Action de quelques hydrocarbures aromatiques bromométhylés sur la synthèse in vitro de DNA et de RNA

Chem.-BioL Interactions Elsevier Publishing Company, Amsterdam Printed in The Netherlands

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ACTION DE QUELQUES HYDROCARBURES AROMATIQUES BROMOMI~THYLI~S SUR LA SYNTHESE IN VITRO DE DNA ET DE RNA

P. D A U D E L a, F. GACHELIN a, M. CROISY DELCEY b, P. J A C Q U I G N O N b, N.P. BUU HOI b ET P. QUEVAL ¢ aFondation Curie, lnstitut du Radium, Laboratoire Curie, Paris, blnstitut de Chimie des Substances Naturelles, C.N.R.S., Gif-sur-Yvette, et CCentre de recherches sur la Cancdrisation Chimique et Hormonale, Vanves (France)

(Requ le 28 mai 1971) (Revision regu le 2 aoOt 1971) (Accept6 le 18 aofit 1971)

SUMMARY

The effect of a series of bromomethylated polycyclic hydrocarbons on in vitro DNA and RNA synthesis has been studied by measurement of the incorporation of [3H]-dTMP or [14C]-AMP into new chains. The inhibition of RNA synthesis was less than 1 2 ~ for 9-bromomethylanthracene, 9-methyl-10-bromomethylanthracene and 12-bromomethylbenzo(a)acridine, and more than 37°//o for 7-bromomethylbenzo(a)anthracene, 7,12-dibromomethylbenzo(a)anthracene and 7-bromomethylbenzo(c)acridine. Analogous results were found for the inhibition of DNA synthesis, except for 7-bromomethylbenzo(c)acridine which had little effect. Apart from this exception a good correlation was found between the inhibitory action of the bromo derivatives and the carcinogenicity of the non-halogenated parent hydrocarbons.

INTRODUCTION

I1 est bien connu que les hydrocarbures aromatiques et certains de leurs d6riv6s m6thyl6s sont capables de se fixer in vivo sur le DNA de diff6rents organes de la souris ou du rat 1-6. Diffdrentes exp6riences ont mis en 6vidence l'effet de ces d6riv6s Abr6viations: AMP, addnosine monophosphate; ATP, ad6nosine triphosphate; dTMP, thymidine monophosphate; dTTP, thymidine triphosphate; PCA, acide perchlorique; POPOP, 1,4-bis-2(5phdnyloxazolyl)-benz6ne; PPO, 2,5-diph6nyloxazole; TCA, acide trichloroac6tique; Tris, trishydroxymdthylaminomdthane. Provenance des principaux produits utilis6s: Micrococcus lysodeikticus, Soci6t6 Miles, U.S.A. ; D N A de thymus de veau, Worthington, U.S.A. ; Ddsoxyribonucl6otides, Schwarz, U.S.A. ; Ribonucl6otides, Miles, U.S.A., ~t l'exception de I'ATP, Boehringer; [3H]-dTTP, N.E.N. Chemicals; [14C]-ATP, C.E.A. Saclay; solu6ne, Packard Instrument France. Chem.-Biol. Interactions, 4 (1971/72) 223-231

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sur la synth~se des acides nucl6iques 7,8. In vitro l'interaction de nature physique qui prend naissance entre les d6riv6s prdcitds et le D N A 9 n'est transform6e en interaction chimique que par voie photochimique 1° ou catalytique ~ R6cemment BROOKESet coll? 2"~3 ont montr6 que deux d6riv6s bromom6thyl6s d'hydrocarbures polycycliques, le bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac~ne et le m&hyl-12bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac6ne, sont capables de r6agir instantan6ment in vitro avec du DNA, lorsqu'ils sont mis en contact avec cette macromol6cule. Selon ces m~mes auteurs la premi6re 6tape de la r6action in vitro d'un tel ddriv6 halog6n6 d'hydrocarbure aromatique, qu'on peut representer schdmatiquement par l'6quation ArCH2Br ~ ARCH2 + + Brpourrait ~tre consid6r6e comme un mod61e d'une des premi6res 6tapes de l'action oncog~ne de d6riv6s m6thyl6s non-halogknks correspondants, off le carbocation pourrait ~tre form6 in vivo par voie enzymatique*. Darts le pr6sent travail nous avons 6tudi6 l'action de d6riv6s bromom6thyl6s d'hydrocarbures aromatiques sur la synth6se de D N A ou de R N A dans des syst6mes acellulaires D N A ou R N A polym6rase d6pendante de D N A et examin6 si l'intensit6 des perturbations prod uites peut ~tre reli6e au pouvoir canc6rog6ne des substances nonhalog6n6es correspondantes, comme pourrait le faire supposer l'hypoth6se 6raise par BROOKES et coll. MATERIELET MI~THODES

(a) Prdparation des hydrocarbures bromom~thylks (1) Bromomkthyl-9-anthrackne (I). 11 a 6t6 pr6par6 selon la m6thode de MECg et coll.I4 par action du tribromure de phosphore sur le 9-hydroxym6thylanthrac6ne dans le t6trachlorure de carbone. Le produit est recristallis6 darts le m~me solvant en fines aiguilles jaunes F -- 157° (litt. 14: 137-142°). (2) Mkthyl-9-bromomkthyl-lO-anthracbne (III). I1 a 6t6 pr6pard par une m&hode diff6rente par HAUPTMANet coll. 15 mais ces auteurs ne pr6cisent pas le point de fusion. Pour notre part, nous l'avons pr6par6 h partir du m6thyl-9-hydroxym6thyi-10anthrac+ne par action du tribromure de phosphore au sein du t6trachlorure de carbone. En fin de r6action, ajouter du m&hanol pour d6truire l'exces d'acide, le d6riv6 o9bromd pr6cipite alors en aiguilles jaunes. I1 est pr6f6rable de bien le laver au m6thanol et de ne pas le recristalliser. En effet toute cristallisation entraine des d6gradations de plus en plus importantes. F -- 186°, d6c. 160°. Analyse 616mentaire calcul6e: C ~ 67.38, H ~ 4.60; trouv6e: C ~ 66.75, H ~ 4.60. (3) BromomOthyl-7-benzo(a)anthracbne (V). Nous a 6t6 fourni par la Soci6t6 Schuchardt. F = 197 °. Les travaux de BOYLANDET SIMS [voir par exemple, P. SIMS, Biochem. J., 105 (1967) 591] montrant la prOsence de dOrivOshydroxym6thylOsdans les m6tabolites des hydrocarbures aromatiques mOthyl6s contribuant d'ailleurs h formuler une telle hypoth6se.

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ACTION DE HYDROCARBURESAROMATIQUESBROMOMETHYLF,S

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(4) Bis(bromomOthyl)-7,12-benzo(a)anthrackne (VI). I1 a 6t6 pr6par6 selon la technique d6crite par BADGER ET COOK~6, c'est-/t-dire par action du brome sur le dim6thyl-7,12-benzo(a)anthrac6ne dans le sulfure de carbone anhydre. Le pr6cipit6 jaune form6 est repris dans du benz~ne d'o~ il cristallise en fines aiguilles jaune p~le. F = 224 ° (litt. 16: 208-209°). (5) Bromomdthyl-12-benzo(a)acridine (II) et bromomdthyl-7-benzo(c)acridine (IV). Elles ont 6t6 prdpardes selon la technique de bromuration d6crite par Buu-HOi ~7, c'est-/l-dire par action du N-bromosuccinimide sur les m6thylbenzacridines correspondantes dans le t6trachlorure de carbone en pr6sence de traces d'acide perbenzoique. Par cristallisation dans le benz6ne on obtient des paillettesjaune orang6. F (II) = 178 °. F (IV) = 188-190 °. Analyse dldmentaire

%C

%H

%N

%Br

(II) calcul6e (II) trouv6e (IV) trouvde

67.10 66.50 66.92

3.75 3.89 3.82

4.35 4.98 4.05

24.80 24.92 24.25

(b) Systbmes acellulaires Les syst~mes acellulaires utilis6s sont ceux d6crits par NAKAMOTOet coll. 18 pour la synth6se du R N A et par ZIMMERMAN 19 pour la synth6se du DNA. Darts les deux cas les fractions enzymatiques ont 6t6 extraites du Micrococcus lysodeikticus, nous avons utilis6 dans ces deux cas les fractions obtenues apr6s les 5 premieres 6tapes de purification. La composition respective des deux syst6mes est donn6e ci-dessous. (1) Systbme RNA polym&ase (DNA-dOpendante). Dans un volume final de 0.5 ml: Tris (pH 7.5) 50 /~moles, nucl6otides non-marqu6s 0.4/~mole de chacun, nucl6otide radioactif 0.2 #mole (125 m#Ci), D N A de thymus de veau 50/zg, spermidine HC1 0.8/~moles, MnCI2 1.25/tmole--fraction enzymatique 20 #1 d'une solution Tris (0.l M, p H 7.5)-glyc6rine (V : V) renfermant quelques/~g de prot6ines. L'hydrocarbure est ajout6 en solution ac6tonique lorsqu'une partie des r6actifs (HzO, Tris, nucl6otides non marqu6s, DNA, spermidine, MnC12) a d6j/l ~t6 port6e/l 30 °. Un temps de 5 min s'6coule avant l'addition de l'enzyme et du nucl6otide marqu6. En g6n6ral nous constituons un m61ange correspondant ~ plusieurs 6chantillons, sur lequel nous pouvons effectuer des pr616vements au cours du temps d'incubation, l'origine du temps 6tant pris au moment de l'introduction du nucl6otide radioactif. La r6action est arr&6e dans la glace par 0.1 ml de T C A / l 50 ~ et le milieu, additionn6 de 200/zg de R N A / l titre d'entraineur, est finalement trait6 par 0.3 ml de T C A / l 5 ~ . Apr+s deux lavages du pr6cipit6 ainsi obtenu l'un par du T C A / t 5 ~ et l'autre par de l'alcool b, 95 °, ce pr6cipit6 est s6ch6 et dig6r6 par 0.3 ml de solu6ne; une partie aliquote de cette solution solu6nique est mesur6e par scintillation en milieu liquide/a l'aide d'un tricarb Packard (milieu scintillant standard tolu6ne 1 1, POPOP 100 mg, PPO 4 g). On a 6galement utilis6 la filtration sur fibre de verre Whatman G F / C pour r6cup6rer

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le matdriel insoluble en milieu trichlorac6tique. Le filtre Whatman est lay6 plusieurs fois avec du TCA 5 ~o et finalement par de l'alcool 5. 95 °, sdch~ il est introduit dans le milieu scintillant en vue de la mesure de sa radioactivit& Les r6sultats obtenus par l'une ou l'autre m&hode sont tout 5. fait analogues. (2) Systbmes DNA polym&ase (DNA-dOpendante). Ce syst6me renferme dans un volume de 0.3 ml: Tris (pH 7.4) 20 ffmoles, d6soxyribonucl6otide non radioactif 10 mffmoles de chacun, MgC12 1 ffmole, 2-mercapto&hanol 0.3 ffmole, D N A de thymus de veau 10#g, pH]-dTTP 4 mffmoles (200 mffCi), enzyme 25ffl de la fraction enzymatique, soit environ 6 #g, m61ang6s 5. 75 ffl d'une solution d'albumine bovine (1 mg/1 ml Tris 0.05 M, 2-mercapto6thanol 0.01 M, pH 7.5). L'hydrocarbure est ajout6 comme dans le cas du syst6me RNA polym6rase lorsqu'une partie des r6actifs (Tris, MgC12, mercapto6thanol, d6soxyribonucl6otides non-marqu6s, DNA) a 6t6 portde 5. 37 °. L'incubation est poursuivie 30 min 5. 37 °. La r6action est arr~t6e dans la glace par addition de 0.5 ml de PCA 5. 7 ~. Apr~s 5 min et addition de 2 ml de pyrophosphate 0.01 M, le pr6cipit6 est filtr6 sur fibre de verre, lav6 par du PCA 5. 0.7 ~ et de l'alcool 5. 80 °. La mesure de la radioactivit6 port6e par le filtre est effectude comme il a d6jb, ~t6 signal& Dans chaque experience, des 6chantillons t6moins sont pr6par~s, pour lesquels la solution ac6tonique de l'hydrocarbure est remplac6e par de l'acdtone pure. Rt~SULTATS

Les Figs. 1 et 2 montrent les r6sultats obtenus en pr6sence et en absence de

u

T~moln

8ooo

2

I

CHaBr'

6000

g g o 4000 O

CH 2 Br

c

2000

0

I

I

I

10 20 30 Temps d'incubation du syst&ne (rain) Fig. 1. Effet du bromomdthyl-7-benzo(a)anthrac6ne 5. diff6rentes concentrations sur l'incorporation de 13H]-TMP dans u n syst~me D N A polym6rase ( D N A - d 6 p e n d a n t e ) . × , 0.12 fig; O, 0.5 #g, p o u r 10 fig D N A dans 0.190 ml.

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T~mo~n 8000 E

~600C 7

g

~ 400C o 0

CN2BP

2000

I I ~, 5 10 Temps d'incubation du systbme (rain)

Fig. 2. Effet du bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac6ne sur l'incorporation de [14C]-AMP dans un syst6me R N A polym6rase (DNA-d6pendante). 1.2/~g pour 50 #g D N A dans 0.460 ml.

bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac6ne dans un syst6me D N A polym6rase ou R N A polym6rase. On a suivi, la synth6se du D N A et du R N A en 6valuant respectivement l'incorporation de dTMP triti6 ou de AMP radiocarbon6 dans les cha~nes en voie de formation. Dans les deux cas on remarque l'existence d'une tr6s nette inhibition du fonc-

6000 E

i

T@moin

4000,

I

~ 200c

8 I

I

I

10 20 30 Temps d'incubotion du systbme (rain) Fig. 3. Effet du temps d'addition du bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac6nesur l'incorporation de [3H]d T M P dans un syst6me D N A polym6rase (DNA-d6pendante). O, addition de l'hydrocarbure au temps z~ro, 0.4 #g pour 10/zg D N A dans 0.190 ml; ×, addition de l'hydrocarbure 11 rain apr6s le d6but de l'incubation, 0.4/tg pour 10 #g D N A dans 0.3 ml.

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--

P. DAUDEL e t coll.

5(

.o .c c i-4

, , . I I CH2Br

CH2Br -

(I)

CH2Br

+

(If)

CH2Br

-I- +

~I

+

~z

CFI2Br

+

+-t--I-

~

~zI

Fig. 4. Effet de diff6rents d6riv6s bromom6thyl6s d'hydrocarbures polycycliques sur l'inhibition de l'incorporation de [3H]-dTMP (exprim6e en ~ par rapport ~t un syst~me t6moin) dans un syst~me D N A polym6rase (DNA-d6pendante), concentration du d6riv6 bromom6thyl6 7 . 7 . 1 0 - 6 M. Voir dans le paragraphe r6sultats la signification des symboles + et --.

tionnement du syst+me provoqu6e par le d6riv6 halog6n6 d'hydrocarbure, par rapport aux 6chantillons t6moins. Cette inhibition d6pend de la concentration du ddriv6 de l'hydrocarbure. La Fig. 1 montre cet effet, il s'agit des perturbations apport6es au fonctionnement du syst~me D N A polym6rase par Faction du bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac~ne h deux concentrations diff6rentes. Comme on peut le voir sur la Fig. 3 l'effet de l'hydrocarbure bromom6thyl6 se traduit instantan6ment. Dans l'exp6rience dont les r6sultats sont traduits sur ce graphique on a introduit le bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac6ne au cours de l'incuba-

50

g

.

c

, i I [

CH2Br

CH2Br -+-

I

rr

I

CH2Br q- q.

I~

CH2Br +

+

+

++

-E?

Fig. 5. Effet de diff6rents d6riv6s bromom6thyl6s d'hydrocarbures polycycliques sur l'inhibition de l'incorporation de [14C]-AMP (exprim6e en ~ par rapport h un systbme t6moin) dans un syst~me R N A polym6rase (DNA-d6pendante), concentration du d6riv6 bromom6thyl6 8 . 1 0 - 6 M. Voir dans le paragraphe r6sultats la signification des symboles q- et .

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tion d'un syst6me D N A polym6rase, la courbe repr6sentant l'6volution de ce syst6me, initialement superpos6e avec celle de l'6chantillon t6moin, s'incurve apr~s l'addition de l'hydrocarbure. Enfin les graphiques des Figs. 4 et 5 donnent les valeurs des inhibitions produites par diff6rents d6riv6s bromom6thyl~s d'hydrocarbures aromatiques sur le fonctionnement soit du syst6me DNA polym6rase (Fig. 4) soit de celui de la RNA polymdrase (Fig. 5). Sur les graphiques ont 6t6 rappel6s, dans la symbolique habituelle* les pouvoirs canc6rog+nes des diff6rents d6riv6s m6thyl6s non-halog6n6s correspondants aux substances que nous avons utilis6es. Pr6cisons qu'il s'agit du pouvoir canc6rog~ne, vis-avis de la souris, l'hydrocarbure 6tant administr6 par badigeonnage sur la peau. CONCLUSION

D'apr6s la Fig. 5 on observe que le fonctionnement d'un syst6me RNA polym6rase DNA-d6pendante est peu alt6r6 (inhibition maximale 12~) par la pr6sence des d6riv6s bromom6thyl6s dont les homologues m6thyl6s non-halogkn~s sont trbs faiblement ou pas canc&ogbnes. L'inhibition d6passe au moins 35 ~ dans le cas off l'on a examin6 l'effet des d6riv6s bromom6thyl6s correspondants aux hydrocarbures canc&ogbnes. Quand on consid6re l'effet de ces m6mes substances sur le fonctionnement d'un syst6me DNA polym6rase, les r6sultats sont qualitativement analogues ~ part cependant une exception importante celle de la bromom6thyl-7-benzo(c)acridine (IV)qui n'a pratiquement pas d'effet sur la synth6se du DNA alors qu'elle se range dans le groupe des compos6s qui provoquent une inhibition de la synth6se du RNA. L'ensemble des r6sultats que nous venons de rapporter montrant un assez bon parall61isme entre l'effet inhibiteur de la synth+se des acides nucl6iques par les d6riv6s bromom6thyl6s d'hydrocarbures polycycliques et le pouvoir canc6rog6ne de leurs homologues non brom6s semble un bon argument en faveur de l'hypoth~se 6mise par BROOKES.

POCHON ET MICHELSON2° ont &udi6 l'interaction du bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac6ne avec le D N A et ont montr6 que ce d6riv6 se fixe vraisemblablement sur le carbone-8 de la guanine dans le grand sillon du DNA. Ces auteurs ont 6galement montr6 l'existence de ponts 6tablis par l'hydrocarbure entre deux bases. On conqoit bien que la pr6sence de l'hydrocarbure fix6 chimiquement sur le DNA par une ou deux de ses r6gions puisse provoquer des alt6rations profondes dans la synth6se du DNA ou du RNA, comme celles que nous avons observ6es.

* Les symboles + + + , correspondent ~. des d6riv6s dou6s d'un fort pouvoir canc6rog~ne; ± , correspondent b. des d6riv6s dou6s d ' u n pouvoir canc6rog~ne faible ou d o u t e u x ; - - , correspondent b. des d6riv6s n'ayant pas provoqu6 de tumeurs dans les conditions exp6rimentales utilis6es.

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REMERCIEMENTS

Nous remercions particuli6rement Madame F. LUTCHER pour son assistance technique tout au long de ce travail, Madame A. MATHIEU et Monsieur DUFOUR qui ont bien voulu examin6 les d6riv6s bromom6thylds du point de vue de leurs spectres IR et N M R ; Mesdames A. JACQUIER et N. REBEYROTTEainsi que Mr. J. MOREAU qui nous ont aid6s b, pr6parer les fractions enzymatiques n6cessaires ft. la r6alisation de ce travail; de m6me nous adressons nos remerciements fi Melle A. M. VOJTEK et fi Mr. J. F. GR~NSTEINqui ont contribu6 b. la pr6paration des compos6s (II et IV), ainsi qu'au Service de Biologie du Commissariat h l'Energie Atomique pour l'aide financi6re qu'il veut bien nous apporter pour l'achat de mol6cules marqu6es. Nous exprimons notre reconnaissance au Professeur J. H. WEISBURGERpour les utiles commentaires dont il nous a fait part. RESUME

L'action sur la synth6se in vitro de DNA et de RNA, d'une s6rie de d6riv6s bromom6thyl6s d'hydrocarbures polycycliques a 6t6 6tudi6e, en 6valuant l'incorporation de [3H]-dTMP ou de [14C]-AMP dans les chaines n6oform6es de syst+mes DNA ou RNA polym6rase d6pendante de DNA. L'inhibition de la synth6se de RNA a 6t6 trouv6e inf6rieure ~t 12 % dans les cas du bromom&hyl-9-anthrac6ne, du m6thyl-9-bromom6thyl-10-anthrac6ne et de la bromom6thyl- 12-benzo(a)acridine; et sup6rieure fi 37 o~opour le bromom6thyl-7-benzo(a)anthrac6ne, le bis-(bromom6thyl)-7,12-benzo(a)anthrac+ne, et labromom6thyl-7benzo(c)acridine. Des r6sultats similaires ont 6t6 obtenus dans l'6tude de l'inhibition de la synth6se du DNA, ~t l'exception de la bromom6thyl-7-benzo(c)acridine qui s'est r6v616e pratiquement sans effet. En dehors de cette exception une bonne corrdlation apparaTt entre l'effet inhibiteur des d6riv6s brornom&hylds utilis6s et le pouvoir canc6rog6ne de leurs homologues non-brom6s.

B1BLIOGRAPHIE 1 2 3

4 5

6

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ACTION DE HYDROCARBURES AROMATIQUES BROMOMI~THYL15S 7

8 9 10 Il 12

13 14

15 16 17

18

19 20

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