit s e u l e m e n t apr6s la naissance que le foie p u i s s e i n e o r p o r e r pr6f6rentiellem e n t l ' a c i d e o r o t i q u e dans son tLNA sugg~re que ce p h 6 n o m b n e est en r a p p o r t d i r e c t avec la diff6r e n c i a t i o n cellulaire. On salt que les diff6rentes f o n c t i o n s h6patiques sont acquises selon une chronologie pr6cise, on p e u t c i t e r h cet 6gard les travaux de A. Jost et de ses c o l l a b o r a t e u r s s u r l ' a p p a r i t i o n du glycogbne dans le foie foetal [11]. En ce qui c o n c e r n e la vote de novo les h6patoblastes n ' a u r a i e n t p a s l ' 6 q u i p e m e n t e n z y m a t i q u e n6cess a i r e "h l ' u t i l i s a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e p o u r la biosynthbse des p y r i m i d i n e s . A l ' a p p u i de cette h y p o thbse on peut citer les r6sultats de B r e s n i c k et coll. [2] qui ont m o n t r 6 q u ' a p r b s i n j e c t i o n d ' a c i d e orotique 14C h la femelle gestante, l'essentiel de la r a d i o a c t i v i t 6 se r e t r o u v e sous f o r m e d'UMP dans le foie m a t e r n e l mats reste sous f o r m e d ' a c i d e orotique dans le foie foetal. Les h6patoblastes synth6t i s e r a i e n t le RNA p a r la vote de synthbse parall~le ¢ salvage p a t h w a y >> et la vote de novo ne deviend r a i t f o n c t i o n n e l l e que p l u s i e u r s j o u r s apr~s la naissance, h u n nloment off l ' a u g m e n t a t i o n des t e n e u r s en azote p a r cellule m a t 6 r i a l i s e la raise en p l a c e des d i v e r s e s fonctions h 6 p a t i q u e s [12]. Dans nos c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s , les syst&nes e n z y m a t i q u e s de la vote de novo ne sont i n d u c t i b l e s ni p a r I'AMP c y c l i q u e ni p a r le glucagon ; il n'est c e p e n d a n t pas exclu qu'ils ne putssent r 6 p o n d r e in vitro h ces m6mes substances. I I - - Foie n~oplasique. Nos t u m e u r s h6patiques qu'elles soient i n d u i t e s ou greff6es, u t i l i s e n t aussi real l ' a c i d e o r o t i q u e que le foie foetal. Le p h 6 n o m ~ n e est d6jh net avec les h6patomes i n d u i t s h c r o i s s a n c e lente. Des r6sultats s e m b l a b l e s ont 6t6 publi6s [4, 6, 5]. Les syst~mes e n z y m a t i q u e s impliqu6s ont d6jh fait l ' o b j e t d ' i n v e s t i g a t i o n s . Si dans le foie tumoral, il semble hien d6montr6 que les p r e m i 6 r e s r6actions e n z y m a t i q u e s de la vote m6tabolique c o n d u i sant de l ' a s p a r t a t e h I'UMP sont actives ; Reid et Morris [13] et plus r 6 c e m m e n t B r e s n i c k et coll. [143 ont montr6 que l'6tape qui c o n d u i t de l ' o r o tate "h I'UMP et qui consiste en une p y r o p h o s p h o r y l a t i o n suivie d ' u n e d 6 c a r b o x y l a t i o n a u n e activit6 tr6s abaiss6e dans d i v e r s t y p e s d ' h 6 p a t o m e s p a r r a p p o r t au foie n o r m a l .
C. Lafarge et C. Frayssinet.
480
Dans l'h6patome, la synth~se des nucl6otides p y r i m i d i q u e s d o i t d o n c se f a i r e p a r u n e a u t r e v o i e q u e c e l l e c l a s s i q u e m e n t d 6 c r i t e p o u r le f o i e n o r mal ; l'activit6 tr~s augment6e de l'uridine kinase d a n s la p l u p a r t d e s t u m e u r s s u g g 6 r e q u e l ' u r i d i n e s o i t u n p r 6 c u r s e u r d i r e c t d e I ' U ~ P [15, 16, 17, 18, 19, 2~] et q u e l a v o i e d e s y n t h ~ s e p a r a l l 6 1 e s o i t pr~pond6rante pour la synth~se du RNA tumoral. L e f o i e foetal et l ' h 6 p a t o m e r 6 p o n d e n t d o n c d e la m~me mani6re h l'administration d'acide orot i q u e . D a n s les d e u x c a s il s ' a g i t d ' h ~ p a t o c y t e s soumis h des divisions cellulaires intenses. Cepend a n t le p h 6 n o m 6 n e o b s e r v 6 n ' e s t p a s li6 h l a c r o i s s a n c e c a r d a u s le f o i e d e j e u n e s r a t s c o m m e d ' a i l l e u r s d a n s le foie e n h y p e r t r o p h i e c o m p e n s a t r i c e , l ' a c i d e o r o t i q u e est b i e n u t i l i s 8 d a n s les s y n t h e s e s nucl6iques. I1 s ' a g i t d o n c d ' u n p h 6 n o m ~ n e d e d i f f @ e n c i a t i o n c e l l u l a i r e : la v o l e de n o o o n ' e s t i n d u i t e q u e q u e l q u e s j o u r s a p r ~ s la n a i s s a n c e et c o r r e s p o n d p o u r l'h6patocyte hun certain degr6 de maturit6, qui est p e r d u d a n s l a c a n c 6 r i s a t i o n . Depuis Warburg des similitudes d'6quipement et d e f o n c t i o n n e m e n t e n z y m a t i q u e e n t r e le f o i e foetal et l ' h 6 p a t o m e o n t s o u v e n t 6t6 6 v o q u 6 e s . L a s i g n i f i c a t i o n d ' u n tel p a r a l l 6 1 i s m e est d i f f i c i l e s a i s i r . O n p e u t l u i a t t r i b u e r u n r61e f o n d a m e n t a l et i m a g i n e r q u e l ' a c q u i s i t i o n p a r l ' h 6 p a t o m e d ' u n caract6re biochimique de type embryonnaire est e n l i a i s o n d i r e c t e a v e c le m 6 c a n i s m e d e l a c a n c 6 r i s a t i o n o u b i e n s u p p o s e r q u e l a p e r t e d ' u n syst b m e e n z y m a t i q u e n ' e s t q u e la c o n s 6 q u e n c e d e la d6diff6renciation cellulaire qui accompagne toujours la transformation canc6reuse. Remerciemenls.
Ce t r a v a i l a bdn6ficid d ' u n e s u b v e n t i o n de la Ligue N a t i o n a l e Fran~aise contre le Cancer. P,~SUM~. On a dtudi6 chez le rat, l ' i n e o r p o r a t l o n de l'acide orotique d a n s le RNA de foie foetal et n 6 o n a t a l et dans le RNA d ' h 4 p a t o m e s de diverses origines (h6patomes i n d u i t s a u DAB ou h l'aflatoxine et t u m e u r greff6e LF). On a m o n t r 6 que : 1 °) L'acide orotique s'incorpore m o i n s bien dans le RNA h d p a t i q u e foetal que dans le RNA h 6 p a t i q u e du r a t a d u l t e lorsque le pr~curseur est inject0 intrap~rit o n 6 a l e m e n t h la femelle gestante. I1 ne s'agit pus d'un b a r r a g e p l a c e n t a i r e p o u r l'acide orotique car le mdme ph6nom~ne est observ6 lorsque le prdcurseur est a d m i nistr6 d i r e c t e m e n t dans la cavit~ p~riton~ale des foetus. D'autres prdcurseurs moins sp6cifiques tels que le p h o s p h o r e 32 s ' i n c o r p o r e n t tr6s b i e n d a n s le RNA h6patique f~etal. Ce n ' e s t qu'h p a r t i r du 2* j o u r apr6s la naissance que l'acide orotique s'incorpore bien dans le RNA BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
h6patique et a u m o m e n t du sevrage l'aetivit6 sp~cifique du RNA a t t e i n t u n e v a l e u r sup6rieure h celle trouv~e chez l'adulte. 2 °) P o u r les t r o i s types d'h~patomes envisages, l'acide orotique s'incorpore m o i n s b i e n dans le BNA t u m o r a l que d a n s le RNA h~patique. Avec le phosp h o r e 32 les r6sultats sont e x a c t e m e n t inversds, Finc o r p o r a t i o n du p r d c u r s e u r est m e i l l e u r e d a n s le RNA t u m o r a l que dans le RNA hdpatique. Ces r&sultats sugg~rent que les syst6mes e n z y m a tiques de la voie de nooo sont peu actifs dans ]e foie foetal et dans les h d p a t o m e s ~tudi~s. Dans nos conditions exp~rimentales ces syst6mes ne sont induits ni p a r le glucagon ni p a r ]'AMP cyclique.
ZUSAMMENFASSUNG.
Bei der B a t t e w u r d e d e r E i n b a u der Orots~iure i n die RNA der Leber des Fetusses u n d des n e u g e b o r e n e n Tieres u n d in die RNA yon H e p a t o m e n verschiedener H e r k u n f t (Hepatome, die d u r e h DAB oder Aflatoxin urLd t r a n s p l a n t i e r t e T u m o r e n LF h e r v o r g e r u f e n wurden) u n t e r s u c h t . Diese U n t e r s u c h u n g e n zeigten : 1. Die Orots/iure i n k o r p o r i e r t sich ~veniger gut in die RNA des H e p a t o m s des Fetusses als in die BNA des Hepatoms der a u s g e w a c h s e n e n Ratte, ~ e n n die Orots/iure i n t r a p e r i t o n e a l e i n e m tr~ichtigen W e i b c h e n i n j i ziert wird. Da die gleiche E r s c h e i n u n g b e o b a c h t e t wird, w e n n d e r Vorl~iufer d i r e k t in die P e r i t o n e a l h S h l e des Fetusses i n j i z i e r t wird, h a n d e l t es sich n i c h t urn: eine Sperre der P l a z e n t a gegeniiber der Orots~iure. Andere weniger spezifische Vorl~iufer ",vie P h o s p h o r 32 w e r d e n sehr gut in die RNA des H e p a t o m s eines Fetusses eingebaut. - - Erst vom zweiten Tag nach d e r Gebm~ a n i n k o r poriert sich die Orots~iure gut i n die RNA eines Hepatoms, und zur Zeit der M ilcbent~v6hnung n i m m t die spezifische Aktivit/it der RNA einen den beim e r w a c h s e n e n Tier /ibertreffenden W e r t an. 2. B e t r a c h t e t m a n all drei T y p e n von Hepatomen, so i n k o r p o r i e r t sich die Orots~iure i n die RNA eines T u m o r s weniger gut als in die RNA eines Hepatoms. Mit P h o s p h o r 32 sind die Ergebnisse genau umgekehrt, die I n k o r p o r a t i o n des Vorl~iufers ist i n die RNA eines T u m o r s besser als in die RNA eines Hepatoms. --Diese Ergebnisse legen nahe, dass die e n z y m a tischen Systeme des de nouo Weges i n der Leber des Fetusses u n d den u n t e r s u c h t e n H e p a t o m e n n u r schwach a k t i v sind. U n t e r u n s e r e n e x p e r i m e n t e l l e n B e d i n g u n g e n werden diese Systerr~e w e d e r d u r c h das Glukagon noch d u r c h das zyklische AMP induziert. BIBLIOGRAPHIE. 1. Minguell, J., Salinas, F. a Peretta, M. (1969) Gro~wth, 35, 217. 2. Hayashi, T., S~win, D. H. & W i a n d , S. (1969) Amer Y. Obst. and Gynecol., 105, 1261. 3. Bresnick, E., Lanclos, K. & Gonzales, E. (1965) Bioehim. Biophys. Aeta, 108, 568. 4. Weber, G., Singhal, R. L. ~ Srivastava, S. K., (1965) Ado. in E n z y m e Regulation, 3, 369. 5. Matsudaira, H., N a k a m u r a , C. & Hishizawa, T. (1968) Gann., 59, 61. 6. F r a y s s i n e t , C. & Lafarge, C. (1966) J. Physiol., 58, 520. 7. Chauveau, J., Moul$, Y. a Rouiller, C. (1956) E x p t l Cell. Res., 1)1, 317.
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all
R61e mineur de la vole d e novo dans la biosynth6se du RNA cours du ddveloppement foetal et ndoplasique du foie chez le rat. C. LAFARGE et C. FRAYSSINET (*). Institut
d e R e c h e r c h e s S c i e n t i f i q u e s s u r le C a n c e r , B . P . n ° 8, 94 - V i l l e i u i [ , F r a n c e . (12/1/1972).
S u m m a r y . - - Studies on the incorporation of orotic acid in the RNA of foetal and neonatal rat liver and in the RNA of hepatomas of various origin (hepatomas induced with DAB or aflatoxine and transplantable hepatomas LF) have shown that : 1 ° ) O r o t i e acid injected intraperitoneally in a pregnant female, is incorporated to a lesser extent in foetal hepatic RNA than in the hepatic RNA of adult rats. The placenta does not block the orotic acid because the same phenomenon is observed when the precursor is injected directly into the peritoneal cavity of the foetus. Other precursors less specific such as 32p are incorporated very well in foetal hepatic RNA. There is a good incorporation of orotic acid at the second day after birth ; the specific activity of the weanling rat hepatic RNA attains a superior value to that found in the adult rat. 2 °) For the three types of hepatomas examined, orotic acid is incorporated to a lesser extent in tumoral RNA than in hepatic RNA. W i t h 32p, the results are exactly reversed as the incorporation of the precursor is better in tumoral RNA than in hepatic RNA. The results suggest that the enzymatic systems of the de n o v o pathway are not very active in foetal liver and in the hepatomas studied. With our experimental conditions, these enzymatic systems are not induced by glueagon nor by cyclic AMP.
D a n s le foie de rat c o m m e d a n s la p l u p a r t des tissus d ' e u c a r y o t e s , la s y n t h ~ s e des n u c l 6 o t i d e s p y r i m i d i q u e s est e s s e n t i e l l e m e n t assur6e p a r la vole m6tabolique de novo dans laquelle l'aspartate p r o v e n a n t du c y c l e de K r e b s est t r a n s f o r m 6 en a c i d e o r o t i q u e p u i s en UMP. A c6t6 de c e t t e v o l e m a j e u r e il e x i s t e u n e v o l e de s y n t h b s e parall61e ( s a l v a g e p a t h w a y ) q u i fait i n t e r v e n i r l ' u r a c i l e p u i s l ' u r i d i n e c o m m e p r 6 c u r s e u r s de I'UMP. D a n s le foie, cette s e c o n d e v o l e est assez p e u f o n c t i o n n e l l e et h q u a n t i t 6 6gale de p r 6 c u r s e u r inject6, l ' a c i d e o r o t i q u e est b i e n m i e u x utilis6 q u e l ' u r a c i l e et l'uridine. T o u t c e c i c o n f b r e un rSle p r i v i l 6 g i 6 h l ' a c i d e o r o t i q u e darts la b i o s y n t h 6 s e d u R N A et e x p l i q u e q u e ce soit le p r 6 c u r s e u r le p l u s c o u r a m m e n t utilis6 p o u r 6 t u d i e r les s y n t h 6 s e s de R N A h 6 p a t i q u e . D a n s u n f o i e n o r m a l l ' e s s e n t i e l de la s y n t h b s e dn R N A 6taut assur6 p a r la v o l e d e n o v o , on s'att e n d fi t r o u v e r u n e m e i l l e u r e i n c o r p o r a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e darts un foie en c r o i s s a n c e q u e d a n s u n foie a d u l t e au r e p o s . Ce fair a 6t6 v6rifi6 exp6rimentalement pour rhypertrophie compen(*) A v e c l a collaboration technique de S. Mousset.
s a t r i c e q u i suit u n e h 6 p a t e c t o m i e p a r t i e l l e , m a i s les r6sultats s o n t c o n t r o v e r s 6 s darts d ' a u t r e s cas de c r o i s s a n c e h 6 p a t i q u e , en p a r t i c u l i e r l o r s du d 6 v e l o p p e m e n t foetal et au c o u r s de la t r a n s f o r m a t i o n c a n c 6 r e u s e du foie. E n ce q u i c o n c e r n e le f o i e foetal alors q u e Minguell et coll. [1] s i g n a l e n t u n e m a u v a i s e i n c o r p o r a t i o n d e l ' a c i d e o r o t i q u e darts le R N A l o r s q u e le p r 6 c u r s e u r est i n j e c t 6 p a r v o l e i n t r a p 6 r i t o n 6 a l e la m b r e ; H a y a s h i , S w i n et W i a n d [2~ r a p p o r t e n t au c o n t r a i r e u n e tr6s b o n n e i n c o r p o r a t i o n d u pr~c u r s e u r d a n s le foie de foetus de 20 jours. P o u r B r e s n i c k et coll. [3] l ' a c i d e o r o t i q u e s ' i n c o r p o r e real l o r s q u e le p r 6 c u r s e u r est i n j e c t 6 h la m b r e , m i e u x l o r s q u ' i l est i n j e c t 6 d i r e c t e m e n t a u x foetus. C e p e n d a n t si n o u s r a p p o r t o n s les c h i f f r e s d ' a c t i vit6 s p 6 c i f i q u e p r 6 s e n t 6 s p a r ces a u t e u r s ~ u n e m 6 m e q u a n t i t 6 de p r 6 c u r s e u r a d m i n i s t r 6 p a r u n i t 6 de p o i d s , n o u s n o u s a p e r c e v o n s que l ' a c t i v i t 6 sp6c i f i q u e q u ' i l s o b t i e n n e n t p o u r le R N A h 6 p a t i q u e foetal r e s t e t o u j o u r s i n f 6 r i e u r e h l ' a c t i v i t 6 sp6cifique du R N A h 6 p a t i q u e m a t e r n e l . P o u r le foie n 6 o p l a s i q u e les r6sultats s o n t p l u s nets : W e b e r et coll. [4], p l u s r 6 c e m m e n t Matsu-
472
C. L a f a r g e el C. F r a y s s i n e t .
d a i r a et coll. [5] et nous-m6mes [6] avons m o n t r 6 que l ' a c i d e orotique s ' i n c o r p o r e b e a u c o u p m o i n s bien dans le RNA d'h6patomes de diverses origines que dans le RNA de foie t6moin. Les exp6riences que nous r a p p o r t o n s ici ont p o u r but de pr6ciser l ' i m p o r t a n c e de la vote de synth6se de novo dans le foie au cours du d6vel o p p e m e n t f~etal et n6onatal et de c o m p a r e r h cet 6gard le foie foetal et n6oplasique.
--
- - les jeunes rats. Nous consid6rons que le lend e m a i n de la n a i s s a n c e est le p r e m i e r jour de la vie postnatale. Les rats au sevrage sont sacrifi6s au 20 e jour apr6s la naissance.
2 °) Rats porteurs de tumeurs. Nous nous sommes adress6s h deux types de tumeurs : - - des tumeurs induiles chez le rat p a r ingestion d ' u n r6gime c o n t e n a n t soit de l'aflatoxine, soit du p a r a d i m 6 t h y l a m i n o - a z o b e n z 6 n e (DAB).
MATERIEL E T METHODES. I
p e n d a n t la dur6e de F i n c o r p o r a t i o n du pr6eurseur.
ANIMAUX.
Nous utilisons des rats W i s t a r C o m m e n t r y 61ev6s au laboratoire et m a i n t e n u s depuis leur
- - une t u m e u r greffde que nous appelons h6patome LF et qui a p o u r origine u n h6patome i n d u i t au DAB. Elle est e n t r e t e n u e au l a b o r a t o i r e p a r
TABLEAU I. Activit~ sp~cifique du R N A h~patique total apr~s injection d'acide orotique v,C.
Temps d'ineorporation
hnimaux inject6s
A. S. du RNA h6patique total
(6)
2 heures
Foie maternel Foie foetal
510 50
(3)
24 heures
Foie maternel Foie foetal
750 120
Foetus injeetds individuellement (46)
2 heures
200
(26)
2 heures
1880
(8)
2 heures
525
Femelles gestantes
J e u n e s rats au s e v r a g e R a t s adultes tomes
Tous les animaux reqoivent 10O ,~Ci/kg d'aeide o.rotiqne 14C, soit 2 heures, soit 24 heures avant le saerifiee. Nos ehiffres exp6rimentaux sont les moyennes de plusieurs exp6riences. Nous donnons entre-parenth6ses le nombre d'anlmaux utilis6s.
sevrage h u n r6gime s t a n d a r d semi-synth6tique 6quilibr6 leur a s s u r a n t u n e b o n n e croissance. 1 °) Foetus et jeunes rats. - - les foetus sont dat6s et pr61ev6s au 20e on 21 ~ jour de la vie foetale. (Nous consid6rons cornme p r e m i e r jour de la vie foetale le jour qui suit la fdcondation).
Les p r 6 c u r s e u r s sont inject6s soit p a r vote i n t r a p6riton6ale h la m6re, soit d i r e c t e m e n t dans la cavit6 p6riton6ale des foetus. Dans ce d e r n i e r cas la femelle gestante est anesth6si6e h l'6ther, u n e l a p a r o t o m i e est faite le long de la ligne b l a n c h e et les cornes ut6rines sont ext6rioris6es le temps m i n i m u m n6cessaire h l ' i n j e c t i o n de c h a c u n des foetus. La p a r o i a b d o m i n a l e est ensuite referm6e BIOCHIMIE, 1972, 54, n ~ 4-.
repiquage d ' u n b r o y a t de t u m e u r dans la cavit6 p6riton6ale de jeunes rats. C'est u n e t u m e u r h croissance r a p i d e a y a n t c e p e n d a n t gard6 des caract6res histologiques de tissu h6patique. Elle pousse en grappes de nodules suffisamment petits p o u r ne pas 6tre n6eros6s, on obtient ainsi envir o n 5,0.0 mg de t u m e u r p a r rat. II --- PR~CURS~EURS UTILIS~S. L'acide orotique 1~C (CMM 26) p r o v i e n t du CEA de Saclay. La t h y m i d i n e tritide est m a r q u 6 e soit sur Ie groupe m~thyle (TMM 79 du CEA), soit sur le cycle ( t h y m i d i n e triti6e p r o v e n a n t du Radiochem i c a l Center d'Amersham).
473
Vote de s y n t h ~ s e d u R N A d a n s le foie foetal et n d o p l a s i q u e . Le Pbosphore 32 p r o v i e n t du CEA de Saclay ( 3 2 p - s 2). I1 est sous forme de phosphate de s o d i u m en solution injectable. If[ - - T E C H N I Q U E S BIOCHIMIQUES.
- - Les n o y a u x sont prdpards selou la t e c h n i q u e de Chauveau el coll. [7~.
total des foetus est bien infdrieure "A celle du RNA hdpatique m a t e r n e l aussi bien p o u r u n temps court d ' i n c o r p o r a t i o n (2 heures) que p o u r u n temps long (24 henres), ce d e r n i e r temps c o r r e s p o n d a n t au m a x i m m n de la courbe d ' i n c o r p o r a t i o n de l'acide orotique dans le RNA hdpatique total. II - - Absence de barribre placentaire pour l'acide
- - Les acides nucldiqnes sont fractionnds puis dosds p a r la t e c h n i q u e de S c h m i d t et T h a n n h a u s e r modifide p a r Mould [81.
--Les mesures de radioactivit~ se font au spectromdtre ~ s c i n t i l l a t i o n T r i c a r b de P a c k a r d ou m u l t i m a t I n t e r t e c h n i q u e p o u r les doubles comptages 82p. 14C. Les quantitds de p r d c u r s e u r s inject6s sont rapportdes au poids des a n i m a u x de facon h p o u v o i r c o m p a r e r entre elles les diff6rentes activitds sp6cifiques.
orotique. La mauvaise i n c o r p o r a t i o n de l'acide orotique duns le RNA hdpatique foetal p o u r r a i t s ' e x p l i q u e r par l'existence d ' u n e b a r r i d r e p l a c e n t a i r e empdc h a n t le passage du p r d c u r s e u r de la mdre vers les foetus. P o u r 6carter cette 6ventualit6 nous avons procdd6 h deux sdries d'expdrienees. 1 ") Injection directe anx [cetus. Nous voyons tableau I que :
TABI.EAU II.
ActivitY, sp~cifique des acides nucldiques ~ t a u x et maternels aprbs 2 heures d'incorporation de diff~rents pr~curseurs.
Pr6eurseurs administr6s
Animaux traitds
Femelles gestantes
(3)
Sdrum dpm 1~C dpm 3H par ml
Mdlange d'aeide orotique t~C et de thymidine 3H (')
Foetus (24)
Phosphore 32 (")
Homogenat de foie A.S.
A.S.
RNA
DNA
Femelle
14
510 ] 200
Foetus
15
10 I 1050
Femelle
710
65
Foetus
6110
5690
(') Les femelles gestantes reqoivent en une injection mixte 1O0 ~xCi/kg d'acide orotique 14C et 200 i~Ci/kg de thymidine ~H. ('*) Chaque foetus d'environ 5 g reqoit 200 ,~,Ci de phosphore 32. A c6t6 de ehaque ehiffre expdrimental qui est une moyenne d'expdriences, figure entre parenthdses le nombre de points expdrimentaux. Les activitds spdcifiques (AS) sont exprimdes en ddsintdgrations p a r m i n u t e et p a r m i c r o g r a m m e de p h o s p h o r e RNA ou DNA. R,GSULTATS. A. FOlE
F(ETAL .ET NI~ONATAL.
I - - Mise en ~vidence d'une mauvaise incorporation de l'acide orotique dans le RNA hdpatique foetal aprbs injection du prdcurseur it la m~re. Les chiffres rapportds au tableau I nous mont r e n t que : l'aetivit6 sp6cifique du RNA hdpatique
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
a) L'aeide orotique s ' i n e o r p o r e mieux dans le RNA hdpatique foetal aprds i n j e c t i o n direete aux foetus, ceei du simple f a r que la c o n c e n t r a t i o n en p r d c u r s e u r rdalisde au n i v e a u d u foie foetal est plus i m p o r t a n t e p a r i n j e c t i o n i n t r a p d r i t o n d a l e direete que p a r i n j e c t i o n via la femelle gestante. b) Cependant, aprds i n j e c t i o n directe aux foetus, p o u r une m~me quantit6 de p r d c u r s e u r inject6 p a r unit6 de poids et p o u r u n mdme temps d ' i n c o r p o ration, l'aetivitd spdeifique du RNA hdpatique total reste bien i n f d r i e u r e ehez les foetus, n o n seulement h celle trouvde p o u r de jeunes rats au sevrage (done en phase de croissanee hdpatique aussi r a p i d e que celle des foetus) mats encore h eelle
C. Lafarge et C. Frayssinet.
474
TABLEAU IlI.
Evolution de l'incorporation des prdcurseurs dons les aeides nucl~iques hdpatiques au cours de la croissance foetale et postnatale du rat. A. S. du RNA Age des animaux
Ac. orotique
A.S. du DNA 14¢ Thymidine 3-----3--~-r r 3,,
32r
t4c
32r
! (46)
200
(24)
6110
0,03
(7)
1580
(24)
5690
~ (40)
130
(18)
6785
0,02
(19)
1625
(18)
3940
1 jour apr~s la naissance.. :i (14)
260
(7)
7125
(8)
2670
(7)
7150
2 jours . . . . . . . . . . . . . . . . .
805
(4)
1810
Foetus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J o u r de la naissance . . . . . . .
.
(8)
--
!.__
(8)
1810 1310 1530
3 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . .
i (13)
835
(8)
4 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . .
(8)
730
(8)
6 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . .
(4)
2070
(5)
1600
(26)
1880
(9)
865
--
(6)
510
(3)
200
--
(13)
525
15 jours . . . . . . . . . . . . . . . . . R a t s au sevrage (20 j) . . . . . . Femelles gestantes . . . . . . . . Rats mfiles adultes . . . . . . . . .
(5)
(10)
5400
4000
--
(10)
600
T o u s l e s pr6curseurs sont a d m i n i s t r 6 s p a r voie i n t r a p 6 r i t o n 6 a l e 2 h e u r e s a v a n t le sacrilice des a n i m a u x : - - l'acide orotique est a d m i n i s t r 6 ~ r a i s o n de 1O0 :t,Ci/kg, la t h y m i d i n e ~H h r a i s o n de 200 ~t~Ci/kg. Les a n i m a u x de certaines s6ries reqoivent les deux pr6curseurs simultan6ment ; - - nous a d m i n i s t r o n s 200 uCi de ~32p aux foetus et p o u r les j e u u e s rats la q u a n t i t 6 de p r 6 c u r s e u r inject6 est ajust6e /~ leur poids. Les rats adultes regoivent 1 mCi de 32p. P o u r pouvoir c o m p a r e r r i g o u r e u s e m e n t les r6sultats nous r a p p o r t o u s tontes Ies activitds spdcifiques ~ une m~me q u a n t i t 6 de prdcurseur injectd p a r kg ; -- les r a t s de certaines s6ries recoivent s i m u l t a n 6 m e n t l'acide orotique 14C et lc ~2P ; - - les chiffres entre p a r e n t h b s e s r e p r 6 s e n t e n t le n o m b r e de points e x p 6 r i m e n t a u x pour lesquels nons d o n n o n s la m o y e n n e des rdsultats. m e s u r 6 e d a n s le f o i e d e f e m e l l e s g e s t a n t e et d e r a t s a d u l t e s rn~les. 2 °) Injection d'un m~lange d'acide orotique 1~C et de thymidine 3H aux [emelles gestantes. Cette exp6ricnce a pour but de contrSter la pr6s e n c e d e s d e u x p r 6 c u r s e u r s d a n s le s a n g d e s f o e t u s ' et d e c o m p a r e r le r a p p o r t ~C/-3H m e s u r 6 d a n s le s a n g foetal ~ c e l u i r e t r o u v 6 d a n s le s a n g m a t e r n e l . L e s r 6 s u l t a t s r 6 u n i s d a n s le t a b l e a u I I n o u s p e r mettent de voir que : a) d a n s le s 6 r u m les r a p p o r t s d e s d p m p a r m l e n 1~C et ~H s o n t les m 6 m c s p o u r les f e m e l l e s gest a n t e s et l e u r s ~oetus. Ceci m o n t r e q u e l o r s d u sacrifice des animaux, un m6me 6quilibre entre p r 6 c u r s e u r s est a t t e i n t d a n s le s a n g d e l a m b r e et d e s foetus. Ce r 6 s u l t a t v a ~ l ' e n c o n t r e d e l ' e x i s t e n c e d'une barri6re placentaire sp6cifique pour l'acide orotique.
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
b) L ' i n c o r p o r a t i o n d e t h y m i d i n e t r i t i 6 e e s t t r b s i m p o r t a n t e d a n s le D N A foetal et f a i b l e darts le D N A d u f o i c d e s f e m e l l e s : les s y n t h 6 s e s d e D N A s o n t e n effct t r 6 s p e u a c t i v e s d a n s u n o r g a n e adulte quiescent. c) A u c o n t r a i r e , l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e d u R N A h 6 p a t i q u e foetal e s t b i e n i n f d r i e u r e h c e l l e d u R N A h 6 p a t i q u e m a t e r n e l , ce q u i r e n d d v i d e n t e l a m a n valse utilisation de l'acide orotique. ]II --
Bonne incorporation du phosphore 32 dans le RNA hdpatique foetal.
P o u r v 6 r i f i e r q u e les s y n t h b s c s d e R N A s o n t a c t i v e s c h e z n o s ~cetus et q u e d ' a u t r e s p r 6 c u r s e u r s peuvent 6tre incorpor6s, nous leur avons administ r 6 d u 32p, p a r v o l e i n t r a p 6 r i t o n 6 a l e . S u r le t a b l e a u I I n o u s v o y o n s q u e : a) le p h o s p h o r e 32 s ' i n c o r p o r e t r 6 s b i e n d a n s le R N A foetal, a u s s i b i e n si ce n ' e s t m i e u x q u e d a n s le DNA.
Voie de synth~se du RNA dans le foie foetal et ndoplasique.
475
TABEAU IV.
Incorporation d'acide orotiqne ~',C dans du RNA d'h~patome. RNA total
H6patomes grefffis (') H6patomes induits h l'aflatoxine C')
(7) (12)
Incorporation (4) 30' Incorporation (4) 1 h 30' (5)
H ~ p a t o m e s
induits au DAB (**)
T6moins Porteurs de greffe
(5)
Foie Foie Tumeur
Activit6 sp6cifique
Activit6 sp6cifique
P. RNA P. DNA
770 920 85
15 675 22 340 1 190
0.21 0.15 0.33
4 650 600 6 550 755
0.20 0.48 0.16 0.37
550 700
10 150 7 720
0.20 0.21
230 300 205 345 135 85
1 800 730 400
0.45
Foie Tumeur Foie Tumeur
T6moins
Foie Foie Nodules -50 mg Porteurs - 100 mg d'hdpatome I - - 100-500 mg - - 500 mg --2g --4g
RNA nucl6aire
(*) Les animaux greffds et leurs t6moins reqoivent 25 tLCi d'acide orotique 14C, 45' avant ]cur sacrifice. (**) Les animaux porteurs d'h6patomes induits h l'aflatoxine reqoivent 100 uCi/kg d'aeide orotique 14C soit 30' soit 1 h 30 avant leur sacrifice. (***) Nous injectons 100 i~Ci/kg d'aeide orotique 14C 2 heures avant le sacrifice des animaux porteurs d'h6patomes induits au DAB et de leurs t6moins. Les r6sultats sont les moyennes d'un nombre de points expdrimentaux que nous indiquons entre parenth6ses.
b) la p e t i t e q u a n t i t 6 de p r 6 c u r s e u r q u i p 6 n 6 t r e et s ' i n e o r p o r e d a n s le foie m a t e r n e l n o u s p e r m e t de c o n s t a t e r c o m m e clans la s6rie p r 6 c 6 d e n t e q u e le R N A h 6 p a t i q u e des f e m e l l e s est d i x l o i s p l u s m a r q u 6 q u e l e u r DNA.
des foetus, c ' e s t - h - d i r e b i e n i n f 6 r i e u r e h celle du R N A h 6 p a t i q u e de l ' a d u l t e et h f o r t i o r i de j e u n e s rats d ' u n e s e m a i n e . Ce n ' e s t q u e d e u x j o u r s apr6s la n a i s s a n c e q u e les a e t i v i t 6 s s p 6 c i f i q u e s d u R,NA d e v i e n n e n t s u p 6 r i e u r e s h eelles t r o u v 6 e s e h e z l'adulte.
Evolution de l'incorporation des prdcurseurs darts les acides nucl~iques h~patiques au coars du d ~ v e l o p p e m e n t [cetal et postnatal.
- - Apr6s m a r q u a g e au 32p au c o n t r a i r e l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e du RNA h 6 p a t i q u e est p l u s 61ev6e p e n d a n t la vie foetale et le d 6 b u t de la v i e p o s t n a t a l e q u e p l u s tard.
IV-
N o u s m e s u r o n s apr6s i n j e c t i o n des d i f f 6 r e n t s p r 6 c u r s e u r s les a c t i v i t 6 s s p 6 c i f i q u e s du R N A h6pat i q u e t o t a l et du D N A de foetus de 2:1 j o u r s et n o u s les c o m p a r o n s "h celles de n o u v e a u - n 6 s , de j e u n e s rats au s e v r a g e , de f e m e l l e s g e s t a n t e s et de r a t s a d u l t e s tomes. Les r6sultats s o n t r 6 u n i s s u r le t a b l e a u III, n o u s v o y o n s q u e :
a) Pour le RNA. -- Apr6s marquage h l'acide orotique l'activit6 s p 6 c i f i q u e du R N A h 6 p a t i q u e des r a t s sacrifi6s le j o u r de la n a i s s a n e e r e s t e tr~s c o m p a r a b l e fi celle
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
Cette d i l f 6 r e n c e e n t r e l ' i n e o r p o r a t i o n des d e u x p r 6 c u r s e u r s d a n s le R N A est m a t 6 r i a l i s 6 e p a r le r a p p o r t AS ~4C/AS 32p q u i e h e z les foetus et les n o u v e a u - n 6 s est b e a u e o u p p l u s f a i b l e q u e e h e z les a d u l t e s et que c h e z les ]eunes rats.
b) Pour le DNA. Les i n c o r p o r a t i o n s de t h y m i d i n e 3H et de 32p s o n t tr6s i m p o r t a n t e s d a n s le f o i e p e n d a n t t o u t e la vie f ~ t a l e et p o s t n a t a l e . Les aetivit6s s p 6 e i f i q u e s du DNA s o n t p l u s 61ev6es e h e z les foetus et les n o u v e a u - n 6 s q u e e h e z les j e u n e s rats et e h e z les adultes.
C. Lafarge et C. Frayssinet.
476
TABLEAU V.
Incorporations cornpar~es de dif[~rents pr~curseurs des acides nuclkiques dans l'h6patome gre[f~ LF. Pr6cursenrs admiaistr6s Thymidine 3H (1 h) (6) Ae. orotique 14C (45 ') (12) Phosphore 32 (45 ') (6)
A,S.
A,S.
RNA aucl~aire
DNA
P. RNA nuel~aire DNA
50
0.21
_ 765
0.55
Foie Tumeur Foie Tumeur
6600
0.19
70
0.58
Foie
1500
130
0.23
Tumeur
1600
140
0.62
La thymidine est administr~e aux animaux h raison de 40 a c t pendant 1 heure. L'aeide orotique h la dose de 12 ~Ci pendant 45 minutes. Le z2p h la dose de 100 lxCi, 45 minutes avant le sacrifice. Pour ehaque s~rie expdrimentale nous donnons la moyenne des r~sultats et entre-parentheses le hombre de points exp6rimentaux. B. HEPATOME GnEFFI~ ET INDUIT.
I - - Mise en ~vidence d'une mauvaise incorporation de l'acide orotique dans le RATA d'h~patome. Dans les s6ries expdrirnentales suivantes nous dtudions d ' u n e p a r t les turneurs h c r o i s s a n c e tr~s r a p i d e que sont les h6patomes greffds LF, d ' a u t r e p a r t les turneurs h c r o i s s a n c e lente que sont ]es h6patomes i n d u i t s h l'aflatoxine et au DAB. 1 °) Tumenrs gre[f~es. Sur le tableau IV nous v o y o n s que : les aetivit~s sp6cifiques de RNA total et nuel6aire sont toujours plus 61ev~es dans le foie (que ee soit le foie t6moin ou le foie de l ' a n i m a l p o r t e u r de greffe) que darts la lurneur. Les r a p p o r t s P. R N A / P . DNA qui d o n n e n t une i d l e de la quantit6 de RNA p a r n o y a u sont deux fois plus 61ev6s dans l'h6patorne que dans le foie des anirnaux t6rnoins ou p o r t e u r s de greffe. Ce r6sultat va dans le sens d ' u n e a b o n d a n t e synth6se de RNA dans les h~patornes et r e n d plus 6vidente la m a u v a i s e utilisation de l ' a e i d e o r o t i q u e p o u r la biosynth6se du RNA.
9_,0) Tumeurs induites. a) Hdpatomes induits par l'aflatoxine. Les r6sultats sont report6s sur le tableau IV : --les activit6s sp~cifiques du RNA nuel6aire mesur6es dans le foie p 6 r i t u m o r a l sont bien sup6r i e n r e s h celles trouv6es dans les tumeurs.
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
- - les r a p p o r t s P. R N A / P . DNA qui refl~tent les quantit6s de RNA p a r n o y a u sont lh e n c o r e trbs 61ev6es dans l'h6patorne. Du fait que les a n i m a u x p o r t e u r s d'h6patornes greff6s sont plus jeunes que eeux p o r t e n t s d'h6patome induit, l'activit6 sp6cifiqne du RNA nuel6aire est plus 61ev6e dans le foie des p o r t e u r s d'h6patomes greff6s.
b) Hdpatomes induits au DAB. Nous pr61evons d ' u n e p a r t le foie des a n i m a u x tbrnoins et d ' a u t r e p a r t le foie p6riturnoral et les diff6rents nodules des rats p o r t e u r s d'h6patomes. Lors du pr616vement des nodules nous 6cartons les masses t u m o r a l e s trop v o l u m i n e u s e s qui p o u r r a i e n t 6tre en grande p a r t i e n6eros6es et nous retenons des t u m e u r s d ' u n 6ventail de poids allant de 50 m g h 4 g. P o u r les trbs petits nodules nous nous effor$ons d'61irniner autant que faire se peut le tissu h6patique p 6 r i t u m o r a l de m6me que nous d6barrassons les plus gros nodules des zones 6ventuellernent n6eros6es. Les exarnens h i s t o l o g i q u e s pratiqu6s sur un c e r t a i n n o m b r e de nodules ont confirm6 leur earaetbre n6oplasique. Les r6snltats tableau IV.
obtenus
sont
r6unis
dans
le
- cornme dans les s6ries p r ( c 6 d e n t e s , les aetivit6s sp6eifiques des RNA total et nuel6aire obtenues aussi bien p o u r le foie de rat t6rnoin que p o u r le foie p 6 r i t u m o r a l sont sup6rieures h eelles trouv6es dans les diff6rentes nodules.
Vole de synthbse du RNA dans le foie foetal el ndoplasique. - - 1~ e n c o r e les r a p p o r t s RNA n u c l 6 a i r e / D N A sont plus 61ev6s p o u r les h6patomes que p o u r le tissu h6patique. En ce qui c o n c e r n e l'activit6 sp6cifique du RNA total des diff6rents nodules, les r6sultats sont homogbnes p o u r les t u m e u r s de petite taille et de taille m o y e n n e p a r c o n t r e ]es activit6s sp6cifiques TABLEAU VI.
Incorporations simultan~es d'acide orotique ~-',C et de Phosphore 32 dans le RNA total de l'h~patome greff~ LF. A. S. l~C
A.S. t~C
A.S. a~p
3 180
11 000
i
0,28
260
36 000
i
0,01
I Foie
(a) Tumeur
Les animaux reqoivent 2 heures avant leur sacrifice un m61ange d'acide orotique 14C (100 i~Ci/kg) et de :~:2p (1 mCi/kg). Nous rapportons les activit6s sp6cifiques en $2p h la m~me quantit6 de pr6eurseur inject6 par unit6 de poids que dans les s6ries pr6c6dentes aria de rendre tous les r6sultats imm~diatement comparables. Nous indiquons entre parentheses le nombre de s6ries exp6rimentales.
477
a) l'activit6 sp6cifique du RNA nucl6aire h6patique est bien s u p 6 r i e u r e h celle du RNA t u m o r a l apr6s m a r q u a g e h l ' a c i d e o r o t i q u e 14C, alors qu'apr6s m a r q u a g e au sap, les r6sultats obtenus sont du m&ne o r d r e p o u r le foie et la tumeur. b) l'activit6 sp6cifique du DNA est au c o n t r a i r e plus 61ev6e dans le cas de la t u m e u r que dans le cas du foie aussi bien aprbs m a r q u a g e h la t h y m i d i n e triti6e qu'aprbs m a r q u a g e au 32p. c) les r a p p o r t s R.NA/DNA sont c o m m e nous l ' a v o n s vu dans les s6ries pr6c6dentes plus 61ev6es dans l ' h 6 p a t o m e que dans le foie. 2 °) L o r s q u e les a n i m a u x r e c o i v e n t des injections mixtes d ' a e i d e o r o t i q u e et de 32p, nous v o y o n s (tableau VI) que les r6sultats obtenus p o u r le RNA total sont e n c o r e plus d6monstratifs : le r a p p o r t AS en 14C/AS en 3zp passe de 0,28 p o u r le foie & 0,01 p o u r la tumeur. C. SIMILITUDE DE COMPORTEMENT DU FOIE F(ETAL ET NEOPLASIQUE VIS-A-VIS DE L'ACIDE 0ROTIQUE.
Nous avons report~ sur la m~me figure les activit6s sp6cifiques du RNA total (apr~s m a r q u a g e l ' a c i d e orotique) et du DNA (apr~s m a r q u a g e ~ la t h y m i d i n e ) de foie foetal et n6onatal afin de les c o m p a r e r d ' u n e p a r t au foie de jeunes rats et d'adultes, d ' a u t r e p a r t au foie n6oplasique. AS
sont plus faibles p o u r les plus gros n o d u l e s de 2 4 g, ceci est peut-6tre dfi h la p r 6 s e n c e de tissu en vole de n6crose, difficile h r e p 6 r e r m a c r o s c o p i q u e m e n t et p a r cons6quent i m p o s s i b l e & 61iminer lors du pr61~vement. Les r6sultats obtenus avec les t u m e u r s i n d u i t e s (tumeurs "h c r o i s s a n c e lente) c o n f i r m e n t ceux obtenus avec les t u m e u r s greff6es (tumeurs h croissance r a p i d e ) et m o n t r e n t qu'il n ' y a pas de corr61ation entre l ' a p t i t u d e h i n c o r p o r e r l ' a c i d e orotique dans le RNA et le taux de c r o i s s a n c e de l'h6patomes. D ' a u t r e p a r t l ' a n a l y s e b i o c h i m i q u e des nodules de diff6rentes tailles m o n t r e que le p h 6 n o m b n e est 6tabli p o u r les plus petites t u m e u r s p e r c e p t i b l e s et isolables et qu'il est p a r cons6quent acquit tr~s tSt au cours de la t r a n s f o r m a t i o n eanc6reuse. II --- Incorporations
compar~es des di[[~rents pr~curseurs des acides nucl~iques dans I'hdpatome greff&
1 °) Les a n i m a u x r e ~ o i v e n t soit de l ' a e i d e orot i q u e a'C, soit de la t h y m i d i n e 3H, soit du 32p. Nous voyons sur le tableau V que :
BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
2500]
~]AS RNA NAS DNA
2.000 1500
IOOO
500 400 300 200 }O0 F£fTU5 N
1j. 2j. 3j.
4j. 5EVRAGAEoUtT E~UMEUR
F1c,. l. - - Variations de l'ineorporation de l'acide orotique et de la thymidine dans le RNA h~patique au cours du d6veloppement et dans l'h6patome greff6. i//// Aetivit6 sp6cifique du RNA h6patique total ..... apr6s 2 heures d'incorporation de 100 uCi/kg d'aeidc orotique 14C. i_/i_.__1 Activit6 sp6eifique du DNA h6patique apr6s 2 heures d'incorporation de 200 ~Ci/kg de thymidine 3H.
478
C. Lafarge et C. Frayssinet.
L a f i g u r e 1 m e t e n 6 v i d e n c e les d i f f 6 r e n c e s d ' a c t i v i t 6 s p ~ c i f i q u e q u i e x i s t e n t e n t r e le R N A h 6 p a t i q u e d e foetus e t d ' a d u l t e et p l u s e n c o r e e n t r e le R N A d e foetus et d e j e u n e s r a t s : l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i fique du RNA h6patique total, faible pendant la v i e fcetale et i m m 6 d i a t e m e n t a p r 6 s l a n a i s s a n e e , s'616~e j u s q u ' a u s e v r a g e p u t s d i m i n u e c h e z l ' a d u l t e t o u t e n se s t a b i l i s a n t h d e s v a l e u r s p l u s 61ev6es q u e c e l l e s r e n c o n t r 6 e s c h e z le foetus.
D. E F F E T DU GLUCAGON ET DE L'AMP CYCLIQUE S~UR L ' U T I L I S A T I O N DE. L ' A C I D E OROTIQ.UE P O U R LA B I O SYNT'HI~SE DES P Y R I M I D I N E S DANS LE F O I E F ( ~ T A L , NEONATAL ET NEOPLASIQ.UE.
Le fait que l'acide orotique s'incorpore peu dans le R N A d e foie foetal m a i s b i e n d a n s le foie d u r a t fig6 d ' u n e s e m a i n e s u g g 6 r e q u e les s y s t 6 m e s e n z y matiques impliqu6s ne sont induits qu'apr6s la
TABLEAU VII.
E[fets du glucagon et de I'AMP cycliql~e sur l'incorporation de l'acide orotique *~C dans le RNA total au cours du d~veloppement foetal, ndonatal et n~oplasique du [oie. Conditions exp6rimentales
A.S. du RNA total Femelle
650
Foetus
130
Femelle
5O5
(3) T~moins Femelles gestantes (3) Glueagon 4 heures 500 pg
Nouveau-n6s de 3 jours
Foetus
6
(3) T4moins
1 470
(6) Glueagon 6 heures p.g
1 525 Foie
2 150
(2} T6moins
Rats porteurs de t u m e u r greff4e
Rats de 1 jour
470
Tumenr (5) Glucagon 4 heures 100 p.g
(6) (5) (4) (6)
Foie
2 420
Tumeur
T4moins AMP cyclique 2 heures AMP cyclique 4 heures AMP cyelique 24 heures
42O 476 525 585 300
___~ 73 ~ 34 ~___53 ~___25
T o u s l e s a n i m a u x re~oivent 100 uCi/kg d'acide orotique 14C, 2 h e u r e s a v a n t l e u r sacrifice : - - les femelles gestantes reqoivent 500 ~g de glucagon p e n d a n t 4 h e u r c s ; - - les nouveau-n6s de 3 j o u r s 100 i~g de glucagon p e n d a n t 6 h e u r e s ; - - les rats p o r t e u r s d ' h 6 p a t o m e s greff6s 100 r~g de glucagon p e n d a n t 4 h e u r e s ; - - les rats de 1 j o u r re~oivent 250 Jag de d i b u t y r y l AMP cyclique 2 heures, 4 h e u r e s ou 24 h e u r e s a v a n t leur sacrifice. Chaque r 6 s n l t a t est la m o y e n n e d ' u n n o m b r e de points e x p 6 r i m e n t a u x que nous pr6cisons e n t r e parenth6ses. Darts la s~rie de rats trait4s h I'AMP cyclique et leurs t6moins, h chaque m o y e n n e est assoei6e l ' e r r e u r s t a n d a r d h la lnoyenne.
P o u r le D N A les r 6 s u l t a t s s o n t e x a e t e m e n t i n v e r s6s : l ' a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e 61ev6e p e n d a n t r o u t e la v i e foetale et n 6 o n a t a l e d i m i n u e h p a r t i r d u s e v r a g e p o u r a t t e i n d r e les f a i b l e s v a l e u r s t r o u v 6 e s c h e z radulte.
n a i s s a n c e . D ' a u t r e p a r t , l a d 6 d i f f 6 r e n c i a t i o n eellulaire qui accompagne toujours la transformation m a l i g n e d e s c e l l u l e s p e u t e x p l i q u e r q u e c e s syst 6 m e s s o i e n t p e u f o n c t i o n n e l s d a n s les h 6 p a t o m e s que nous avons 6tudi6s.
D ' a u t r e p a r t le p a r a l 1 6 1 i s m e e n t r e f o i e ~oetal et h6patome tant pour l'aetivit6 sp6eifique du RNA q u e p o u r c e l l e d u D N A est f r a p p a n t e .
Nous avons donc tent6 de stimuler l'incorporat i o n d e l ' a c i d e o r o t i q u e d a n s le R N A p a r d e s a g e n t s tels q u e le g l u c a g o n et I ' A M P c y c l i q u e q u i
BIOCHIMIE, 1'972, 54, n ° 4.
Vote de s y n t h b s e d u R N A d a n s le foie [oetal el n d o p l a s i q u e .
sont r e s p o n s a b l e s de l ' i n d u e t i o n ou de la d6r6p r e s s i o n de bon n o m b r e d ' e n z y m e s darts le foie adulte. Nous avons adopt6 des c o n d i t i o n s exp6rim e n t a l e s p r o c h e s de celles p o u r lesquelles J. P. Jost et coll. [9] ont p u o b t e n i r in vivo l ' i n d u c t i o n de s6rine d6shydratase. 1 °) Action du gIucagon. Le glucagon agit p a r l ' i n t e r m 6 d i a i r e de r A M P cyclique. Son effet est m a x i m u m 4 ~ 6 h e u r e s aprbs l'administration. Nous v o y o n s sur le t a b l e a u VII qu'il n ' y a p a s de diff6rence d ' i n c o r p o r a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e dans le RNA e n t r e les a n i m a u x trait6s et leurs t6moins aussi b i e n p o u r le foie que p o u r la t u m e u r ( d a n s le cas des a n i m a u x p o r t e u r s d ' h 6 p a t o m e s ) . 2 °) Action de I'AMP cyclique. L'AMP c y c l i q u e est a d m i n i s t r 6 sous f o r m e dibutyryl. Nous v o y o n s (tableau VII) que l ' i n c o r p o r a tion d ' a c i d e orotique ~4C n'est p a s significativem e n t p l u s i m p o r t a n t e dans le RNA h 6 p a t i q u e des nouveau-n6s trait6s h 1'AMP c y c l i q u e que dans celui des t6moins du m6me hge. Le glucagon et I'AMP c y c l i q u e sont donc in vivo dans nos c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s sans effet sur la vote de synthbse de novo. DISCUSSION DES I~ESU~,TATS. I - - Foie fcetal et n~onatal.
L ' a c i d e orotique s ' i n c o r p o r e real dans le RNA h6patique foetal, c e p e n d a n t cette i n c o r p o r a t i o n n'est p a s nulle et ceci e x p l i q u e les r6sultats cont r a d i c t o i r e s obtenus p a r diff6rents auteurs qui n ' o n t p a s mesur6 dans des c o n d i t i o n s c o m p a r a b l e s l ' i n c o r p o r a t i o n chez l ' a d u l t e et chez les foetus. 1 °) I1 r e s s o r t de nos r6sultats que l ' a c i d e orotique p6n~tre dans les foetus aprbs i n j e c t i o n i n t r a p6riton6ale h la mbre. Le m a u v a i s m a r q u a g e de leur RNA h 6 p a t i q u e se r e t r o u v e aprbs i n j e c t i o n d i r e c t e de ce p r 6 c u r s e u r h c h a c u n d ' e n t r e eux, il n'est donc p a s le fair d ' u n e b a r r i ~ r e p l a c e n t a i r e colnme Font sugg6r6 Minguell et co11. [13 d ' u n e p a r t , B r e s n i c k et coll. (3] d ' a u t r e p a r t . 2 °) Le m a u v a i s m a r q u a g e du RNA h 6 p a t i q u e foetal p a r l ' a c i d e o r o t i q u e ne p e n t 6tre le fait de la p r 6 s e n c e d a n s cet organe, des cellules h6matopoi6tiques qui existent en g r a n d h o m b r e ~ eSt6 des h6patohlastes et ne d i s p a r a i s s e n t que quelques jours aprbs la naissance. En effet, si on en juge p a r les r6sultats obtenus en culture de cellules [103 la lign6e rouge (du m o i n s chez l ' h o m m e ) i n c o r p o r e BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
479
trbs b i e n l ' a c i d e orotique. La p e r t e de cette facult6 qui se r e n c o n t r e dans une an6mie m6galoblastique cong6nitale c o r r e s p o n d dans ces cellules h la p e r t e d'activit6 de la p y r o p h o s p h o r y l a s e et de la d6carb o x y l a s e qui i n t e r v i e n n e n t d a n s la t r a n s f o r m a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e en UMP. 3 °) Le fair que ce soit s e u l e m e n t apr6s la naissance que le foie p u i s s e i n e o r p o r e r pr6f6rentiellem e n t l ' a c i d e o r o t i q u e dans son tLNA sugg~re que ce p h 6 n o m b n e est en r a p p o r t d i r e c t avec la diff6r e n c i a t i o n cellulaire. On salt que les diff6rentes f o n c t i o n s h6patiques sont acquises selon une chronologie pr6cise, on p e u t c i t e r h cet 6gard les travaux de A. Jost et de ses c o l l a b o r a t e u r s s u r l ' a p p a r i t i o n du glycogbne dans le foie foetal [11]. En ce qui c o n c e r n e la vote de novo les h6patoblastes n ' a u r a i e n t p a s l ' 6 q u i p e m e n t e n z y m a t i q u e n6cess a i r e "h l ' u t i l i s a t i o n de l ' a c i d e o r o t i q u e p o u r la biosynthbse des p y r i m i d i n e s . A l ' a p p u i de cette h y p o thbse on peut citer les r6sultats de B r e s n i c k et coll. [2] qui ont m o n t r 6 q u ' a p r b s i n j e c t i o n d ' a c i d e orotique 14C h la femelle gestante, l'essentiel de la r a d i o a c t i v i t 6 se r e t r o u v e sous f o r m e d'UMP dans le foie m a t e r n e l mats reste sous f o r m e d ' a c i d e orotique dans le foie foetal. Les h6patoblastes synth6t i s e r a i e n t le RNA p a r la vote de synthbse parall~le ¢ salvage p a t h w a y >> et la vote de novo ne deviend r a i t f o n c t i o n n e l l e que p l u s i e u r s j o u r s apr~s la naissance, h u n nloment off l ' a u g m e n t a t i o n des t e n e u r s en azote p a r cellule m a t 6 r i a l i s e la raise en p l a c e des d i v e r s e s fonctions h 6 p a t i q u e s [12]. Dans nos c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s , les syst&nes e n z y m a t i q u e s de la vote de novo ne sont i n d u c t i b l e s ni p a r I'AMP c y c l i q u e ni p a r le glucagon ; il n'est c e p e n d a n t pas exclu qu'ils ne putssent r 6 p o n d r e in vitro h ces m6mes substances. I I - - Foie n~oplasique. Nos t u m e u r s h6patiques qu'elles soient i n d u i t e s ou greff6es, u t i l i s e n t aussi real l ' a c i d e o r o t i q u e que le foie foetal. Le p h 6 n o m ~ n e est d6jh net avec les h6patomes i n d u i t s h c r o i s s a n c e lente. Des r6sultats s e m b l a b l e s ont 6t6 publi6s [4, 6, 5]. Les syst~mes e n z y m a t i q u e s impliqu6s ont d6jh fait l ' o b j e t d ' i n v e s t i g a t i o n s . Si dans le foie tumoral, il semble hien d6montr6 que les p r e m i 6 r e s r6actions e n z y m a t i q u e s de la vote m6tabolique c o n d u i sant de l ' a s p a r t a t e h I'UMP sont actives ; Reid et Morris [13] et plus r 6 c e m m e n t B r e s n i c k et coll. [143 ont montr6 que l'6tape qui c o n d u i t de l ' o r o tate "h I'UMP et qui consiste en une p y r o p h o s p h o r y l a t i o n suivie d ' u n e d 6 c a r b o x y l a t i o n a u n e activit6 tr6s abaiss6e dans d i v e r s t y p e s d ' h 6 p a t o m e s p a r r a p p o r t au foie n o r m a l .
C. Lafarge et C. Frayssinet.
480
Dans l'h6patome, la synth~se des nucl6otides p y r i m i d i q u e s d o i t d o n c se f a i r e p a r u n e a u t r e v o i e q u e c e l l e c l a s s i q u e m e n t d 6 c r i t e p o u r le f o i e n o r mal ; l'activit6 tr~s augment6e de l'uridine kinase d a n s la p l u p a r t d e s t u m e u r s s u g g 6 r e q u e l ' u r i d i n e s o i t u n p r 6 c u r s e u r d i r e c t d e I ' U ~ P [15, 16, 17, 18, 19, 2~] et q u e l a v o i e d e s y n t h ~ s e p a r a l l 6 1 e s o i t pr~pond6rante pour la synth~se du RNA tumoral. L e f o i e foetal et l ' h 6 p a t o m e r 6 p o n d e n t d o n c d e la m~me mani6re h l'administration d'acide orot i q u e . D a n s les d e u x c a s il s ' a g i t d ' h ~ p a t o c y t e s soumis h des divisions cellulaires intenses. Cepend a n t le p h 6 n o m 6 n e o b s e r v 6 n ' e s t p a s li6 h l a c r o i s s a n c e c a r d a u s le f o i e d e j e u n e s r a t s c o m m e d ' a i l l e u r s d a n s le foie e n h y p e r t r o p h i e c o m p e n s a t r i c e , l ' a c i d e o r o t i q u e est b i e n u t i l i s 8 d a n s les s y n t h e s e s nucl6iques. I1 s ' a g i t d o n c d ' u n p h 6 n o m ~ n e d e d i f f @ e n c i a t i o n c e l l u l a i r e : la v o l e de n o o o n ' e s t i n d u i t e q u e q u e l q u e s j o u r s a p r ~ s la n a i s s a n c e et c o r r e s p o n d p o u r l'h6patocyte hun certain degr6 de maturit6, qui est p e r d u d a n s l a c a n c 6 r i s a t i o n . Depuis Warburg des similitudes d'6quipement et d e f o n c t i o n n e m e n t e n z y m a t i q u e e n t r e le f o i e foetal et l ' h 6 p a t o m e o n t s o u v e n t 6t6 6 v o q u 6 e s . L a s i g n i f i c a t i o n d ' u n tel p a r a l l 6 1 i s m e est d i f f i c i l e s a i s i r . O n p e u t l u i a t t r i b u e r u n r61e f o n d a m e n t a l et i m a g i n e r q u e l ' a c q u i s i t i o n p a r l ' h 6 p a t o m e d ' u n caract6re biochimique de type embryonnaire est e n l i a i s o n d i r e c t e a v e c le m 6 c a n i s m e d e l a c a n c 6 r i s a t i o n o u b i e n s u p p o s e r q u e l a p e r t e d ' u n syst b m e e n z y m a t i q u e n ' e s t q u e la c o n s 6 q u e n c e d e la d6diff6renciation cellulaire qui accompagne toujours la transformation canc6reuse. Remerciemenls.
Ce t r a v a i l a bdn6ficid d ' u n e s u b v e n t i o n de la Ligue N a t i o n a l e Fran~aise contre le Cancer. P,~SUM~. On a dtudi6 chez le rat, l ' i n e o r p o r a t l o n de l'acide orotique d a n s le RNA de foie foetal et n 6 o n a t a l et dans le RNA d ' h 4 p a t o m e s de diverses origines (h6patomes i n d u i t s a u DAB ou h l'aflatoxine et t u m e u r greff6e LF). On a m o n t r 6 que : 1 °) L'acide orotique s'incorpore m o i n s bien dans le RNA h d p a t i q u e foetal que dans le RNA h 6 p a t i q u e du r a t a d u l t e lorsque le pr~curseur est inject0 intrap~rit o n 6 a l e m e n t h la femelle gestante. I1 ne s'agit pus d'un b a r r a g e p l a c e n t a i r e p o u r l'acide orotique car le mdme ph6nom~ne est observ6 lorsque le prdcurseur est a d m i nistr6 d i r e c t e m e n t dans la cavit~ p~riton~ale des foetus. D'autres prdcurseurs moins sp6cifiques tels que le p h o s p h o r e 32 s ' i n c o r p o r e n t tr6s b i e n d a n s le RNA h6patique f~etal. Ce n ' e s t qu'h p a r t i r du 2* j o u r apr6s la naissance que l'acide orotique s'incorpore bien dans le RNA BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.
h6patique et a u m o m e n t du sevrage l'aetivit6 sp~cifique du RNA a t t e i n t u n e v a l e u r sup6rieure h celle trouv~e chez l'adulte. 2 °) P o u r les t r o i s types d'h~patomes envisages, l'acide orotique s'incorpore m o i n s b i e n dans le BNA t u m o r a l que d a n s le RNA h~patique. Avec le phosp h o r e 32 les r6sultats sont e x a c t e m e n t inversds, Finc o r p o r a t i o n du p r d c u r s e u r est m e i l l e u r e d a n s le RNA t u m o r a l que dans le RNA hdpatique. Ces r&sultats sugg~rent que les syst6mes e n z y m a tiques de la voie de nooo sont peu actifs dans ]e foie foetal et dans les h d p a t o m e s ~tudi~s. Dans nos conditions exp~rimentales ces syst6mes ne sont induits ni p a r le glucagon ni p a r ]'AMP cyclique.
ZUSAMMENFASSUNG.
Bei der B a t t e w u r d e d e r E i n b a u der Orots~iure i n die RNA der Leber des Fetusses u n d des n e u g e b o r e n e n Tieres u n d in die RNA yon H e p a t o m e n verschiedener H e r k u n f t (Hepatome, die d u r e h DAB oder Aflatoxin urLd t r a n s p l a n t i e r t e T u m o r e n LF h e r v o r g e r u f e n wurden) u n t e r s u c h t . Diese U n t e r s u c h u n g e n zeigten : 1. Die Orots/iure i n k o r p o r i e r t sich ~veniger gut in die RNA des H e p a t o m s des Fetusses als in die BNA des Hepatoms der a u s g e w a c h s e n e n Ratte, ~ e n n die Orots/iure i n t r a p e r i t o n e a l e i n e m tr~ichtigen W e i b c h e n i n j i ziert wird. Da die gleiche E r s c h e i n u n g b e o b a c h t e t wird, w e n n d e r Vorl~iufer d i r e k t in die P e r i t o n e a l h S h l e des Fetusses i n j i z i e r t wird, h a n d e l t es sich n i c h t urn: eine Sperre der P l a z e n t a gegeniiber der Orots~iure. Andere weniger spezifische Vorl~iufer ",vie P h o s p h o r 32 w e r d e n sehr gut in die RNA des H e p a t o m s eines Fetusses eingebaut. - - Erst vom zweiten Tag nach d e r Gebm~ a n i n k o r poriert sich die Orots~iure gut i n die RNA eines Hepatoms, und zur Zeit der M ilcbent~v6hnung n i m m t die spezifische Aktivit/it der RNA einen den beim e r w a c h s e n e n Tier /ibertreffenden W e r t an. 2. B e t r a c h t e t m a n all drei T y p e n von Hepatomen, so i n k o r p o r i e r t sich die Orots~iure i n die RNA eines T u m o r s weniger gut als in die RNA eines Hepatoms. Mit P h o s p h o r 32 sind die Ergebnisse genau umgekehrt, die I n k o r p o r a t i o n des Vorl~iufers ist i n die RNA eines T u m o r s besser als in die RNA eines Hepatoms. --Diese Ergebnisse legen nahe, dass die e n z y m a tischen Systeme des de nouo Weges i n der Leber des Fetusses u n d den u n t e r s u c h t e n H e p a t o m e n n u r schwach a k t i v sind. U n t e r u n s e r e n e x p e r i m e n t e l l e n B e d i n g u n g e n werden diese Systerr~e w e d e r d u r c h das Glukagon noch d u r c h das zyklische AMP induziert. BIBLIOGRAPHIE. 1. Minguell, J., Salinas, F. a Peretta, M. (1969) Gro~wth, 35, 217. 2. Hayashi, T., S~win, D. H. & W i a n d , S. (1969) Amer Y. Obst. and Gynecol., 105, 1261. 3. Bresnick, E., Lanclos, K. & Gonzales, E. (1965) Bioehim. Biophys. Aeta, 108, 568. 4. Weber, G., Singhal, R. L. ~ Srivastava, S. K., (1965) Ado. in E n z y m e Regulation, 3, 369. 5. Matsudaira, H., N a k a m u r a , C. & Hishizawa, T. (1968) Gann., 59, 61. 6. F r a y s s i n e t , C. & Lafarge, C. (1966) J. Physiol., 58, 520. 7. Chauveau, J., Moul$, Y. a Rouiller, C. (1956) E x p t l Cell. Res., 1)1, 317.
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