thérapie génique des déficits immunitaires

PiDIATRIE

J Pbdiatr Ihkiculture 2002 ; 15 : 4-10 0 2002 gdirions scientifiques et mbdicales Elsevier SAS. Tow droits r&er&

Gbk?ALE

therapie genique des d~fieits immunitoires A. Fischer,

S. Hacein-Bey,

F. Le Deist,

G. de Saint

Basife,

JF? de Villartay,

M. Cavazzana-Cc&o h6pital Necker-Enfonts-Mchdes,

lnserm

U429,

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rue de SPvres, 750 I5 Paris, France

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4

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/

gene

I

de d&kits immunitaires primitifs mettent en jeu le pronostic vital. Ainsi, les deficits immunitaires combines s&&es (DIG), differents types de deficits des lymphocytes T, le syndrome de Wiskott Aldrich, le deficit en l&and de CD40 et de nombreuses maladies des cellules phagocytaires ont un pronostic severe [l-6]. La greffe de cellules souches allogeniques est de ce fait largement utiliste comme traitement de ces maladies. Les rPsultats des greffes effect&es B partir de donneurs HLA identiques procurent une chance de succes Bevee. I1 n’en est pas de m&me en ce qui concerne les greffes effect&es Q partir de donneurs non HLA gCnetiquement identiques, Malgre des progrts significatifs, recemment decrits pour les patients atteints de DICS, les risques d’echec lies aux infections, B la reaction du greffon contre f’hote et a d’autres complications, expliquent qu’il en soit ainsi. De plus, beaucoup de patients, notamment atteints de DICS, ayant rec;u une greffe de cellules souches hematopo%tiques haplo-identique, presentent un deficit persistant de la fonction des lymphocytes B, qui necessite un traitement au long tours par immunoglobulines par voie intraveineuse [7, 81. Enfin, l’immunit~ des lympho~tes T parfois decline au-dela dune dizaine d’anntes 191. Neanmoins, le succes des greffes de cellules souches htmatopoi’etiques est lie B la capacite d’autorenouvellement de ces cellules permettant, en theorie, tout au long de la vie une production de cellules normales. C’est egalement fond6 sur ce principe que le traitement curatif de maladies gtnetiques du systtme h~matopo~~tique par therapie genique

JOURNAL

DE PtDIATRIE

ET DE PUCRICULTURE

no 1 .2002

PiDIATRIE

est envisage. En effet, l’integration et l’expression dun transgene dans les cellules souches hematopoletiques (CSH) devraient permettre d’obtenir une gutrison [lo]. Une strategic alternative de transfert de genes consiste a cibler les lymphocytes T ptripheriques qui sont B longue durtie de vie. Le travail pionnier de M. Blaese et al. dans le cadre du traitement du deficit en adtnosine desaminase le montre, bien que cette thtrapeutique ne puisse permettre d’obtenir la guerison de maladies. 11 a et6 cependant montrt que des lympho~es T fonctionnels transduits pouvaient persister plus de huit ans aprts le traitement [ 11, 121. Les deficits immunitaires primitifs representent de bons candidats pour une approche de therapie genique car, pour beaucoup d’entre eux, les genes responsables ont Ctt identifies. Les vecteurs aujourd’hui disponibles derives d’oncorttrovirus murins peuvent &tre utilises dans des essais cliniques [ 131. Ces vecteurs permettent d’obtenir l’inttgration de transgene dans des cellules infect&es et a replications du gkne lors de la division cellulaire. Cependant, les copies provirales de ces vecteurs ne peuvent franchir la barriere nuckaire et done ne peuvent s’integrer dans des cellules quiescentes. Cela est un obstacle important dans la mesure ou la plupart des CSH ne sont pas en cycle. 11 represente la limite majeure au developpement actuel de la therapie genique dans le domaine des maladies des cellules sanguines. Les perspectives d’utilisation de vecteurs lentiviraux, qui permettent d’obtenir l’integration stable dun transgtlne dans le gtnome de cellules au repos, paraissent sur ce plan inttressantes [14-171. Neanmoins, les questions de securite liees B l’utilisation de tels vecteurs pour une implication clinique n’ont pas encore ttt completement resolues. Dans ces conditions, les applications cliniques de la therapie genique aux deficits immunitaires primitifs ne peuvent &tre envisagees pour l’instant que si certaines conditions sont remplies.

iconditionsnkcessairesir I’eff icaciti! d’une th&apie gknique d’un dkficit i~~unitaire pri~itif Le profil d’expression du gene doit Ctre le plus proche possible du profii physiologique; Pour une serie de genes qui sont exprimes de facon constitutive comme le gene de l’adenosine dtsaminase (ADA) ou du recepteur de la sous-unite de rtcepteurs de cytokine yc, il n’y a pas de difficult6 particulitre. En revanche, transactivateur JOURNAL DE PtDlATRlE

par exemple, dans le cadre du deficit en des molecules HLA de classe II ET DE PU’bRIClJLTURE no 1 - 2002

GiNiRALE

(CIITA) responsable dune forme de deficit immunitaire avec dtfaut d’expression des proteines HLA de classe II, la situation est plus difftcile car l’expression de cette proteine est induite par l’interftron y. De meme, le ligand de CD40 qui est deficient dans le syndrome hyper-IgM lie a 1’X n’est exprimt que par des lymphocytes T activb. Une expression constitutive de cette molecule par les lymphocytes telle que cela a et6 rtalisi chez des souris deficientes provoque la survenue de lymphome [ 181. Bien que l’on commence a mettre au point des procedts de regulation de l’expression de genes incorpores dans des vecteurs, on ne peut pour I’instant envisager une application clinique dans ces situations. Une eventuelle surexpression dun transgtne peut etre dangereuse, ainsi une surexpression de kinase associte B des recepteurs membranaires pourrait induire des signaux de survie ou de proliferation cellulaire excessifs pouvant a terme favoriser la survenue dun cancer. Cela doit &tre envisage par exemple pour le cas des deficits en ZAP-70 ou en JAK3. Ntanmoins, dans ce dernier cas, une telle complication n’a pas ttC observee dans la therapie genique des _ souris defcientes en JAK-3. Le fait que I’expression dun transgene con&e un avantage stlectif aux precurseurs lymphocytaires, pourrait permettre de surmonter I’obstacle lit aux defauts de transduction des cellules souches hematopokiques. En effet, la proliferation intense des prtcurseurs lymphocytaires suivie dune differentiation en un tres grand nombre de lymphocytes T a longue duke de vie pourrait etre suffkante pour corriger, pendant une longue periode de temps, les constquences cliniques de deficits immunit~res s&&es des lymphocytes T La fonction du produit du transgttne indique s’il peut en @tre ainsi. Le deficit en yc responsable du DICS lie B l’X et le deficit en JAK-3, tous deux caracttrises par un defaut de developpement des lympho~es T et NK en representent Ies modeles ideaux ; yc est une sous-unite de recepteurs de cytokines partages par les recepteurs des IL-2, 4, 7, 9 et 15. L’IL-7 et l’IL-15 sont respectivement responsables de l’induction de signaux de survie et de proliferation dans les precurseurs des lymphocytes T et NK [19]. Lexpression de la proteine yc procure ainsi un avantage selectif. Le fait que le profil dinactivation du chromosome X des femmes conductrices de cette maladie soit d&vie dans les populations lymphojiraires [ZO], l’avantage de croissance procure in vitro aux lymphocytes B transform& par le virus d’Epstein Barr deficient en yc aprPs expression de cette proteine [2 11, ainsi que la plus frequente expression de JAK-3 dans les populations lymphocytaires en comparaison avec 5

PiDlATRlE

GkNiRALE

les cellules myeloi’des chez les souris deficientes en JAK-3 apres transfert ex vivo du gene JAK-3, illustrent cette possibilite [22-281.

protocote de tronsfert de g&es Des ameliorations sensibles des methodes de production de vecteurs et de leur construction, ainsi que des conditions d’infection des cellules progenitrices hematopo~~tiques sont survenues au tours des dernitres an&es. 11 est ainsi possible d’obtenir une meilleure expression de transgene dans les populations de lymphocytes [23]. L a modification de vecteurs rttrovifaux, par la deletion de sequences inhibitrices de l’expression de transgtne au sein des LTR (Long terminal repeat), pourrait egalement permettre d’obtenir une expression prolong&e des transgenes [30, 311. L’utilisation de lignees cellulaires d’encapsidation permettant d’obtenir des titres plus eleves de virus, ainsi que l’utilisation de virus pseudotypes a l’aide par exemple de la pronine d’enveloppe du virus de la leucemie du singe Gibon (GAL&‘) peuvent Cgalement augmenter l’efficacitri: de transduction [33, 341. Des progres significatifs ont et& effect& dans l’utilisation des cytokines afin d’obtenir une preactivation des progtniteurs htmatopoi’etiques, permettant ainsi plus frequemment l’integration des provirus dans ces cellules sans qu’il n’y ait de differentiation cellulaire, l’utilisation du SCF (Stem ~e~~~ctu~), de la thrombopoi’etine ou MGDF et du FIST3 ligand, pour augmenter l’efficacitt de transduction des prtcurseurs hematopoi’etiques CD34 + [35-371. Enfin, l’utiiisation d’un fragment obtenu par recombinaison generique de la fibronectine (CH296) permet egalement d’augmenter I’efficacitt de transduction [38-411. Cet effet est vraisemblablement lit a la co-localisation des cellules et des particules virales.

dkficits i~~unitaires

primitifs

Le deficit en ADA a tte la premiere maladie cible dune therapie genique, dam la mesure ou le gene a Pte identifie il y a trts longtemps et oh il s’agit d’un gene exprimt de fa(;on constitutive. D.B. Kohn et al. ont Ccrit de facon precise les resultats obtenus chez trois patients‘ qui ont rer;u des precurseurs hematopdietiques CD34 + transduits du cordon ombilical. 11 est dtmontrt que, quatre an&es plus tard, la frequence de cellules T contenant le transgitne varie de 1 B 10 %, alors que seulement 0,Ol % des autres cellules sangui6

nes contient ce transgene [42]. Cela demontre qu’un avantage selectif est confer& aux lymphocytes T par rapport aux autres populations cellulaires par la presence et l’expression du gene de I’ADA. Cependant, les transcrits du gene ADA ne sont pas detect& dans les lymphocytes T au repos. Chez un patient, le traitement substitutif en enzyme ADA a CtC interrompu. 11 a alors CtC observe une chute des populations lymphocytaires et des fonctions immunes, bien que le pourcentage de lymphocytes T circulants transduits ait augment& Ces resultats indiquent qu’une expression insuffisante du transgene ne permet pas de restaurer une fonction immune normale. 11 est trts vraisemblable que le traitement continu substitutif en adtnosine desaminase exerce un effet deletere paradoxal en inhibant l’avantage selectif potentiellement confert aux cellules transduites.

le deficit en yc Comme indiqut ci-avant, cette maladie semble @tre le modele ideal pour une therapie gtnique. Une serie d’etudes in vitro a montrt la possibilite d’obtenir une stable de la prottine yc dans des expression lymphocytes B transform& par le virus d’Epstein Barr provenant de patients d&inures [43-451. De plus, la proteine est fonctionnelle. La differentiation de cellules NK et de lymphocytes T peut tgalement etre restauree in vitro apres transduction a l’aide d’un vecteur retroviral des cellules de patients CD34 + [46], En utilisant des souris deficientes en yc comme modele, il a Pte montre que toutes les anomalies immunologiques liees au deficit en yc pouvaient etre corrigees aprts transfert du gene “fc dans les CSH murines. Une immunitt complete se developpe et a et& observee de facon stable pendant 11 mois 147-493. Toutes ces etudes ont constitue les bases exptrimentales en vue de la mise en place d’un essai clinique. Cet essai a et& propose B des patients atteints d’un deficit immunitaire combine severe lie B 1’X n’ayant pas de donneur HLA identique. Le protocole consiste en le prelevement de cellules medullaires, la purification de cellules CD34 + , leur preactivation pendant une journte B l’aide des cytokines SCF, MGDF, FLT31, et IL3, suivis de trois cycles d’infection par un surnageant contenant le virus dtfectif dans des sacs plastiques recouverts du fragment de fibronectine CH296. Les rtsultats chez les deux premiers malades trait& ont et& recemment rapport& avec un recul de plus d’une an&e (maintenant de 18 mois) [50, 5 I]. Aucun effet secondaire n’a Cte observe chez ces patients, alors que le dtveloppement de lymphocytes T transduits et, JOURNAL

DE PtDlATRlE

ET DE PUiRlCULTURE

f

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PiDIATRIE

dans une certaine mesure, des cellules NK a et& observe. La presence de populations lymphocytaires normales s’associe au developpement de reponses immunes specifiques d’antigenes. Ainsi, un b&Ace clinique a & obtenu : les patients sent gueris des infections presentees avant traitement et ils vivent maintenant normalement chez eux sans aucun traitement. Des rtsultats similaires ont tgalement Ctt obtenus plus recemment chez deux autres malades, 11 est ainsi dtmontre qu’un avantage selectif est procure aux cellules prog~nitrices des lympho~tes dans cette maladie. Bien s&r, les resultats a trts long terme ne sont pas connus. On ne peut exclure d’observer une extinction de l’expression du transgene et le dtclin progressif du nombre de prtcurseurs transduits qui pourraient provoquer une perte progressive des cellules immunes apres quelques annees [52]. Neanmoins, ces resultats apportent aujourd’hui une preuve de principe de l’efficacitt d’une thtrapie ge’nique.

autres DICS A cbtt de la ntcessitt d’une evaluation B long terme des r&ultats de la therapie genique du DISC lie Q I’X, il existe aujourd’hui un potentiel pour l’extension de ce traitement a d’autres formes de deficits immunitaires. Les maladies proches du DICS lit a I’X, comme le deficit en JAK3 et le deficit en chaine a du rtcepteur de 1’IL-7 sont les candidats evidents pour un tel traitement. La proteine JAK-3 est associee a la region intraceIlulaire de yc et transmet des signaux d’activation. La chame a du recepteur de l’IL7 est associee B yc pour former le recepteur de l’IL7 ntcessaire au developpement des lymphocytes T. La correction du deficit en JAK3 a d’abord CtC obtenue in vitro dans les lignees de lymphocytes B, puis il a CtC demontre qu’il Ctait possible de corriger le deficit in vivo chez des souris JAK-3 [53, 54]. Les deficits en proteines Rag-l et Rag-2 provoquent un dtfaut de dtveloppement des lymphocytes T et B car la recombinaison des elements V(D)J des genes codants pour les chaines des recepteurs T pour l’antigene et des recepteurs B pour l’antigene ne peut se faire [55]. 11 n’est pas certain que l’avantage selectif confer& par l’expression de la proteine Rag- 1 ou Rag-2 dans des cellules deficientes soit aussi puissant que celui confer4 par l’expression de la proteine yc. Neanmoins, ces formes de DICS ainsi que la maladie syndrome d’Omenn, reprtsentent voisine, le aujourd~hui de bons candidats 8 une application dune therapie gtnique. 11 faudra cependant verifier que l’expression constitutive, soit de la prottine Rag-l, soit JOURNAL

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de la proteine Rag-2 dans les lymphocytes, n’exerce pas de consequences fscheuses puisque, normalement, ces proteines ne sont plus exprimees aprts que les rearrangements des recepteurs T ou B pour l’antigene sont effectuts. Les deficits en lymphocytes T, en particulier les deficits en ZAP-70, sont d’autres candidats possibles compte tenu de la gravitt de la maladie [56]. La correction du deficit en ZAP-70 dans les precurseurs hematopoi’ttiques necessitera l’utilisation dun promoteur restreignant l’expression en lymphoc~es T afin d’kiter une expression aberrante dans d’autres cellules [571. Le deficit immunitaire des lymphocytes T secondaire au defaut d’expression des molecules HLA de classe II est une autre maladie pour laquelle la thtrapie genique peut etre envisagee. Dans cette pathologie, quatre genes differents codant des facteurs de transcription ou un transactivateur des genes des molecules de HLA classe II sont anormaux. Les trois premiers genes sont exprimes de faGon constitutive. Cependant, aucun avantage selectif ne peut &tre attendu de leur expression 1581. Par ailleurs, l’expression du 4e gene (CIITA) est inductible. Le syndrome de Wiskott Aldrich est une autre forme de deficit immunitaire pour lequel la thtrapie genique representerait un progrts therapeutique significatif [59]. Comme les conductrices de cette maladie lice B l’X presentent un profil d’inactivation du chromosome X non lie au hasard dans l’ensemble des lignees sanguines, il est possible qu’une forme d’avantage selective puisse Ctre procuree par l’expression de la prottine WASP (deficiente dans cette maladie) dans les prtcurseurs hematopdittiques [60]. Cette question pourrait etre resolue par l’analyse d’un modttle murin de deficit WASP qui a et& recemment obtenu. A noter que la correction du deficit en proteine WASP dans les lymphocytes a ete obtenue in vitro et qu’elle permet la normalisation de l’architecture cellulaire. Comme indique prectdemment, le deficit en ligand de CD40 responsable du syndrome hyper-IgM lie a I’X est une autre forme grave de deficit des lymphocytes T qui pourrait profiter dune thtrapie genique, B condition cependant que l’expression du gene soit trts strictement regulee. Differentes possibilit& peuvent etre envisagees pour obtenir ce rtsultat, en particulier, on peut eventuellement songer a utiliser une forme soluble de la proteine [61]. Aujourd’hui, les perspectives de therapie genique des deficits immunitaires apparaissent sous un jour plus positif compte tenu des premiers resultats obtenus dans le traitement du DICS lie a l’X et des progres de la technologie du transfert de gene dans les cellules 7

PEDIATRIE

GENERALE

souches hematopoi’ttiques. Neanmoins, comme cela a et4 discutt, nombre de questions doivent &re t&s rigoureusement examinees au cas par cas. La disponibilite 6ventuelle de vecteurs lentiviraux, si leur usage clinique est rendu possible sans risque toxique, pourrait rep&enter un progres considerable en thtrapie genique des maladies du sang. 11s permettraient en effet le traitement de maladies pour lesquelles aucun avantage selectif procure par le transgene ne peut &tre envisage, telles que, par exemple, la granulomatose septique chronique ou encore dans la p-thalassemie

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