Action de la flore microbienne du tractus digestif sur la biosynthese de l'acide cholique chez le rat

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Biochimica et Biophysica Acta, 499 (1977) 67--72

© Elsevier/North-Holland Biomedical Press

BBA 28297 ACTION DE LA F L O R E MICROBIENNE DU TRACTUS DIGESTIF S U R LA BIOSYNTHESE DE L'ACIDE CHOLIQUE CHEZ LE R A T

E. SACQUET, C. MI~JEAN, C. LEPRINCE et M. RIOTTOT Laboratoire des Animaux sans Germes du CNRS, au CNRZ., Jouy-en-Josas, 78350 (France)

(Re~u le 27 j a n v i e r 1977) Summary A c t i o n o f the m i c r o b i a l flora o f the digestive tract on the b i o s y n t h e s i s o f cholic acid in t h e rat

Axenic and holoxenic (conventional) rats were fed a diet containing trace amounts of [2,4-3H]cholic and [24-14C]chenodeoxycholic acids. In the feces of both groups of rats, the percentage of labelled bile acids which were 3H-labelled was slightly different. In the experimental conditions used, the intestinal microflora only slightly modified the synthesis of 12~-hydroxylated bile acids.

Introduction

I1 est g~n~ralement admis que la biosynth~se des acides biliaires se fait selon deux voies m~taboliques semblables qui se s~parent au niveau de la 12a-hydroxylation du 7a-hydroxy-4-cholesten-3-one, pour aboutir, l'une h l'acide cholique, l'autre ~ l'acide ch~nod~soxycholique et, chez le rat, aux acides muricholiques. Or, Kellogg [1] a ~tabli que le rat ax~nique excrete moins d'acides biliaires que le rat holox~nique *, et que ses mati~res f~cales contiennent moins d'acide cholique que d'acide fl-muricholique. La question se pose donc de savoir si la presence de la flore microbienne dans le tractus digestif du rat holox~nique a pour effet d'augmenter d'une mani~re pr~f~rentielle la synth~se de l'acide cholique plutSt que celle des acides chdnod~soxycholique et muricholiques. Les ~tudes in vitro d'Einarsson et al. [3] sur l'activit~ des enzymes microsomalesdu foie, 12~- et 6~-hydroxylases, donnent une rdsponse positive. Cependant, la proportion d'acide cholique et de ses m~tabolites bact6riens par rapport l'ensemble des acides biliaires f~caux refl~te in vivo l'acitivit~ de la 12~-hydroxylase. Cette proportion n'a jamais ~t~ ~tablie en raison de la composition * N o u s utilisons la terminologie de Raibaud et al. [2].

68 tr~s complexe des acides biliaires f~caux chez le rat holox~nique. Nous nous proposons dans cette ~tude de comparer le pourcentage d'acide cholique dans les f~ces du rat ax~nique et la pourcentage d'acide cholique et de ses m~tabolites bact~riens dans les f~ces du rat holox~nique, en utilisant le marguage isotopique par les acides [2,4-3H]cholique et [24-~"C]ch~nod~soxycholique. Material et M~thodes

Principe. Quand des rats ing~rent avec leur aliment une dose constante d'un acide biliaire marqu~ pendant un temps suffisant pour que le pool de cet acide biliaire soit enti~rement renouvel~, l'activit~ sp~cifique de cette esp~ce chimique et de ses produits de transformation oscille autour d'une valeur moyenne qui est constante. I1 suffit de mesurer la radioactivit~ excr~t~e pendant un temps suffisant pour avoir une bonne estimation de sa valeur moyenne et de la diviser par l'activit~ sp~cifique d'un acide bfliaire f~cal facflement dosable pour connaitre la masse de cette esp~ce chimique et de ses m~tabolites qui est excr~t~e. Dans cette experience oh l'acide [2,4-3H]cholique et l'acide [24-'4C]ch~nod~soxycholique sont utilis~s comme marqueurs, les masses des acides 14C et 3H excr~t~es par chaque groupe de rats sont calcul~es en dosant les radioactivit~s totales du 3H et du 14C excr~t~es pendant une dur~e de quatre jours et en d~terminant, chez les rats ax~niques, les activit~s sp~cifiques de l'acide [2,4-3H]cholique et celles de l'acide ~-muri[4-14C]cholique, chez les rats holox~niques, celles de l'acide d~soxy[2,4-3H]cholique et ceUes de l'acide hyod~soxy[4-14C]cholique. Comme la flore microbienne d~termine une perte importante de 3H aux d~pens de l'acide [2,4-3H]cholique, la valeur de ce marqueur est ~tablie en le comparant ~ l'acide [24-14C]cholique. Enfin, la valeur de cette m~thode peut ~tre v~rifi~e en comparant les r~sultats ainsi obtenus avec ceux que donne la m~thode de l'~quilibre isotopique [4-14C]cholest~rol dont la valeur a ~t~ pr~c~demment ~tablie [4]. Aliment et animaux d'expdrience. Les animaux d'exp~rience sont des rats de race Fisher, m~les, ax~niques et holox4niques, ~g~s de 130 ~ 150 jours. Ces sujets reqoivent le r~gime semi-synth~tique de composition suivante: cas~i'ne 220 g, amidon de mai's 580 g, huile de mai's 90 g, cellulose 50 g, m~lange mineral et vitaminique q.s. Organisation des expdriences. Trois experiences sont ainsi effectu~es: Experience 1. Quatre rats ax~niques reqoivent pendant trois semaines 100 000 dpm d'acide [2,4-3H]cholique et 20 000 dpm d'acide [24-~4C]ch~nod~soxycholique par gramme d'aliment. Les f~ces sont r~coltSes durant la troisi~me semaine apr~s l'introduction des marqueurs dans le r~gime. Experience 2. Trois rats holox~niques reqoivent 180 000 _dpm d'acide [2,4-3H]cholique et 14 800 dpm d'acide [249~C]cholique par gramme d'aliment. Les f~ces sont r~colt~es du 12 au 15~ jour apr~s l'introduction du marqueur dans le r~gime. Experience 3. Deux groupes de trois rats holox~niques reqoivent, l'un, 630 000 dpm d'acide [2,4-3H]cholique et 20 000 dpm d'acide [24-14C]ch~no-

69 d~soxycholique par gramme d'aliment, et l'autre 311 000 dpm d'acide [2,4-3H] cholique et 20 000 d p m d'acide [24-14C]ch~nod~soxycholique par gramme d'aliment. Dans le premier groupe, les f~ces sont r6colt~es du 12e au 15e jour; dans le second, deux r~coltes de f~ces sont analys6es: l'une faite du 12e au 15e, et l'autre du 19e au 21e j o u r apr~s l'introduction du marqueur dans l'aliment, ce qui porte ~ neuf, le nombre total des r~coltes de f~ces analys~es chez les rats holox~niques. Moldcules marqudes. Ces mol6cules proviennent de la firme NEN (NEN Chemicals GmbH, D 6072 Dreieichenhai'n, Allemagne de l'Ouest, Siemenstrasse). Elles ont l'activit~ sp~cifique suivante: acide [24-14C]cholique: 44.5 mCi/mol; acide [2,4-3H]cholique: 14 Ci/mol; acide [24-14C]ch6nod6soxycho lique: 50 mCi/mol. Elles sont purifi~es par chromatographie sur couche mince. EUes sont p o u r cela m~thyl~es par le diazom~thane, chromatographi~es sur gel de silice G ~ l'aide du m~lange SVII d ' H o f m a n n [5]: chloroforme/ac6tone/ m6thanol (70 : 25 : 5, v/v), 61udes par le m6thanol, hydrolys~es par la soude 2 M et extraites apr~s acidification ~ pH 2 par le chloroforme/m6thanol. Mdthodes biochimiques. Les m6thodes d'extraction et de s~p~ration biochimique des acides biliaires ont ~t~ pr~c~demment expos~es en d6tails [4]. Rappelons que les acides biaires f~caux son extraits par l'~thanol bouillant au Kumagawa, s6par6s de l'insaponifiable par la technique de Grundy et al. [6], m6thyl~s par le diazom~thane, s~par6s par chromatographie en couche mince et ~lu~s par le m~thanol. Leur radioactivit~ est dos6e par scintillation liquide et leur masse par action de la 3-hydroxysteroi'de d~shydrog~nase. Mode d'expression des rdsultats. Les r~sultats sont exprim6s par la m o y e n n e arithm~tique et l'~cart-type de la moyenne. La difference entre les moyennes est appr~ci~e par le test t de Student. Resultats La perte de 3H subie par l'acide cholique est estim6e par le rapport: 3H/14C dans l'aliment R = 3H/14C dans les f~ces Dans les experiences faites avec le marquage par les acides [2,4-3H]cholique et [2494C]ch6nod~soxycholique, R = 1.02 + 0.01 pour les quatre valeurs obtenues chez les rats ax~niques, R = 0.35 + 0.022 pour les neuf valeurs obtenues chez les rats holox~niques. Dans les experiences faites avec le marquage par l'acide [2,4-3H]cholique et l'acide [24-14C]cholique R = 0.30 + 0.004 pour les trois valeurs obtenues chez les rats holox~niques. La perte de 3H, nulle chez les ax~niques, importante chez les holox~niques est donc le fait du m6tabolisme bact~rien. Cependant, chez les trois rats holox~niques qui re~oivent ~ la fois l'acide [2,4-3H]cholique et l'acide et l'acide [24-14C]cholique, le rapport 3H/14C vaut en m o y e n n e 3,71 + 0.047 pour l'ensemble de la radioactivit~ excr6t~e, et 4,00 + 0,015 pour l'acide d~soxycholique. La valeur de l'excr~tion f6cale de l'acide cholique et de ses m~tabolites calcul6e d'apr~s le marquage par le 3H est donc tr~s proche de celle qui est obtenue lorsque le calcul est bas~ sur les valeurs du 14C: elle vaut 0.93 -+ 0.009 de celle-ci.

70 TABLEAU I C O M P A R A I S O N E N T R E L A C O M P O S I T I O N E N A C I D E S B I L I A I R E S D E S F~.CES D E S R A T S A X E N I QUES, ETABLIE PAR MARQUAGE PAR LES ACIDES [2,4-3H]CHOLIQUE ET [24-14C]CHENODES O X Y C H O L I Q U E (A), O U P A R M A R Q U A G E P A R LE [4 - 1 4 C ] C H O L I ~ S T E R O L (B) P, probabilit6 q u e la difference ne s o i t pas significative; N.S., n o n significatif; S., significatif. Acides

Cholique

C o m p o s i t i o n * (%)

p

Marquage A

Marquage B

3 5 . 6 -+ 1 . 7 4

3 2 . 3 -+ 0 . 5 3

cz-Muricholique

4.0 + 0.19

6.8 + 0.23

N.S.

~-Muzicholique

54.5 + 1.68

5 3 . 7 -+ 0 . 7 8

Ch~nod6soxycholique

3 . 0 -+ 0 . 4 5

5.2 -+ 0 . 2 6

p < 0.05

S.

Ursod~soxycholique

2 . 2 -+ 0 . 1 9

1 . 4 -+ 0 . 2 2

p ~ 0.05

S.

p < 0.05

S. N.S.

* % m o y e n -+ ~cazt-type de la m o y e n n e de 4 rats.

Le Tableau I reprdsente la composition des f~ces des rats ax~niques en acides biliaires, dtablie par marquage par les acides [2,4-3H]cholique et [24-14C]chdnoddsoxycholique d'une part, et celle qui a ~t~ dtablie dans une prdc~dente expdrience et dans laquelle le marqueur est le [4-14C]cholest~rol [4]. Les pourcentages des cinq acides biliaires classiquement reconnus chez le rat [7], qui sont obtenus par ces deux mdthodes, ne sont pas identiques, puisque des diffdrences significatives apparaissent au niveau des composants mineurs; mais les proportions des composants les plus abondants, les acides cholique et ~-muricholique ne sont pas diff~rentes, en sorte que l'ensemble de ces deux compositions appara~t semblable. Les excrdtions fdcales des acides biliaires mesur~es dans ces deux expdriences sont semblables. Ces excrdtions fdcales, exprim~es en micromoles par 100 g de poids vif sont, chez les axdniques: 7.4 + 1.00 dans la prdsente expdrience, 9.8 + 0.45 dans l'exp~rience prdcddente; la diffdrence n'est pas significative: p > 0.05. Chez les holox~niques, elles valent 1 1 . 9 + 0.41 dans la pr~sente expdrience contre 12.9-+ 0.91 dans l'expdrience pr~c~dente, et la difference n'est pas significative: p > 0.10.

T A B L E A U II EXCRETION FECALE JOURNALI~RE DES ACIDES BILLIAIRES 3H ET DES ACIDES BILLIAIRES 1 4 C , C H E Z L E S R A T S A X ~ . N I Q U E S E T C H E Z L E S R A T S H O L O X I ~ N I Q U E S , E X P R I M E E E N /~MOL P O U R 1 0 0 G D E P O I D S C O R P O R E L . % M O Y E N D ' A C I D E C H O L I Q U E E T D E SES M E T A B O L I T E S BACT]~RIENS PAR RAPPORT A L'ENSEMBLE DES ACIDES BILLIAIRES EXCRETES n , n o m b z e de sttiets; p, probabilit~ q u e la difference ne s o i t pas signifieative; N . S . , n o n significatif; S., significatif. E x c r e t i o n f~cale *

Ax6niques

Holox~niques

(n = 4)

(n = 9)

p

/~mol d'acides 3 H

2.5 -+ 0.32

4.3 ---0.19

<0.001

/~mol d'acides 1 4 C

4.9 -+ 0.71

7.5 -+ 0.33

<:0.001

S.

3 3 . 8 -+ 1 . 6 8

36.4 + 0.84

~0.20

N.S.

% acide c h o l i q u e

• M o y e n n e -+ dcazt-type de la m o y e n n e .

S.

71 Le Tableau II precise l'excr~tion f~cale des acides biliaires tritiSs et ceUe des acides biliaires marquis par le 14C. Les rats holox~niques excr~tent davantage d'acides biliaires de ces deux categories que les rats ax~niques. Cependant, le pourcentage d'acide cholique n'est pas significativement different chez les deux types de rats. Si l'on tient c o m p t e de l'erreur commise dans le dosage de l'acide cholique, du fait de la perte de tritium caus~e par le m~tabolisme bact~rien, ce pourcentage passe de 36.4% ~ 38.3% chez les rats holox~niques, valeur qui est tr~s peu diff~rente de celle qui est observ~e chez les rats ax~niques: 33.8%.

Discussion Le marquage par les acides [2,4-3H]cholique et [24-14C]ch~nod~soxycholique permet donc de doser l'excr~tion f~cale des acides biliaires et de distinguer l'acide cholique et ses m~tabolites bact~riens de l'ensemble des acides biliaires f~caux. I1 apparai't ainsi que la presence d'une flore microbienne dans le tractus digestif du rat ne produit qu'une augmentation tr~s mod~r~e de la proportion d'acide cholique synth~tis~. Ceci est en d~saccord avec les conclusions d'Einarsson et al. [3] qui observent des differences significatives de l'activit~ de la 12a-hydroxylase du 7a-hydroxy-4-cholesten-3-one et de la 6J3-hydroxylase de l'acide lithocholique au niveau de microsomes h~patiques selon que ceux-ci proviennent de rats ax~niques ou de rats holox~niques. Ce d~saccord surprend d'autant plus que les deux facteurs actuellement connus, qui sont capables de faire valrer l'activit~ de la 12a-hydroxylase, le sexe [8] et la presence de cholesterol alimentaire [9] sont identiques dans les experiences des auteurs su~dois et dans les nStres: rats m~les, absence de cholesterol alimentaire. Ces consid~rations conduisent fi penser que l'action de la flore microbienne sur l'activit~ de cette enzyme pourrait d~pendre d'autres facteurs que ceux qui sont mentionn~s ci-dessus. On peut imaginer en particulier que Faction de la flore microbienne du tractus digestif sur cette enzyme serait le fait d'un nombre tr~s r~duit d'esp~ces bact~riennes qui seraient pr~sentes dans certaines animaleries et absentes dans d'autres.

R~um~ Des rats ax~niques et holox~niques reqoivent dans leur aliment une dose traceuse d'acide [2,4-3H]cholique et d'acide [24-14C]ch~nod~soxycholique. Dans les f~ces de ces deux groupes de rats, la proportion des acides biliaires triti~s par rapport ~ l'ensemble des acides biliaires marquis est peu diff~rente. I1 en r~sulte que, dans les conditions exp~rimentales ici r~alis~es, la presence d'une flore microbienne dans le tractus digestif ne modifie que faiblement la synth~se des acides biliaires 12a-hydroxyl~s.

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