Angiostatina y su actividad antitumoral

REVISIONES

Angiostatina y su actividad antitumoral Jordi Félez, Mercè Jardí y Begoña Arza Departamento de Biología Vascular. Institut de Recerca Oncològica (IRO). Hospital Duran i Reynals. Barcelona. Angiostatina; Angiogénesis; Vasculogénesis; Cáncer; Actividad antitumoral

La angiogénesis constituye uno de los factores que favorecen el crecimiento tumoral y su diseminación. Diversas sustancias poseen la capacidad de inhibir el proceso angiogénico. Un conjunto de evidencias parecen demostrar que, entre las sustancias con capacidad antiangiogénica, la angiostatina (AGS) sola, asociada a endostatina o a otros agentes terapéuticos puede constituir un nuevo agente terapéutico con actividad antitumoral. En el presente artículo se revisan los mecanismos implicados en la formación de los vasos, vasculogénesis y angiogénesis, así como la posibilidad de manipular terapéuticamente estos mecanismos, haciendo un especial hincapié en la AGS, un fragmento derivado del plasminógeno. Vasculogénesis y angiogénesis El crecimiento de los tejidos está ligado al proceso angiogénico. La creación de nuevos vasos puede producirse a través de dos mecanismos distintos: la vasculogénesis y la angiogénesis1,2. La vasculogénesis implica el desarrollo de nuevos vasos a partir de células troncales endodérmicas pobremente diferenciadas, que según el estímulo recibido pueden diferenciarse hacia progenitores hematopoyéticos o hacia endodermo que irá desarrollándose hasta formar nuevas estructuras vasculares. En condiciones normales, este proceso está ligado fundamentalmente al desarrollo embrionario y fetal, aunque en determinadas situaciones de la vida adulta se induce también la vasculogénesis. La angiogénesis define el proceso de formación de nuevos vasos a partir de los ya existentes. De forma clásica, durante la angiogénesis pueden distinguirse distintas fases3. Inicialmente, en respuesta a una serie de estímulos angiogénicos locales, los capilares y las vénulas poscapilares son «activados». Las consecuencias de esta «activación» no están del todo definidas molecularmente, pero se sabe que tras este proceso se producen una vasodilatación, un incremento de la permeabilidad vascular, la acumulación de fibrina extravascular y la posterior degradación proteolítica de las matrices extracelulares de los vasos a partir de las cuales se generan nuevos capilares. Las células endoteliales activadas generan prolongaciones citoplasmáticas e inician un proceso de migración sobre la matriz extracelular circundante hacia el lugar donde se ha producido el estímulo angiogénico inicial. Las células endoteliales migrantes se elongan, se alinean formando un nuevo brote capilar y comienzan un proceso de división activa polarizada sobre el extremo al que se dirige el nuevo vaso. El nuevo brote capilar pronto genera una cavidad proximal que se extiende hacia la zona de proliferación. Numerosos brotes capilares anastomosan sus extremos hasta formar un circuito por el que se establece el flujo sanguíneo. La maduración de los vasos se produce al desaCorrespondencia: Dr. J. Félez. Departamento de Biología Vascular. Institut de Recerca Oncològica (IRO). Hospital Duran i Reynals. Autovía de Castelldefels, km 2,7. L’Hospitalet de Llobregat. 08907 Barcelona. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 9-12-1999; aceptado para su publicación el 18-1-2000 (Med Clin (Barc) 2000; 114: 431-436

rrollarse la membrana basal rodeada por una capa cada vez más prominente de células musculares lisas, lo que contribuye a la morfogénesis capilar. Diversos procesos, como el desarrollo muscular, el crecimiento, la reparación de las heridas, etc., están ligados a la proliferación de estos nuevos vasos a partir de brotes capilares de los vasos ya existentes.

Angioblastos

Vasculogénesis Plexo vascular primario

Angiogénesis Sin brotes vasculares (intususcepción) Angiogénesis Con brotes vasculares

Pericitos y células musculares lisas Neoformación vascular

Arteria

Capilares

Vena

Fig. 1. Vasculogénesis y angiogénesis. A partir de agregados de angioblastos puede inducirse su diferenciación hacia células endoteliales y su organización en plexos vasculares primarios (vasculogénesis). Este proceso está mediado por el factor de crecimiento endotelial vascular tipo A (VEGF-A) y su receptor Flk-1. Desde los plexos vasculares primarios puede inducirse la angiogénesis por dos vías: intususcepción (angiogénesis sin brotes vasculares) o por formación de brotes o yemas vasculares (angiogénesis con brotes vasculares). La diferenciación hacia una u otra vía depende de las interacciones coordinadas entre los sistemas del VEGF-A y la familia de genes de la angiopoyetina. La angiogénesis por intususcepción se produce por activación del sistema VEGF-A y sus receptores, así como por la encapsidación de las células periendoteliales (pericitos y células musculares lisas) mediada por TIE-1 (receptor endotelial tirosincinasa con homología con inmunoglobulina y el factor de crecimiento endotelial), TIE-2 (receptor tirosincinasa de la túnica interna endotelial) y angiopoyetina-1. La angiogénesis por brotes requiere la degradación de la matriz extracelular y la inducción de la migración endotelial, en la que participan el VEGF-A y la angiopoyetina-2. Los pericitos y las células musculares lisas proporcionan la fuerza estructural de los vasos neoformados, en parte, por generar matriz extracelular. Además, estas células participan en la maduración funcional de los vasos controlando el tono vascular, su permeabilidad y otras funciones vasculares. En estos procesos, en el ámbito molecular, junto con diversos miembros de la familia de angiopoyetinas participan también varias moléculas del sistema coagulativo: factor tisular (TF), posiblemente el receptor de la trombina y el PDGF-B y su receptor. El TGF-β1 (factor de crecimiento transformante tipo β1) participa en la diferenciación de las células mesoteliales hacia pericitos o células musculares lisas.

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MEDICINA CLÍNICA. VOL. 114. NÚM. 11. 2000

TABLA 1 Moduladores de la angiogénesis

A

Positivos

Transformación maligna B

C

Plg

AGS

Plg

AGS

Tumor in situ

AGS

Inicio de la angiogénesis

D

Crecimiento tumoral Fig. 2. Representación esquemática del proceso de crecimiento tumoral y su relación con la angiogénesis. A partir de una transformación maligna inicial (A), las células tumorales pueden permanecer localizadas in situ (B) a través de un proceso en el que se mantiene un equilibrio entre células tumorales en crecimiento y muerte celular inducida, en parte, por la falta de vascularización. Esta fase se denomina «tumor in situ» y parece estar regulada en parte por la generación de angiostatina (AGS) a partir del plasminógeno peritumoral (Plg), que impediría la neovascularización del tumor. En determinadas condiciones, los moduladores positivos de la angiogénesis pueden sobrepasar a sus represores, iniciándose la neovascularización del tumor (C) que finalmente favorece su crecimiento (D) y diseminación. Las células tumorales pueden migrar a partir del tumor primario y formar pequeñas colonias en tejidos a veces distantes del tumor primario. Sobre estos tejidos, las colonias de células tumorales pueden permanecer localizadas durante un tiempo relativamente largo (de forma similar al proceso representado en B) o, por el contrario, inducir la neovascularización de la colonia y su crecimiento (metástasis) tal como se ha representado en C y D.

Un numeroso grupo de genes y sus productos median en el proceso angiogénico participando de distinta manera en la regulación de la vasculogénesis y de la angiogénesis. Algunos de los genes implicados en el desarrollo vascular son activados por distintos inductores según el proceso en el que participan, vasculogenésis o angiogénesis. Recientemente se han intentado dilucidar estos mecanismos de regulación molecular4,5. Las vías que participan en él no están del todo definidas ni completadas pero, como puede verse en la figura 1, es un proceso complejo, en el que los genes reguladores del proceso vasculogénico o angiogénico son activados para inducir el crecimiento vascular, mientras que otros genes actúan limitándolo. El balance entre ambas regulaciones, positiva y negativa, comporta en condiciones fi-

432

VEGF/VPF FGF-1, -2, -5 Lípidos de adipocitos Angiogenina EGF/TGF-α Oligosacáridos hialurónicos Hipoxia IL-8 MGF PDGF-BB PIGF Proliferina TGF-β Factor tisular TNF-α G-CSF

Negativos

Angiostatina Endostatina TGF-β Quimocinas C-X-C Ácido hialurónico IL-12 Interferones MMP PAI-1 Proliferin-related protein Esteroides Retinoides Trombospondina TNF-α Inhibidores de la ribonucleasa Fragmento (16 kD) de prolactina

siológicas el establecimiento de nuevos vasos cuyo desarrollo se ajusta a la demanda de oxígeno y nutrientes por el tejido neoformado, y contribuye al mantenimiento de los lechos vasculares necesarios para asegurar la función normal de un determinado órgano o tejido. Un gran número de sustancias participan en la regulación de la angiogénesis. En la tabla 1 se han resumido las más importantes hasta ahora conocidas. Estas sustancias mediadoras del proceso angiogénico se agrupan en reguladores positivos, o sea, factores que estimulan el crecimiento de nuevos vasos, y reguladores negativos, factores que frenan el crecimiento de los vasos o inducen apoptosis de las células endoteliales. La actividad de algunos de estos mediadores es sumamente importante, como se ha demostrado en estudios tanto in vitro como in vivo. Esto ha permitido el inicio de estudios clínicos, algunos ya en fases II y III, diseñados para evaluar su posible potencial terapéutico como agentes mediadores de la angiogénesis6-8. Manipulación terapéutica de la angiogénesis Distintos procesos patológicos están ligados a una anormal vascularización (tabla 2). Se cree que en determinadas situaciones patológicas el desarrollo de una nueva vasculatura puede provocar una hipotética mejoría9-12. Por ejemplo, se considera que la estimulación precoz de nuevos vasos en el tejido miocárdico mejoraría la hipoxia inducida por una circulación coronaria anormal10,13-19. Por el contrario, la disminución del proceso angiogénico en la retinopatía proliferativa podría mejorar la pérdida de agudeza visual que se asocia a esta enfermedad10,11,13. Aunque la modulación selectiva del proceso angiogénico en un determinado tejido hace unos años podría parecer un objetivo fuera del alcance terapéutico, en la actualidad estamos en condiciones de poder actuar selectivamente en un órgano o tejido. De hecho, se han realizado ya las primeras experiencias utilizando vectores génicos dirigidos hacia un tejido diana a los que se les ha acoplado el gen de un determinado modulador angiogénico20-22. El vector insertado específicamente en un tejido diana se activa sobre éste sobreexpresando un determinado modulador angiogénico. Un número importante de grupos de investigación y empresas de biotecnología trabaja de manera activa sobre los mecanismos de manipulación terapéutica de la angiogénesis8. En la tabla 3 se describen algunos de los estudios clínicos que se están realizando actualmente (datos del National Cancer Institute6), señalando el objetivo que se persigue y el agente modulador de la angiogénesis utilizado.

J. FÉLEZ ET AL.– ANGIOSTATINA Y SU ACTIVIDAD ANTITUMORAL

Cáncer y angiogénesis

desarrolla hasta que su tamaño produce una autolimitación en su crecimiento. La activa proliferación celular que habitualmente acompaña al desarrollo inicial del tumor se ve autolimitada por el proceso de muerte celular inducido por el alejamiento del aporte sanguíneo de las células tumorales neoformadas. Puede alcanzarse un equilibrio entre células que proliferan y las que mueren por falta de oxígeno y nutrientes, desarrollándose lo que normalmente denominamos tumor in situ. Este estadio tumoral puede permanecer silente durante un período de tiempo prolongado, sin producir manifestaciones clínicas importantes y sin que por los medios más usuales pueda detectarse precozmente la transformación maligna, a menos que se trate de un tumor fácilmente localizable como algunos de piel o cérvix. Por el tipo de tumor, por el tejido afecto o por causas todavía no conocidas, el proceso de neovascularización puede activarse rompiendo el equilibrio entre células malignas que proliferan y células que mueren. Las células tumorales pueden por sí mismas inducir la neovascularización o inducirla indirectamente a través de mediadores liberados por el tejido circundante al tumor o por macrófagos y neutrófilos. Incluso en estas circunstancias, el proceso de neovascularización puede ser abortado por distintos mecanismos a través de la sobreexpresión de sustancias que son capaces de frenarlo: factores antiangiogénicos. Si estos mecanismos antiangiogénicos son ineficaces o se ven superados por la inducción de la neovascularización, cientos de nuevos capilares convergen hacia el pequeño tumor favoreciendo su rápido crecimiento. Se calcula que cada 100-1.000 células tumorales precisan de una nueva célula endotelial para mantener su viabilidad23. Un gramo de tumor que aproximadamente contiene entre 0,1-2 billones de células precisa de al menos unos 20 millones de células endoteliales para asegurar su supervivencia. Desde una perspectiva distinta, si fuéramos capaces de inhibir el crecimiento de una célula endotelial, induciríamos la muerte de 100 a 1.000 células tumorales23. La neovascularización tumoral comporta que las nuevas células endoteliales generadas promuevan la proliferación y la

La mayoría de tejidos de nuestro organismo están rodeados por una capa muy fina de capilares que aportan nutrientes, eliminan productos de desecho y participan en el normal aporte de oxígeno. En general, en la vida adulta los capilares no aumentan ni de tamaño ni de número, dado que las células endoteliales que forman la estrecha pared capilar no se dividen, excepto en condiciones particulares como, por ejemplo, durante el proceso de cicatrización de las heridas o durante el ciclo menstrual en el endometrio. En estas circunstancias se pone en marcha el proceso angiogénico o de proliferación vascular, que se autolimita al cabo de un tiempo. El proceso de neovascularización se produce también en condiciones patológicas como por ejemplo, en las retinopatías proliferativas, la artritis, etc. El crecimiento tumoral depende también de una neovascularización. La transformación maligna que implica la inicial formación de una pequeña masa tumoral, en un principio, se produce sin estimular la angiogénesis (fig. 2). Inicialmente, el tumor se TABLA 2 Procesos que pueden beneficiarse de la manipulación terapéutica de la angiogénesis Incrementado la respuesta angiogénica Inducción de la formación de vasos colaterales Isquemia miocárdica Isquemia periférica Isquemia cerebral Cicatrización de las heridas Reparación de fracturas Cirugía reparadora Trasplante de islotes de Langerhans Disminuyendo la respuesta angiogénica Crecimiento tumoral y metástasis Neovascularización retiniana Hemangioma Artritis reumatoide Neovascularización de placas ateroscleróticas

TABLA 3 Inhibidores de la angiogénesis en ensayos clínicos (fases II y III) Fármaco

Promotor

Fase

Mecanismo

Fármacos que previenen que nuevos vasos sanguíneos invadan el tejido que los rodea Marimastat Bay 12-9566 Ag3340

British Biotech, Annapolis, MD Bayer, West Haven, CT Agouron, La Jolla, CA

Fase III Fase III Fase III

Inhibidor sintético de metaloproteinasas de matriz (MMP) Inhibidor sintético MMP Inhibidor sintético MMP

Fase II Fases I/II

Inhibidores del crecimiento endotelial Inhibidores del crecimiento endotelial

Inhibidores naturales de la angiogénesis Factor 4 plaquetario Interleucina 2

Repligen, Cambridge, MA Genetics Institute, Cambridge, MA

Fármacos que bloquean los factores que estimulan la formación de vasos sanguíneos RhuMad VEGF Su5416 Interferón α

Genentech, San Francisco, CA Sugen, Inc., Redwood City, CA Disponible comercialmente

Fase II Fase II Fase II

Anticuerpo monoclonal contra el VEGF Molécula que bloquea el receptor VEGF Inhibe la liberación del VEGF

Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE

Fase II

Toxina bacteriana que se une a los vasos sanguíneos recién formados e induce una respuesta inflamatoria

Fase II

Análogo sintético de una proteína fúngica; inhibe el crecimiento de las células endoteliales

Terapia antivascular dirigida ZD0101

Interrumpe la división de las células endoteliales TNP-470

TAP Pharmaceuticals, Inc., Deerfield, DL

Mecanismos desconocidos; inhiben la angiogénesis en ensayos de laboratorio y en animales Talidomida CAI Suramina IM862

Entremed, Inc., Rockville, MD NCI, Bethesda, MD Parke-Davis, Morris Plains, NJ Cytran, Kirkland,WA

Fase II Fases I/II Fases II/III Fase II

Sedante sintético; mecanismo desconocido Inhibidor no específico de la invasión y motilidad celular Efectos no específicos y múltiples Mecanismos desconocidos

Datos obtenidos del Journal of the National Cancer Institute, 1 de julio de 19986.

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Plasminógeno K1

K2

K3

K4

K5

Angiostatinas

Degradación del plasminógeno

Fig. 3. Representación esquemática de la formación de angiostatina/s a partir del plasminógeno. Varias enzimas proteolíticas pueden degradar al plasminógeno por diversas zonas generando fragmentos de distinta longitud que contienen los kringles (K) 1-3, 1-4, 1-5, o el kringle 5 aislado. Todos estos fragmentos del plasminógeno poseen actividad antiangiogénica, aunque al parecer el fragmento que contiene los kringles 1-4 y el kringle 5 aislado poseen mayor actividad que los demás (veanse detalles en el texto).

motilidad de las células tumorales. Las células endoteliales en división son capaces de secretar componentes que participan en estos procesos. Por ejemplo, en el cáncer de mama, los capilares neoformados secretan interleucina 6 que incrementa las posibilidades de que las células tumorales abandonen los límites iniciales del tumor, migren hacia el flujo sanguíneo e invadan y se expandan en otros órganos (metástasis)23. Algunas de estas células metastáticas serán angiogénicas y, por ello, se desarrollarán rápidamente en el tejido invadido. Otras, sin embargo, pueden adquirir su potencial angiogénico al cabo de largos períodos de tiempo, incluso cuando el tumor primario del que derivan ha sido eliminado. La posibilidad de que la angiogénesis tumoral pueda modificarse terapéuticamente abre una nueva perspectiva en el tratamiento del cáncer13,23-30. No se intenta eliminar el tumor, sino privarlo de sus nutrientes. La diana terapéutica no es la célula cancerosa, capaz siempre de producir nuevas mutaciones y hacerse resistente a fármacos citostáticos, sino la célula endotelial sana, con una baja capacidad de replicación y mínima posibilidad de mutación. La angiostatina Entre los factores que frenan el crecimiento de los vasos, un componente, la AGS, ha demostrado en estudios in vitro e in vivo una actividad antiangiogénica que parece capaz de disminuir el crecimiento tumoral y la diseminación metastá-

434

sica31-33. De hecho, la AGS fue identificada por vez primera sobre un modelo murino al que se habían implantado células tumorales pulmonares de Lewis31. En los ratones con células tumorales pudo detectarse en la orina y en plasma un componente que era capaz de inhibir la proliferación de células endoteliales ex vivo e in vivo. Esta sustancia se denominó AGS. Si el tumor primario implantado era resecado, la actividad antiangiogénica disminuía drásticamente, lo que indicaba que la presencia de AGS se asociaba al tumor primario. Esta observación condujo al grupo de Folkman a postular la teoría de la neoplasia silente, según la cual durante el período inicial de la tumorogénesis, si las células malignas son capaces de inducir la expresión o generación de AGS, el tumor permanece localizado in situ, sin diseminarse23,26. En estas situaciones fue posible detectar AGS en la sangre circulante y en la orina de estos animales. Los modelos murinos a los que se implantó este tipo de tumores no desarrollaban metástasis pulmonares cuando se les inyectaban células de carcinoma de Lewis. Sin embargo, cuando se resecaba el tumor primario, se observó un gran número de metástasis pulmonares. Todo ello parecía confirmar la teoría propuesta por el grupo de Folkman. La identificación y caracterización de la AGS en los animales de experimentación fue relativamente fácil, pero sorprendente. Pronto pudo constatarse que la proteína identificada correspondía a un fragmento del plasminógeno, una proenzima presente en grandes cantidades en el plasma y medio intersticial que tras ser activada se convierte en plasmina, la enzima responsable de la degradación de la fibrina de los coágulos y trombos, que participa también en la disolución de las matrices extracelulares. Como se ha comentado, la AGS resultaba ser un fragmento del plasminógeno. En el ámbito molecular, el plasminógeno es una molécula de 92 kDa, en la que se localiza una región donde reside su potencial enzimático proteolítico (proteasa-domain) y unas estructuras que se agrupan de manera que recuerdan la forma de un famoso pastel escandinavo denominado kringle. La agrupación molecular en forma de kringles no es exclusiva del plasminógeno. Diversas proteínas, incluidas la protrombina, la urocinasa, el tPA, la lipoproteína(a), etc., poseen en distinto número estas agrupaciones características que forman los kringles. El plasminógeno posee cinco kringles, que difieren ligeramente unos de otros, numerados 1 a 5 (fig. 3). La AGS, originalmente descrita por el grupo de Folkman, corresponde al fragmento del plasminógeno comprendido entre los kringles 1 y 4. Sin embargo, en estudios posteriores se ha podido constatar que la región entre los kringles 1 y 3 y, como veremos posteriormente, el kringle 5 poseen también una actividad antiangiogénica34-37. Aunque de forma rigurosa deberíamos hablar de angiostatinas, dependiendo de los kringles presentes, en aras de una mayor simplificación nos referiremos a la AGS como el fragmento del plasminógeno comprendido entre los kringles 1 y 4. Angiostatina y actividad antitumoral La AGS puede obtenerse con relativa facilidad a partir de una proteólisis parcial del plasminógeno o también de manera recombinante38,39, lo que ha facilitado la realización de numerosos estudios biológicos en los que se ha ensayado su potencial antitumoral de diversas maneras. Desde la descripción inicial de la AGS en 1994 hasta la actualidad, el número de trabajos científicos publicados sobre la AGS ha crecido de manera espectacular y posiblemente lo irá haciendo durante los próximos años (fig. 4). Estos estudios se centran básicamente en dos temas de interés. En un primer grupo se intentan caracterizar las funciones biológicas de la

J. FÉLEZ ET AL.– ANGIOSTATINA Y SU ACTIVIDAD ANTITUMORAL

60 MMP-3

Número de publicaciones

50

40

30 MMP-3 Plg

20

1

4

12

ON

10

0

1994

1995

1996

1997

1998

Fig. 4. Número de publicaciones sobre angiostatina desde 1994 hasta 1998.

Fig. 5. Generación de AGS y kringle 5 por degradación del plasminógeno con MMP-3. En la parte superior se representan esquemáticamente las zonas del plasminógeno susceptibles de ser degradadas por la MMP-3. La parte inferior corresponde a un Western blot en el que se evidencia cómo el plasminógeno (Plg) es degradado por la MMP-3 en función del tiempo (1, 4 y 12 en horas) generando AGS (K1-4). Como puede observarse, la digestión prolongada (ON) del Plg con MMP-3 genera K5. La detección del plasminógeno se ha realizado con un anticuerpo policlonal contra el mismo, mientras que la detección del K5 se ha realizado con un anticuerpo monoclonal contra el K5.

500 400 Células (× 1.000)

AGS y los mecanismos que regulan su generación. En un segundo grupo se analiza el papel de la AGS como agente antitumoral, sola o asociada a otros componentes antiangiogénicos o antineoplásicos. Aunque diversas evidencias señalan que la AGS se genera por una proteólisis del plasminógeno, no se ha definido el papel predominante de una única enzima en la formación de la AGS. En principio, cualquier enzima con capacidad para degradar al plasminógeno, separando los kringles del resto de su estructura, podría actuar como agente generador de la AGS. Hipotéticamente, la misma plasmina, la elastasa y distintas metaloproteasas pueden realizar esta función in vivo. Recientes estudios han demostrado que el sistema del plasminógeno actúa de forma coordinada con el sistema de las metaloproteasas en el proceso de remodelación vascular19. Las metaloproteasas constituyen un grupo de enzimas proteolíticas que son secretadas en forma de cimógenos inactivos al medio pericelular o expresadas como enzimas activas ancladas a la membrana celular40. Entre las metaloproteasas, la MMP-3 o estromalisina-1 despierta un especial interés dado que esta metaloproteasa es capaz de ser activada por la plasmina y, a su vez, la MMP-3 activada degrada al plasminógeno. En trabajos realizados en nuestro laboratorio hemos generado AGS y K5 al someter al plasminógeno a la acción de la MMP-3 recombinante activa. Como puede observarse en la figura 5, la MMP-3 degrada al plasminógeno por la unión entre los kringles 4 y 5, y a su vez degrada la unión del kringle 5 con el dominio serinaproteasa del plasminógeno, con lo que genera dos componentes con actividad antiangiogénica, la AGS (kringles 1-4) y el kringle 541, a partir de una única molécula de plasminógeno. En trabajos recientes se ha evidenciado que el kringle 5 tiene una actividad antiangiogénica igual o mayor que la AGS y que es capaz de inhibir la migración de las células endoteliales con mayor efectividad que la AGS34,42, por lo que la actividad antitumoral de este fragmento del plasminógeno despierta, si cabe, un mayor interés que la AGS. En nuestro centro hemos podido evidenciar que el K5 purificado es capaz de inhibir la proliferación del las células endoteliales en cultivo (fig. 6), lo que constata el papel antiangiogénico de este fragmento del plasminógeno.

300 200 100 0 0

25

50

Horas Fig. 6. Inhibición de la proliferación de células endoteliales por el K5 del plasminógeno. Células endoteliales ECV304 (50.000 por pozo) fueron puestas en cultivo en medio condicionante sobre placas de cultivo (Nunc; 24 pozos). La proliferación de dichas células se valoró mediante el recuento celular a las 24 y 48 h de cultivo. Las células en medio condicionante o en el que contenía plasminógeno humano (2 µM) proliferaron como se indica en la figura, y se obtuvieron 380.000 y 390.000 células por pozo a las 48 h de cultivo, en medio condicionante (●) o en medio que contenía plasminógeno (▲), respectivamente. La adición de kringle 5 (■) (2µM) a las células en cultivo inhibió su proliferación, detectándose 90.000 células a las 48 h. Los experimentos se realizaron por triplicado.

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Mientras que la caracterización biológica de las actividades del kringle 5 se explora activamente, disponemos ya de un conjunto de evidencias que sugieren que la AGS puede actuar como un eficaz agente antitumoral. En diversos estudios se ha investigado el papel de la AGS sobre modelos tumorales que poseen una alta invasividad y poder metastizante, tales como gliomas y carcinomas de próstata43-45. En dichos estudios, la actividad antitumoral se ha evaluado utilizando AGS sola o asociada a otros agentes terapéuticos, tales como la endostatina, otro potente inhibidor de la angiogénesis con capacidad antitumoral, junto a radiaciones ionizantes o agentes citostáticos8,30,46-48. En algunos de estos estudios se ha corroborado directamente la actividad antitumoral de la AGS, mientras que en otros la AGS se ha administrado a dosis relativamente bajas con el fin de valorar el efecto de su asociación a otros agentes terapéuticos. En general, en estos estudios parece comprobarse que la AGS efectivamente se comporta como un agente antitumoral eficaz en los modelos utilizados. Algunas de las discrepancias hasta ahora encontradas pueden deberse a la hetereogeneidad de los preparados de AGS hasta ahora empleados, en los que se han detectado ciertas diferencias en la región aminoterminal. Será preciso esperar el resultado de los estudios que se están realizando actualmente con AGS y K5, con mayor homogeneidad que la de los preparados hasta ahora utilizados, para realmente confirmar el esperanzador papel de estos moduladores de la angiogénesis en los procesos tumorales. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Carmeliet P, Collen D. Molecular analysis of blood vessel formation and disease. Am J Physiol 1997; 273: H2091-H2104. 2. Bussolino F, Mantovani A, Persico G. Molecular mechanisms of blood vessel formation. Trends Biochem Sci 1997; 22: 251-256. 3. Clark ER, Clark EL. Observations on healing tissue: a combined light and electron microscopic investigation. Am J Anat 1939; 64: 251-301. 4. Cameliet P, Collen D. Genetic analysis of blood vessel formation. Role of endothelial versus smooth muscle cells. TCM 1997; 7: 271-281. 5. Carmeliet P, Moons L, Dewerchin M, Mackman N, Luther T, Breier G et al. Insights in vessel development and vascular disorders using targeted inactivation and transfer of vascular endothelial growth factor, the tissue factor receptor, and the plasminogen system. Ann NY Acad Sci 1997; 811: 191-206. 6. Nelson NJ. Inhibitors of angiogenesis enter phase III testing [noticias]. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 960-963. 7. Harris AL. Are angiostatin and endostatin cures for cancer? Lancet 1998; 351: 1598-1599. 8. Harris AL. Anti-angiogenesis therapy and strategies for integrating it with adjuvant therapy. Recent Results Cancer Res 1998; 152: 341-352. 9. Bicknell R, Harris AL. Mechanisms and therapeutic implications of angiogenesis. Curr Opin Oncol 1996; 8: 60-65. 10. Pepper MS. Manipulating angiogenesis. From basic science to the bedside. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997; 17: 605-619. 11. Folkman J. Clinical applications of research on angiogenesis. N Engl J Med 1995; 333: 1757-1763. 12. Hockel M, Schlenger K, Doctrow S, Kissel T, Vaupel P. Therapeutic angiogenesis. Arch Surg 1993; 128: 423-429. 13. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med 1995; 1: 27-31. 14. Simons M, Ware JA. Food for starving hearts. Nature Med 1996; 2: 519520. 15. Schaper W. Molecular mechanisms of coronary collateral growth. Circ Res 1996; 79: 911-919. 16. Yanagisawa-Miwa A, Uchida Y, Nakamura F, Tomaru T, Kido H, Kamijo T et al. Salvage of infarcted myocardium by angiogenic action of basic fibroblast growth factor. Science 1992; 257: 1401-1403. 17. Banai S, Jaklitsch MT, Shou M, Lazarous DF, Scheinowitz M, Biro S et al. Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs. Circulation 1994; 89: 2183-2189. 18. Harada K, Friedman M, Lopez JJ, Wang SY, Li J, Prasad PV et al. Vascular endothelial growth factor administration in chronic myocardial ischemia. Am J Physiol 1996; 270: H1791-H1802. 19. Heymans S, Luttun A, Nuyens D, Theilmeier G, Creemers E, Moons L et al. Inhibition of plasminogen activators or matrix metalloproteinases prevents cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure. Nat Med 1999; 5: 1135-1142.

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20. Tanaka T, Cao Y, Folkman J, Fine HA. Viral vector-targeted antiangiogenic gene therapy utilizing an angiostatin complementary DNA. Cancer Res 1998; 58: 3362-3369. 21. Griscelli F, Li H, Bennaceur-Griscelli A, Soria J, Opolon P, Soria C et al. Angiostatin gene transfer: inhibition of tumor growth in vivo by blockage of endothelial cell proliferation associated with a mitosis arrest. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 6367-6372. 22. Cao Y, O’Reilly MS, Marshall B, Flynn E, Ji RW, Folkman J. Expression of angiostatin cDNA in a murine fibrosarcoma suppresses primary tumor growth and produces long-term dormancy of metastases. J Clin Invest 1998; 101: 1055-1063. 23. Folkman J. Fighting cancer by attacking its blood supply. Sci Am 1996; 275: 150-154. 24. Fidler IJ, Ellis LM. The implications of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis [comentario]. Cell 1994; 79: 185-188. 25. Folkman J. Angiogenesis inhibitors generated by tumors. Mol Med 1995; 1: 120-122. 26. Folkman J. New perspectives in clinical oncology from angiogenesis research. Eur J Cancer 1996; 32A: 2534-2539. 27. Gibaldi M. Regulating angiogenesis: a new therapeutic strategy. J Clin Pharmacol 1998; 38: 898-903. 28. Kerbel RS. A cancer therapy resistant to resistance [noticias, comentario; v. comentarios]. Nature 1997; 390: 335-336. 29. O’Reilly MS. Angiostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and of tumor growth. EXS 1997; 79: 273-94: 273-294. 30. O’Reilly MS, Boehm T, Shing Y, Fukai N, Vasios G, Lane WS et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997; 88: 277-285. 31. O’Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, Chen C, Rosenthal RA, Moses M et al. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell 1994; 79: 315-328. 32. O’Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, Chen C, Rosenthal RA, Cao Y et al. Angiostatin: a circulating endothelial cell inhibitor that suppresses angiogenesis and tumor growth. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1994; 59: 471-482. 33. O’Reilly MS, Holmgren L, Chen C, Folkman J. Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nat Med 1996; 2: 689-692. 34. Cao Y, Chen A, An SSA, Ji RW, Davidson D, Llinas M. kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth. J Biol Chem 1997; 272: 22924-22928. 35. Cao Y, Ji RW, Davidson D, Schaller J, Marti D, Sohndel S et al. kringle domains of human angiostatin. Characterization of the antiproliferative activity on endothelial cells. J Biol Chem 1996; 271: 29461-29467. 36. Ji WR, Barrientos LG, Llinas M, Gray H, Villarreal X, Deford ME et al. Selective inhibition by kringle 5 of human plasminogen on endothelial cell migration, an important process in angiogenesis. Biochem Biophys Res Commun 1998; 247: 414-419. 37. Ji WR, Castellino FJ, Chang Y, Deford ME, Gray H, Villarreal X et al. Characterization of kringle domains of angiostatin as antagonists of endothelial cell migration, an important process in angiogenesis. FASEB J 1998; 12: 1731-1738. 38. Sim BK, O’Reilly MS, Liang H, Fortier AH, He W, Madsen JW et al. A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer. Cancer Res 1997; 57: 1329-1334. 39. Wu Z, O’Reilly MS, Folkman J, Shing Y. Suppression of tumor growth with recombinant murine angiostatin. Biochem Biophys Res Commun 1997; 236: 651-654. 40. Félez J, Jardí M, López-Alemany R, Arza B, Barrowcliffe TW. Mecanismos de regulación del crecimiento celular y diseminación metastásica: especial referencia a la miogénesis. Haematologica 1999; 84: 252262. 41. Lijnen HR, Ugwu F, Bini A, Collen D. Generation of an angiostatin-like fragment from plasminogen by stromelysin-1 (MMP-3). Biochemistry 1998; 37: 4699-4702. 42. Cao Y. Endogenous angiogenesis inhibitors: angiostatin, endostatin, and other proteolytic fragments. Prog Mol Subcell Biol 1998; 20: 161-176. 43. Kirsch M, Strasser J, Allende R, Bello L, Zhang J, Black PM. Angiostatin suppresses malignant glioma growth in vivo. Cancer Res 1998; 58: 4654-4659. 44. Gately S, Twardowski P, Stack MS, Cundiff DL, Grella D, Castellino FJ et al. The mechanism of cancer-mediated conversion of plasminogen to the angiogenesis inhibitor angiostatin. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 10868-10872. 45. Chen C, Parangi S, Tolentino MJ, Folkman J. A strategy to discover circulating angiogenesis inhibitors generated by human tumors. Cancer Res 1995; 55: 4230-4233. 46. Gorski DH, Mauceri HJ, Salloum RM, Gately S, Hellman S, Beckett MA et al. Potentiation of the antitumor effect of ionizing radiation by brief concomitant exposures to angiostatin. Cancer Res 1998; 58: 56865689. 47. Mauceri HJ, Hanna NN, Beckett MA, Gorski DH, Staba MJ, Stellato KA et al. Combined effects of angiostatin and ionizing radiation in antitumour therapy. Nature (Lond) 1998; 394: 287-291. 48. Boehm T, Folkman J, Browder T, O’Reilly MS. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature 1997; 390: 404-407.