Apoptose et Chlamydia

Apoptose et Chlaznydia Regulation de l'apoptose au COUIS de l'infection par la bacterie intracellulaire stricte Jean-Luc PerfettJn1

t'apoptose estune mort cellulalredistinctede la necrose et seproduit physlologiquement au cours des etapes du developpernent embryonnaire et de l'horneostasle cellulaire. Cependant, rapoptose peut egalernent survenir au cours de differentes pathologies telles que les maladies auto-lrnrnunes, les cancers et les desordres neurodegeneratifs (2). De plus, des agents pathogenes tels que les virus, les bacterles et les parasites sont egalernent connus pour leur capadte de moduler Ie processus apoptotique de fa cellule note mtectee. En effet, de nombreux agents pathogenes tels que ShIgella fiexnen, Bordetella pertussIs, Salmonella typhlmurfum, Escherfchla coli et Staphylococcus aureus induisent I'apoptose des cellules notes lntertees, tandis que certains agentspathogenes a developpernent intracellulaire strictcontrOlent Ie mecanisme de la mort cellulaire des cellules qu'lls Infectent (16). Le protozoaIre Toxoplasma gondil alnsl que Ie virus de rHSV-1 (herpes sImplex vitus 1) protegent les cellules qu'lls infectent contre I'apoptose Induite par les cellules du systerne Immunitaire ou par des ligands non physlologiques [15, 311. Ces agentspathogenes peuvent mettre en ceuvre desrnecanlsmes d'inhibition de I'apoptoseafln de proteger fes cellules lntertees contre fa cytotoxldte du systeme Immunitaire. La levee de cette protection a fa fin du cycle Infectieuxde I'agent pathogene cantribue a la propagation de celut-d dans l'organlsme. t'apoptose peut done etre constderee soit camme un mecanisme de defense de la cellule note afin de prevenlr la propagation bacterlenne au vlrale, soit comme un evenernent du cycle lnfectieux de I'agent pathogene contribuant a l'etabllssement de I'Infection. La regulation de ce processus de mort cellulaire represents une etape deterrnlnante dans I'InteractJon entre I'agent pathogene et l'organlsrne. Plusleurs laboratolres se sont lnteresses a ce processus dans Ie cadre des infections a ChlamydIa.

1. Caracteristiques de l'infection

a Chlamydia

Les bactertes du genreChlamydIa sont desagents pathogenes lntracellulaires stricts quI infectent principafement les muqueuses des epitheliums. Chez

Apoptose en pathologie humaine I'homme, C. trachomatis provoque, selon les souches, des infections des voies oculaires et urogenltales, et des ganglions Iymphatiques. C. pneumoniae est egalernent pathogene pour I'homme ; son implication dans des infections des voies respiratoires a ete recernrnent reconnue, et elle pourrait etre assodee l'atherosderose. Enfin, C. psittaci, agent pathogene de divers animaux peut egalernent provoquer des pneumonies chez I'homme. On estime pius de 500 millions Ie nombre de personnes dans Ie monde qui sont lnfectees par des bacterles du genre Chlamydia. Souvent, les infections primaires sont relativement mineures, voire asymptomatiques. Les sequelles, cedte, sterlllte, grossesse extra-uterine apparaissent longtemps apres !'infection. Ces bacteries Gram-negatives possedent un unique cycle cellula ire {figure 7) caracterlse par deux formes majeures : les corps elernentalres (CE) qUi correspondent aux formes infectieuses, de petites tailles (200 300 nm) et ne possedant pas dactlvlte rnetabolique, et les corps reticules (CR), formes metabollquement actives de I'organisme (de 1 11m de diarnetre), Une infection typique par Chlamydia debute toujours par l'entree des CE dans I'organisme ; les CE se Iient a la membrane des cellules epltheflales des muqueuses (cible preferentielle au cours de !'infection) et sont lnternallses selon un processus d'endocytose. Ce mecanisme d'endocytose aboutit la formation de vacuoles contenant les microorganismes. Ces dlfferentes vacuoles ne fusionnent aucun moment avec les Iysosomes, mettant Ie pathogene I'abri de I'action bactericide de la cellule hote. Rapidement apres !'internalisation, les CE se dlfferendent en CR qui se divisent par fission binaire au cours de la phase de croissance bacte-

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Figure 1. Modele du cycle infectieux de Chlamydia. Les bccteries. sous forme infectieuse, CE (corps elernentcdres). entrent dans la cellule hote Elles se differencient en CR (corps reticules) metcboliquernent actifs, qui proliferent dans une vacuole. Elles se transforment ensuite en CE infectieux qui sortent de la cellule. Un nouveau cycle peut commencer.

Apoptose et Chlamydia rienne. Quelques CR commencent a se diff~render en CE au bout de 25 a 30 h. L'ensemble des CR se differendent au bout de 40 h d'infection. L'incluslon peut contenlr a ce stade plus de , 000 CE Infectleux. Les CE sont relarguesdanslestissus, entrainant la mort lnexpllquee de la cellulehote. Un nouveau cycle Infectleuxpeut debuter (5). La croissance lntracellulaire de cette bacterle represente un evenernent crucial dans la physlopathologie de l'lntectlon, En effet, \I est Indispensable pour Chlamydia de reanser une production efficace de baderles (conversion CE-CR, proliferation puis conversion CR-CE) et de liberer une progenle Infec· tleuse capable d'infecter d'autres cellules notes, La multiplication Intracellulalre de Chlamydia ainsl que les etapes de replications Intracytoplasmiques utilisees par de nombreux virus requlerent un echappement aux mecantsmes de defense de la cellule hOte et de l'organlsme lnfecte. L'etude des mecanlsmes rnoleculalres et cellulalres lmpllques dans la survle de la cellule note au cours du processus Infectieux represente une etape Indispensable a la comprehension de la physlopathologiede !'infection.

2. Le controle de la mort cellulaire in vitro: un enjeu vital au cours des infections

a Chlamydia

La cytotoxldte provoquee par des Infections dues aux soucnes humalnesou non humalnesde Chlamydia a ete demontreedurant de nombreuses annees (6), mals Ie mecanisme de mort cellulalre n'avalt pasete caracterlse. Unanue et aJ. ont rnontre que des macrophages et des monocytes qul sublssent l'apoptose serretent des cytoklnes pro-Inflammatoires telles que I'IL-' p [221. L'etude de la regulation de la mort cellulaire non seulement dans res cellules epttneflales, cibles preferentlelles de Chlamydia in vivo, mals egatement dans les cellules du systerne Immunitalre presentes au nlveau des muqueuses lnfectees, nous a semble partkullerement Interessante. En effet,Ie controte de la mort cellulaire des polynudealres neutrophiles, des macrophages ou des cellules dendritiques pourrait modifier de facon lmportante Ie developpernent de la reponse immune et de I'Infiammatlon. Etant donne Ie role que l'apoptose lndulte par Chlamydia pourrait jouer dans la liberation des bactertes par les cellules lnfectees ou dans r1nduction de la reponse lnflammatolre In vivo, nous avons recherche sl res macrophages et les monocytes dans lesquels I'Infection a ete decrtte (25) alnsl que les cellules eplthellales meurent par apoptose au cours de J'lnfection par Chlamydia.

2.1.1. Induction de la mort cellulaire

au COUlS de l'infection par Chlamydia Sur Ie plan morphologlque, II est frequent d'observer chez les celluJes Infectees, une condensation pertnudealre en mottes diffuses et compactes de la chromatlne revelant un pnenornene de c caryorrhexle• et pouvant aboutlr a

Apoptose en pathologie humaine

la suite de la reduction du volume nuclealrea ta fragmentation du noyau. On peut egalernent observer, assodees aces attelntes nudealres, la vacuolisation du cytoplasme ainsl que la dilatation des mitochondrles, ce qui suggere un dysfonctionnement de ces organelles. t'endonudeolyse est constderee comme revenement biochimique central du processus de mort celJulaire prograrnmee 143). En effet, au cours de I'apoptose, rADN est clive par des endonudeases en fragments ollgonudeosomlques dont lestailles correspondent a desrnonorneres ou desollgomeres de 180 paires de bases environ. Le c1ivage lnter-nucleosomal au cours de !'infection par C. pslttad ou C. trachomatls a ete rnls en evidence a ralde de deux techniques 134, 37). La technique TUNEL (TdT-medlated dUTP nick end labelllng) a permIsde montrer la fragmentation de rADN descelJules lnfectees en Incorporant grace a la TdT (terminal deoxynucleotldyl transferase) des nudeotldes dUTP fluorescents aux extrernltes 3' des fragments d'ADN. La fragmentation de rADN chromosomlquea ete conflrmee par electrophorese, par revelation d'un aspect en • barreaux d'echelle> de rADN des celJules lnfectees, ce qui est caracterlstlque du c1ivage lnter-nudeosomtque mis en oeuvre au cours de nombreux mecanlsmes d'apoptose. Assodee aces atteintes nudealres et cytoplasmiques, on peut egalernent observer une perte de rasymetrle membranalre des cellules lnfectees (Lupu et at, soumis pour publlcatlonl, La translocation des phosphatidyl-serlnes du feuillet interne vers Ie feuillet exteme de la membrane plasmique des cellules mtectees a ete detedee par cytornetrle de flux gracea la fixation de rannexine V - une protelne de liaison des phospholipldes dependante du calcium - conjuguee a un marqueur fluorescent. t'apoptose estfortement lnhlbee lorsque les celJules hOtes sont lncubees avec C. pslttad ou C. trachomatls en presence de l'heparlne (traltement qui lnhibe radheston des bactertes aux celJules), ce qui montre que les baderles presentent une adlvlte cytotoxlque spedtlque a I'lnfectlon. L'apoptose est egalementbloquee en presence de chloramphenicol (traitement qullnhibe la synthese protelque desprocaryotes, et non celie deseucaryotes, en bloquant la reaction de la peptldyl-transferase au niveau des ribosomes), ce qui suggere la necesslte que !'infection soit productive pour provoquer I'apoptose. En revanche, lesInfectionsreallsees en presence de cycloheximide, un Inhibiteur de synthese protelque chezleseucaryotes, ont revele que la synthese de protelnes de novo par la cellule hOte n'est pas necessalre a la mort des celJules lnfectees. L'etude de la dnetlque de la condensation des noyaux des cellules eplthellales lnfectees par C. pslttad a dernontre que raugmentation significative de rapoptose n'apparalt qu'apres la 30e heure d'lnfectlon, et peut atteindre plus de la mottle descellules apresla 48e heure d'infection. Une reaction similaire a ete observee lors de I'Infectlon de monocytes. Ces observationssuggerent que Ie processus d'apoptose est dedenche pendant la phase tardive de I'Infection, qui correspond a la multiplication de la forme baderlenne CR. L'lnfection des celJules notes en presence de penldlline G - qui ernpeche ta dlfferendatlon desCR non lnfectieuxen CE infectieux en bloquant la synthese du peptidoglycane, run des constituants de la parol bacterlenne- n'altere pas de fac;on significative I'Induction de rapoptose due a Chlamydia, ce qui

Apoptose et Chlamydia

suggere que I'lnltlation de I'apoptose depend de rnecanlsmes qui precedent la differendation desbacterles en CEo La dnetlque d'lndudlon de I'apoptose observee au cours des Infections a Chlamydia est lndependante de la cellule hOte lnfectee alnsl que des trois especes bacterlennes utilisees 134, 37) (Perfettinl et at, soumis pour publication). Ce phenornene estprobablement constant et regule au cours de l'lnfection par toutes les especes de Chlamydia.

2.1.2. Voies de signalisation impliquees dans l'induction de l'apoptose Un grand nombre de signaux de mort peuvent actlver des voles genetlquement dlstlnctes d'apoptose. La vole des caspases et celie du dysfonctionnement des organelles dont les mltochondrles sont les deux programmes les mleux caracterlses, t'etat d'activation de protelnes appartenant a deuxfamilies dlstlnetes lrnpllquees dans ces deux programmes d'executlon a ete caracterise au cours de I'lnfection par Chlamydia. Dans cette revue, seulle role des caspases estexamine. Les etudes reaIisees chez Ie nematode Caenorhabditls elegans ont permis la caracterisation d'un ensemble de genes nomrnes ced (cell death dejectlve), qui sont impuques dans la regulation du processus apoptotique [131. Deux de ces genes, Ced-3 et cea-a, sont lrnpllques dansJ'lnductlon du processus apoptotique, tandis qu'un autre gene, Ced-9, bloque J'lnductlon de I'apoptose. la decouverte d'une homologlede sequence entre Ced-3 et un genede mammlfere a Inltle la caracterisation d'une famille de proteases a cysteine appelee caspases ou proteases de la famille ICE Unterleukln-l convertase enzyme), Ces proteases a cysteine sont capables de cliver spedflquement leur substrat apres un adde aspartlque et constituent une famille d'au moins quatorze membres chez les mammiferes. La caspase-1 (ou ICE) est Ie premier membre de cette famille de proteases. Cependant, Ie phenotype normal des souris deflclentes en Caspase-1 remet en question Ie role de cette caspase dans les processus apoptotlques (40). La Caspase-1 semblerait done essentlellement intervenlr dans la secretion de deux cytoklnes pro-Inflammatoires, I'Il-1 ~ et i'lL-lB. Neanrnolns, II a etemontre que la Caspase-1 ala capadted'lndulreuneapoptose de la cellule note grace aux protetnes secretees par des bacterles, I'IpaB de Shigella et la SipB de Salmonella [7, 21). De pius, au eours de I'Infection de monocytes par C. psfttad, on observe une liberationd'll-1 ~ par des monocytes lnfectes, cequi suggere que la Caspase-1 est actlvee. Un InhibiteurIrreversible spedflque de la Caspase-1 Inhibeegalement la secretion IL-1~. Ces resultats mettenten evidence une activation de la Caspase-1 pendantI'lnfection. Or,J'lnhibitlon de la Caspase-1 n'ernpecne pas rlnductlon de rapoptose par ChlamydIa. Done, bien qU'elle soit artivee au cours de J'lnfeetion, la Caspase-l ne partidpe pas a l'lndudlon de cette apoptose. La caspase-3 esttmpllquee danslesetapes tardlves de nombreuxprocessus apoptotiques (42). L'aetivation de eette caspase permetIe clivage et l'actlvation d'endonudeases telles que Ie facteur de fragmentation de I'ADN IJ]FF, DNA fragmentation facton et la desoxyribonudease actlvee par les caspases (CAD, caspase-actlvated DNase). Ces enzymes sont lmpllquees dansla fragmen-

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tation de rADN et dans la condensation chromatinienne. Etant donne Ie role central de cette caspase dans la phase effectrice de nombreux processus apoptotiques, Ie role d'un inhibiteur speclflque de la Caspase-3 sur l'apoptose induite par Chlamydia, ainsi que l'actlvlte enzymatique de cette caspase pendant l'tnfectlon, ont ete etudles [34]. Bien que cet inhibiteur bloque d'autres voies d'apoptose qui dependent des caspases,!'inhibiteur de la Caspase-3 n'a pas d'effet sur l'apoptose au cours de !'infection par Chlamydia. De plus, un substrat fluorescent de la Caspase-3 n'est pas clive par les Iysats de cellules lnfectees (Perfettini et al., soumis pour publlcatlon). Enfin, un inhibiteur alarge spectre capable d'Inhlber de facon irreversible ractivation de plusieurs caspaChlamydia et renforce ses n'ernpeche pas !'induction de l'apoptose due l'lnterpretatlon que cette apoptose est lndependante des caspases connues lfigure 2).

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Ces resultats se rapprochent de recentes etudes qul dernontrent que l'apoptose, surtout lorsqu'elle est lnltlee a l'lnterleur d'une cellule, peut etre dedenchee sans la participation de caspases [40]. En effet, dans de nombreux rnodeles d'lnductlon d'apoptose, des inhibiteurs spedflques des caspases ne sont pas capables d'lnhlber l'apoptose induite par des stimuli pro-apototiques [13, 32, 40) et l'artlvatlon des caspases ne semble pas etre suffisante pour induire l'apoptose [26].

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Figure 2. Apoptose induite par Chlamydia in vitro, Les cellules intectees par Chlamydia secretent des cytokines pro-inflammatoires telles que l':L-l p grace a l'activation de la Ccspose-I. Cependant la Caspase-l ne contribue pas a la mort de cellule hote intectee. La Caspase-3 n'est pas cctivee au cours de ltnfection. De plus, un inhibiteur general des caspases n'oltere pas le processus apoptotique, ce qui suggere que l'apoptose observee au cours de l'infection par Chlamydia n'utilise pas de caspases connues,

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2.1.3. Regulation de la mort celluIaire

par des proteines de la familIe Bcl·2 Les membres de la famille BcI-2 comprennent des protelnes antl-apoptotlques telles que Bcl-2 et Bcl-Xl , et des protelnes pro-apoptotlques telles que Baxet Bak, Ces protetnes Interagissent aveclesmitochondrleset determlnent sl une cellule dolt vlvre ou mourir 118, 19, 39).Des etudes recentes suggerent que Ie dysfonetionnement des organelles represente une etape Irreversible dans les phases effectrlces de nombreux processus apoptotlques. Xlang et al. dernontrent que la surexpression de Bax Indult une mort cellulaire par apoptose sansImpliquer les caspases {441. De pius, la liberation de I'AIF(apoptosls Indudng/ador) durant l'alteratlon des mitochondrles provoque des modifications stereotyplques de l'apoptose au niveau de noyaux lsoles 141 I, suggerant que Ie dysfonctionnement desmitochondrlespeut Indulre une mort cellulalre lndependante descaspases. t'actlvlte pro-apoptotlquede Baxa ete observee chez plusleurs Ilgnees cellulalres en reponse a de nombreux stimuli [44). La protelne Bax reside dans Ie cytosol et est transloqueeaux mitochondrles a la suite d'une stimulation. Nousavons observe au coursde I'Infectlonde cellules eplthellales par C pslttad I'activatlon de ce faeteur pro-apoptotique. L'lnhibltion de cette activation par la protetne inhibitrice de I'actlvation de Bax (Bax Inhlbltor-n 1451, diminue I'apoptose observes au coursde I'Infection par Chlamydia (Perfettinl et aI., soumis pour publication). L'lnhibltion de I'apoptose Induite par Chlamydia dimlnue egalernent Ie rendement de I'Infectlon, ce qui suggers que I'apoptose pourrait contribuer a la sortie des bacterles des cellules lnfertees.

2.2. Resistance de la cellule infectee contre l'apoptose induite par des ligands externes Des modeles anlmaux infectes par ChlamydIa developpent une reaction inflammatoire au bout de 2 a 3 j d'infection. La reponse immunitaire adaptative mise en place au cours de ces Infections est bIen caractertsee IS) et les lymphocytes T CD4+ auxiliaires (Th7, t netper 7) semblent etre Indispensables a I'ellmlnation de I'Infection chez la souris. La reponse immune cellulalreainsl que la reponse Inflammatoire observees au cours d'infectlons a Chlamydia sont susceptibles d'lnltler des rnecantsmes d'apoptoseafln de lutter et d'ellrnlner eet agent pathogene de I'organisme. Les lymphocytes T CD8+ et les eellules NK (natural kl11er) utilisent les voles perforine/granzyme et FasUFas afin d'ellmlner les eellules lnfectees, tandis que les eellules CD4+ de type Thl utiIisent Ie systerne FasL (Fas ffgand) [301. Des agents pathogenes Intracellulaires ont mls en place des mecanisrnes pour echapper a eettereponse de rnote et pouvolr se multiplier sans dommage. De nornbreuses etudes ont reveledes rnecantsmes antl-apoptotlquesmls en ceuvre au nIveau de la celluleh6te, soit par desvirus soit par desbacterles a devetoppement Intracellulaire. En effet, plusleurs protelnes vlrales protegent de I'apoptose(Ia proteine CrmAdu virus de la vaedne, les protelnes p35 et lAPdu baculovirus, et les protelnes ICP4 de I'HSV1) 120). A I'heure actuelle, aucun facteur bacterten anti-apoptotlque n'a ete caracterlse, Neanrnolns, des

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parasites developpement intracellulaire tels que Leishmania et Toxoplasma inhibent I'apoptose des cellules tnfectees [29, 311. L'etude du genome deChlamydia na cependant pas revere de sequences pouvant coder pour des proteines homologues a des facteurs viraux. Neanrnolns, dlfferentes etudes revelent la presence de mecanlsmes anti-apoptotiques pendant les temps courts de !'infection pouvant intervenir dlfferents niveaux du processus de mort cellulaire mis en ceuvre IfIgure 3).

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2.2.1. Inhibition de la liberation du cytochrome c et inactivation des cc:spases Avant l'lnltiation de I'apoptose qui survient vers la fin du cycle d'infection de

Chlamydia, l'infection de monocytes et de cellules epltheltales protege les eellules notes contre la mort induite par des molecules pro-apoptotiques trnpllquees dans les reponses immunes, tels que Ie TNFo. (tumour necrosisfactor a), I'anticorps anti-Fas et les granzymes/perforines, et aussi contre des inducteurs d'apoptose non physiologiques tels que la staurosporine - inhibitrice de la protelne kinase C - et l'etoposlde [14]. Cette protection est observee pendant les temps precoces de !'infection et la levee de la protection par Ie chloram-

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Figure 3. Protection de la cellule infectee contre I'apoptose induite par des ligands externes. Les cellules inlectees par Chlamydia presentent une resistance I'apoptose induite par c:tifferents stimuli pro-apoptotiques. Ce phenomena de protection peut intervenir differents stades de I'apoptose, ce qui ernpeche la IiOOration du cytochrome c des mitochondries ou inhibe certains recepteurs de surface impliques dans I'initiation de signaux de mort.

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phenkot et non par Ie cycloheximide suggerent que l'adlvlte antl-apoptotlque dependd'une synthese protelque bacterlenne efficace et non de celiede l'hote, Cependant, Ietraitement par la penldltlne ne modifie pasl'adlvite antlapoptotique.Cette protection co'incide avecla proliferation desCR et pourrait donc etre due a la presence de facteurs baderlens presents a la surface des CR ou secretes par Ie systerne de secretion de type III recemrnent decouvert dans Ie genome de Chlamydia [23). Chacun des Inducteurs d'apoptose utilises provoque une activation sequentlelle de caspases dont celiede fa Caspase-3. Au cours de I'lnfectionde fa cellulenote, on observe une Inhibition de la maturation de fa pro-caspase3 Inactive en sa forme actlvee. Ce resultat a ete conflrme par I'lnhibition du clivage de la poly(ADP-rlbose)polymerase (PARP), un substrat de la Caspase3, et de la fragmentation de rADN au coursde l'lnfectlon [14). Afin d'etabllr sl ces Inhibitions resultent directement d'une Inhibition de la Caspase-3 ou du blocage d'un evenernent sltue en amont dans la voie de signalisation, la translocation du cytochromec au nlveau de cellules lnfectees et traltees par la staurosporine a ete etudlee. Contrairement aux cellules traltees seulement par la staurosporlne, les cellules lnfertees par Chlamydia reverent un noyau non condense d'asped normal et presentent une localisation mitochondrlale du cytochrome c. Ces resultats ont ete conflrmes biochimlquement par westernblot apres la separation desfractions cytosoliques et mitochondrlales [141. la regulation de la liberation du cytochrome c represente donc un evenement central dans la regulation de rapoptose de la cellule mtectee par Chlamydia. Recemrnent, une autre equlpe a rnontre que des monocytes lnfectes par C pneumonlae sont resistants a l'apoptose induite par des agents chlrnlotherapeutlques, Ie s-methoxysporatene et I'hyperldne [171. Ce mecanisme antiapoptotique necesslte egalement la multiplication Intracellufaire desbactertes et peut etre module par la secretion de cytoklnes pro-inflammatolres telles que I'Il-1 0 et I'Il-12 par la cellule hote lntectee. II reste cependant a determiner slles cytokines produitesau cours de l'infection peuvent controler la survie cellulaire en modifiant : a) I'equilibre entre les facteurs antl-apoptotiques et les facteurs pro-apoptotlques. en augmentant, par exemple, Ie nlveau d'expresslon de la protelne 8cl-2 [1 , 351, ou b) l'efflcadte de la multiplication intracellufaire et donc indirectementIes phenomenes de resistance a rapoptose.

2.2.2. Modification de l'activite de receptews

a la surface des ceUules infectees

Au cours des Infections duesaux bacterles lntracellulaires, I'organisme developpe une reponse inflammatoire de tacon a enrnmer ou a limiter !'infection. l'ATP est lmpllque dans les reponses inflammatolres [111 et peut controler Ie developpement de ragent pathogene Intracellulaire Mycobaderium tUberru/osls [24, 281, Depius, rATP estcapable d'induireI'apoptose de nombreux types cellulaires tels quelesmacrophages, lesmonocytes, lesthymocytes et res cellules dendritiques [8, 121. Ce processus de mort cellulalre estdedendie via desrecepteurs nudeotldlques qui sontdlstrlbues ala surface descellules. Onpeutregrouper ces recepteurs en pfusleurs families : la familledesrecepteurs P2X qui sont assodes

Apoptose en pcrthologie humaine

aux canaux lonlques, ta famllle des recepteurs P2Y et P2U qui sont couples aux protelnes G, et celie desrecepteurs P2Z qui revele fa presence de pores a ATP. Ces recepteurs sont caraderlses en termes d'affinlte vis a vis desagonistes et des antagonlstes de nudeotldes, t'effet de I'ATP extracellulaire (ATPol sur fa multiplication Intracellulaire de Chlamydia et surla survie descellules h6teslnfectees a ete recernment etudie (9). La survie des macrophages a ete rnesuree en presence de ptusleurs nudeotldes, et I'ATPo etait Ie seul nucleotide capable d'inltier rapoptose, En effet, lesnudeotldes ADP, AMP ou UTP sont capables d'actlverd'autres recepteurs mais pas les P2l..La spedfldte du recepteur a ete conflrrnee grace a l'etudede I'effetdes antagonistes (ATP oxyde,Mg++) et des agonistes (BzATP) de ces recepteurs, De plus, lorsque des macrophages sont mtectes par Chlamydia, et traltes ensulte par differents nucteondes, I'ATPo Inhibe la proliferation lntracellulaire des bacterles, En contrepartle, les cellules lnfectees par Chlamydia sont partiellement protegees contre I'apoptose Induite par I'ATPo, et une Infection productive estnecessalre pour lnstaurer la protection etudlee (9). Chlamydia protege lescellules contreI'apoptose Induitepar la staurosporine ou par des anticorps anti-Fas en Inhlbant I'activatlon des caspases a l'lnterleurde la cellule tnfectee (14). L'infectlon inhlbe I'apoptose due a I'ATPo aun autreniveau. L'actlvatlon desrecepteurs P2ZJP2X7 provoquela permeabilisation de la membrane plasmlque aux molecules de faible poids moleculaire. Dans les cellules lnfectees par Chlamydia, II y a une nette Inhibition de la permeablllte membranaire a un marqueur fluorescent Qud/eryellow), et une diminution et une modification des flux caldques etudles (9), L'lnhibition de l'adlvlte des recepteurs P2ZJP2X7 dans les cellules infectees par Chlamydia represente done un mecanisme original d'lnhibition de I'apoptose par un microbe Intracellulaire et montre que Chlamydia estcapable de reguler rapoptose a dlfferents niveaux, Cet agent pathogene Intracellulalre strictutiliseprobablement d'autres rnecanlsmes pour assurer la survle de la cellule h6te afln de reallser un cycle d'lnfectlon complet.

3. L'apoptose au cours de l'infection in vivo Chez leshumalns, la salplngite represente la consequence la plus Importante d'une infection a Chlamydia et peut aboutir a I'obstructlon des trompes, causant alnsl une sterillte. Peu de choses sont connues au sujet de la pathogenese des Infections humaines sexuellement transmlssibles a c trachomatls. L'utilisation de modeles animaux est done necessalre pour completer et vallder les etudes reallsees In vitro, Ala suite de l'infectlon de souris avec Ie serovar MoPn de C trachomat/s par vole vaginale, on detecte rapidement des bacterles au niveau du col de l'uterus (3), L'!nfection progresse ensulte jusqu'a l'endornetre et lesovlductes au bout de 7 a 9 j d'lnfectlon, ce qui aboutit danscertains cas a une sterlllte. La reponse de l'h6te a une Infection primaIre des muqueuses survlenten 2 j et est caracterlsee par une Inflammation et une Infiltration de polynudeaires

Apoptose et Chlamydia

neutrophiles et d'un faible nombre de monocytes [41. La pathologle est essentiellement due une reponse lnflammatoire excessive face I'Infectlon. De nombreux rnedlateurs de I'Inflammatlon sont presents durant I'Infectlon et contribuent aux lesions tissulaires et la fibrose. L'IL-' et Ie TNFa sont deux cytokines pro-inflammmatoires qui partidpent au recrutement des polymorphonudealres et contribuent ta fibrose en augmentant la production de prostaglandines et de conagene. rexpresslon des tntegrlnes, ainsl que la secretion des cytokines pro-Inflammatoires telles que I'IL-G, IL-B, GM-CSF /granUlocyte-macrophage colony-silmulatlngfador) et du TGFp (tranS/arming growth factor Pl. Le TNFa a ete detecte au nlveau des trompes de Fallope de femmes lnfectees par Chlamydia et dans les secretions de souris et de cochons d'inde lnfectes experimentalement. De pius, des macrophages et des monocytes qui subissent rapoptose secretent la cytoklne pro-inflammatoire IL-'~ [221. II est done concevable que l'apoptose Induite par rtnfectlon de ChlamydIa pulsse contribuer la reponse mftammatotre. A l'lnverse, des cytokines telles que Ie TNFa sont egalernent capables de provoquer rapoptose de cettules dbles, ce qui suggere que I'Inflammation qui suit I'Infectlon par ChlamydIa pourralt provoquer rapoptose.

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Au bout de 2 j d'infection des souris par vole Intravaglnale avec Ie serovar MoPn, les cellules lnfectees du col de l'uterus presentent parfois des noyaux apoptotiques, d'apres Ie marquage par la technique de TUNEL (371. Cependant, II n'exlste statlstlquement pas de difference significative entre Ie nombre de cellules apoptotiques au ntveau du col de souris lnfertees et de celles qui ne Ie sont pas, Neanmolns, la presence de nombreux amas de cellutes lnfectees et apoptotiques dans la lurnlere du col suggere que ces cellules pourralent etre ellminees par I'organlsme, afln de lutter contre la dissemination de ragent pathogene dans les muqueuses. Cependant, une Importante augmentation du nombre de celluJes apoptotiques est observable au nlveau des comes uterlnes et des ovlductes, au bout de 2 et 7 j d'infect ion. ttant donne la faible reponse inflammatolre observes dans ce modele au bout de 2 j d'infectlon, raugmentation du nombre de cellules apoptotlques suggere un mecanisme pro-apoptotlque Inltie par la multiplication des bacterles dans les tlssus, Tandis qu'apres 7 j d'infectlon, la presence des cellules apoptotlques peut etre la consequence de la coexistence de deux evenernents Inducteurs d'apoptose que sont l'lnfectlon et fa reponse inflammatolre. La diminution du nombre de cellules apoptotiques au niveau des comes uterlnes et des oviductes chez des souris depletees en TNFa puis mfectees durant 7 j confirme cette hypothese et suggere que des cytoklnes pro-lnflammatolres sont capables d'lnduire I'apoptose au cours d'une Infection par ChlamydIa. D'apres une etude recente 1101, Ie nombre de bacterles lsolees it partir de souris ou de cochons d'inde depletes en TNFa et tnfectes par ChlamydIa a ete compare it celul obtenu partir d'anlmaux lnfectes, mals non depletes. La secretion de TNFa n'altere pas Ie nlveau de I'Infection dans les deux modeles etudles, Cependant, Ie nombre de cellules polynudealres augmente au nlveau du tractus genital murin et dans res tlssus de cochon d'tnde chez lesquels II y a, assodee cette augmentation, une augmentation du nombre de lymphocytes, II semblerait done que la secretion de TNFa au cours de l'lnfection contribue a I'apoptose des cellules Inflammatoires Infiltrees dans les tis-

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Apoptose en pathologie humaine

sus, reverent ainsl un effet paradoxal de I'Inflammation au coursde la pathogenese des Infections a Chlamydia. En contrepartie, les rnecanlsrnes de cytotoxldte medlee par des cellules effectrlces du systerne immunitaire ne semblent pas Influencerrevolution de l'lnfectlon par Chlamydia (38). Chez les souris defldentes en perforlne, en Fas, en FasL (ligand de Fas), ou bien en perforine et FasL, les batteries sont ellmlnees de la muqueuse genltale avec les memes dnetlques. De pius, les animaux genetlquernent modifies presentent en reponse a une stimulation aux antlgenes de Chlamydia, une secretion de cytokines et d'lmrnunoglobutlnes comparable aux anlmaux normaux et montre un niveau Identiqued'lgA dans res secretions vaglnales, ce qui confirme que !'inactivation gentque des differentes molecules etudlees n'a pas provoque de modification de la reponse Immunitaire par des mecanlsmes de compensation. L'analyse histologlque du tractusgenital de souris mutantesou normalesrevere une reponse Inflammatalre slmilaire, ce qui suggere que la cytotoxldte medlee par les cellules T rrest pasindispensable a la lutte contre lesInfectionsaChlamydia au bien que la resistance a rapoptose des cellules infectees In vitro protegent les ceuutes lnfectees in vivo contre la cytotoxldte des cetlules du systeme Immunitalre.

4. Conclusions et perspectives La regulation des reponses immunitaires et revolution des processus Inflammatoires impliquent souvent la mort cellulaireprograrnmee. Parailleurs, certains microorganismes Intracellulaires tels que rHSV-1 ou bien Ie parasite Cryptosporldlum parvum sont capables-de protegerres cellules lntectees contre la reponse cytotoxique du systerne Immunitalre,et en rnemetemps d'lndulre une apoptose de la cellule hOte due a I'Infection elle-rnerne [17, 27, 33). Les travaux recents effectues sur la bacterle intracellulaire Chlamydia suggerent qu'une regulation fine du processus de mort des cellules lnfectees pourrait contribuer la pathogenldte. Alnsi, les bacterles en cours de dlfterenclatlon paurraient proteger les cellules notes contre Ie systems Immunitaire, tandis que rapoptose dedenchee par !'infection pourrait contribuer a la sortie de la bacterle de fa cellule lnfedee et a l'inflammation llee a I'Infection In vivo. Le mecanisme d'Indudlon de rapoptose des cellules notes lnfectees par Chlamydia est lndependant des caspases connues. Plusieurs caspases sont lrnpllquees au cours du developpement de rorganisme unicellulaire Dldyostet/um atscotaeum, mais la mort cellulaire ne necesslte pas ractivation de caspases (36). t'apoptose au cours de I'Infection par Chlamydia paurrait donc representer un modele bacterlen pour retude des voles mdependantes des caspases. La caracterisation de facteurs protelquesCed lmpllquesdansIe contr61e de la mort cellulaire de Caenorhabdit/s elegans, suivle de I'Identification de la famille des caspases chez les vertebres par homologie avec Ced-3, ont fortement « oriente « les travaux effectues dans Ie domalne de la mort celJulaire programmee, La decouverte de mediateurs mdependants des caspases represente un nouveau defl dans la recherche sur rapoptose. La caracterisation future de ces medlateurs devrait offrir de nouvellesapproches therapeu-

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Apoptose et Chlamydia

tiquesafin de limiter lesdegats tissulaires et d'eradlquerr1nfectlon perslstante

a Chlamydia.

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